占迪1, 何环1
, 廖远松1, 赵尚明1, 姚菁华1, 肖栋2, 唐俊3, 陶秀祥1 1.中国矿业大学化工学院, 煤炭加工与高效洁净利用教育部重点实验室, 江苏 徐州 221116;
2.中国矿业大学煤炭资源与安全开采国家重点实验室, 江苏 徐州 221116;
3.中国矿业大学安全学院, 江苏 徐州 221116
收稿日期：2017-09-15；修回日期：2017-12-10；网络出版日期：2018-01-24
基金项目：国家自然科学基金（51404259）；江苏省自然科学基金（BK20150181）
作者简介：何环, 博士, 中国矿业大学生物工程系副教授, 硕士生导师。2009年毕业于中南大学获微生物学博士学位。研究方向:煤炭清洁利用、矿区生态修复, 在煤炭生物液化和气化、煤矿瓦斯的微生物降解、煤炭生物脱硫、煤矿区重金属污染治理方面取得系列研究成果。先后主持了国家自然科学基金, 江苏省自然科学基金等研究课题, 已在Fuel、Fuel Processing Technology、Energy & Fuel、Bioresource、Applied Energy等期刊上发表论文40余篇
*通信作者：何环, Tel:+86-516-83591059;E-mail:hehuan6819@126.com
摘要：[目的]以白音华褐煤为底物，利用从我国多地煤矿及污水处理厌氧罐中富集-混合-驯化得到的高效混合菌群进行产气，分析其群落组成并优化产气条件。[方法]采用Miseq高通量测序分析混合菌群结构，通过Plackett-Burman（P-B）和Box-Behnken（B-B）试验对褐煤产气影响因素和条件进行筛选和优化。[结果]本源和外源微生物样本混合样品（HN+MD+WT）经驯化后菌群产气效率最高。该样品菌群中细菌群落多样性丰富，以变形菌门的脱硫弧菌属Desulfovibrio（15.07%）、拟杆菌门的屠场杆状菌属Macellibacteroides（14.6%）、厚壁菌门的梭菌属Clostridiaceae（9.77%）、互营菌门的脱硫代硫酸盐弧菌属Dethiosulfovibrio（8.76%）以及热袍菌门Oceanotoga属（8.66%）为主。古菌全部为广古菌门，其群落多样性则较为单一，其中甲烷卵圆形菌属Methanocalculus（80.28%）占据绝对优势。Plackett-Burman（P-B）试验结果表明温度、CoCl2添加量和NiCl2添加量是影响褐煤产气的关键因素；Box-Behnken（B-B）试验结果表明最优产气条件为：温度36，CoCl2添加量0.17 g/L，NiCl2添加量0.02 g/L，最优条件下褐煤累计产甲烷量（周期20 d）达到159.33μmol/g。[结论]经过驯化可以得到高效的产气菌群，优化培养条件可使产气效率明显提高。
关键词： 褐煤 生物强化产气 微生物群落分析 产气条件优化
Community structure analysis of methanogenic flora and optimization for bioaugmentation methane generation from lignite
Di Zhan1, Huan He1
, Yuansong Liao1, Shangming Zhao1, Jinghua Yao1, Dong Xiao2, Jun Tang3, Xiuxiang Tao1 1.Key Laboratory of Coal Processing & Efficient Utilization, Ministry of Education, School of Chemical Engineering, China University of Mining and Technology, Xuzhou 221116, Jiangsu Province, China;
2.State Key Laboratory of Coal Resources and Safety Mining, China University of Mining and Technology, Xuzhou 221116, Jiangsu Province, China;
3.School of Safety Engineering, China University of Mining and Technology, Xuzhou 221116, Jiangsu Province, China
Received 15 September 2017; Revised 10 December 2017; Published online 24 January 2018
*Corresponding author: Huan He, Tel: +86-516-83591059; E-mail: hehuan6819@126.com
Supported by the National Natural Science Foundation of China (51404259) and by the Natural Science Fund of Jiangsu Province (BK20150181)
Abstract: [Objective]The mixed methanogenic flora with high methane production from Baiyinhua lignite was obtained from several coalmines and an anaerobic polluted water processing tank by enrichment, mixture and domestication. The community structure was analyzed and its methane production condition from lignite was optimized.[Methods]The community structure was analyzed by Miseq high-throughput sequencing. Plackett-Burman and Box-Behnken tests were conducted to screen and optimize the main factors influencing the efficiency of methane production.[Results]The mixed flora (HN+MD+WT) combined with indigenous and exogenous microbial culture produced the highest methane after domestication. The diversity of bacterial community was abundant, in which the dominant portion was Desulfovibrio (belong to proteobacteria, 15.07%), Macellibacteroides (belong to bacteroidetes, 14.6%), Clostridiaceae (belong to Firmicutes, 9.77%), Dethiosulfovibrio (belong to Synergistetes, 8.76%) and Oceanotoga (belong to thermotogae, 8.66%). All the archaea were assigned to Euryarchaeota, and its diversity was single comparatively. Methanocalculus (80.28%) was the most dominant genus. Plackett-Burman test results indicated temperature, concentrations of CoCl2and NiCl2 were the most important influencing factors. Box-Behnken test results showed that the optimal conditions were as follows:temperature 36℃, CoCl2 concentration 0.17 g/L, NiCl2 concentration 0.02 g/L, under which the methane accumulation is up to 159.3 μmol/g (20 d).[Conclusion]A mixed flora with high methane production could be obtained by domestication. The productivity of methane could be enhanced significantly by optimizing the culture condition.
