杨顺1,2, 杨婷1, 林斌1,2, 刘杏忠1
, 向梅春1 1.中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室, 北京 100101;
2.中国科学院大学, 北京 100049
收稿日期：2017-03-15；修回日期：2017-04-28；网络出版日期：2017-05-25
基金项目：北京市科技计划（D151100003915002）；中国科学院科技服务网络计划（STS计划）（KFJ-SW-STS-143-5）
*通信作者：刘杏忠, E-mail:liuxz@im.ac.cn
向梅春, E-mail:xiangmc@im.ac.cn
摘要：[目的]从作物根围土壤中筛选高效溶磷菌株。[方法]结合溶磷圈筛选法和钼锑抗比色法评价菌株的溶磷能力；利用菌株的形态学特性、培养性状和微管蛋白β-tubulin基因序列分析方法进行菌株的鉴定；采用气相色谱-质谱法（GC-MS）对溶磷菌的产酸物质进行分析；并用平板亲和性实验测定菌株间的兼容性。[结果]筛选得到2株高效溶磷菌株P1-1、P2-2；经鉴定，菌株P1-1为黑曲霉（Aspergillus niger），P2-2为塔宾曲霉（A.tubingensis）。2株溶磷菌株的产酸物质相同，均为草酸、葡萄糖酸、乳酸和甘油酸。这2株溶磷菌与杀线虫功能菌株淡紫拟青霉（Purpureocillium lilacinum）、橄榄色链霉菌（Streptomyces olivaceus）和苍白杆菌（Ochrobactrum pseudogrignonense）兼容性好。2菌株分别在Ca3（PO4）2、Zn3（PO4）2、羟基磷灰石为磷源的无机磷固体培养基中25℃培养5 d，测定溶磷圈的直径（D）与菌落直径（d），通过计算其比值D/d的大小对比，以及在Ca3（PO4）2、Zn3（PO4）2、羟基磷灰石为磷源的液体培养基中培养5 d，测定发酵液中有效磷含量进行比较后判定，这2株溶磷菌溶解磷的能力强且效果相当。[结论]获得了2株高效的溶磷真菌。它们能活化多种难溶性磷源，同时伴随挥发性酸性物质的产生；2个菌株与1组杀根结线虫微生物菌群兼容性均良好。
关键词： 溶磷真菌 曲霉属 筛选 复合微生物菌剂
Isolation and evaluation of two phosphate-dissolving fungi
Shun Yang 1,2, Ting Yang 1, Bin Lin 1,2, Xingzhong Liu 1
, Meichun Xiang 1 1.State Key Laboratory of Mycology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China;
2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Received 15 March 2017; Revised 28 April 2017; Published online 25 May 2017
*Corresponding author: Xingzhong Liu, E-mail:liuxz@im.ac.cn
Meichun Xiang, E-mail:xiangmc@im.ac.cn
Supported by the Beijing Municipal Science and Technology Project (D151100003915002) and by the Science and Technology Service Network Initiative (KFJ-SW-STS-143-5)
Abstract: [Objective]To isolate phosphate-solubilizing strains from crop rhizosphere soil for functional composite microbial community and bio-fertilizer production.[Methods]The phosphate-solubilizing capacity was evaluated by the halo zone of dissolving phosphate and molybdenum antimony colorimetric. Phosphate-solubilizing fungi were identified based on their morphological and cultural characteristics and β-tubulin sequence analysis. Acid producing substances of phosphate solubilizing fungus were analyzed by GC-MS and the biological compatibility of microbial strains was tested by medium method.[Results]Two phosphate-solubilizing fungi were screened from soybean rhizosphere soil, P1-1, P2-2, which were identified as Aspergillus niger and A. tubingensis. The volatile acids (oxalic acid, gluconic acid, lactic acid and glycerol acid) were detected in both fungi. They were compatible with a group of nematicidal microorganisms (Purpureocillium lilacinum + Streptomyces olivaceus + Ochrobactrum pseudogrignonense). The D/d (diameter of the halo zone/diameter of the colony) value of P1-1 and P2-2 was detected after culturing on three media with Ca3(PO4)2, Zn3(PO4)2 and phosphorite at 25℃ for 5 days, and the available phosphorus contents were detected after 5 days culturing in liquid medium containing Ca3(PO4)2, Zn3(PO4)2 and phosphorite. The results indicated that the two phosphate-dissolving fungi had similar capability in dissolving phosphorus.[Conclusion]Two high-efficient phosphate solubilize fungi were obtained, and they could activate a variety of insoluble phosphorus sources accompanied by the production of volatile acidic substances. The two strains showed good biological compatibility with a group of nematicidal microorganisms.
