顾航, 肖凡书, 贺志理, 颜庆云
中山大学环境科学与工程学院, 环境微生物组学研究中心, 广东 广州 510006
收稿日期：2017-11-05；修回日期：2018-01-10；网络出版日期：2018-01-24
基金项目：中山大学“****”（38000-18821107）；中山大学“****”（38000-18821105）
作者简介：颜庆云, 博士, 中山大学教授、博士生导师。2009年于中国科学院水生生物研究所获得博士学位; 2012年入选中国科学院青年创新促进会(第二批); 2013-2015年在美国环境基因组学研究所(IEG)从事博士后研究; 2016年以"****"急需青年杰出人才引进到中山大学。现任中国原生动物学会理事、中国生态学会微生物专业委员会委员、副秘书长。主要从事微生物生态学及环境微生物组学研究, 在水环境微生物群落构建机制及其对环境变化的响应, 以及鱼类肠道微生物形成、维持机制及生态系统功方面能取得了一系列成果。已在Nature Communications、Environmental Microbiology、Molecular Ecology、mBio等专业刊物发表论文38篇, 主持国家自然科学基金、中国科学院和中山大学人才项目等课题12项
*通信作者：颜庆云, Tel:+86-20-31561769;E-mail:yanqy6@mail.sysu.edu.cn
摘要：湿地生态系统是陆地上巨大的有机碳库，同时也是大气中甲烷（CH4）的主要排放源。由于CH4对全球的增温潜能是CO2的34倍，因此关于湿地CH4排放在全球气候变化中有关碳汇、碳源的研究具有极其重要的意义。全球80%-90%的CH4排放离不开微生物活动，湿地生态系统中产CH4菌和CH4氧化菌的种类组成、数量及功能与CH4通量密切相关，但基于湿地生态系统中介导CH4循环的功能微生物对甲烷排放通量的影响及作用机制研究相对比较分散。为更好地认识微生物介导的CH4排放过程的微生物调控机制，本文综述了湿地生态系统中参与CH4循环的功能微生物，对介导CH4循环相关微生物活性的影响因子进行了回顾，重点总结了湿地生态系统微生物介导的CH4排放机制，并对未来的相关研究方向进行了展望。由于湿地微生物介导的碳循环过程也可能决定了湿地生态系统对全球气候变暖的反馈，因此本文也能为全球气候变化研究提供微生物方面的参考。
关键词： 湿地 微生物 甲烷(CH4) 温室气体 全球变暖
Microbial driven methane emission mechanisms in wetland ecosystems
Hang Gu, Fanshu Xiao, Zhili He, Qingyun Yan
Environmental Microbiomics Research Center, School of Environmental Science and Engineering, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China
Received 5 November 2017; Revised 10 January 2018; Published online 24 January 2018
*Corresponding author: Qingyun Yan, Tel: +86-20-31561769; E-mail: yanqy6@mail.sysu.edu.cn
Abstract: Wetland is one of the largest carbon sink among all terrestrial ecosystems, and regarded as the main emission source of methane (CH4) in the atmosphere. As CH4 has 34 times warming potential of carbon dioxide (CO2)per mole, it is of great importance to study the contribution of wetland as carbon sink or carbon source to global climate change. Totally, 80% to 90% of CH4 emissions come from microbial activity, and CH4 flux in wetland is closely related to microbial composition, abundance and function of methanogens and methanotrophs. However, the studies on the effects and mechanisms of the functional microorganisms that control CH4 cycling in wetland ecosystem is relatively decentralized. To better understand the microbial regulation mechanism of CH4 emission process, we provide an overview of microbial community associated to CH4 cycling, the factors influencing the microbial methane emission activity, and the microbial methane emission mechanisms in wetland ecosystem. Besides, we indicate further research needs on microbial-driven CH4 emission and their potential response to climate change.
