方翔1, 徐伟芳1, 牛娜2, 欧婷1, 王飞1, 左伟东1, 谢洁1
1.家蚕基因组生物学国家重点实验室, 西南大学生物技术学院, 重庆 400715;
2.深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心, 广东 深圳 518000
收稿日期：2018-01-19；修回日期：2018-05-30；网络出版日期：2018-07-17
基金项目：国家自然科学基金（31601678）；西南大学本科生科技创新基金（20163107002）
*通信作者：谢洁。Tel:+86-23-68251701;Fax:+86-23-68250191;E-mail:healthjie@163.com
摘要：[目的] 利用植物内生拮抗菌防治植物病害是一种有效的生物防治手段。本研究从健康桑树中分离筛选桑椹菌核病拮抗性内生细菌，为桑椹菌核病生物防治提供优良菌种。[方法] 用组织分离培养釆法及抑菌圈法分离、筛选桑椹菌核病拮抗性内生细菌；根据菌体形态、培养特征、生理生化特性及基于16S rDNA序列的系统发育分析，对抑菌活性显著且稳定的菌株进行菌种鉴定；进而利用菌丝生长速率法检测活性发酵液的抑菌谱与热稳定性，并通过单因素及正交试验优化该菌株产生抑菌活性物质的发酵条件。[结果] 从健康桑树中共分离获得55株内生细菌，其中XP-27菌株对核盘菌PZ-2的抑菌活性稳定且拮抗效果明显；XP-27菌株形态、培养特征、生理生化特性与芽孢杆菌属相符，基于16S rDNA序列的系统发育分析结果显示该菌株与多株甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）的亲缘关系最近，且处于系统发育树的同一分枝，故将XP-27菌株鉴定为甲基营养型芽孢杆菌，命名为B.methylotrophicus XP-27；抑菌谱与热稳定性实验结果表明XP-27菌株对灰霉菌SWU5、腐霉菌SWU3等10种常见植物病原菌具不同程度的抑制作用，且其发酵滤液热稳定性强；发酵条件优化结果表明该菌株最佳培养基配方与培养条件为：牛肉膏1.00%，淀粉1.50%，K2HPO4 0.05%，MgSO4·7H2O 0.10%，初始pH值为8.0，培养温度为30℃，接种量为7%，发酵时间为120 h。[结论] 筛选获得的桑树内生细菌B.methylotrophicus XP-27对桑椹菌核病病原菌核盘菌PZ-2具有显著拮抗作用，可作为开发桑椹菌核病生防制剂的候选菌株。
关键词：桑椹菌核病桑树内生菌拮抗菌发酵优化
Screening, identification and optimization of fermentation conditions of an antagonistic endophytic bacterium from mulberry
Xiang Fang1, Weifang Xu1, Na Niu2, Ting Ou1, Fei Wang1, Weidong Zuo1, Jie Xie1
1.State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, College of Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China;
2.Food Inspection and Quarantine Technical Center of Shenzhen Entry and Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen 518000, Guangdong Province, China
Received 19 January 2018; Revised 30 May 2018; Published online 17 July 2018
*Corresponding author: Jie Xie, Tel:+86-23-68251701;Fax:+86-23-68250191;E-mail:healthjie@163.com
Supported by the National Natural Science Foundation of China (31601678) and by the Undergraduate Science and Technology Innovation Fund of Southwest University (20163107002)