Key words: phosphate-solubilizing fungi Aspergillus screening multi-microbial agent
磷对植物的生长发育有着不可替代的作用，是植物必需的矿质营养元素之一[1]。磷不仅参与许多重要的生命代谢活动，而且还是很多器官的组成成分，磷对作物碳水化合物的运输、合成和分解起着重要作用[2]。土壤中磷元素的丰缺度对作物的产量和品质影响非常明显。由于大部分磷与土壤中的Ca2+、Fe3+、Fe2+、Al3+结合形成难溶磷酸盐，导致土壤中95%以上的难溶性磷源不能直接被植物吸收利用[3]。
土壤中存在着大量溶磷微生物，它们能够将难溶性磷酸盐转化为植物可吸收利用的有效磷，具有这种能力的微生物称为溶磷微生物(phosphate-solubilizing microorganisms)[4]。溶磷微生物主要分为溶磷真菌和细菌，研究显示，溶磷细菌的数量是溶磷真菌的2–50倍[5]。然而，溶磷细菌常在传代过程中溶磷活性降低或失去活性，溶磷真菌的活性和溶磷能力均高于溶磷细菌[6]。溶磷真菌类菌株主要属于曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)、小菌核菌(Sclerotium)和镰刀菌(Fusarium)[7]。其中，在众多溶磷微生物中，曲霉属菌株的溶解活性最高[8]。国外已对该属溶磷菌做了大量的调查研究[9]。国内也有大量关于溶磷真菌曲霉属的报道。赵小蓉等[10]研究不同C、N源和C/N比对微生物溶磷的影响，结果发现，曲霉2TCiF2和4TCiF6在以NO3–为氮源的培养基中表现出强的解磷活力。李露莉等[11]发现黑曲霉对于提高低品位的磷矿石具有重要作用。梁艳琼[12]、张丽珍[13]等分别从热带作物根际和盐碱地柠条根围土壤中分离出溶磷曲霉。龚明波等[14]从土壤中筛选出1株能促进玉米生长的构巢曲霉。吕靖等[15]的研究表明黑曲霉发酵液对石灰性土壤中小麦幼苗具有促生作用。
筛选高效溶磷菌株是开发微生物菌肥不可或缺的重要环节。本研究在溶磷菌株的筛选基础上，利用溶磷圈法和钼锑抗比色法对得到的高效溶磷菌进行定性和定量测定，从而综合评价其溶磷效果。通过气相色谱-质谱法(GC-MS)对溶磷菌产酸物质的分析，初步探讨溶磷菌的溶磷机理。单一菌种向多种功能菌的组合应用是提高微生物肥料效果的有效途径，而菌株间的兼容性测定是各功能菌组合的前提条件。本研究结果与一组杀线虫功能菌株兼容性好，为微生物肥料的研发提供了很好的菌种资源。
1 材料和方法 1.1 材料
1.1.1 作物土壤来源: 土壤于2015年10月采自北京市昌平区大豆、生菜、玉米和苹果大田，共采集土壤12份。土样采回后置于冷库保存，用于溶磷真菌的筛选。
1.1.2 培养基: (1) 难溶无机磷培养基[16]：葡萄糖10 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，磷源5 g，(NH4)2SO4 0.5 g，NaCl 0.2 g，KCl 0.2 g，MnSO4 0.03 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂20 g，酵母膏0.5 g，水1 L，pH值7.0±0.2，121℃灭菌30 min备用。(2) PDA培养基(美国BD公司)用于真菌的培养。(3) PDA、高氏1号(广东环凯微生物科技有限公司)和LA (美国BD公司)混合培养基用于菌株的兼容性测定。(4)查氏酵母膏琼脂培养基(CYA)用于菌种的鉴定：K2HPO4 1 g，查氏浓缩液10 mL，酵母抽提粉5 g，蔗糖30 g，琼脂15 g，水1 L。查氏浓缩液配方：NaNO330 g，KCl 5 g，MgSO4·7H2O 5 g，FeSO4·7H2O 0.1 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，CuSO4·5H2O 0.05 g，无菌水100 mL。