Key words: wetland microorganism methane (CH4) greenhouse gas global warming
全球气候变暖已广泛为大家所关注[1]，人类活动及自然排放的温室气体所产生的温室效应是目前公认的全球变暖的主要原因[2-3]。CH4是大气中仅次于CO2的第二大温室气体，其温室效应贡献率约为23%[4]。自工业革命以来，大气中CH4浓度已由0.72 μmol/mol (体积分数)上升到2012年的1.82 μmol/mol，是工业革命前的近2.5倍[5]。最近20年来，大气中CH4浓度的增加速率是CO2的100倍[6]，且大气甲烷浓度仍以每年1.0%-1.2%的速度在递增[7]。大气CH4来源可分为人为源和自然源，其中人为源约占三分之二，主要包括畜牧、稻田、采煤、油气工业、垃圾填埋以及生物质燃烧等，而湿地是CH4排放最主要的自然源[8]。
湿地被誉为“地球之肾”，是陆地上生物多样性最丰富且生产力最高的生态系统[9]。虽然全球湿地面积仅占陆地面积的4%-6%[10]，但湿地生态系统碳贮藏量占全球的20%-30%[11-12]，其储量约为770×108 t，占陆地生物圈碳素的35%，是全球最大的碳库[13]。湿地也一直被认为是大气CO2的重要碳汇[14]，湿地植物通过光合作用固定大量的CO2，而呼吸作用又释放一定量的CO2。植物地上部分和死根残留在沉积物中形成沉积有机质，一部分有机质经微生物分解再次以CO2的形式释放到大气中，而另一部分有机碳和无机碳在湿地中积累[15]。另一方面，由于湿地水体的厌氧环境，且拥有大量微生物，因此被固定的碳在湿地环境中会通过呼吸作用或微生物的分解作用再次释放到大气中，碳释放以CO2和CH4为主。由于湿地有机物的高储量，湿地生境是大气CH4的主要自然来源[16]，全世界每年约有11×1013 g CH4-C是来自湿地释放，湿地每年向大气中排放的CH4约占全球CH4排放总量的15%-30%，占全球自然源排放总量的75%[17-18]，因此湿地也扮演着CH4源的角色。2016年170多个国家共同签署《巴黎协定》，承诺将全球气温升高幅度控制在工业革命前的2 ℃范围之内，因此，湿地的碳源和碳汇功能研究成为全球气候变化研究关注的焦点。
湿地生态系统向大气排放CH4取决于其中产CH4古菌和CH4氧化菌活动的平衡。在厌氧条件下，有机物经过CH4菌的发酵作用产生CH4；而在有氧的条件下，CH4被CH4氧化菌氧化成CO2释放到大气中，近年来不同的厌氧甲烷氧化机制也不断被发现。CH4的好氧氧化被认为是湿地系统中CH4最主要的汇，该反应可氧化湿地中产生的50%以上的CH4[19]。产CH4菌和CH4氧化菌是介导湿地CH4循环的重要功能菌群，探索湿地生态系统中产CH4菌和CH4氧化菌的多样性和调控机制有助于深入认知湿地CH4代谢循环的微生物学机制，为最终有效调控湿地CH4代谢、减少CH4排放通量提供科学依据。为此，本文对湿地生态系统微生物介导的CH4排放机制进行了综述，并就湿地生态系统影响介导CH4循环微生物的因子进行了回顾。
1 湿地产甲烷菌及其影响机制 1.1 湿地甲烷产生原理 甲烷产生是严格的厌氧过程(图 1)，有机物质一般由3种不同的菌群通过以下步骤进行分解：(1)水解作用：复杂有机物质经水解发酵菌合成的水解酶作用转变成单糖类物质，并进一步发酵成脂肪酸、CO2和H2；(2)在产氢产乙酸菌作用下，脂肪酸氧化生成乙酸、CO2和H2；(3)乙酸、H2和CO2分别被乙酸型和氢型产甲烷古菌利用产生甲烷[20]。其中，同型产乙酸细菌也可将H2和CO2转变成乙酸，并由乙酸型产甲烷古菌转变成甲烷。