魏舸1,2, 白亮1,3, 曲爽1, 王四宝1,2
1.中国科学院植物生理生态研究所, 中国科学院昆虫发育与进化生物学重点实验室, 上海 200032;
2.中国科学院大学, 北京 100049;
3.同济大学生命科学与技术学院, 上海 200092
收稿日期：2018-02-04；修回日期：2018-03-31；网络出版日期：2018-04-11
基金项目：国家自然科学基金（31472044，31772534，31701841，31501703）；国家重点研发计划专项（2017YFD0200400，2017YFD0201202）
作者简介：王四宝, 中科院上海植物生理生态所研究员, 博士生导师, 研究组组长。中科院"****"终期评估优秀获得者, 上海市"浦江人才"。2007年博士毕业于中科院上海生命科学研究院; 曾先后在美国马里兰大学昆虫学系和美国约翰霍普金斯大学分子微生物与免疫学系从事博士后研究。王四宝研究员长期从事多学科交叉研究, 主要研究昆虫与微生物相互作用。近年在媒介昆虫微生物组及与宿主和病原互作研究中取得重要进展, 以通讯作者或第一作者在Science、PNAS(3篇)、PLoS Pathogens、Trends in Biotechnology等重要学术期刊上发表论文。目前担任中国菌物学会副秘书长、中国菌物学会菌物组学专业委员会主任, 中国昆虫学会昆虫微生物组学专业委员会副主任、昆虫比较免疫与互作专业委员会副主任。兼任国际杂志Frontier in Microbiology和Infectious Diseases and Translational Medicine的副编辑
*通信作者：王四宝, Tel/Fax:+86-21-54924339, E-mail:sbwang@sibs.ac.cn
摘要：昆虫与微生物之间的互利共生关系是自然界中一种常见的互作形式。昆虫的种类丰富多样并且在自然界中分布广泛，在一定程度上得益于共生微生物的帮助。随着生物技术的不断发展，越来越多的共生微生物和互利共生模式得以发现并深入研究。微生物不仅能够为昆虫的生长发育提供营养，还能合成很多生物活性物质、调节宿主的免疫、对抗捕食者和抵御病原微生物感染，成为宿主昆虫健康和适应的守护者。鉴于共生微生物与昆虫生理生态的密切联系，以及昆虫对人类经济与健康的重要影响，利用共生微生物对昆虫及虫媒病进行生物控制已经成为一个热点研究方向，并展现了良好的应用前景。本文对昆虫共生微生物的多样性、生物学功能、与宿主相互作用机制及其在病虫害和虫媒病防治中的研究进展进行综述和展望。
关键词： 微生物组 共生 昆虫与微生物互作 共生控制
Insect microbiome and their potential application in the insect pest and vector-borne disease control
Ge Wei1,2, Liang Bai1,3, Shuang Qu1, Sibao Wang1,2
1.Key Laboratory of Insect Developmental and Evolutionary Biology, Institute of Plant Physiology and Ecology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, China;
2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3.School of Life Science and Technology, Tongji University, Shanghai 200092, China
Received 4 February 2018; Revised 31 March 2018; Published online 11 April 2018
*Corresponding author: Sibao Wang, Tel/Fax:+86-21-54924339, E-mail:sbwang@sibs.ac.cn
Supported by the National Natural Science Foundation of China (31472044, 31772534, 31701841, 31501703) and by the National Key Research and Development Program (2017YFD0200400, 2017YFD0201202)
Abstract: Insect-microbe symbiosis is a common type of interaction in nature. Insects are the most diverse and abundant group of species with a wide range of distribution. The evolutionary success of insects and their diversification into a wide range of ecological niches are partly due to the beneficial interaction with their associated microbiome. With the development and application of omics, numbers of symbionts have been discovered and novel symbiotic relationships were revealed. Symbionts play important roles on insect hosts in many ways, including provision of nutrients, production of bioactive components, modulation of host immune hemeostasis, protection from predators and pathogens. Therefore, symbionts serve as guardian of the insect health and adaptation Considering the important relationship of insect symbionts and hosts, insect symbionts have become promising in the development of novel tools for the biological control of insect pests, and blocking the transmission of insect-borne diseases. In this paper, we provide an overview on diversity of insect symbionts, the latest advance in the understanding of biological functions of insect symbionts, interactions between insect hosts and symbionts, and the novel strategies for the control of insect pest and vetor-borne diseases. Finally, we will discuss the directions for future study.
