唐虹, 张小燕, 杜雪晴, 宋召军, 焦新安, 黄金林
扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室, 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心, 江苏 扬州 225009
收稿日期：2017-03-01；修回日期：2017-05-29；网络出版日期：2017-07-10
基金项目：国家自然科学基金（31372449）；国家支撑计划（2014BAD13B02）；江苏省自主创新项目[CX（15）1009-2]
*通信作者：黄金林, Tel:+86-514-87971136;E-mail:jinlin@yzu.edu.cn
摘要：[目的]研究fliD基因对空肠弯曲菌生物学特性的影响，为阐明该基因的功能和作用机制奠定基础。[方法]利用同源重组技术构建fliD基因的插入失活突变株NCTC11168△fliD，并通过与野生株比较，对fliD突变株生长速率、运动力、黏附力和侵袭力等生物学特性进行研究。[结果]与野生型NCTC11168相比，突变株NCTC11168△fliD的生理生化特性不变；突变株的生长速率无明显变化；MH半固体穿刺实验中，突变株只能在接种处生长，运动力明显减弱；在Caco-2细胞黏附、侵袭实验中，fliD突变株的黏附率和侵袭率分别为164.00±19.49、55.00±6.09，fliD基因失活使得突变株的黏附率和侵袭率显著降低（0＜P ＜ 0.01）。[结论]fliD基因是空肠弯曲菌运动能力重要的分子基础，与空肠弯曲菌感染细胞的黏附侵袭作用密切相关，即与空肠弯曲菌的致病性密切相关。
关键词： 空肠弯曲菌 fliD基因 突变株 生物学特性
Construction and characterization of a Campylobacter jejuni fliD mutant
Hong Tang, Xiaoyan Zhang, Xueqing Du, Zhaojun Song, Xin'an Jiao, Jinlin Huang
Key Laboratory of Zoonoses of Jiangsu Province, Co-Innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infection Diseases and Zoonoses of Jiangsu Province, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu Province, China
Received 1 March 2017; Revised 29 May 2017; Published online 10 July 2017
*Corresponding author: Jinlin Huang, Tel:+86-514-87971136;E-mail:jinlin@yzu.edu.cn
Supported by the National Natural Science Foundation of China (31372449), by the Key Project of National Science and Technology Support Plan of China (2014BAD13B02) and by the Independent Innovation Fund Project of Agricultural Science and Technology in Jiangsu Province [CX(15)1009-2]
Abstract: [Objective]We studied the biological characteristics of the fliD mutant strain to clarify the function and mechanism of fliD gene.[Methods]The fliD mutant was constructed through homologous recombination, and biological characteristics of the fliD mutant were identified in comparison with the wild type of Campylobacter jejuni.[Results]Mutant NCTC11168△fliD presented the same biochemical indexes and similar growth curves of the wild type. After being inoculated into semisolid Mueller Hinton ager plate, the wild strain presented diffusion growth phenotype, but fliD mutant could only grow in the site inoculated, indicating that its motility was significantly reduced. The adhesion rate and invasion rate of fliD mutant were 164.00±19.49 and 55.00±6.09 respectively, which means that the mutation of fliD gene significantly reduced the rates of adhesion and invasion.[Conclusion]fliD gene was not only an important molecular basis for bacterial motility but also necessary for the adhesion and invasion of Campylobacter jejuni infection cells.