Abstract: [Objective] Application of antagonistic endophyte is a potential strategy for biological control of plant diseases. In this study, the antagonistic endophytic bacteria were isolated and screened from healthy mulberry, to provide candidate strains for the biological control of mulberry fruit sclerotiniose. [Methods] Tissue isolation method was used to isolate the endophytic bacteria from healthy mulberry tissues. The endophytic bacterium with strong and stable antagonistic activity on the pathogens of mulberry fruit sclerotiniose was screened by inhibition zone method. The antagonistic bacterium was identified through morphological features, cultural, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA phylogenetic analysis. Antimicrobial spectrum and thermal stability of cell-free fermentation supernatant were assayed by mycelial growth rate. The fermentation conditions and medium composition were optimized through single factor and orthogonal experiment. [Results] In total 55 endophytic bacteria were isolated from healthy mulberry. Among them, strain XP-27 was found to have strong and stable antagonistic activity against Sclerotinia sclerotiorum PZ-2 (the pathogen of mulberry fruit sclerotiniose). Morphological features, cultural, physiological and biochemical characteristics indicated that XP-27 belongs to genus of Bacillus. Based on 16S rDNA phylogenetic analysis, XP-27 was close to the Bacillus methylotrophicus and within the same clade with several strains of Bacillus methylotrophicus. Therefore, strain XP-27 was identified as Bacillus methylotrophicus, and named to be B. methylotrophicus XP-27. Antimicrobial spectrum assayed results showed that strain XP-27 had variously antagonistic activity on 10 plant pathogens and had excellent heat stability. The results of fermentation optimization showed that the optimal medium was composed of 1.00% beef extract, 1.50% starch, 0.05% K2HPO4, 0.10% MgSO4·7H2O and the optimal culture conditions were inoculation size of 7% for 120 h at 30℃ with initial pH 8.0. [Conclusion] The above results indicated that mulberry endophytic bacterium B. methylotrophicus XP-27 has strong antagonistic activity on S. sclerotiorum PZ-2, being a candidate strain for developing the biological control agent against mulberry fruit sclerotiniose.
Keywords: mulberry fruit sclerotiniosemulberry endophyteantagonistic bacteriumfermentation optimization