Key words: microbiome symbiosis insect-microbe interaction symbiotic control
昆虫是世界上分布最为广泛，数量繁多，种类也最为丰富的动物类群[1]。昆虫肠道也栖息着大量的微生物，通过长期协同进化，形成复杂而动态平衡的微生态系统，在昆虫进化和适应上发挥不可替代的作用，是宿主昆虫健康和适应的守护者。在以往的观念中，微生物往往扮演有害的反面角色，科学研究也偏重于病原和寄生的角度。受限于共生微生物普遍无法体外培养，昆虫共生微生物的研究一直进展缓慢。近年来随着分子生物技术的快速发展，高通量宏基因组测序和组学分析技术的出现，为昆虫共生微生物的发现及其与昆虫互相作用的研究提供了有力工具。研究表明昆虫体内的微生物量超过了昆虫自身的细胞数，生物量可达昆虫干重的1%–10%，从这个角度可以说昆虫其实是一个多物种的复合体[2]。昆虫为微生物提供了相对稳定的生存环境和营养资源，同样共生微生物也参与了昆虫的绝大多数生命活动，包括在营养匮乏的食性下提供必要的营养物质，帮助其分解难以消化的食物成分，调节免疫系统以抵抗病原菌和寄生虫，分泌生物活性物质对抗捕食者和拟寄生天敌，参与种内和种间信息传递，影响宿主传播疾病的媒介能力，甚至影响宿主的交配和生殖。因此，一些科学家把共生微生物称为昆虫宿主的一个“多功能器官”，在调节昆虫多种生理功能和维持肠道稳态等方面发挥着重要的作用。
昆虫与人类的生产生活密切相关，因此昆虫共生微生物也在生物医药、农业和生态等方面展现出研究价值。许多模式昆虫为研究微生物与宿主的相互作用提供了良好的实验模型，尤其是在免疫与代谢领域[3]。对于一些传播疾病的媒介昆虫，共生微生物能影响宿主昆虫的媒介效能和发育时间[4-6]，显示出共生微生物在疾病控制方面的应用潜力。农业害虫能造成大量的农业损失，木食性昆虫对建筑的损害也很大，但也有部分授粉昆虫有益于农业，更有家蚕、蜜蜂等直接为人类创造经济价值，不论益虫或害虫都会受到共生微生物的影响。此外，昆虫及其共生微生物在自然生态系统中具有调节生物地化循环的重要作用，如参与碳氮循环[7-8]。最近还有研究发现黄粉虫能够依靠肠道内的微小杆菌Exiguobacterium sp. YT2消化分解聚苯乙烯[9-10]，为解决塑料污染问题提供了一种新思路。过去几十年间，农业害虫和媒介昆虫的防治主要依赖化学杀虫剂，然而化学杀虫剂对环境的污染和对生态系统其他生物的不利影响一直使其倍受诟病，同时越来越多的害虫对杀虫剂产生了抗性并在种群内快速扩散，严重影响了化学杀虫剂对害虫的控制效果。此外，化学杀虫剂虽然能够控制害虫种群但却保留着生态空位，一旦停用或产生抗性，害虫会迅速恢复到原来数量以填补空位。因此，我们迫切需要开发新的害虫防治策略。鉴于共生微生物重要的生物学功能和在病虫害控制方面的应用潜力，昆虫共生微生物的研究近年来受到广泛的关注，目前已有许多研究成果展现出良好的应用前景。
1 共生微生物的多样性 共生的概念由de Bary于1879年首次提出[11]，根据对宿主的影响可将共生关系分为三种(表 1)：互利共生(mutualism)，有利于宿主的生长；偏利共生(commensalism)，对宿主生长没有影响；寄生(parasitism)，不利于宿主的生长。按照微生物共生位置是否在宿主细胞内部，又可以分为内共生(endosymbiosis)和外共生(ectosymbiosis)。而根据微生物与宿主之间相互依赖的程度可分为初生共生体(primary symbiont)和次生共生体(secondary symbiont)，其中初生共生体与宿主具有协同依赖性，往往与宿主有着非常长的协同进化史，并且能在种群内垂直传播。次生共生体与宿主联系在一起的时间则较短，并且没有那么强的依赖性，可以与宿主分开生存。