1.1.3 供试磷源:难溶磷酸盐为: 磷酸三钙Ca3(PO4)2 (上海百舜生物科技有限公司)，羟基磷灰石(上海百舜生物科技有限公司)，磷酸锌Zn3(PO4)2 (北京普益华科技有限公司)。
1.1.4 供试菌株: 淡紫拟青霉YES-2 (CGMCC No. 2012)、橄榄色链霉菌HDZ-9-47 (CGMCC No. 2878)和苍白杆菌NC1 (CGMCC No. 12154)为本实验室前期筛选的杀线虫功能菌株[17]。
1.1.5 主要试剂: PCR Mix购自天根生化科技(北京)有限公司；引物βt-2a和βt-2b由上海生工生物技术有限公司合成。
钼锑贮存溶液：量取153 mL浓硫酸(分析纯，密度1.84 g/mL)，缓缓加入到400 mL蒸馏水中，不断搅拌，冷却。另称取经磨细的钼酸铵10 g溶于温度约60 ℃的300 mL水中，冷却。然后将硫酸溶液缓缓倒入钼酸铵溶液中。再加入0.5%酒石酸锑钾溶液100 mL，冷却后，加水稀释至1000 mL，摇匀，贮于棕色试剂瓶中。钼锑抗显色剂：称取1.50 g抗坏血酸溶于100 mL钼锑贮存溶液中，此溶液有效期不长，宜随配随用。
5 mg/L磷标准溶液：将0.4394 g在50℃烘干的磷酸二氢钾溶于100 mL水，加5 mL浓硫酸防腐，用水定容到1 L，浓度为100 mg/L磷溶液，此溶液可以长期保存。吸取上述溶液10 mL于200 mL容量瓶中，加水至标度，浓度为5 mg/L磷标准溶液，此溶液不宜久存。
1.1.6 主要的仪器: 电热恒温培养箱DNP-9082 (上海精密实验设备有限公司)；摇床HZO-F160 (太仓市强乐实验设备有限公司)；PCR仪ABI Veriti96 (美国)；分光光度仪Bio-Rad SmartSpec3000 (美国)；光学显微镜Nikon eclipse 80i (日本)；气相色谱质谱联用仪GCMS-QP2010 Ultra (岛津公司)。
1.2 溶磷菌株的筛选与菌株间的亲和测定
1.2.1 基于稀释土壤法对菌株进行初筛: 制作(10-2–10-4)的土壤悬液，将土壤悬液涂布于以Ca3(PO4)2为磷源的无机磷培养基(含100 mg/L链霉素和氯霉素)上，25 ℃培养。分离产生溶磷圈的菌株至PDA培养基上，纯化，15%甘油–80 ℃保存。
1.2.2 溶磷菌株与功能菌株的亲和性检验: 将PDA、高氏1号和LA培养基按等比例混合灭菌后倒入15 cm培养皿中，待培养基凝固后将菌株HDZ-9-47和NC1菌体以“井”字形划线方式接种到培养基，30℃培养2 d。然后用打孔器从培养5 d的P1-1、P2-2、YES-2菌落边缘打取0.6 cm的菌饼，分别接入距HDZ-9-47和NC1菌体0.5 cm的位置。于25 ℃下倒置培养5 d后观察菌株间的生物兼容性。
1.3 溶磷菌株的鉴定
1.3.1 菌株形态学观察: 菌种经标准培养条件培养后，挑取菌体制做显微形态观察切片，于普通光学显微镜下观察，记录菌种的显微形态：包括分生孢子头、顶囊、产孢结构、分生孢子等特征，参照中国真菌志(第五卷)曲霉属及其相关有性型进行描述[18]。
1.3.2 基于菌株微管蛋白β-tubulin基因序列的系统发育学分析: 用热裂解法提取真菌DNA[19]。并用引物βt2a (GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC)和βt2b (ACCCTCAGTG TAGTGACC CTTGGC)扩增真菌微管蛋白β-tubulin基因。PCR扩增产物由北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。利用BLAST程序将β-tubulin序列与数据库中的所有序列进行比对，选取同源性较高与相近种的序列，并利用MEGA 5.0进行系统发育树构建。