Key words: lignite bioaugmentation methane production microbial community analysis condition optimization of biomethane generation
煤层气是一种优质的清洁能源，在世界能源结构中占有重要地位，也是当前国家大力提倡开发的新能源。大量研究表明，已开发的煤层气资源中有近20%的甲烷气由微生物产生，这在世界范围内得到广泛关注，微生物促产煤层气(microbially enhanced CBM，MECBM)也成为煤炭洁净利用领域研究热点[1]。研究表明，煤化程度较低的煤如褐煤，由于其水分、灰分和挥发分含量高、热值低，且腐植酸含量较多，故直接燃烧效益不高。但是这些煤中氧含量及侧链官能团较多，适合微生物利用，为生物产气提供了物质基础[2]。褐煤的厌氧降解产气过程是由发酵水解细菌、产氢产乙酸菌、产甲烷菌等多种功能微生物协同完成。按其来源，其中功能微生物分为煤层环境中的本源厌氧微生物和来自沼气池、农田土壤等非煤层环境中的外源厌氧微生物[3]。目前研究表明，本源和外源厌氧降解微生物都可以利用褐煤进行生物产气[4]。Green等[5]从粉河盆地煤层水富集的产甲烷菌群中进行模拟产气试验，显著提高了甲烷产气量。王宝玉等[6]用煤对沼液中菌群进行驯化，发现驯化后的菌群也能利用煤产气。林海等[7]从含氧低的污泥中富集厌氧产气菌群，发现这些厌氧微生物也可利用褐煤产气，并且当菌种经褐煤驯化后，产气量提高近30%，产气周期也大幅缩短。然而，煤的微生物产气效率低，通常需要数月才能得到少量甲烷。故有****通过调节产气环境，利用化学试剂来提高产气效率。nal等发现适当添加微量元素(Fe、Ni、Co、Mo、Zn、Mn、B和Cu)能够增强产甲烷菌活性和提高甲烷生成量，而微量或是过量都会使甲烷产量减少[8]。苏现波等[9-11]研究了盐度、pH、温度、氧化还原电位、微量元素和关键营养物质添加量对产甲烷的影响，发现菌群的生长状况、关键酶的活性和煤的性质均会随这些因素的改变而发生变化。王艳婷等[12]通过单因素和正交试验对几个可能影响褐煤生物产气的理化因素进行筛选，结果表明温度、pH、NaCl浓度、煤浆浓度4个因素对褐煤产气影响较为显著，而煤粉粒度影响相对较弱。有报道表明煤的熟化程度也会对生物产气具有影响，这可能与煤可被微生物利用的有机物质多少有关，煤熟化程度越低，有机质含量越高，其产气量也越多[13-14]。目前已有相当数量的关于外源和本源菌产气报道，然而由于两者所处环境不同，其菌群结构也存在差异，所以作者考虑将两者混合，这可能发挥其优势互补作用，而至今仍鲜有关于外源和本源混合菌群产气的报道。另外，虽然有关煤生物产气影响因素的报道较多，但没有****广泛考虑众多因素的整体影响。本研究从煤矿原位煤层水样和外源污水处理中厌氧罐水样中分别富集产甲烷菌群并混合，利用褐煤对混合菌群进行连续驯化产气，得到驯化后菌群，利用Miseq高通量测序方法分析群落组成并通过P-B和B-B响应面试验综合筛选关键影响因素并优化产气条件，以期通过本文为今后混合菌群产气的研究提供初步依据。
1 材料和方法 1.1 煤样 煤样取自我国内蒙古白音华煤田中西部，属白音华盆地水文地质单元的西南部分。褐煤元素分析和工业分析结果见表 1，其中可溶小分子有机质组分主要是C6-25的烷烃和芳烃，且含有较多的羟基、羰基、醚键等极性集团[15]。依据本实验室对产气过程中褐煤粒度的单因素实验研究[11]，将褐煤样本经破碎后筛分至80目(180 μm)和120目(120 μm) 2个不同粒度，筛分后煤样经80 ℃真空干燥24 h后，放入干燥器保存以备用。
表 1. 褐煤元素分析和工业分析 Table 1. Elemental and industrial analysis of lignite (%)
| Aanlytic method | Ultimate analysis | Proximate analysis | ||||||||
| Composition | W(C) | W(H) | W(O) | W(N) | W(St) | Mad | Aad | Vdaf | FCdaf | |
| Content/% | 78.02 | 7.21 | 11.98 | 1.82 | 0.97 | 11.88 | 27.47 | 52.32 | 47.68 | |
| W(C), W(H), W(O), W(N) and W(St) represents the weight of C, H, O, N and total S respectively; M, A, V, FC, ad and daf represents moisture, ash, volatiles, fixed carbon, air dried base and dried ash free base respectively. | ||||||||||
表选项
1.2 产甲烷菌群富集和驯化 产甲烷菌群富集原始样品采集自安徽淮南张集一矿的煤和煤层水(该煤矿瓦斯浓度较高，编号HN)、内蒙古蒙东(褐煤主要产区，编号MD)煤层水及徐州万通酱油厂污水处理厌氧罐水样(编号WT)。产甲烷菌群富集中所用基本培养基、还原基质、微量元素和维生素如下，所有接种操作均在厌氧培养箱(上海跃进，YQX-Ⅱ型)中完成。