桑椹又名桑果、乌椹、桑枣，为多年生木本植物桑树(Morus alba L.)的果实。新鲜桑椹不仅含有丰富的维生素、矿物质等营养成分，还富含大量花青素、黄酮等抗氧化活性成分，对人体具有较好的营养与保健功能[1-2]。近年来，随着我国蚕桑产业多元化发展，果用桑树资源发展迅速，初步统计我国果桑种植面积已超过15000 hm2[3]。然而，迅速发展的果桑产业面临着桑椹菌核病(俗称白果病)的严重威胁，该病害在重庆、安徽、浙江、广东、广西、台湾等全国各大桑园均有发生，发病率高达30%–90%[3-4]，给果桑生产带来极大经济损失。桑椹菌核病是一种由真菌引起的果桑病害，桑实杯盘菌(Ciboria shiraiana)[5-6]、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)[7]、肉阜状杯盘菌(Ciboria carunculoides)[8]和桑椹核地杖菌(Scleromitrula shiraiana)[6]等病原真菌均可引起桑果发病。根据染病桑果发病症状及病原菌的不同，可将桑椹菌核病分为桑椹肥大性菌核病、桑椹小粒性菌核病和桑椹缩小性菌核病，其中肥大性菌核病为主要表现形式[4]。目前，生产上防控桑椹菌核病以化学(农药)防治为主，另辅以农业(土壤翻耕，深埋菌核)[9]、物理(覆盖地膜)[10]等防控手段，但农业及物理防治方法耗时费力，且防效甚微；化学法主要是通过多菌灵或甲基托布津等农药对处于花期的桑果进行喷雾防治[11-12]，尽管此法短期内防治效果较好，但易导致农药残留、病原菌产生耐药性、造成环境污染等一系列弊端。近年来，随着人们对食品安全问题的日益重视，使用安全有效的微生物菌剂[13-14]防治桑椹菌核病已逐步成为一种极具潜力的防控手段，但利用此法进行菌核病防治的报道整体较少。因此，寻获能够有效抑制菌核病病菌生长的微生物菌种资源已迫在眉睫。
植物内生菌(Endophytes)是指存在于健康植物体内，但不会引起宿主植物发生明显病害的一类微生物菌群[15]。内生菌因具有抵御植物病原菌[16]、促进宿主植物生长[17]、增加宿主植物抗病虫害能力[18-19]等功能而被广泛应用于植物病害的生物防治。近年来，有关利用桑树内生菌防治桑树病害的研究报道表明桑树中存在大量能够抑制桑树病原菌生长的拮抗菌群，这些菌群是开发桑树病原微生物生防制剂的重要菌种来源[20-23]。牟志美等从健康桑树叶片中分离获得一株对炭疽病菌具较好抑菌作用的伯克霍尔德氏菌LU10-1[20]；谭广秀从野生型鲁桑枝条分离筛选出的枯草芽孢杆菌ME1对多种病原菌拮抗效果显著[21]；本实验室前期亦从健康桑树中分离得到多种对金黄色葡萄球菌、白僵菌、绿僵菌、丁香假单胞菌等致病菌有明显抑制效果的内生细菌[22-23]。
本研究以一种桑椹肥大性菌核病的病原菌核盘菌[7](Sclerotinia sclerotiorum) PZ-2为靶标，从健康桑树中分离筛选对病菌具有较强抑制作用的内生细菌，测试其抑菌谱与发酵滤液的热稳定性，并优化其抑菌活性物质产生的发酵条件，为利用桑树内生菌进行桑椹菌核病生物防治奠定基础。
1 材料和方法 1.1 供试材料和培养基 供试桑树材料：2015年9月，于重庆市蚕业科学技术研究院桑园(N 29°50' E 106°25')采伐新伦教品种2年生健康植株的枝条(离地约1.5–2.0 m)，采集的枝条用自来水洗净晾干后，于4 ℃保存备用。
供试病原菌：核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum) PZ-2、桑椹核地杖菌(Scleromitrula shiraiana) SXSG-5为本实验室分离保存。腐霉菌(Pythium aphanidermatum) SWU3、灰霉菌(Botrytis cinerea) SWU5、大丽花轮枝孢(Verticillium dahliae) SWU6、榆梢枯长喙霉(Ceratocystis ulmi) SWU10、木霉属菌(Trichoderma sp.) SWU11、烟草疫霉(Phytophthora nicotianae) SWU20、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani) SWU22、链铬孢菌(Alternaria alternata) SWU26为本实验室收集保存。
培养基：(1)发酵培养基(g/L)：淀粉10.0，胰蛋白胨10.0，KH2PO4 1.0，MgSO4·7H2O 0.1，pH 7.0；(2)碳源基础培养基(g/L)：蛋白胨10.0，NaCl 1.0，pH 7.0；(3)氮源基础培养基(g/L)：葡萄糖10.0，NaCl 1.0，pH 7.0；(4)无机盐基础培养基(g/L)：葡萄糖10.0，蛋白胨5.0，pH 7.0。
1.2 桑树内生菌的分离纯化 采用组织分离培养法[24]进行内生菌的分离：取长约5 cm桑枝茎段，置于75%酒精中完全浸没，取出后于酒精灯上点燃，待茎段表面乙醇燃尽后，在培养基上滚一圈，验证消毒是否彻底。随后用无菌刀片将样品分层剖开，切成小块分别置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、高氏一号培养基(GA)、琼脂培养基(WA)上，于28 ℃培养，逐日观察，待切口边缘长出细菌时，及时挑取并釆用平板划线法进行纯化。
1.3 内生拮抗菌的筛选 将获得的内生细菌纯培养物接种于PDB培养基，于28 ℃摇床180 r/min恒温培养4 d，收集发酵液，10000 r/min离心30 min，取上清过0.22 μm滤膜制备无菌发酵滤液。以核盘菌PZ-2作为靶标菌株，灭菌PDB培养基为对照，釆用抑菌圈法[22]检测发酵液抑菌活性，筛选对核盘菌PZ-2生长具有抑制作用的内生拮抗菌，并选取抑菌活性稳定且效果显著的拮抗菌用于后续研究。发酵液抑菌活性具体检测方法为：在新鲜PDA平板中央接种PZ-2菌饼，并在距离菌饼中心30 mm处用8 mm直径的打孔器打孔，孔内加入200 μL内生细菌无菌上清发酵液，25 ℃培养1周，测量抑菌圈直径，以此判断内生细菌发酵液抑菌活性。