东秀珠等[21]在青藏高原若尔盖湿地冻土中分离到1株专性嗜冷产甲烷古菌Methanolobus psychrophilus R15，研究表明该菌以甲醇、甲基硫化物为底物产生甲烷，即甲基化合物营养型产甲烷作用，而不是氢营养型或乙酸型产甲烷。Lang等[22]对白蚁肠道中富集培养的第七目产甲烷菌“Candidatus Methanoplasma termitum”进行基因组测序和生理实验表明，它们和专性甲基型产甲烷古菌不同点在于缺少将CO2还原为甲基辅酶M的完整路径，其正常生长需要通过额外添加H2以还原甲醇、甲胺、二甲胺等底物来产生甲烷，因此该菌既不是典型甲基型产甲烷古菌也不是氢型产甲烷古菌，属于两者的混合营养型。虽然以上菌种目前还没有被正式有效认可，但这将有助于进一步完善产甲烷菌的代谢途径研究。
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| 图 1 湿地甲烷产生原理和影响机制 Figure 1 The method and impact mechanism of methane production in wetland. a: fermenting bacteria; b: syntrophic bacteria; c: homoacetogenic bacteria; d: methanogens using H2 and CO2; e: methanogens using acetate; f: sulfate-reducing bacteria; g: denitrifying bacteria; h: Fe, Mn reducing bacteria. |
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目前已发现的产甲烷菌属于广古菌门(Euryarchaeota)，共由7个目组成，分别为甲烷火球菌目(Methanopyrales)、甲烷球菌目(Methanococcales)、甲烷杆菌目(Methanobacteriales)、甲烷微菌目(Methanomicrobiales)、甲烷八叠球菌目(Methanosarcinales)、甲烷胞菌目(Methanocellales)[23]和Methanoplasmatales[24]/Methanomassiliicoccales[25-26]。产甲烷的关键酶是甲基辅酶M还原酶MCR (Methyl coenzyme M reductase)，目前广泛使用mcrA作为鉴别产甲烷菌的功能基因，Dziewit等[27]设计测试了4种引物分别作用于产甲烷菌的标记基因mcrB和mcrG (存在于所有产甲烷菌)、mtaB和mtbA (只存在于甲基营养型产甲烷菌)，结果表明，基于mcrB和mcrG分子标记基因的高通量测序分辨率比mcrA高，将mcrB、mcrG、mcrA和16S rRNA分子标记基因联用使得复杂的产甲烷菌获得更全面的分类多样性信息，而mtaB和mtbA可特异性用于甲基营养型产甲烷菌的检测与分析。
不同湿地中产甲烷菌类型及产甲烷贡献率存在异质性，S?llinger等[28]在16个欧洲北部泥炭湿地系统中发现第七目产甲烷菌Methanomassiliicoccales也广泛分布，Methanomassiliicoccales是近几年在人类和动物肠道或瘤胃发现的新型产甲烷菌目，初步的数据显示其在湿地中占总产甲烷菌的丰度较低，因此不是湿地甲烷排放的主要贡献者。Zhang等[29]在中国青藏高原若尔盖泥炭沼泽发现了一类新的嗜低温产甲烷菌Zoige cluster Ⅰ，属于Methanosarcinales，占到产甲烷菌总量的30%，但是产甲烷能力相对较弱，此外Methanomicrobiales也是该湿地主要的产甲烷菌。Horn等[30]对德国中东部沼泽湿地的研究发现，该湿地不存在乙酸发酵型产甲烷菌，产甲烷菌主要为Methanomicrobiales和Methanobacteriaceae等，只能利用H2/CO2还原产甲烷。据报道湿地产甲烷菌主要利用H2/CO2还原产生甲烷[31-32]，也有人认为湿地产甲烷菌主要以乙酸发酵型产甲烷菌为主，其产生的甲烷占湿地甲烷总产生量的67%以上[20]。