表 1. 微生物与昆虫关系的主要类型 Table 1. Interactions between microbes and their insect hosts
| Type of symbiosis | Impact on the insects | Impact on the microbes |
| Mutualism | Benefit | Benefit |
| Commensalism | Unharmed | Benefit |
| Parasitism | Harmed | Benefit |
表选项
分离再培养是研究昆虫共生微生物的一个经典的方法，但是昆虫体内的复杂环境无法在体外模拟。由于多数昆虫共生微生物都无法在体外进行培养，因此长期以来昆虫共生微生物的多样性被严重低估了。随着分子生物技术的发展，通过高通量宏基因组测序分析，我们才得以初步了解共生微生物的多样性。昆虫作为宿主，从体壁到消化道和血腔及其他器官，乃至细胞内都有微生物的踪影。昆虫的外骨骼体壁通常认为是阻挡微生物的一道物理屏障，但也有微生物在表面附着。昆虫肠道是微生物定殖的主要场所，肠道内的共生微生物具有最丰富的组成结构和最复杂的生物学功能。昆虫的唾液腺、卵巢和血腔是病毒和寄生虫侵染的主要器官，从这些器官也能够分离到共生菌，如朝井杆菌(Asaia sp.)能定殖于多种蚊子的唾液腺和生殖系统[12]。细胞内共生菌沃尔巴克氏体(Wolbachia)则能定殖在尖音库蚊和白纹伊蚊的头部、肌肉、马氏管、卵巢和精巢[13]。
共生微生物的种类包括细菌、真菌、古细菌、病毒和原生动物，不同的昆虫其共生微生物也各不相同。原生生物在低等白蚁和以腐木为食的蟑螂中研究的最多，它们主要通过在群体中互相传播而存留在这些昆虫体内[14]。而真菌则在以木材或者腐殖质为食的昆虫肠道中较为常见，它们可能在食物消化方面具有重要作用。产甲烷的古生菌大多存在于以木材或者腐殖质为食的甲壳虫和白蚁等昆虫中[15-16]。细菌则在几乎所有昆虫肠道内都有分布，并且常常占据着最大的数量。即使是同种昆虫，随着生长阶段和分布环境的不同其肠道微生物的结构也有差异。以研究较多的按蚊为例，其肠道微生物主要来自于食物和水，因此不同种群的按蚊肠道菌存在一定的差异。雌雄按蚊的食性不同，雄蚊只吸食花蜜而雌蚊还会吸食血液，不同的消化过程对肠道微生物意味着不同的选择压力和营养资源，雄蚊高糖低pH的食性能够选择特定的菌群，而雌蚊吸血后的肠道环境则趋向于具有溶血能力的细菌。此外，吸血时雌蚊肠道温度的升高和活性氧胁迫的降低有利于细菌的增殖[17]，也会改变菌群的结构。按蚊在完全变态发育过程中，幼虫孵化时携带少量继承来的共生菌，以细菌和浮游生物为食的过程中又摄入环境中的菌群和蓝藻[18]，而幼虫化蛹阶段和羽化阶段会各排出一次由围食膜包裹的胎粪[19]，绝大多数肠道微生物以这种形式被排出，因此幼虫阶段与成虫阶段肠道菌组成存在巨大差异。肠道菌群个体之间也相互影响和制约，并在宿主的免疫生理作用下通常维持着一种稳态，而当发生某种剧烈变化比如病原菌入侵时，整个稳态被打破，肠道菌群结构发生变化，表现为菌群失调。细菌种间竞争实验显示，体外培养的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)能对鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、伯克氏菌(Burkholderia)产生抑菌圈[20]。在沙漠飞蝗体内的共生菌的竞争定殖实验也表明，当粘质沙雷氏菌缺失时，肠道菌的多样性有一定的提高[21]。