Key words: Campylobacter jejuni fliD gene mutant biological characteristics
空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni，Cj)是一类细胞色素氧化酶阳性、微需氧、弯曲螺旋杆状的革兰阴性细菌，可表现出活泼的运动力。自2005年以来，空肠弯曲菌一直是欧盟导致人类细菌性胃肠炎的主要原因，每年大约造成900万人感染，花费成本高达24亿欧元[1]。目前空肠弯曲菌的生态学、流行病学和病原学等方面的研究已取得了一定的进展，但对其致病机理的了解甚少。鞭毛是空肠弯曲菌典型的毒力因子，在其致病过程中发挥重要作用。据研究报导，鞭毛介导空肠弯曲菌运动[2]，其相关基因失活会使空肠弯曲菌对细胞的黏附侵袭能力下降[3-4]，并影响空肠弯曲菌定殖在宿主胃肠道[5]。目前空肠弯曲菌鞭毛引起以上毒力表型变化的机理还不清楚，相关基因与毒力的偶联性也没有进行分析。
fliD基因是空肠弯曲菌鞭毛合成级联通路中的重要元件，分析该基因的特性、功能及其与毒力的关联将会对研究空肠弯曲菌致病机理大有裨益。本研究通过同源重组技术构建了空肠弯曲菌fliD突变株，并对突变株的生物学特性进行了研究。该研究为深入了解fliD基因的功能，解析空肠弯曲菌的致病机理奠定基础，为弯曲菌的预防与控制提供新靶点。
1 材料和方法 1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒及细胞株: 大肠杆菌DH5α由本实验室保存，空肠弯曲菌NCTC11168由遵义医学院孙万邦教授惠赠。克隆载体pMD-20T (Simple)购自TaKaRa公司，大肠杆菌-空肠弯曲菌穿梭质粒pRY107由爱荷华州大学Qijing Zhang教授惠赠。实验用细胞系为Caco-2，由本实验室保存。
1.1.2 主要试剂: 限制性内切酶BamHⅠ、SacⅠ和AflⅡ，普通Taq酶，高保真酶，高保真dNTPs，PCR buffer，dNTPs mixture，DNA marker，T4 DNA连接酶，胶回收试剂盒，购自TaKaRa公司；细菌基因组提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；弯曲杆菌选择性添加剂(SR0204)，弯曲菌哥伦比亚(CCDA)琼脂培养基购自Oxoid公司；Mueller Hinton (MH)液体培养基购自BD公司；高糖型DMEM培养基，胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；青链霉素购自Solarbio公司；硫酸庆大霉素，TritonX-100购自Sigma公司。其余常规试剂均为国产或进口分析纯产品。
1.2 fliD突变株的构建
1.2.1 引物设计与合成: 根据GenBank上已公布的空肠弯曲菌NCTC11168全基因组序列，以及质粒pRY107图谱，应用软件Primer 5.0设计引物(表 1)。引物由南京金斯瑞有限公司合成。
表 1. PCR引物序列 Table 1. Primers used for PCR
| Genes | Primers | Primer sequences(5′→3′) | Amplicon size/bp | Note |
| fliD | fliD-F | TAGGATCCATGGCATTTGGTAGTC | 1929 | BamHⅠ |
| fliD-R | GCGGAGCTCTTAATTATTAGAATTGTT | SacⅠ | ||
| kanr | kanr-F | GACTTAAGGATAATGCTAAGACAATCACTAAA | 1021 | Afl Ⅱ |
| kanr-R | AGCTTAAGCGCTTATCAATATATCTATAGAATG | Afl Ⅱ |
表选项
引物fliD-F/R用于扩增空肠弯曲菌fliD基因，引物kanr-F/R用于扩增质粒pRY107中卡那霉素抗性基因盒。