此外，不同地区或相同地区不同植被下，产甲烷菌种类和甲烷产率也存在着较大异质性，主要是由于温度、底物、植物、pH和硫酸盐、硝酸盐、金属等环境因子的影响。
1.2 温度对湿地产甲烷菌的影响机制 温度通过影响产甲烷菌的代谢速率和底物供应，成为控制不同类型湿地生态系统甲烷排放的重要因子之一[33-34]。产甲烷菌对温度变化非常敏感，一般只能在0-35 ℃保持相对较高的活力，当然，也存在极端环境的产甲烷古菌，可分为嗜热菌(最适温度55 ℃左右)、极端嗜热菌(最适温度高于80 ℃)、嗜冷菌(最适温度低于0 ℃)[34]。由于酶的活性影响，产甲烷菌存在着功能发挥的最适生长温度，否则，产甲烷菌活性都会受到不同程度的抑制。Hoj等[35]研究了温度变化对湿地生态系统产甲烷菌群落结构和多样性的影响，结果表明，随着温度增高，产甲烷菌群多样性和数量增加，与此同时甲烷产率也相应地增加；而且温度越高，对温度变化不敏感的产甲烷菌成为优势菌群。Yvon-Durocher等[36]研究了湿地在季节性温度增加下，产甲烷菌产生更多的甲烷排放量，并指出全球变暖将使湿地贡献更多的温室气体从而成为不可忽视的甲烷排放源。Avery等[37]通过添加14C标记底物，发现美国北卡罗莱纳州White Oak河流沉积物中甲烷产生总速率、乙酸发酵产甲烷速率和氢营养型产甲烷速率均随着培养温度升高呈指数增长，表明CO2还原和乙酸发酵产甲烷都受控于温度。但是，也有研究认为，温度通过影响产甲烷底物供应，进而影响土壤产甲烷菌功能的发挥，例如Conrad[38]认为低温降低了产H2细菌的活性，而间接影响产甲烷菌的甲烷产生量，Saarnio等[39]认为低温限制了根系分泌物的分解，从而减少了产甲烷底物的供应，抑制了甲烷的产生和排放。
1.3 底物对湿地产甲烷菌的影响机制 产甲烷菌能够利用的底物十分有限，仅包括几种分子结构简单的小分子物质，如H2、CO2、乙酸盐、甲酸盐、甲基化合物(甲醇、甲胺、三甲胺以及二甲基硫)等[40]。充足的底物供应和适宜的产甲烷菌生长环境是甲烷产生的先决条件，Vizza等[41]在湿地沉积物中添加有机物后产甲烷量显著提高了75%；Lin等[42]发现，氢营养型产甲烷菌都存在于两种底物条件不同的沼泽湿地中，而乙酸型产甲烷菌只存在于其中一个湿地，证明了底物的不同可决定产甲烷菌的活性和甲烷产生途径。
1.4 植物对湿地产甲烷菌的影响机制 植物通过根系分泌物和植物残体为产甲烷菌提供底物，从而影响甲烷产生。Galand等[43]对芬兰中部不同植物类型沼泽甲烷产生途径和产甲烷菌多样性的研究发现，产甲烷菌群落差异的原因在很大程度上与植物类型有关。Malmer等[44]对维管束植物和泥炭藓植物进行研究表明，维管束植物根系较非通气组织的泥炭藓植物要发达，在土壤中分布也更深，根系可以穿透到厌氧层，将碳源如乙酸等输送到深部泥炭层，这类植物生长的泥炭湿地以乙酸发酵型产甲烷菌为主或两者同时存在。对于缺少维管束植物的泥炭湿地，由植物分泌的活性有机碳很少进入到泥炭土壤的厌氧层，仅有惰性而陈旧的泥炭可以用作产甲烷菌的底物，此类泥炭沼泽多以H2/CO2产甲烷途径产生CH4，为氢营养型产甲烷菌[32]。因此，不同的植被类型不同的生长特征对产甲烷菌群落有着直接的影响。