1.4 内生拮抗菌的鉴定
1.4.1 菌体培养特征、形态观察及生理生化特征测定: 目标菌株培养特征观察、菌落形态观察以及运动性、淀粉水解、明胶液化、氧化酶、硝酸盐还原等生理生化特性测试等实验，均参照文献[25-27]的方法进行。
1.4.2 菌体分子生物学鉴定和系统发育分析: 提取目标菌株基因组，并以其为模板，采用引物27 F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′进行16S rDNA扩增。PCR反应条件为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序，将获得的基因序列拼接后在NCBI (https:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行同源性比较分析，下载同源性较高的菌种序列信息，用ClustalX 2.0程序进行多重序列比对，利用MEGA 6.0软件邻接法(Neighbor-joining method)进行1000次步长计算，构建系统发育树[28]。
1.5 拮抗菌株发酵液热稳定性检测 将拮抗菌株XP-27接种于发酵培养基，参照方法1.3制备拮抗菌株无菌上清液，取等量无菌发酵上清液分别在40、60、80、100 ℃处理30 min，冷却至室温后，用菌丝生长速率法[29]检测其对核盘菌PZ-2的抑菌活性。具体方法为，将PDA培养基高压灭菌后冷却至50 ℃左右，以5%的比例混入不同温度处理后的拮抗菌无菌发酵上清液制备检测平板，以混入未经热处理的拮抗菌无菌发酵上清液平板作阳性对照，以未加发酵滤液的PDA平板作为阴性对照，接入直径0.5 cm的核盘菌PZ-2菌饼后，置于25 ℃培养箱中培养5 d，每处理组3个重复。实验结束后，用十字交叉法测量病原菌菌落直径，根据以下公式(1)计算抑菌率[30]。
 | 公式(1) |
1.7 拮抗菌株发酵条件优化 参照方法“1.3”的抑菌圈法检测不同碳氮源对XP-27菌株产生抑菌活性物质的影响。参照方法1.5的菌丝生长速率法检测其余发酵条件(无机盐、温度、pH、接种量以及发酵时间等)对XP-27菌株产生抑菌活性物质的影响，为便于抑菌效果的观察，此处检测平板中所含无菌发酵上清液的比例为1%。最后采用抑菌圈法对优化后的培养基配方与培养条件进行验证。
1.7.1 培养基成分优化: (1) 碳源优化：在其他条件不变的情况下，在碳源基础培养基中分别加入1.0%的葡萄糖、麦芽糖、乳糖、玉米粉、淀粉和蔗糖作为碳源，以碳源基础培养基为对照；(2)氮源优化：在其他条件不变的情况下，在氮源基础培养基中分别加入1.0%的NaNO3、KNO3、NH4NO3、牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、(NH4)2SO4和酵母浸出粉作为氮源，以氮源基础培养基为对照；(3)无机盐优化：在其他条件不变的情况下，根据菌体对大量元素和微量元素的需求量不同，对MgSO4、NaCl、KH2PO4、K2HPO4和CaCl2五种大量元素设置0.05%、0.10%和0.15%共3个浓度梯度，对MnSO4、ZnSO4和FeSO4三种微量元素设置0.0001%、0.0005%和0.0010%共3个浓度梯度，以无机盐基础培养基为对照。
1.7.2 正交试验: 根据培养基成分单因素实验的结果，选择最佳有机氮源(牛肉膏)、碳源(淀粉)、无机盐(K2HPO4和MgSO4)共4个因素，设置3个水平，进行正交试验(表 1)。发酵实验设计3次重复，取3次实验的平均值作为发酵配方的实验结果。
表 1. L9 (34)正交因素与水平 Table 1. Factors and levels of L9 (34) orthogonal test
| Levels | Beef extract/% (A) | Starch/% (B) | K2HPO4/% (C) | MgSO4/% (D) |
| 1 | 0.5 | 0.5 | 0.05 | 0.05 |
| 2 | 1.0 | 1.0 | 0.10 | 0.10 |
| 3 | 1.5 | 1.5 | 0.15 | 0.15 |
表选项
1.7.3 培养条件优化: 基于优化的发酵培养基，检测XP-27菌株在不同培养条件下获得发酵液的抑菌效果。(1)起始pH：设置5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0共8个起始pH值，其他条件一致，接种后于28 ℃、180 r/min培养4 d，检测抑菌效果，确定最适起始pH值；(2)温度：设置20、25、28、30、37、40 ℃共6个温度，其他条件一致，接种后置于180 r/min培养箱中培养4 d，检测抑菌效果，确定最适温度；(3)接种量：设置0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、5.0%、7.0%、9.0%和10.0%共8个接种量，其他培养条件一致，在28 ℃、180 r/min培养4 d，检测抑菌效果，确定最适接种量；(4)发酵时间：设置12、24、36、48、72、96、120、144 h共8个发酵时间，其他培养条件一致，在28 ℃、180 r/min条件下培养后，检测抑菌活性，确定最适发酵时间。