1.4 基于平板法的菌株溶磷效果测定 将溶磷菌株制作成菌悬液，取200μL菌悬液于6 cm培养皿中，每个培养皿倒入5颗玻璃珠均匀涂板。25℃培养1 d后用6 mm的打孔器打成菌饼，将菌饼接入含Ca3(PO4)2、Zn3(PO4)2、羟基磷灰石的无机磷平板上，25℃培养5 d后测定溶磷圈直径(D)与菌落直径(d)的比值(D/d)大小，以此来初步确定菌株的溶磷能力。
1.5 基于钼锑抗比色法的菌株溶磷效果进一步测定及GC-MS对产酸物质的分析
1.5.1 磷标准曲线的绘制: 将50 mg/L的磷标液稀释为5 mg/L，分别吸取5 mg/L的磷标液0、2、4、6、8、10 mL至50 mL容量瓶中，加入蒸馏水至体积为30 mL，然后加入2滴2, 4-二硝基酚指示剂，逐滴加入4 mol/L的NaOH溶液至容量瓶中液体呈微黄色，再逐滴加入1 mol/L的H2SO4至黄色刚刚消去，接着加入5 mL钼锑抗显色剂，并用蒸馏水定容至刻度。在常温下显色2 h，然后与上述样品的显色液同在分光光度计上测定吸光度值，波长设定为700 nm。以磷浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制磷标准曲线。
1.5.2 钼锑抗比色法测定发酵液中有效磷的含量: 在500 mL三角瓶中装入50 mL已灭菌的无机磷培养基，难溶磷酸盐浓度为5 g/L，分别接种200 μL菌悬液，25 ℃、200 r/min摇床培养5 d。将发酵液摇匀，取20 mL到离心管中，8000 r/min离心10 min；吸取5 mL上清液到50 mL的容量瓶中，加入蒸馏水至体积为30 mL，加入2滴2, 4-二硝基酚指示剂，再加入1滴1 mol/L的H2SO4至溶液黄色刚好退去，接着加入5 mL的钼锑抗试剂，定容至刻度，在常温下显色2 h。然后与上述样品的显色液同在分光光度计上测定吸光度值，波长设定为700 nm。根据标准曲线计算出对应的有效磷含量。
1.5.3 溶磷菌P1-1、P2-2发酵液pH值的变化: 在500 mL三角瓶中装入50 mL已灭菌的无机磷培养基，难溶磷酸盐浓度为5 g/L，分别接种200μL菌悬液于25℃、200 r/min摇床培养，每隔24 h取5 mL发酵液测定pH值。
1.5.4 气相色谱-质谱法(GC-MS)对发酵液中产酸物质的测定: (1) 样品的制备：在500 mL三角瓶中装入50 mL已灭菌的无机磷培养基，分别接种200μL菌悬液，25℃、200 r/min摇床培养5 d。将发酵液摇匀，取20 mL到离心管中，8000 r/min离心10 min；吸取上清液100μL，加入400 μL冷甲醇，剧烈漩涡1 min，14000 r/min、4℃离心15 min；取400 μL上清液冻干，封口，4℃保存备用。(2)衍生化反应与进样测定：将冻干样品加入100μL 20 mg/mL甲氧胺溶液(溶于吡啶中)，剧烈漩涡1 min，室温超声10 min，37℃水浴1.5 h；加入80μL MSTFA，剧烈漩涡1 min，37℃水浴1 h，14000 r/min、4℃离心15 min；取2μL上清进样。进样测定方法参照文献[20]。
2 结果和分析 2.1 溶磷菌的分离筛选与菌株间的亲和测定
2.1.1 溶磷菌的分离筛选: 从北京市昌平区大豆根围土壤(E116°07.909′；N40°11.303′)中分离到6株具有溶磷特性的菌株。其中，P1-1、P2-2菌株产生的溶磷圈较大，且经传代培养试验后活性和溶磷效果稳定，繁殖能力强。本研究选择这2菌株进行深入研究。
2.1.2 功能菌株间亲和性: 功能复合微生物菌群HDZ-9-47、NC1、YES-2和实验菌株P1-1、P2-2在混合培养基上共培养5 d后的菌落形态如图 1所示。P1-1、P2-2菌株生长良好，且与各菌株间无拮抗现象，表明P1-1、P2-2菌株与功能菌株间均具有良好的生物兼容性，可以用作功能微生物菌群的研究。