1.5 pH对湿地产甲烷菌的影响机制 大多数产甲烷菌最适pH为6.0-8.0，其在pH极端环境下仍存在较高的多样性，不同pH环境影响产甲烷古菌的代谢途径。Kotsyurbenko等[45]在西伯利亚泥炭湿地的研究发现，当pH从4.8降到3.8时，产甲烷菌由乙酸型代谢途径转变为氢营养型，且物种丰富度显著降低，这表明产甲烷菌对pH的变化相当敏感；Gorres等[46]在丹麦沼泽湿地土壤中发现，pH 3.2-4.4环境下未测到产甲烷菌，在pH 3.9-4.6土壤中检测到的产甲烷菌为氢营养型，而pH 5.0-5.3土壤中的产甲烷菌同时包括氢营养型和乙酸型，这说明产甲烷菌一方面对外界pH变化具有较强的敏感性，另一方面其对特定生境也具有一定的适应能力。
1.6 硫酸盐、硝酸盐、金属还原过程对湿地产甲烷菌的影响机制 湿地生态系统中，厌氧条件下微生物介导的还原过程还包括硫酸盐、硝酸盐、亚硝酸盐、金属还原等，它们与产甲烷菌都参与有机物的代谢过程，研究表明，湿地中产甲烷古菌丰度与硫酸盐、硝酸盐、金属还原相关微生物呈现负相关，主要是因为这些微生物通常与产甲烷古菌竞争利用乙酸、H2等底物，从而抑制产甲烷菌的生长[47]。(1)硫酸盐还原：Olsson等[8]对硫酸盐含量丰富的辽河三角洲海滨湿地研究发现，当硫酸盐浓度＞18×10-6μg/g时明显抑制CH4产生；Vizza等[41]在反应器中分别于潮汐盐水湿地和淡水湿地的沉积物中添加等量有机碳，结果潮汐湿地沉积物中产生的甲烷比淡水湿地少，主要是因为潮汐湿地中丰富的硫酸盐还原菌显著抑制了产甲烷菌的活性；(2)硝酸盐、亚硝酸盐还原：Kim等[48]研究发现，增加湿地沉积物中硝酸盐含量后，CH4产生量显著下降，同时nirS基因拷贝数逐渐增加，说明该湿地中反硝化菌在与产甲烷菌竞争底物的过程中占优势；(3) Mn(Ⅳ)、Fe(Ⅲ)还原：He等在美国California的湿地中发现随着沉积物深度增加Mn(Ⅱ)、Fe(Ⅱ)增加，产甲烷关键基因mcrA与调控金属还原酶的mtrB/pioB基因的丰富度呈负相关，Roden等[49]研究表明Fe还原菌比产甲烷古菌对乙酸具有更高的亲和力和竞争力。也有许多研究发现，在一些环境中甲烷产生的途径是以非竞争性机制为主，通过以非竞争性底物甲胺、三甲胺、甲醇和甲硫氨酸等作为碳源产生CH4，其他菌不能利用此类化合物[21, 28]。因此，此类条件下甲烷产生不仅包括竞争性底物乙酸发酵和H2/CO2还原途径，还包括非竞争性底物的氧化还原途径。
综上所述，目前有关天然湿地产甲烷菌种类、鉴定和分布多样性的研究已经比较广泛，但是对于决定产甲烷菌优势菌群和产生途径的作用机制尚不明确，有待深入研究。天然湿地产甲烷菌的甲烷产生量受到上述影响因子的限制时，是否与产甲烷菌群落结构或数量有关，也是目前值得研究的问题。
2 湿地甲烷氧化的微生物学原理 CH4的生物氧化主要可分为两大类型(图 2)：一类是在有氧条件下由微生物利用氧气作为电子受体将CH4氧化，CH4的好氧氧化被认为是湿地系统中CH4最主要的汇，该反应可氧化湿地土壤中产生的50%以上的CH4[19]。另一类是在厌氧条件下由微生物利用除氧气外的其他电子受体(如SO42-等)将CH4氧化。好氧甲烷氧化菌和厌氧甲烷氧化菌广泛分布在不同环境，它们能将CH4彻底氧化成CO2和水，是生态系统CH4排放的天然消减器。
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| 图 2 甲烷氧化原理 Figure 2 The theory of methane oxidation. Including the aerobic oxidation of methane in shallow water level, and the anaerobic oxidation of methane in deep water level. |