1.2.2 重组质粒的构建: 以空肠弯曲菌NCTC11168基因组DNA为模板，PCR方法扩增fliD基因。以质粒pRY107为模板，PCR方法扩增其中卡那霉素抗性基因盒(kanr)。PCR反应条件为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物DNA胶回收试剂盒回收纯化，并取少量回收产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。检测正确后将fliD基因及kanr抗性基因与pMD-20T (Simple)载体连接，并转化DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后，挑取阳性菌落扩大培养，提取质粒进行PCR和酶切鉴定。鉴定正确的阳性克隆送南京金斯瑞公司测序，测序正确的质粒分别命名为pMD20T-fliD和pMD20T-kanr。
1.2.3 自杀载体pMD20T-fliD-kanr的构建: AflⅡ为fliD基因内部单一酶切位点，而且在pMD-20T (Simple)载体中无此酶切位点。通过酶切连接反应，将pMD20T-kanr载体中的kanr插入pMD20T-fliD载体中fliD基因内部，从而完成自杀载体构建。自杀载体的构建流程如图 1所示。
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| 图 1 自杀载体pMD20T-fliD-kanr构建流程 Figure 1 The construction process of the suicide plasmid pMD20T-fliD-kanr. |
| 图选项 |
提取pMD20T-fliD质粒和pMD20T-kanr质粒，以Afl Ⅱ限制性内切酶进行单酶切反应，酶切产物经1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳。胶回收试剂盒回收pMD20T-fliD质粒酶切后的4.7 kb片段和pMD20T-kanr质粒酶切后的1 kb片段，并进行连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞，在Kan (50 μg/mL)抗性LB平板上筛选，挑取阳性克隆扩大培养，然后提取质粒进行PCR和酶切鉴定，以验证kanr是否插入fliD基因中。鉴定正确的质粒大小应约为5.7 kb，命名为pMD20T-fliD-kanr。
1.2.4 空肠弯曲菌fliD突变株的筛选: 应用插入失活的方法构建空肠弯曲菌fliD突变株。pMD20T载体不能在空肠弯曲菌中复制，因此以pMD20T作为自杀载体，另外以kanr作为筛选标记。将自杀载体pMD20T-fliD-kanr电转化进空肠弯曲菌NCTC11168感受态细胞，通过同源重组使自杀载体上的fliD-kanr片段和空肠弯曲菌fliD基因片段发生同源交换，从而获得fliD基因失活的空肠弯曲菌fliD突变株。电击转化后的感受态细胞在带Kan (50 μg/mL)抗性CCDA固体培养基上进行筛选。并用fliD-F和fliD-R引物对转化子进行PCR验证，验证正确的菌株即为空肠弯曲菌fliD突变株NCTC11168△fliD。
1.3 细菌生化鉴定 复苏空肠弯曲菌，接种于CCDA固体培养基，42℃微需氧条件下培养18 h后利用VITEK 2型自动微生物鉴定仪，通过NH鉴定卡(奈瑟菌、嗜血杆菌鉴定卡)对空肠弯曲菌野生株NCTC11168及突变株NCTC11168△fliD进行生化鉴定。观察fliD基因失活是否对空肠弯曲菌基本生理生化特性造成影响。
1.4 细菌生长曲线测定 参照文献[6]的方法，在CCDA固体培养基上复苏细菌，于42℃微需氧条件下培养24 h后用MH液体培养基收获细菌，并调OD600值为0.7；将菌悬液以1:10稀释(OD600值约为0.07)，并以1 mL每孔分装于24孔板中，每株细菌分装10个孔；将24孔板置于厌氧罐中充气后37℃、180 r/min条件下摇床振荡培养；从转接开始，每隔3 h取出24孔板1次，每次测定1个孔中菌悬液OD600值，直至细菌达到稳定生长期；记录每株细菌各个时间段的OD600值并绘制生长曲线，比较野生株和突变株的生长速度。
1.5 细菌运动力检测 参照文献[7]的方法，复苏空肠弯曲菌，接种于CCDA固体培养基，于42℃微需氧条件下培养18 h；以MH液体培养基收获新鲜培养的细菌，并调OD600值为0.8；以无菌穿刺针蘸取少量菌悬液，并垂直穿刺接种于含0.4%琼脂的MH半固体培养基；平板在42℃微需氧条件下倒置培养48 h后观察细菌从接种点向四周扩散情况，从而比较野生和突变株的运动能力。