2 共生微生物的功能 2.1 营养、代谢与行为 共生微生物与昆虫的相互作用包括营养上的互助(图 1)。昆虫在生态系统中分布非常广泛，有些昆虫需要面对营养匮乏或难以消化的食物，而共生微生物可以为宿主昆虫提供必需的营养物质或消化酶帮助宿主适应特殊的生存方式，而微生物可以持续从宿主得到代谢产物作为营养来源。与宿主营养相关的微生物往往是初生共生体，为宿主提供食物中得不到的营养物质，包括氨基酸、维生素和辅酶因子等，并帮助宿主完成氮、硫代谢[22-23]。这些内共生菌定殖于宿主特化的称为类菌体的细胞内[24]，使宿主更稳定地控制共生菌的保留和传播。除了营养物质的代谢，共生微生物还能帮助昆虫代谢有毒物质。植物为了对抗昆虫的取食，会向环境释放植物化感物质，连同人类施用的杀虫剂都对昆虫有毒害作用。昆虫自身也有解毒机制，如细胞色素P450单加氧酶、谷胱甘肽S-转移酶和一些酯酶能氧化、分解有毒物质来解毒。最近的研究发现很多昆虫共生微生物也参与解毒过程。椿象通过从甘蔗田中获取能分解杀螟松的伯克氏菌而获得抗杀螟松抗性[25-26]。像这样从环境中摄入共生菌而获得解毒能力的方式与进化形成抗毒基因相比显然快得多，也更容易在种群中扩散。昆虫共生微生物不仅为宿主昆虫提供必需的营养，还帮助代谢毒素，对昆虫适应多样化的生存环境起到了重要作用。另外，共生菌在昆虫体内合成或分解产生的代谢物可以被宿主利用合成信息素或种间激素，调节种群行为或影响其他物种[27]。沙漠飞蝗中肠共生细菌成团泛菌(Pantoea agglomerans)等能利用消化废弃物中的木质素派生物香草兰酸合成愈创木酚，而愈创木酚是沙漠飞蝗聚集信息素的重要成分，信息素从粪便挥发出来吸引更多蝗虫集群行动[21]。
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| 图 1 昆虫肠道共生菌在宿主昆虫健康与感染中的功能 Figure 1 Roles of the gut microbiota in insect health and infection. |
| 图选项 |
2.2 免疫与保护 昆虫在自然环境中会面对多种多样的生存威胁，包括各种病原、寄生虫和捕食者的攻击。在昆虫与这些威胁的对抗中，共生菌发挥着不可或缺的作用。已有许多研究报道无菌处理的昆虫与对照组相比，更易受到病原菌和寄生虫的感染[28-29]。这种共生菌抑制其他外来微生物定殖或增殖的现象称为定殖抗力(colonization resistance)，其机制可能有三点：调控激活宿主先天免疫系统、竞争性营养消耗、通过物理隔离或代谢产物抑制其他微生物。其中研究最多的是共生微生物对免疫系统的影响，有研究通过比较有共生菌的按蚊和除菌的按蚊的免疫基因表达谱发现，共生菌的存在能激活按蚊的免疫系统，上调很多免疫基因的表达水平，其中包括cecropin、defensin和gambicin等抗菌肽[30]，因此在按蚊遭遇病原微生物如疟原虫入侵时能有更高的免疫水平来抑制感染[31-32]。