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甲烷氧化菌的特征酶是甲烷单加氧酶(Methane monooxygenase，MMO)，甲烷氧化菌通过MMO的作用下将甲烷氧化为有机酸等中间产物，并最终转化为CO2[50]。MMO有2种不同的类型：颗粒状或膜结合甲烷单加氧酶(Particulate methane monooxygenase，pMMO)和可溶性甲烷单加氧酶(Soluble methane monooxygenase，sMMO)，虽然它们在细胞内具有相似的功能，但这2种酶的基因或结构都不相同，几乎所有的甲烷氧化菌都能合成pMMO，但只有少数甲烷氧化菌属能产生sMMO[51]。因此，编码pMMO蛋白β亚基的pmoA基因被广泛应用于检测甲烷氧化菌群，但也有例外，Methylocella和Methyloferula不能合成pMMO，还应选择编码sMMO的α亚基的mmoX基因来检测环境中的这两类甲烷氧化菌[52]。
2.1 甲烷好氧氧化 甲烷好氧氧化菌目前发现主要由变形细菌门(Proteobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia)组成。根据细胞的内膜结构、磷脂脂肪酸成分和碳同化途径等可将甲烷氧化菌分成3大类：第1类是Ⅰ型菌和Ⅹ型菌，属于γ变形菌纲。第2类是Ⅱ型菌，属于α变形菌纲[53]。Ⅰ型菌具有扁平型的细胞内膜，附着颗粒型甲烷单加氧酶pMMO，在细胞内膜上利用5-磷酸核酮糖同化途径(RuMP)进行甲烷的氧化；Ⅱ型菌除了Methylocella以外，不具备完整的细胞内膜，附着可溶性甲烷单加氧酶sMMO，在细胞内膜及周质空间利用丝氨酸同化途径实现甲烷氧化[54-55]；有研究发现Ⅰ型氧化菌主要分布在湿地植物的根际和表层土，而Ⅱ型菌则在下层无氧区域占优势[56-57]，不少研究也表明Ⅱ型菌更能适应低氧环境[58]。第3类即疣微菌门，主要来自于嗜热嗜酸的极端环境中，研究发现其不形成细胞内膜，利用颗粒型甲烷单加氧酶pMMO先将CH4转化成CO2，再利用卡尔文循环同化CO2[59-61]。
2.2 甲烷厌氧氧化 甲烷厌氧氧化(Anaerobic oxidation of methane，AOM)是在厌氧条件下由微生物利用除氧气外的其他电子受体(如SO42-等)将甲烷氧化的过程。这也是目前研究的热点，有研究认为该过程是一种被忽视的甲烷汇，Segarra等[62]在淡水湿地研究中发现厌氧甲烷氧化可减少50%以上的CH4排放。目前已知的厌氧甲烷氧化过程主要有3类。第1类是硫酸盐型厌氧甲烷氧化(Sulphate-dependent anaerobic methane oxidation，SAMO)：1999年，DeLong团队[63]首次发现古菌催化了海底沉积物的厌氧甲烷氧化，并采用次级离子质谱技术(SIMS)证实该厌氧甲烷氧化过程是在甲烷氧化古菌(Anaerobic methanotrophic archaea，ANME)和硫酸盐还原菌的协同驱动下以SO42-为电子受体完成的[64]，2012年，Milucka发现ANME-2具备独立完成硫酸盐还原和甲烷氧化两个过程的能力[65]。