基本培养基(g/L)：MgCl2 0.1，KCl 0.2，NaCl 2.0，NH4Cl 1.0，KH2PO4 0.4，CH3COONa 5.0，HCOONa 5.0，酵母膏1.0；补充溶液为：刃天青(0.1%) 1 mL/L，微量元素10 mL/L，维生素溶液10 mL/L。
褐煤产气培养基：从基本培养基中去除碳源CH3COONa和HCOONa。用于驯化培养和优化试验。
还原基质(g/L)：L-半胱氨酸盐酸盐0.5，NaHCO3 1.0，Na2S·9H2O 0.5。
微量元素(g/L)：N(CH2COOH)3 1.5，NaCl 1.00，MgSO4·7H2O 3.00，CoCl2 0.18，MnSO4·H2O 0.50，CaCl2·2H2O 0.10，ZnSO4·7H2O 0.18，FeSO4·7H2O 0.10，Na2MoO4·2H2O 0.01，KAl(SO4)2·12H2O 0.02，NiCl2·6H2O 0.03，CuSO4·5H2O 0.01，H3BO3 0.01。
维生素(mg/L)：生物素2，泛酸钙5，盐酸吡哆醇10，硫胺素5，核黄素5，叶酸2，对氨基苯甲酸5，烟酸5，硫辛酸5，钴胺素0.1。
产甲烷菌群富集培养过程：在500 mL厌氧培养瓶中加入300 mL上述培养基，按等体积比将原始样液进行混合(两两混合为15:15 mL；三者混合为10:10:10 mL)，接种30 mL样品后置于35 ℃恒温摇床培养30 d，利用气相色谱仪(安捷伦，6890N)分析产甲烷量。
产甲烷菌群的驯化：在500 mL厌氧培养瓶中加入300 mL褐煤产气培养基，并加入10 g煤样作为碳源，煮沸驱氧，灭菌，并用还原基质保持其还原态，将富集培养物30 mL接种到培养瓶中，置于35 ℃恒温摇床(120 r/min)培养30 d，并设置3组平行试验。每隔5 d，用气相色谱仪(安捷伦，6890N)测量甲烷产量。经3次连续传代驯化后，发现30 d内甲烷总产量同第2次驯化相比不再增加，于是认为所得培养物为充分驯化的产甲烷混合菌群。
1.3 产甲烷混合菌群群落组成分析 通过比较混合菌群产气效率，对其中产气效率最高的菌群群落多样性进行分析。取经驯化后产气最高的培养液20 mL，并在10000 r/min、4 ℃离心20 min，去上清液，沉淀用于DNA提取。按照DNA提取和纯化试剂盒(E.Z.N.A. Soil DNA Kit和Gel Extraction Kit，Omega Corporation，USA)程序得到约3 mg DNA样本，然后用干冰冻存后寄往上海美吉生物医药科技有限公司Illumina MiSeq平台进行高通量测序，细菌和古菌的16S rDNA-V4PCR扩增和测序引物序列如表 2所示。原始下机序列利用Mothur (version 1.3，http://www.mothur.org/，USA)软件去除非特异性序列片段、重复序列及包含模糊碱基和单碱基高重复区的序列，最终获得高质量的序列集。上述获取的优化序列通过Mothur软件进行操作分类单元(Operational taxonomic unit，OTU)聚类并构建OTU数据集。按照文献[16]中方法得到OTU的物种和丰度组成。为了确定驯化后产甲烷菌群中最佳物种分类水平，根据测序结果我们从不同分类水平上对样本中的细菌和古菌的分布情况做了统计，其中细菌和古菌均从门和属2个水平分析。利用Mothur计算了样本Alpha多样性(Alpha diversity)，包括Chao1值、ACE值、Shannon以及Simpson指数。
表 2. 细菌和古菌的16S r DNA-V4区PCR扩增引物及序列 Table 2. PCR amplified primers and sequences of bacteria and archaea
| Type | Primer | Sequencing end | Primer order of sequencing end | Non-sequencing end | Primer order of non-sequencing end |
| Bacteria | 16S 338F_806R | 338F | ACTCCTACGG GAGGCAGCAG | 806R | GGACTACHVG GGTWTCTAAT |
| Archaea | 16S 5248F_958R | 524F_10_ext | TGYCAGCCG CCGCGGTAA | Arch958R_mod | YCCGGCGTTG AVTCCAATT |
表选项
1.4 Plackett-Burman试验(P-B，筛选试验设计)和Box-Behnken试验(B-B，响应面试验设计) 利用P-B试验从温度、pH、煤粒度、煤添加量、盐度、镍离子浓度、钴离子浓度、转速、接种量8个因素中筛选出影响甲烷产气的关键因素。每个试验组做3个平行样，响应值为培养20 d的产甲烷量(μmol/g)，结果取平均值。其中因素P值小于0.05的认为是显著，即关键因素。对P-B试验筛选得到甲烷产气的关键影响因素进行B-B试验并通过响应面分析得到最优的甲烷产气条件和最优条件下产甲烷量的预测值。
1.5 产甲烷量分析 利用气相色谱仪(安捷伦，6890N)分析气体中甲烷峰面积，通过标准曲线将所测峰面积换算成为甲烷量，即为实测甲烷量n1，单位质量褐煤产甲烷量Mz由公式(1)计算得到。
 | 公式(1) |