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| 图 1 溶磷菌株与杀线虫功能菌株间共培养5 d的菌落形态 Figure 1 The colonial morphology of the phosphate-solubilizing fungi with three biocontrol agents co-cultured for 5 days on plate. |
| 图选项 |
2.2 菌株的鉴定
2.2.1 菌株形态学观察: 菌株在CYA培养基上培养5 d后，P1-1菌株的菌落直径为4.7 cm；菌落颜色从黄色变为黄褐色，反面褐色；菌落质地中心凸起，有放射状沟纹；渗出液少量；顶囊为球形，直径为50–80 μm；分生孢子球形，直径3.0–4.5 μm。P2-2菌株的菌落直径为2.8 cm；菌落颜色为褐色，反面为淡黄褐色；菌落质地有放射状沟纹；渗出液少量；顶囊为球形，直径为50–80μm；分生孢子球形，直径2.8–4.5μm。
2.2.2 菌株微管蛋白β-tubulin序列分析: 利用β-tubulin特异性引物对菌株进行PCR扩增得到520 bp的目的扩增产物。用BLAST程序对菌株P1-1、P2-2的β-tubulin序列与数据库中的所用序列进行核苷酸同源性比对，根据序列相似性构建系统发育树。菌株P1-1、P2-2均为曲霉属真菌，其中，P1-1菌株与黑曲霉(Aspergillus niger)形成同一分支，P2-2菌株与塔宾曲霉(Aspergillus tabingensis)形成相同分支(图 2)。结合形态学特征，菌株P1-1鉴定为黑曲霉，P2-2为塔宾曲霉。
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| 图 2 菌株P1-1、P2-2基于β-tubulin序列同源性构建的系统进化树 Figure 2 Phylogenetic tree of strain P1-1, P2-2 and reference Aspergillus species. Evolutionary distances were calculated by MEGA5; Bootstrap =1000. Bar. 0.05 substitution per nucleotide. |
| 图选项 |
2.3 溶磷菌在不同磷源平板上的效果 P1-1、P2-2菌株在磷酸钙、磷酸锌、羟基磷灰石为磷源的无机磷培养基上于25℃培养5 d后，产生明显的溶磷圈(图 3)。结果初步显示P1-1、P2-2菌株能溶解不同形式的无机磷源。
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| 图 3 溶磷菌在不同磷源的固体培养基上产生的溶磷圈 Figure 3 Halo of phosphate-solubilization microorganism on different solid media. A: CK; B–D: P1-1 in the media containing Ca3(PO4)2 (B), Zn3(PO4)2 (C) and Phosphorite (D). E: CK; F–H: P2-2 in the media containing Ca3(PO4)2 (F), Zn3(PO4)2 (G) and Phosphorite (H). |
| 图选项 |
同时统计P1-1菌株在相应培养基上的溶磷圈的直径(D)与菌落直径(d)的比值D/d的大小分别为1.59、2.89、1.23；P2-2菌株在对应的培养基上D/d值为1.76、3.17、1.29。结果表明P1-1、P2-2菌株对磷酸锌的溶解程度比溶解磷酸钙和磷灰石的能力强(表 1)。