1.6 Caco-2细胞黏附、侵袭实验 参照文献[8]的方法，实验步骤为：对饲养良好的Caco-2细胞进行细胞计数，用24孔板每孔铺1×105个细胞；以无抗DMEM培养基收获新鲜培养的细菌，并调OD600值为1.0 (细菌数约为109CFU/mL)，稀释10倍至细菌数约为108 CFU/mL；弃去已铺满单层Caco-2细胞的24孔板中的培养基，用无菌PBS洗2次，每孔加入1 mL浓度为108CFU/mL的细菌悬液；置于CO2培养箱中孵育，使细菌能够充分黏附于细胞表面或侵袭到细胞内部。
黏附实验：孵育3 h后弃去培养基，用无菌PBS洗3次，以洗脱未黏附的细菌；之后加入1 mL 0.01% Triton X-100裂解细胞，收获裂解液，以无菌PBS进行倍比稀释，涂布于无抗CCDA固体培养基，计算黏附的细菌数。
侵袭实验：孵育3 h后吸去24孔板内培养基，以无菌PBS洗3次，之后加入含100 mg/mL庆大霉素的DMEM培养基，于CO2培养箱中再孵育1 h，以杀死黏附于细胞表面的细菌；之后加入1 mL 0.01% Triton X-100裂解细胞，收获裂解液，以无菌PBS进行倍比稀释，涂布于无抗CCDA固体培养基，计算侵袭的细菌数。
2 结果和分析 2.1 突变株的构建
2.1.1 重组质粒的构建与鉴定: 以空肠弯曲菌NCTC11168基因组DNA为模板，用引物fliD-F/R扩增大小为1929 bp的fliD基因，以质粒pRY107为模板，用引物kanr-F/R扩增大小为1021 bp的kanr基因，电泳结果与预期大小相符(图 2)；fliD基因和kanr基因与克隆载体pMD-20T相连后，以BamHⅠ和SacⅠ对重组质粒pMD20T-fliD进行酶切，得到1.9 kb和2.7 kb大小的片段；以AflⅡ对重组质粒pMD20T-kanr进行酶切，得到1 kb和2.7 kb大小的片段，结果与预期相符(图 3)，测序结果也与GenBank中公布的序列相一致，证实重组质粒构建成功。
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| 图 2 fliD和kanr基因的PCR扩增 Figure 2 PCR amplification of fliD and kanr gene. M: DL2000 DNA marker; lane 1: The PCR product of fliD. |
| 图选项 |
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| 图 3 重组质粒的酶切鉴定 Figure 3 Analysis of recombinant plasmid with restriction enzyme. M1: DL2000 DNA marker; M2: λ-EcoT 14Ⅰ digest marker; lane 1: pMD20T-fliD/BamHⅠ+SacⅠ; 2: pMD20T-kanr/ Afl Ⅱ. |
| 图选项 |
2.1.2 自杀载体pMD20T-fliD-kanr的构建: 自杀载体pMD20T-fliD-kanr经Afl Ⅱ单酶切后，电泳出现4.7 kb和1.0 kb大小的2个片段。结果均与预期相符(图 4)，说明kanr已顺利插入到重组质粒pMD20T-fliD中fliD片段内部AflⅡ酶切位点之间，得以成功构建自杀载体pMD20T-fliD-kanr。
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| 图 4 自杀载体pMD20T-fliD-kanr的酶切鉴定 Figure 4 Analysis of suicide plasmid pMD20T-fliD-kanr with restriction enzyme. M1: λ-EcoT 14Ⅰ digest marker; lane 1: pMD20T-fliD-kanr/AflⅡ. |
| 图选项 |
2.1.3 空肠弯曲菌fliD突变株的筛选与鉴定: 将自杀质粒pMD20T-fliD-kanr电转化空肠弯曲菌感受态细胞后，自杀载体上的fliD-kanr片段和空肠弯曲菌fliD基因片段发生同源交换。这会使空肠弯曲菌fliD基因失活，同时也使空肠弯曲菌拥有卡那霉素抗性。空肠弯曲菌野生株可以扩增出1.9 kb的条带；而fliD突变株则扩增出2.95 kb的条带(图 5)，这与fliD-kanr片段预期大小相符，说明kanr已成功插入空肠弯曲菌fliD基因内部。
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| 图 5 fliD突变株的PCR鉴定 Figure 5 PCR identification of fliD mutant strain. M: 250 bp DNA ladder marker; lane 1: PCR identification of fliD mutant strain with fliD-F/R. |