2 结果和讨论 2.1 产甲烷混合菌群的富集和驯化 图 1为产甲烷混合菌群产气量随时间变化曲线，可以看出3种混合菌(HN+MD+WT)产气量最大(101.35 μmol/g，30 d)，且驯化使产甲烷量明显提高(28.4%)。外源和本源富集菌群两两混合后褐煤的最终产气量也均高于单一样本产气量。一般认为，本源菌具有较好的对煤的适应能力，所以其产气效率会高于外源菌群，但实际上外源菌群加入可以促进本源菌甚至优于单一本源菌进行产气[17-18]，本研究中厌氧罐中样本(WT)的产气量也高于其他2个原位富集样本。然而，根据WT产气率高于2个HN和MD的现象，且文献表明产甲烷功能微生物初期只能利用煤中可溶性小分子进行厌氧产气[19-20]，可以推测厌氧罐中富集菌群可能含有较多产甲烷菌群，所以在初期能够快速利用溶解的小分子有机物进行产甲烷，因此使得其对本源菌群有较好的促进作用。整体上而言，富集菌群利用褐煤产气大致也存在类似的3个阶段[7, 20]，前10 d为产气潜伏期，产气量缓慢增长；10-25 d为产气增长期，产气量大量累积；25 d以后为产气减缓期，除HN外，其他样本产气量仍维持增长，但增长速度明显减缓。综合考虑，在后续的优化试验中选取淮南、蒙东和万通厌氧污水处理反应器样本中富集出来微生物混合驯化培养物(HN+MD+WT) 20 d产甲烷量作为响应值来筛选因素并优化其最佳培养条件，并利用高通量测序技术对该菌群组成进行了分析。
 |
| 图 1 富集和驯化的不同菌群培养物利用褐煤产甲烷量 Figure 1 Methane production with different enriched and domestication culture. |
| 图选项 |
2.2 产甲烷混合菌群群落组成分析 迄今国内外关于煤层气田原位微生物多样性报道较多，主要用到技术有16S rDNA克隆文库[21]和高通量测序[16, 22]方法，由于近年来高通量测序技术迅速发展，其能够全面、准确和深入了解微生物群落信息，已成为时下研究煤层气田原位微生物最热门的手段。从表 3可以看出得到混合菌群(HN+MD+WT)中细菌和古菌的覆盖率都达到了99.9%以上，表明测序结果能够覆盖样品中绝大多数的微生物群落组成信息。OTU个数细菌群落统计为105，古菌群落统计为8；Shannon指数和Simpson指数是用来估算样品中微生物的多样性指标，Shannon指数越大表明群落多样性越丰富，Simpson指数越小表明群落多样性越丰富[23]，因此，此混合菌群中细菌群落多样性丰富而古菌中群落多样性较为单一。
表 3. 群落多样性及丰富性指数统计 Table 3. The community diversity and abundance index
| Type | Total sequence number | OUT number | Ace index | Chao index | Coverage rate/% | Shannon index | Simpson index |
| Bacteria | 17611 | 105 | 114 | 116 | 99.93 | 2.96 | 0.1087 |
| Archaea | 25300 | 8 | 0 | 8 | 100.00 | 0.81 | 0.6539 |
表选项
由图 2-A可知原始混合菌群中主要优势细菌菌门包括拟杆菌门(Bacteroidetes，26.19%)、厚壁菌门(Firmicutes，24.75%)、变形菌门(Proteobacteria，15.07%)、互养菌门(Synergistetes，13.36%)、热袍菌门(Thermotogae，8.66%)以及螺旋菌门(Spirochaetae，6%)，其中还检测到低丰度的脱铁杆菌门Deferribacteres (2.77%)和Cloacimonetes (2.71%)等。从图 2-B细菌属水平上群落丰度分析可以发现变形菌门的脱硫弧菌属Desulfovibrio(15.07%)是该富集样本中丰度最高的微生物，它们主要参与芳香烃的降解、体系的反硝化反应等[6, 24]。
 |
| 图 2 细菌和古菌在门和属水平上的群落组成分析 Figure 2 Community composition analysis of mixed flora at phylum and genus level. Chart A, B: bacteria; chart C, D: archaea. |
| 图选项 |
厚壁菌门中的微生物主要参与一些混合酸、醇和中性物质的生成，其中的梭菌科Clostridiaceae (9.77%)在一些淀粉、纤维质、几丁质等的解聚中扮演重要角色[24]。拟杆菌门在沉积物中较常见，是一大类化能自养型微生物，混合样本中属于该门的微生物主要有屠场杆状菌属Macellibacteroides (14.6%)，Mariniphaga属(3.65%)，Proteiniphilum属(3.49%)和东方龙细菌属Draconibacterium (2.21%)，它们主要参与大分子如蛋白质、糖、纤维素等的降解，发酵成为甲酸、氢气和二氧化碳[25-26]。螺旋体门Sphaerochaeta属(6%)相对丰度并不高，但是有报道表明该属可降解碳水化合物产生乙醇、乙酸、乳酸、氢气和二氧化碳，是煤大分子降解中的主要功能菌属[27]。混合样品中属于互养菌门中的微生物分别有胺小杆菌属Aminobacterium (3.45%)、产氢产乙酸菌属Sedimentibacter (2.64%)、脱硫代硫酸盐弧菌属Dethiosulfovibrio (8.76%)和Synergistaceae (1.15%)，它们是厌氧系统中重要的氨基酸降解和产氢产乙酸的功能细菌，该类微生物在连接发酵型细菌和产甲烷菌中起重要作用[28-29]。脱铁杆菌门是一类通过专性或兼性厌氧代谢获得能量的细菌，可利用多种电子受体，该门中的地弧菌属Geovibrio (2.77%)据报道是降解丙酮生成甲烷的混合培养微生物中的主要种属[30]。