Chris等从野外按蚊种群中分离到一株肠杆菌Esp_Z，引入实验室按蚊种群后显著提高了对疟原虫感染的抗性，而通过RNAi干扰按蚊IMD和Toll免疫通路发现该菌株对疟原虫的抑制作用并不依赖按蚊免疫系统，进一步通过Transwell体外培养实验证实该菌株通过产生ROS活性氧直接抑制疟原虫的发育[32]。与此相反，也有研究发现某些细菌如肠杆菌大量存在时，有利于疟原虫感染[18]，说明即使属于同一类细菌，不同种或同种不同菌株的细菌对宿主的影响可能存在很大的差异。例如，Bando等从野外分离到一株能抗疟但不能稳定共生的沙雷氏菌，在实验室进行传代筛选后得到一株能稳定共生的突变株，然而该菌株失去了抗疟能力[33]。昆虫共生菌的定殖抗力对病原真菌同样奏效，豌豆蚜虫的一大天敌是虫霉目真菌Erynia，这种虫霉菌孢子沾染到蚜虫后会萌发并侵入体表，随后菌丝生长填满整个体腔杀死蚜虫，并产生大量新孢子。在一种内共生细菌Regiella insecticola存在的条件下，蚜虫抗虫霉菌感染的能力提高至少5倍，即使虫霉菌成功感染并杀死蚜虫，其最终产生孢子数量也会受到严重影响而只能达到正常状况下的1/10[34]，因此共生菌R. insecticola保护的不仅仅是蚜虫个体，还包括整个蚜虫群体。共生微生物对病毒也具有抑制作用，果蝇C病毒(DCV)是一种无包膜RNA病毒，对黑腹果蝇表现出高致病性和死亡率，研究报道被细胞内共生菌沃尔巴克氏体(Wolbachia)定殖的果蝇能显著降低由DCV造成的死亡率，同时去除Wolbachia的果蝇对DCV更加易感[35-36]。
共生微生物还能通过产生有毒代谢产物的方式保护宿主昆虫免于被捕食。豌豆蚜虫的另一大天敌是拟寄生蚜茧蜂Aphidius ervi，蚜茧蜂会在蚜虫身上产入单个卵，幼虫孵化后从内部吞噬蚜虫并形成茧，最终成虫羽化，留下木乃伊一般的蚜虫。有趣的是蚜虫个体之间对拟寄生的敏感性有很大差别，随后的研究发现差别来自于蚜虫体内某些共生菌的存在与否，其中共生菌Hamiltonella defensa能产生毒素直接杀死蚜茧蜂的幼虫[37-38]。此外，有研究报道白蚁体内的共生菌能产生甲烷可以防御蚂蚁等天敌的捕食[39]，毒隐翅虫体内共生菌能产生一种聚酮类有毒物质岬毒素可以抵御狼蛛的捕食[40-41]。
有研究发现，共生菌还可以通过保护“重要第三者”的方式间接保护昆虫宿主。切叶蚁与环柄菇科真菌的互作关系是共生关系研究的一个经典，切叶蚁具有挑选并种植环柄菇科真菌使之作为食物来源的独特能力，而环柄菇科真菌自身缺乏竞争能力，数千年来蚂蚁和真菌为了生存而相互依赖。当其他不能作为食物来源的真菌入侵并竞争抑制环柄菇科真菌时，蚂蚁和真菌间的互利共生就会受到威胁。有趣的是，切叶蚁体表的腺窝内携带一种放线菌属共生菌，能够产生抗真菌物质杀死入侵病原真菌Escovopsis spp.来保护环柄菇科真菌，进而保护了蚂蚁宿主的生存[42-43]。
昆虫在自然环境中除了要面对各种天敌的威胁，还要面对人类活动诸如农药杀虫剂大量使用所带来的生存压力和恶劣环境的影响。昆虫通过微生物获得解毒能力的现象已有不少报道，日本科学家发现农场土壤中少量存在一种能降解杀虫剂扑灭松作为碳源的伯克氏菌，豆科害虫点蜂缘蝽以及同属的椿象可在幼虫时期从土壤中获得这种共生菌。向农场施放扑灭松能使这种菌在土壤中大量富集，并与点蜂缘蝽形成共生关系赋予其抗药性[25]。此外，共生菌还能提高宿主抗逆能力，有些共生菌能赋予蚜虫修复热损伤的能力，使其在高温环境下有更高的存活率[44]。
共生微生物介导的保护是一个已经通过生态模型预测并且越来越多地被观察到的现象，共生菌为宿主昆虫提供保护使得共生组合具有更大的竞争优势，有利于共生关系稳定维持。