| 图选项 |
2.2 细菌生化鉴定 利用自动微生物生化鉴定仪VITEK2，通过NH鉴定卡(奈瑟菌、嗜血杆菌鉴定卡)对空肠弯曲菌野生株以及fliD突变株进行了生化鉴定。生化鉴定结果如表 2所示，fliD突变株的生化指标均与空肠弯曲菌野生株相同，即fliD基因失活并未对空肠弯曲菌的正常生理生化代谢造成影响。
表 2. 空肠弯曲菌的生化特性鉴定 Table 2. Biochemical characteristics of Campylobacter jejuni
| Biological characteristics | NCTC11168 | fliD mutant strain |
| ArgA | - | - |
| GGT | - | - |
| LysA | - | - |
| DGAL | - | - |
| LeuA | + | + |
| ELLM | - | - |
| PheA | - | - |
| ProA | - | - |
| PyrA | + | + |
| TyrA | - | - |
| APPA | - | - |
| dGLU | - | - |
| GLYG | - | - |
| dMNE | - | - |
| dMAL | - | - |
| SAC | - | - |
| NAG | - | - |
| URE | - | - |
| BGALi | - | - |
| ODC | + | + |
| AARA | - | - |
| PVATE | + | + |
| PHC | - | - |
| dMLT | + | + |
| MTE | - | - |
| IGLM | + | + |
| PHOS | - | - |
| DRIB2 | - | - |
| OPS | + | + |
| dXLY | - | - |
| +: Positive; -: Negative. | ||
表选项
2.3 细菌生长曲线测定 测定空肠弯曲菌野生株以及fliD突变株每个时间段菌悬液OD600值，绘制生长曲线并比较菌株间的生长速度。结果如图 6所示，可以看出fliD突变株的生长速度与野生株NCTC11168相比无明显差异，表明fliD基因失活并不会对空肠弯曲菌的正常生长造成明显影响。
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| 图 6 NCTC11168, fliD突变株以及野生株的生长曲线 Figure 6 Growth curves of NCTC11168 and fliD mutant strain. |
| 图选项 |
2.4 细菌运动力检测 将空肠弯曲菌野生株以及fliD突变株穿刺接种MH半固体培养基后，将平板在42℃微需氧条件下倒置培养以检测细菌运动力。培养48 h后，取出平板观察，结果如图 7所示，NCTC11168野生株可从接种处向四周扩散生长，且形成明显的圆形菌斑；fliD突变株只能在接种处生长，未见扩散运动，运动力明显减弱。
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| 图 7 NCTC11168野生株和fliD突变株的运动力检测 Figure 7 Motility assay of NCTC11168 and fliD mutant strain. |
| 图选项 |
2.5 Caco-2细胞黏附、侵袭实验 当Caco-2细胞形成单层后，以100 MOI的量接种空肠弯曲菌野生株和fliD突变株以检测细菌黏附和侵袭细胞能力，黏附作用3 h，侵袭作用3 h，结果如图 8所示。野生株NCTC11168和fliD突变株的黏附分别为295.17±29.66、164.00±19.49，fliD突变株的对细胞的黏附率显著低于野生株NCTC11168 (0＜P＜0.01)；野生株NCTC11168和fliD突变株的侵袭率分别为160.67±8.22、55.00±6.09，fliD突变株的对细胞的侵袭率显著低于野生株NCTC11168 (0＜P＜0.01)。