热孢菌门在微生物促采煤层中的应用有过报道，其功能可能主要是参与大分子的发酵降解[31]，混合样品属于该门微生物Oceanotoga属(8.66%)，在用生物乙醇废料作为底物的高温生物反应器中也有发现报道[32]，但是在生物产煤层气中具体功能不太清楚。
产甲烷菌代谢类型主要有氢营养型、乙酸营养型、甲基营养型和混合营养型，以及最新报道可用甲氧基的芳香族化合物来直接产甲烷[33-34]。从分类学上产甲烷菌又可以被分为甲烷杆菌纲(Methanobacteria)、甲烷球菌纲(Methanococci)、甲烷微菌纲(Methanomicrobia)和甲烷火菌纲(Methanopyri) 4个纲7个目，这些类型产甲烷菌在生物煤层气体系中均有报道[2, 24, 33]。由图 2-C可知原始混合菌群中古菌主要为广古菌门(Euryarchaeota)，从属水平分析(图 2-D)可以发现群落中甲烷微球目的甲烷卵圆形菌属(Methanocalculus，80.28%)占据绝对优势，热原体目某属(Thermoplasmatales_norank，10.58%)其次，还有丰度很低的甲烷微菌目某属Methanomicrobiaceae_uncultured (4.33%)。另外，甲烷八叠球菌目的甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)和嗜甲基产甲烷菌属(Methanomethylovorans)分别占2.83%和0.74%。其中Methanocalculus属在中性偏碱条件下生长最快，大部分已报到的该属产甲烷古菌主要分布在盐湖、油水井和海洋沉积物中，利用H2/CO2，大部分也可以利用甲酸盐作为电子供体来还原CO2，部分利用二级醇/CO2生长[35]。Thermoplasmatales是产甲烷古菌中新分类的目，它们可以利用H2/甲醇和甲胺类化合物生长产甲烷[35]。Methanomicrobiaceae属于甲烷微菌球纲，该纲是目前产甲烷古菌研究报道最多的微生物，有4目、9科、25属，都可以利用H2/CO2，大部分也可以利用甲酸盐作为电子供体来还原CO2，部分利用二级醇/CO2生长[33, 35]。甲烷八叠球菌目是形态最丰富的一个目，在自然界分布广泛，能够利用乙酸、CO2、甲醇、甲胺、甲基硫化物等多种有机或无机化合物为底物产生甲烷[35-36]。通过与文献比较分析发现，本研究中富集到的菌群中产甲烷古菌的代谢类型多样，均能够利用有机小分子来产甲烷，所以推测这有可能与外源菌群(WT)中富含该类型产甲烷菌有关，所以该富集样本能够对本源菌产气有促进作用，具体原因还有待进一步分析。
2.3 P-B试验筛选混合菌群产甲烷气关键影响因素 大量研究表明，各种物化和生物因素都会从不同方面影响煤的生物产气效果[8-13]。如从产气底物分析，煤粒度和煤添加量的不同导致菌群和煤接触面积差异，从而影响产气速率；从外部培养条件分析，温度不仅会影响菌群代谢生长而且会对酶活性产生影响，转速的不同则会通过影响煤样和菌群之间的传质速率来影响产气速率，微量元素如钴和镍等主要和产甲烷菌群的酶活性有关等[2, 7, 37]。在P-B试验之前，按参考文献[7-11]选择了部分对产气有显著影响的因素，并对这些因素先进行单因素试验筛选，得出温度、pH、煤粒度、煤添加量、盐度、CoCl2添加量、NiCl2添加量、转速、接种量8个因素是可能具有显著影响的因素。故将上述8个条件选为研究因素，并选取3个虚拟因素，采用Design expert 8.05软件进行N=12的P-B试验设计，每个因素选用高(+)和低(-)2个水平，响应值为产甲烷量(μmol/g)，因素水平表见表 4，P-B试验设计及结果见表 5。
表 4. P-B试验设计因素及水平 Table 4. Factors and level in P-B experiment design
| Variable | Factor | Low level (-) | High level (+) |
| X1 | T/℃ | 30 | 40 |
| X2 | pH | 6.5 | 7.5 |
| X3 | Coal size/μm | 124 | 176 |
| X4 | Coal amount/(g/L) | 20 | 30 |
| X5 | CoCl2/(g/L) | 0.05 | 0.25 |
| X6 | NiCl2/(g/L) | 0.01 | 0.05 |
| X7 | Rotation rate/(r/min) | 100 | 150 |
| X8 | Inoculum concentration/% | 8 | 12 |
| X9, X10, X11 | Visual factors | - | - |
表选项
表 5. P-B试验设计及结果 Table 5. P-B experimental design and results
| Run | X1 | X2 | X3 | X4 | X5 | X6 | X7 | X8 | Y/(μmol/g) |
| 1 | + | - | + | + | - | + | + | + | 78.05 |
| 2 | + | - | + | + | + | - | - | - | 73.59 |