表 1. P1-1、P2-2菌株在不同无机磷培养基中产生溶磷圈的直径与菌落直径的比值 Table 1. Diameter ratio of phosphate dissolving circle and colony circle on the media with different phosphorus source (5 d)
| Strains | Ca3(PO4)2 | Zn3(PO4)2 | Phosphorite | ||||||
| D | d | D/d | D | d | D/d | D | d | D/d | |
| P1-1 | 5.9 | 3.7 | 1.59 | 2.6 | 0.9 | 2.89 | 6.4 | 5.2 | 1.23 |
| P2-2 | 5.8 | 3.3 | 1.76 | 3.8 | 1.2 | 3.17 | 6.6 | 5.1 | 1.29 |
| D: diameter of phosphate-dissolving zone (cm); d: colony growth diameter (cm). | |||||||||
表选项
2.4 溶磷菌在不同磷源发酵液中的效果测定
2.4.1 标准曲线的建立: 将5 mg/L的磷标液稀释为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L，然后在分光光度计上测定吸光度值，波长设定为700 nm。以磷浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标作图，得到y=0.3371x–0.0071 (R=0.9955)的磷标准曲线。
2.4.2 发酵液溶磷效果测定: 以不接菌为对照，Ca3(PO4)2、Zn3(PO4)2、羟基磷灰石培养基的有效磷含量分别是3.98、0.95、4.80 mg/L；P1-1菌株在Ca3(PO4)2、Zn3(PO4)2、羟基磷灰石为磷源的液体培养基中培养5 d后，发酵液中可溶性磷含量分别增加到83.36、64.08、90.18 mg/L，是不接菌溶液的20.94、67.47、18.79倍；接种P2-2后各发酵液中有效磷含量分别是79.50、62.30、86.92 mg/L，是不接菌溶液的19.97、65.58、18.11倍(表 2)。
表 2. 溶磷菌对3种难溶磷酸盐的溶解能力 Table 2. Solubilization ability of P1-1, P2-2 strains to three insoluble phosphates in liquid medium (5 d) (mg/L)
| Strains | Ca3(PO4)2 | Zn3(PO4)2 | Phosphorite |
| No fungi | 3.98 | 0.95 | 4.80 |
| P1-1 | 83.36 | 64.08 | 90.18 |
| P2-2 | 79.50 | 62.30 | 86.92 |
表选项
结果显示，接菌后摇培5 d，溶液中的可溶性磷含量增加了18–90倍，说明溶磷菌株对无机磷的溶解能力极强。
2.4.3 溶磷真菌发酵液中pH值的变化情况: 溶磷菌株P1-1、P2-2在无机磷液体培养基中培养，随着培养时间的延长，pH逐渐下降；经过培养60 h后，pH基本趋于平衡(图 4)。
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| 图 4 溶磷菌在无机磷培养基中pH值的变化 Figure 4 pH variation in culture medium during solubilizing period. A: P1-1; B: P2-2. |
| 图选项 |
2.4.4 气相色谱-质谱(GC-MS)测定结果: 溶磷菌株P1-1、P2-2的GC-MS总离子流色谱图所示，培养5 d后2株溶磷菌产生的挥发性酸性物质相似(图 5)。经NIST谱库检索鉴定出2株溶磷菌产生的酸性物质为草酸、葡萄糖酸、乳酸和甘油酸。