3 昆虫共生微生物的应用 昆虫与人类活动密切相关，其中有很多是害虫或疾病传播媒介，对农业造成巨大的经济损失，甚至对人类健康构成严重威胁。如何高效而经济地控制病虫害和病媒的传播是现今科学界的一大挑战。过去一段时间，化学杀虫剂的广泛使用，一定程度上遏制了病虫害和虫媒疾病的传播。然而，昆虫抗药性的广泛出现和对化学杀虫剂污染环境影响健康方面的忧虑加深，迫使我们寻找新的解决办法。生物控制和昆虫不育技术在昆虫防治上取得了一定的成果，但还远远不够。最近的研究表明，肠道共生菌在害虫和虫媒病的防控上具有很大的应用潜力，并已取得了一定的进展。
3.1 生物防治 除了化学合成杀虫剂，自然界中本身就存在着一些天然杀虫剂。有些微生物能合成具有杀虫效应的蛋白，如苏云金芽孢杆菌在形成芽孢时会在芽孢旁形成一颗菱形或双锥形的碱溶性蛋白晶体δ-内毒素，也称为伴孢晶体，对200多种昆虫尤其是鳞翅目的幼虫具有毒杀作用，被称为细菌杀虫剂。苏云金芽孢杆菌cry基因和cyt基因编码合成两种毒蛋白，被昆虫摄入后能被肠道碱性环境分解为活性肽而激活毒性，与昆虫肠道上皮细胞特异受体结合，引起细胞膜穿孔损伤消化道，影响昆虫取食而死亡[45]。球形芽孢杆菌能合成Mtx和Bin毒力蛋白高效杀伤按蚊幼虫[46]。这两类杀虫细菌已经通过野外实验，在爆发疟疾的冈比亚和加纳有效地抑制了按蚊的种群数量，是目前应用最为广泛和最有潜力的细菌杀虫剂，已有多种商业化产品问世，如VALENT BIOSCIENCES公司为不同疾病媒介提供的多种产品，包括Bti水悬浮制剂Vectobac 12AS，以及Bs颗粒制剂VectoLex WDG等，对冈比亚按蚊、斯氏按蚊以及库蚊属媒介幼蚊的控制具有一定的效果[47]。此外，还衍生出许多转Bt基因农作物，已经广泛种植。有研究显示昆虫肠道微生物参与了Bt毒蛋白对昆虫的杀伤作用，无菌的昆虫对Bt毒性耐受更强，其原因可能是Bt蛋白损伤肠上皮后，肠道菌进入血腔引起败血症加速昆虫死亡[48]。昆虫病原真菌如白僵菌、绿僵菌也是应用非常广泛且具有潜力的微生物杀虫剂，他们能够专一地感染宿主昆虫，而不危害其他动植物，也不会造成环境污染。但是，病原真菌的生长速度相对缓慢以及杀虫周期较长，这是影响真菌杀虫剂开发利用的一个主要限制因素。最近有研究发现昆虫肠道微生物能够提高白僵菌的杀蚊速度，通过比较无菌的按蚊和正常按蚊在感染白僵菌后的存活时间，发现含有正常肠道菌群的按蚊死亡速度明显高于无菌的按蚊[30]，这提示我们在施放白僵菌时或许可以搭配一些肠道菌以提高杀虫速度。
3.2 共生微生物的定殖抗力 定殖抗力指共生微生物在宿主昆虫稳定定殖时，能抵御外来病原菌和寄生虫的定殖和入侵。以传播疟疾的按蚊为例，疟原虫通过按蚊吸血进入中肠，需要在24 h内经历配子体、合子、动合子3个发育阶段，随后侵入中肠细胞发育为卵囊最终释放子孢子。而肠道菌的存在会严重影响疟原虫的发育，如果用抗生素处理清除肠道菌，按蚊将更易感染疟原虫[29]。有研究报道将分离的肠道细菌粘质沙雷氏菌、栖水肠杆菌、阴沟肠杆菌与感染间日疟的血一起饲喂淡色按蚊(Anopheles albimanus)，结果仅有1%的按蚊被疟原虫感染，而无菌对照组感染率高达71%[49]。除了肠道微生物，昆虫细胞内共生菌Wolbachia也对多种病原微生物展现出抑制作用。自然条件下的蚊子中，仅在尖音库蚊和少数种伊蚊体内发现有Wolbachia。将Wolbachia引入埃及伊蚊(Aedes aegypti)群体[50]，有效地抑制了登革病毒的传播并缩短了宿主伊蚊的寿命[51]，极大地减弱了埃及伊蚊传播疾病的媒介能力。