| 3 | + | + | + | - | - | - | + | + | 143.84 |
| 4 | + | + | - | + | + | + | - | - | 25.27 |
| 5 | + | + | - | - | - | + | - | - | 108.78 |
| 6 | - | + | + | + | - | - | - | - | 84.74 |
| 7 | - | - | - | - | - | - | - | - | 93.66 |
| 8 | - | + | - | + | + | - | + | + | 84.60 |
| 9 | - | + | + | - | + | + | + | + | 33.45 |
| 10 | + | - | - | - | + | - | + | + | 118.18 |
| 11 | - | - | + | - | + | + | - | - | 29.01 |
| 12 | - | - | - | + | - | + | + | + | 57.98 |
表选项
P-B试验方差分析模型的P值为0.0276，在α=5%水平上达到显著；各因素显著性检验结果见表 6，从表中可以得出温度、CoCl2添加量对产甲烷量有显著影响，NiCl2添加量对产甲烷量有极显著影响，其他因素影响不显著。因此选取温度、CoCl2添加量、NiCl2添加量进一步采取B-B设计以确定最优的产甲烷量及培养条件。其他相关因素则合理取值。
表 6. 因素的显著性检验 Table 6. Verification of significant factors
| Variable | Factor | Regression coefficient | Contribution level | P value | Significant level |
| X1 | T/℃ | 27.83 | 15.18 | 0.0263 | * |
| X2 | pH | 5.04 | 0.51 | 0.5059 | N |
| X3 | Coal size/μm | -7.63 | 1.18 | 0.3362 | N |
| X4 | Coal/(g/L) | -20.45 | 8.47 | 0.0550 | N |
| X5 | CoCl2/(g/L) | -33.83 | 23.17 | 0.0149 | * |
| X6 | NiCl2/(g/L) | -44.35 | 39.82 | 0.0070 | ** |
| X7 | Rotation rate/(r/min) | 16.84 | 5.74 | 0.0861 | N |
| X8 | Inoculum concentration/% | 12.60 | 3.21 | 0.1560 | N |
| ** and * represents significant level of 1% and 5% respectively; N represents no significant level. | |||||
表选项
2.4 B-B试验设计及分析 依据B-B试验对温度、CoCl2添加量、NiCl2添加量进行3因素3水平的设计，因素水平如表 7所示。试验设计及结果如表 8所示，以产甲烷量为响应值(Y)，对试验结果进行二次多元回归拟合，获得Y (产甲烷量)、A (温度)、B (CoCl2添加量)和C(NiCl2添加量)的三元二次回归方程如公式(2)所示，其中Y为响应值，A、B、C为实际因素水平。
 | 公式(2) |
| Sample number | Factor | Level | ||
| -1 | 0 | 1 | ||
| A B C | T/℃ CoCl2 amount/(g/L) NiCl2 amount/(g/L) | 30 0.05 0.01 | 35 0.15 0.03 | 40 0.25 0.05 |
表选项
表 8. B-B试验设计及结果 Table 8. B-B experimental design and results
| Run | A | B | C | Y/(μmol/g) |
| 1 | 0 | -1 | -1 | 81.38 |
| 2 | 0 | 0 | 0 | 143.17 |
| 3 | 1 | 1 | 0 | 119.38 |
| 4 | 0 | 0 | 0 | 158.39 |
| 5 | 0 | 0 | 0 | 142.74 |
| 6 | 1 | -1 | 0 | 73.46 |
| 7 | -1 | 0 | -1 | 122.99 |
| 8 | 0 | 0 | 0 | 155.64 |
| 9 | 1 | 0 | 1 | 101.13 |
| 10 | -1 | -1 | 0 | 62.48 |
| 11 | 1 | 0 | -1 | 115.50 |
| 12 | -1 | 0 | 1 | 59.16 |
| 13 | 0 | 1 | -1 | 111.87 |
| 14 | 0 | -1 | 1 | 62.59 |
| 15 | 0 | 0 | 0 | 144.58 |
| 16 | 0 | 1 | 1 | 64.86 |
| 17 | -1 | 1 | 0 | 69.27 |
表选项