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| 图 8 NCTC11168和NCTC11168△fliD对Caco-2细胞的黏附(A)和侵袭(B) Figure 8 Adherence (A) and invasion (B) assary of NCTC11168 and NCTC11168△fliD to Caco-2. 1: NCTC11168; 2: NCTC11168△fliD. P < 0.01. |
| 图选项 |
3 讨论 目前空肠弯曲菌的生态学、流行病学和病原学等方面的研究已取得了一定的进展，但对其致病机理的了解甚少。随着2000年英国Sanger中心对空肠弯曲菌NCTC11168全基因组测序的完成[9]，对于空肠弯曲菌生理及毒力相关信息有了一定的了解。在众多毒力相关因素中，鞭毛是空肠弯曲菌典型的毒力因子，鞭毛及其介导的运动力帮助细菌感染和定殖。fliD基因是鞭毛基因调节系统的关键组分[10]，在空肠弯曲菌中指导合成鞭毛丝最顶端的帽盖结构蛋白FliD蛋白，FliD蛋白促使鞭毛亚单位聚合成完整的鞭毛，在空肠弯曲菌鞭毛的生物合成过程中发挥重要作用。但目前我们对于fliD基因的调节机制并不清楚。本研究通过同源重组方法成功构建了空肠弯曲菌fliD突变株，并通过一系列实验对fliD突变株的生物学特性进行了研究，以帮助了解fliD基因的作用机制。
通过插入失活的方法构建基因突变株是目前研究基因功能简单而有效的方法，这种方法也同样适用于空肠弯曲菌。插入失活通常是通过1次双交换重组而完成的[11]，这个过程利用自杀载体上所携带的报告基因，例如蔗糖敏感基因作为选择标记[12-13]。本研究挑选kanr抗性基因盒为筛选标记，插入fliD基因内部使其失活，也因此在操作中需要考虑该菌株的生物安全性。
fliD基因在不同细菌中的研究多有报道，Tasteyre等[14]采用Dot blot和放射性标记方法，Dingle等[15]采用诱导突变株方法获得FliD黏附功能的证据，同时还认为FliD在不同艰难梭菌菌株中的黏附能力不等，使细菌的毒力发生了变化。Koji Yonekura等[16]用电子显微镜和单粒图像分析技术研究了帽子蛋白-鞭毛丝复合体的结构，阐述了鞭毛帽子蛋白质FliD的旋转为奇异变形杆菌鞭毛自体组装提供动力。张小燕等通过构建重组质粒，在大肠杆菌中表达FliD蛋白，证明在空肠弯曲菌FliD蛋白中具有良好抗原性[17]。本研究中对fliD基因生物学特性探索过程中，可以看出其对于空肠弯曲菌的运动能力有重要作用。半固体穿刺实验结果表明fliD基因失活会明显降低空肠弯曲菌运动力；fliD突变株对Caco-2细胞的黏附侵袭力的明显下降也揭示了fliD基因失活降低了空肠弯曲菌运动能力，提示fliD基因的作用机制可能是通过介导鞭毛的活力来影响细菌的运动力。弯曲菌在动物组织上的黏附和定殖是感染建立的重要步骤。许多先前的研究得出结论，早期粘膜损伤是空肠弯曲菌黏附并入侵上皮细胞的结果[18-19]。所以在黏附侵袭实验中，我们选择Caco-2细胞模型，一种人克隆结肠腺癌细胞，结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，用以模拟弯曲菌真实感染过程，从而探究fliD突变株的黏附侵袭能力。fliD突变株黏附侵袭力的明显下降，不仅揭示了fliD基因失活降低了空肠弯曲菌的运动能力，还为FliD蛋白可能是弯曲菌感染细胞过程中的早期黏附因子提供了参考依据[20]。与大多弯曲菌鞭毛基因突变体一样，fliD突变体运动力明显减弱，对细胞的黏附侵袭力显著降低。例如，惠星星等对空肠弯曲菌flhA突变株的研究表明，flhA是空肠弯曲菌鞭毛生成和运动能力重要的分子基础，与空肠弯曲菌致病性密切有关[6]。Murat等发现空肠弯曲菌flhF突变株不能形成鞭毛，从而对细菌运动性产生影响，进一步影响细菌定殖、感染[21]。Wassenaar等发现，flaB基因的突变体仍然具有运动性，而flaA基因的突变株无运动性，且不能黏附和侵袭宿主肠道细胞[22]。最新研究证明空肠弯曲菌鞭毛丝帽盖蛋白FliD不仅介导细菌的运动力，还扮演着早期黏附因子的角色[20]，这一结论也与本研究的结果相符合。
本研究对fliD突变株生物学特性探究，为研究空肠弯曲菌中fliD基因的功能奠定了基础，但fliD基因具体的功能和作用机制还需要进一步研究证明。如fliD是如何参与空肠弯曲菌鞭毛在细菌运动力上的功能作用？FliD蛋白作为弯曲菌感染细胞过程中的早期黏附因子的表达调节机制？fliD基因型和表型差异是否细菌肠道定殖部位及生态小境？
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