随后又有研究发现Wolbachia还能抑制丝虫和寨卡病毒的传播[52-53]。最近中山大学和密歇根大学联合研究小组尝试通过显微注射技术将Wolbachia注入斯氏按蚊(Anopheles stephensi)胚胎，最终成功得到感染Wolbachia的雌蚊，证实Wolbachia也能抑制疟原虫的感染[52]。除了对病原微生物的抑制作用，Wolbachia最引人注目的特性是能够通过诱导胞质不相容性影响宿主的生殖。感染的雄性与未感染的雌性交配时，核融合失败导致受精早期中断，无法产生后代。胞质不相容性导致种群生育率降低但对于感染的雌性是一个生殖优势，因此有利于Wolbachia在整个种群的扩散和维持[54]。
3.3 转基因共生菌对抗虫媒病 与直接针对蚊子进行基因操作不同，转基因共生菌(paratransgenesis)通过对蚊子共生菌进行转基因操作，使其作为效应基因的表达载体对宿主蚊虫产生转基因效果。转基因共生菌技术是在转基因昆虫的基础上发展而来，与直接对昆虫做转基因相比，转基因共生菌更容易操纵、转基因株系易于扩大培养、易于在宿主种群内扩散、种属适应面广等诸多优点。这项技术的应用需要满足几个前提条件：(1)可培养的共生菌；(2)可用的遗传操作体系；(3)合适的共生关系；(4)合适的目的基因，不能对共生菌和宿主有不利影响；(5)转基因共生菌易于引入宿主种群。以传播疟疾的按蚊为例，目前已经有报道分离到的能稳定共生或又能在按蚊种群内垂直传播的共生菌Serratia AS1、Pantoea、Asaia SF2.1都是很好的转基因表达载体[55-57]。抗疟效应基因的选择可以从多个方面考虑，大约可分四类：(1)杀伤因子：包括宿主先天免疫系统的抗菌肽，如defensins、gambicin、cecropins，以及能裂解疟原虫但对宿主无影响的外源蛋白如蝎毒素、C型凝集素、血管紧缩素Ⅱ、蛙皮素，人工合成的抗疟裂解小肽Shiva1、Shiva3和gomesin[57-65]；(2)阻断抑制因子：如EPIP在疟原虫入侵蚊子中肠的时候能阻止血纤维蛋白溶酶原结合到动合子的表面从而阻止疟原虫侵入蚊子中肠[66]。其他的阻断因子多为单链的单克隆抗体(scFvs)，如scFvs 4B7能够结合到恶性疟原虫动合子表面蛋白Pfs25上，2A10则能与恶性疟原虫的环子孢子蛋白(CSP)特异性结合，scFv 1C3能够特异性与恶性疟原虫分泌的几丁质酶1结合。单链的单克隆抗体虽然特异性很高，但也有一个致命的缺点，一旦病原物发生结合位点的基因突变，就会导致结合效率大大降低，对病原物起不到抑制阻断的目的；(3)竞争抑制因子：对于疟原虫来说，要完成它在蚊子体内的发育阶段就必须要穿透蚊子的中肠壁随后还要进入蚊子的唾液腺，在这个过程中疟原虫需要识别蚊子本身的一些受体，并与之结合，才能进行下一步的入侵过程[67-68]。竞争结合抑制因子正是基于这样的事实，产生一些与蚊子组织细胞受体相互作用的蛋白，提前占据受体的结合位点，阻止疟原虫的入侵。如SM1(唾液腺的一个12个氨基酸的多肽)，中肠肽1 (MP1)和中肠肽2 (MP2)属于结合类抑制因子，能够分别阻断动合子和子孢子的入侵[69-70]。另外，一个磷脂酶A2突变体(mPLA2)可能是通过修饰改变蚊子中肠上皮细胞膜的性状来阻止动合子的入侵[57-59]；(4)免疫调控因子：蚊子的免疫系统在抵抗疟原虫的过程中发挥重要的作用，因此充分激活蚊子自身免疫中的抗疟因子能有效杀灭疟原虫。