对上述回归模型进行方差分析(表 9)，模型P值＜0.0001达到极显著水平，并且失拟项P值为0.5026，对响应值没有显著性影响，表明数据中没有异常点，不需要引入更高此项。R2=0.9815，说明模型的相关性较好；AdjR2=0.9578，说明该模型可以解释95.78%的产甲烷量随A、B、C 3个因素变化的情况。变异系数CV为7.02%，表明响应值的变化只有7.02%来自变量之外，R2预测值为0.8614，与AdjR2接近并且模型精密度Adeq Precision达到16.147 (大于4.0为合理)。综上所述，用软件建立的回归模型的拟合效果较好，能够较好表征响应值和因素之间的实际关系，因此可以用该模型对响应值(产甲烷量)进行分析和预测。由方差因素显著性分析(表 8)可以得出，一次项C极显著，A、B显著；交互项AB、AC显著，BC不显著；二次项A^2、B^2、C^2极显著。
表 9. 回归模型方差分析 Table 9. Variance analysis of regression model
| Source | Sum of mean square | Free degree | Mean square | F value | P value Prod＞F | Significant level |
| Model | 20330.0500 | 9 | 2258.89500 | 41.361580 | ＜0.0001 | *** |
| A-A | 1141.4640 | 1 | 1141.46400 | 20.900820 | 0.0026 | ** |
| B-B | 913.1935 | 1 | 913.19350 | 16.721070 | 0.0046 | ** |
| C-C | 2591.5500 | 1 | 2591.55000 | 47.452680 | 0.0002 | *** |
| AB | 382.6914 | 1 | 382.69140 | 7.007286 | 0.0331 | * |
| AC | 611.6966 | 1 | 611.69660 | 11.200490 | 0.0123 | * |
| BC | 199.1274 | 1 | 199.12740 | 3.646129 | 0.0978 | N |
| A^2 | 2449.1580 | 1 | 2449.15800 | 44.845390 | 0.0003 | *** |
| B^2 | 8018.2070 | 1 | 8018.20700 | 146.817700 | ＜0.0001 | *** |
| C^2 | 2650.5210 | 1 | 2650.52100 | 48.532460 | 0.0002 | *** |
| Residual | 382.2935 | 7 | 54.61336 | |||
| Unintended term | 157.4295 | 3 | 52.47649 | 0.933480 | 0.5026 | N |
| Net error | 224.8640 | 4 | 56.21601 | |||
| Sum of correction | 20712.3500 | 16 | ||||
| *** represents extremely significant level of 0.1%; ** and * represent significant level of 1% and 5% respectively; N represents no significant level. | ||||||
表选项
2.5 响应面分析 由图 3-5的响应面分析结果可以看出，等高线图椭圆程度越来越弱，由椭圆趋向于圆。等高线的形状反映了交互作用的强弱大小[38]，椭圆表明因素交互作用大，圆形则表明交互作用不明显。因此，温度和NiCl2添加量、温度和CoCl2添加量对产甲烷量影响存在较强的交互作用，CoCl2添加量和NiCl2添加量对产甲烷量影响交互作用不显著。响应面立体图呈凸状，表明产甲烷最优值在试验取值范围内达到。
 |
| 图 3 温度和CoCl2添加量对产甲烷量影响的响应面和等高线图 Figure 3 Response surface and contour map of the effect of temperature and CoCl2 content on the yield of methane. |
| 图选项 |
 |
| 图 4 温度和NiCl2添加量对产甲烷量影响的响应面和等高线图 Figure 4 Response surface and contour map of the effect of temperature and NiCl2 content on the yield of methane. |
| 图选项 |
 |
| 图 5 CoCl2添加量和NiCl2添加量对产甲烷量影响的响应面和等高线图 Figure 5 Response surface and contour map of the effect of NiCl2 and CoCl2 content on the yield of methane. |
| 图选项 |
2.6 最优条件及验证试验 通过软件求解回归方程，得到最优解：温度为35.98 ℃，CoCl2添加量为0.17 g/L，NiCl2添加量为0.02 g/L，最优解下产甲烷量预测值为154.01 μmol/g。为验证上述条件是否为最优条件，在温度为36 ℃、CoCl2添加量为0.17 g/L、NiCl2添加量为0.02 g/L条件下进行3次平行重复试验，结果取平均值，得到该条件下实际产甲烷量为159.33 μmol/g。预测精度达到96.65%，因此基于B-B设计试验的回归模型所得混合菌群产甲烷最优参数条件可靠。