第2类是反硝化型厌氧甲烷氧化(Denitrification dependent anaerobic methane oxidation，DAMO)：2006年，Raghoebarsing等[66]利用同位素示踪试验证实CH4的氧化可耦合亚硝酸盐的还原，此生物过程被称之为亚硝酸盐还原型甲烷厌氧氧化，2008年，Ettwing等[67]发现在该厌氧氧化体系中不存在古菌时，DAMO速率并没有下降，并发现亚硝酸盐还原型甲烷厌氧氧化过程的主导微生物是NC10细菌门的Candidatus Methylomirabilis oxyfera，进一步的基因组分析和实验证明M. oxyfera通过内部供氧途径从而能够在厌氧环境中不依靠光合作用就能产生分子O2，从而实现厌氧甲烷氧化[68-70]，然而有研究发现高浓度的NO2-对M. oxyfera有毒性作用[71]；2009年，Hu等[72]在高浓度硝酸盐培养体系中，NC10菌群与古菌混合培养对NO3-的还原率是只含NC10菌群的30倍，由此得出硝酸盐还原型甲烷氧化途径，且主要是由古菌主导的，随后Haroon等[73]证实了古菌ANME-2d能够利用NO3-作为最终电子受体独自实现整个AOM过程。第3类是金属元素还原型甲烷厌氧氧化途径(M-DAMO)：2009年，Beal等[74]在湖泊沉积物中发现微生物利用Mn4+和Fe3+作为电子受体厌氧氧化CH4，随后，Fu等[75]将DAMO菌和Shewanella oneidensis MR-1菌富集培养，发现铁矿减少42%-88%，同位素实验证实DAMO细菌和S. oneidensis MR-1菌耦合的铁还原过程13CH4反应生成了13CO2，目前以铁锰氧化物作为电子受体的AOM代谢机制尚不清楚，是AOM菌或者铁锰还原菌独立完成M-DAMO过程，还是两种微生物协同共生一起完成该过程仍需验证。除了上述3种外，2017年，Valenzuela等[16]在排除硫酸盐、硝酸盐、亚硝酸盐和金属还原的情况下，利用同位素实验表明甲烷厌氧氧化菌耦合自然有机物腐殖质的还原，并通过16S rRNA测序证明了厌氧甲烷氧化菌是耦合自然有机物还原的主要微生物。
以上厌氧甲烷氧化反应可以用化学方程式表述为：
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3 影响湿地CH4总排放的环境因素 3.1 水文条件 湿地水位的高低决定了湿地的氧气环境，主要是因为其影响湿地的氧气含量与植物的通气组织，进而影响CH4的排放。Henneberg等[83]研究表明，高水位时湿地比低水位释放更多甲烷，且在低水位时种植植物比未种植植物释放更多甲烷；沙晨燕等[84]采用静态箱法研究美国俄亥俄州哥伦布市Olentangy河湿地研究中心的4种不同类人工湿地的甲烷排放量，结果发现深水区比起交错区的CH4排放量更高；Mander等[85]对水平潜流人工湿地的温室气体排放随水位变化进行了3年研究，结果显示水位越高甲烷排放通量越大。因此，湿地的水位是决定湿地成为甲烷汇还是甲烷源的重要因素之一。
3.2 植物 植物作为湿地CH4产生底物的重要提供者影响湿地系统的碳吸收、排放过程。其提供的底物类型包括植株凋落物、根的分泌物与脱落物3种形式，底物的丰富度直接决定了微生物和土壤酶功能的发挥。Kankaala等[86]对某芦苇型湿地进行3年的跟踪研究表明，随着季节的不同，CH4的排放与植被生物量密切相关，夏季时，较高的植被生物量影响到CH4的排放，因为植物由于根部腐烂和分泌物所产生的有机物质对产CH4菌来说可作为营养基质。另外，植被既可以加速也可以减缓甲烷的释放，湿地植物提供“通气组织”将O2传输至植物根际，促进微氧环境甲烷的氧化作用，另一方面植物组织又可以避开有氧土层将厌氧环境产生的甲烷直接转运到大气[87]，有研究报道湿地土壤中大部分甲烷(50%-90%)是通过植物传输到大气中的[88]。不同植物种类所组成的不同湿地类型CH4排放通量方面存在着较大差别，对于传输能力较差的植物，植物体将O2传输到根围的输入量较少，从而减弱根围和根茎部分甲烷氧化菌对于CH4的氧化，使得CH4排放通量增加，而通气组织较强的植物如维管植物因其可为CH4排放提供通道，此类湿地甲烷排放量较大，因此Bubier等[89]认为湿地中某些维管植物的存在对高的甲烷排放通量具有指示作用。