吸血诱导表达的Akt是胰岛素信号通路里的一个重要信号分子，可以调控蚊子抵抗疟原虫的感染。同样，过表达IMD通路中的转录因子Rel2也能够上调蚊子的免疫反应抵抗疟原虫入侵[71]。近年来利用转基因共生菌阻断疟疾传播的研究取得重要进展，Wang等以按蚊常见共生细菌成团泛菌为模型，借助大肠杆菌溶血素分泌系统(HlyA)合成SM1、Scorpine或(EPIP)4等抗疟效应分子，能在多种按蚊体内有效抑制多种疟原虫，显示该策略在抗疟上具有通用性[57]。最近，研究团队发现了一株能通过雄蚊交配和雌蚊产卵进行横向和垂直传播的共生细菌Serratia AS1，可在多种按蚊种群中快速散播和持续跨代传播；通过基因工程改造使AS1分泌表达多种抗疟活性分子，能在按蚊体内高效特异地抑制或杀灭恶性疟原虫，使按蚊成为无效疟疾媒介。该研究解决了如何将抗疟菌株快速扩散到整个蚊群的关键难题，为从源头上对抗疟疾传播提供有应用前景的新“武器”[56]。除此之外，转基因共生菌在抑制其他虫媒病的研究中也取得进展。美洲锥虫病由长红猎蝽传播的克氏锥虫引起，科学家通过改造猎蝽共生菌Rhodococcus rhodnii表达cecropin A，对克氏锥虫有良好的抑制效果[72]。类似的策略也用于控制非洲昏睡病的研究，研究人员对布氏锥虫的传播媒介采采蝇的肠道菌Sodalis glossinidius进行了基因工程改造，使其表达抗菌肽attacin，也取得了良好的效果。除了人类虫媒病，很多植物病原也是由昆虫传播，因此，转基因共生菌在植物虫媒病害的防控上也具有广阔的应用前景，如葡萄皮尔斯病是由玻璃翅叶蝉携带的叶缘焦枯菌(Xylella fastidiosa)引起，有望通过改造叶蝉共生菌Alcaligenes sp.来控制皮尔斯病的传播[73]。另外，在白蚁防治方面也有转基因共生菌的应用，基于白蚁对木质纤维素的消化依赖于肠道原生生物分泌的消化酶，研究人员改造了一株酵母使其表达特异性裂解原生生物的小肽并引入白蚁群体，导致白蚁肠道内辅助消化的原生生物死亡，白蚁因营养摄取不足而大量死亡[74]。
4 总结和展望 共生是自然界广泛存在的一种互作形式，正是由于共生微生物对宿主的重要作用，这种关系才一直稳定而广泛地存在着。高通量测序技术的发展和应用为我们理解昆虫与肠道微生物的相互作用提供了巨大帮助，昆虫肠道微生物的多样性和生物学功能等方面的研究已取得一些重要进展，为病虫害和疾病的控制提供了新思路。现代分子遗传技术也为我们提供了足够的工具去改造微生物以操纵其在宿主体内的组成和功能，使得很多病虫害及疾病控制的设想有了实现的可能。但目前对于共生微生物与宿主昆虫之间复杂的相互关系以及共生微生物在昆虫各种生理活动中所起的具体作用和分子机制尚知之甚少。我们在研究中也逐渐发现，共生微生物与宿主免疫系统、外来病原、环境变化、营养摄入，甚至共生微生物种群之间都相互影响与相互适应，形成一张复杂的网络。常规研究方法中简化模型选取单一变量的思路在研究共生微生物系统时存在一定的局限性。基于高通量测序技术，宏基因组学、转录组学、蛋白组学、代谢组学和微生物组学等多组学的快速发展，将为研究整个互作网络提供宏观视角。微观分子操作结合宏观分析，能更准确地研究与理解昆虫与微生物之间的互作关系，也有助于发展更好的病虫害控制方法。不论是利用共生菌自身的特性，还是通过转基因赋予共生菌特殊的能力去对抗病原物，在控制病虫害和阻断虫媒病的传播上都呈现出重要的应用前景。
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