本文利用驯化的混合产甲烷菌群进行产气条件优化试验，在产气进行到20 d时，得到159.33 μmol/g的产率，而此时仍有少量甲烷继续生成。其他研究者在实验室条件下所得的甲烷产率大多在50-200 μmol/g，也有少数达到250 μmol/g以上，如表 10，这些研究者所用的煤多为烟煤和亚烟煤，少数为褐煤和无烟煤[2]。与之相比，本试验在没有对煤进行化学或其他方式进行预处理的情况下，且产气优化试验仅进行到20 d时已获得了较高的甲烷产率，具有一定的应用意义。
表 10. 用煤进行的非原位生物产甲烷 Table 10. Ex situ bio-methane production from coal
| Sources of microbial community | Coal source | Coal rank | Coal size/mm | Test duration/d | Methane yield / (μmol/g) | Reference |
| Formation water | Illinois basin, USA | High volatile B bituminous | ＜0.42 | 20 | 140 | [39] |
| Formation water | Wallon, Australia | Subituminous | 0.30-0.60 | 7 | 265 | [40] |
| Wetland sediment | Texas, USA | Subbituminous | NA | 105 | 69-101 | [41] |
| Formation water | San Juan Basin, USA | NA | Ground | 243 | 100 | [42] |
| Well water | Powder River Basin, USA | Subbituminous | 0.25-0.60 | 26 | 59 | [5] |
| NA | Powder River Basin, USA | Lignite and subbituminous | Crushed | 365 | 6-15 | [43] |
| Mine water | Jitpur, India | Hard coal | 0.025-0.060 | 63 | 214 | [44] |
| Formation water | Pittsburgh No.8, USA | High volatile bituminous | NA | 60 | 91 | [45] |
| Formation water | Pocahontas No.3, USA | Low volatile bituminous | NA | 60 | 159 | [45] |
表选项
3 结论 (1) 通过对2个矿区中的煤层水样和煤样以及污水厌氧罐水样进行产甲烷菌群富集培养，并对混合富集菌群经褐煤驯化培养，得到了高效产气的产甲烷混合菌群(HN+MD+WT)。利用Miseq高通量测序分析其群落组成，发现初始混合菌群中细菌群落多样性丰富，其中厚壁菌门(Firmicutes)的梭菌科Clostridiaceae (9.77%)，变形菌门(Proteobacteria)的脱硫弧菌属Desulfovibrio (15.07%)，拟杆菌门(Bacteroidetes)的屠场杆状菌属Macellibacteroides (14.6%)、Mariniphaga (3.65%)和Proteiniphilum (3.49%)，互养菌门(Synergistetes)的脱硫代硫酸盐弧菌属Dethiosulfovibrio (8.76%)和胺小杆菌属Aminobacterium (3.45%)，螺旋菌门(Spirochaetae)的Sphaerochaeta属(6%)，以及热袍菌门(Thermotogae)为主。古菌群落多样性则较为单一，全部为广古菌门(Euryarchaeota)，其中以该门中甲烷卵圆形菌属(Methanocalculus，80.28%)占据绝对优势，热原体目某属(Thermoplasmatales_norank，10.58%)其次，还有丰度很低的甲烷微菌科某属(Methanomicrobiaceae_uncultured，4.33%)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina，2.83%)和嗜甲基产甲烷菌属(Methanomethylovorans，0.74%)。
(2) 通过P-B试验得出温度、CoCl2添加量和NiCl2添加量为影响产甲烷量的重要因素，对重要因素进行B-B试验并进行回归分析和响应面分析，得出显著程度为NiCl2添加量＞温度＞CoCl2添加量，并且温度和NiCl2添加量、温度和CoCl2添加量对产甲烷量影响存在较强的交互作用，而CoCl2添加量和NiCl2添加量对产甲烷量影响交互作用不显著。
(3) 通过求解回归方程得出最优的产气条件：温度为36 ℃，CoCl2添加量为0.17 g/L，NiCl2添加量为0.02 g/L。最优条件下产气量预测值为154.01 μmol/g，经验证试验得到该条件的实际产甲烷量为159.33 μmol/g，预测精度达到96.65%，达到条件优化的目的。
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