3.3 温度 温度在CH4产生和排放中起着非常重要的作用，温度变化直接影响微生物的活动[90]。相对较高的夏季温度不仅能够提高产CH4菌的活动能力，而且由于快速的氧气消耗影响到氧化菌的活动能力，因此温度升高可提高CH4排放量[33]。Siciliano等[90]对加拿大某山谷泥炭地研究发现，25 ℃相比15 ℃时CH4排放浓度增加了133%，且微生物产甲烷菌群显著增加；Hoj等[35]对挪威高纬度北极泥沼地研究也发现，随着温度的增加产甲烷古菌的多样性和丰度会增加，导致甲烷产生速率的明显增加。但是也有研究认为目前所有有关环境变量对甲烷产生和氧化速率的研究只局限于短期的影响，不同时空条件下也会出现不同的结果，例如Metje等[91]对西伯利亚冻原泥沼研究表明，产甲烷古菌种群结构在较宽泛的温度波动范围内维持不变。
3.4 湿地类型 不同类型湿地生态系统中CH4排放量存在着差异。在若尔盖高原湿地生长季节，CH4排放有较大的空间变异，湖滨湿地CH4平均排放量为11.95 mg/(m2·h)，其次为宽谷湿地，CH4排放量为2.12 mg/(m2·h)；河岸湿地表现为CH4吸收, 其吸收量为0.007 mg/(m2·h)[92]。在爱沙尼亚的两种不同类型的废水处理微型人工湿地，即水平式潜流人工湿地(HSSF)和垂直式潜流人工湿地(VSSF)中，CH4的排放量分别为CH4-C 31-12100 μg/(m2·h)和CH4-C 950-5750 μg/(m2·h)[93]。在德国西南部的研究发现湖滨湿地CH4排放是宽谷湿地的5.5倍[94]。这些差异可能是由于环境因子的空间异质性，例如沉积物结构、大型植被分布、营养物质供给和土壤供养程度等[95]。
4 总结和展望 湿地生态系统对于水生和陆地生态系统均具有非常重要的意义，在维护区域生态平衡和保护生物多样性等方面具有不可或缺的作用。在本团队之前参与的研究中，应用GeoChip了解了河口湿地碳循环基因及微生物群落，甲烷代谢、碳的降解和固定过程构成了湿地碳循环的关键过程[96]；另一方面，针对气候变暖的研究发现厌氧环境中产甲烷菌对气候变暖的反馈为mcrA基因增加，好氧环境中甲烷氧化菌pmoA也增加的动态演替过程[97]。产甲烷菌的产甲烷菌全球变暖使湿地CH4排放对全球气候变暖的贡献不容忽视，为揭示不同环境中CH4产生、氧化过程，探讨起关键作用的微生物种类和生理生态功能，所开展的相关研究发现了一系列新型产CH4古菌和CH4氧化菌，在揭示其特殊的生态机制中也取得了一些重要进展。这些创新性成果的发现得益于微生物研究方法和技术的不断发展和更新，但未来还需要在以下研究方向深入探究。
(1) 湿地中CH4产生和氧化微生物适应环境变化(如气候变暖、底物输入)的机理研究及其在N、S、金属等循环中参与氧化还原的微生物间的相互作用；
(2) 湿地中产CH4菌和CH4氧化菌群落的时空异质性及其在不同时空尺度CH4排放通量的贡献；
(3) 甲烷产生和氧化微生物的新型菌群、代谢途径和甲烷排放调控。能常规分离培养的微生物种类不足实际总量的1%，这暗示环境中可能仍存在大量未知的CH4产生和氧化微生物。新型微生物种类极有可能拥有新的代谢途径，包括全新的甲烷产生和氧化途径以及微生物种间相互作用关系。
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