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| 图 5 溶磷菌株P1-1、P2-2发酵液中有机酸GC-MS定性分析图 Figure 5 GC-MS detection of organic acids in phosphate-solubilizing strains metabolite. A: P1-1; B: P2-2. |
| 图选项 |
3 讨论和结论 土壤中存在着大量的能够溶解难溶性磷源的微生物，主要包括溶磷真菌、溶磷细菌和少数几种溶磷放线菌[21]。其中，溶磷真菌主要分布在曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)。研究表明，溶磷曲霉属真菌溶磷效果好且对植物具有明显的促生长作用[22]。本研究从大豆根际土壤中获得了2株溶磷曲霉。其中一株P1-1为常见溶磷黑曲霉(A. niger)，另一株为国内首次报道具有溶磷特性的塔宾曲霉(A. tubingensis)。
微生物的溶磷能力一般有3种测定方法，一是将溶磷菌株在含有难溶性磷酸盐的固体培养基上培养，测定菌落周围产生的透明圈的大小；二是进行液体培养，测定培养液中可溶性磷的含量；三是进行土壤培养，测定其有效磷的含量[7]。范丙全等筛选的2株草酸青霉菌P8和Pn1在难溶无机磷培养基Ca3(PO4)2上培养5 d分别能够产生4.9 cm和4.5 cm的透明圈，而国际上研究和应用较多的拜莱青霉菌(ATCC20851)只能够产生2.4 cm的透明圈[23]。本研究通过平板溶磷圈法初筛发现，P1-1、P2-2菌株在无机磷培养基Ca3(PO4)2上可产生5.9、5.8 cm的透明圈，溶磷效果非常显著。同时，用钼锑抗染色法对溶磷菌株的溶磷效果进行定量测定，溶液中的可溶性磷含量与对照相比增加了18–90倍，结果同样说明2株溶磷菌的溶磷能力非常强。经2种方法测定的溶磷结果较为一致，对Ca3(PO4)2、Zn3(PO4)2、羟基磷灰石均具有较强的溶解效果；其中，无论是P1-1菌株还是P2-2菌株均表现为对Zn3(PO4)2具有更强的溶解能力。
微生物的解磷机制一般认为是由于微生物分泌出有机酸，这些酸既能够降低pH值，又可与铁、铝、钙、镁等离子结合，从而使难溶性磷酸盐溶解。尽管有研究发现培养介质pH值的下降，并不是微生物解磷的必要条件[24]，但越来越多的研究发现溶磷量与培养液中的pH值存在着一定的负相关性[7, 23]。从本研究结果也能看出，随着溶磷量的增加，pH值逐渐降低，推测溶磷菌的溶解能力与溶磷菌的产酸能力相关。据报道，能够溶磷的微生物产生的有机酸多种多样，主要包括草酸、乳酸、苹果酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、氨基乙酸、丁二酸、葡萄糖酸、乙酸、延胡索酸、富马酸、丙酸和葡萄糖酸等[25]。通过气相色谱-质谱法对溶磷菌P1-1、P2-2的产酸种类进行了鉴定，结果发现2株溶磷菌的产酸物质相同，都为草酸、葡萄糖酸、乳酸和甘油酸。2株溶磷菌产酸物质相同的结果可能是由于它们的亲缘关系较近的原因(图 2)。
溶磷微生物拥有溶解难溶磷的能力，被公认为安全、环保、经济、高效的活化土壤难溶磷的生物措施，具有重要的开发应用价值，是微生物肥料研究的好材料。研究表明，人工合成的功能型微生物菌群在控制土壤病害[26]、抵御环境有害生物入侵[27]和增加作物生物量[28]等方面发挥着重要的作用。而合成微生物菌群功能的发挥首先取决于其群落内部物种间是否具备良好的生物兼容性。本研究筛选的溶磷菌株P1-1、P2-2与一组杀根结线虫微生物菌群兼容性好，是构建功能复合微生物肥料的理想材料。
References
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