2 结果和分析 2.1 内生拮抗菌的分离筛选 从健康桑树新伦教(桑树品种)茎中共分离出55株内生细菌，以核盘菌PZ-2作为指示菌，初筛获得15株具有抑菌活性的内生拮抗菌，其中8株内生菌抑菌活性较强，复筛确定抑菌效果显著且稳定的XP-27菌株(图 1)开展后续研究。
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| 图 1 XP-27菌株发酵液对核盘菌PZ-2生长抑制情况 Figure 1 Inhibitory effect of fermentation filtrates from strain XP-27 against growth of Sclerotinia sclerotiorum PZ-2. CK: PDB medium; T: The fermentation supernatant of XP-27 strain. Observed the results at the second day after inoculation the target strain. |
| 图选项 |
2.2 拮抗菌株XP-27的鉴定
2.2.1 形态学鉴定: 将筛选获得的拮抗菌XP-27菌株接种至PDA培养基，培养48 h后，菌落呈圆形，表面及边缘粗糙，呈乳白色，蜡状(图 2-A)。XP-27菌株革兰氏与芽孢染色结果表明，该菌体为革兰氏阳性杆状菌株，且能产芽孢(图 2-B、C)。
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| 图 2 XP-27菌株的形态学特征 Figure 2 The morphological features of XP-27 strain. A: the colony characteristic of strain XP-27 on PDA after 48 h cultured; B: Gram stain result; C: spore stain result. |
| 图选项 |
2.2.2 生理生化试验: 生理生化试验结果表明，XP-27菌株能够水解淀粉，液化明胶，还原硝酸盐，过氧化氢酶、卵黄卵磷脂酶以及酪素水解呈阳性，能够在含有7% NaCl的培养基中生长，在半固体琼脂培养基中扩散生长表明其具有运动性(表 2)。综合对XP-27菌株的生长特性及形态特征观察，判断其为芽孢杆菌属菌株。
表 2. XP-27菌株生理生化实验结果 Table 2. Physiological and biochemical characteristics of XP-27 strain
| Test items | Results |
| Mannose | – |
| Simon’s phosphate | + |
| Semi-solid agar | + |
| Gas of glucose | – |
| Peptone hydrolysis | – |
| Nitrate reduction | + |
| Starch hydrolysis | + |
| Lecithinase | + |
| Triple sugar iron agar | + |
| Gelatine liquefication test | + |
| Arabinose | – |
| Xylose | – |
| Glucose phosphate | – |
| Calalase | + |
| 7% NaCl | + |
| Casein hydrolysis | + |
| Phenylalanine deaminase | – |
| +: positive (growth or reaction); –: negative (no growth or no reaction). | |
表选项
2.2.3 XP-27菌株16S rDNA序列测定及系统发育分析: 将XP-27菌株16S rDNA扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，得到长度为1456 bp的片段，提交该序列相关信息至GenBank，获得登录号MF375212，将该序列与GenBank中序列进行在线比对，结果显示其与多株Bacillus methylotrophicus菌株16S rDNA序列的同源性高达99%。基于16S rDNA系统发育分析结果显示，XP-27菌株与登录号为NR116240、KC790266及KC790325等甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus (又名Bacillus velezensis[31])的亲缘关系最近，处于系统发育树的同一分枝(图 3)。
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| 图 3 XP-27菌株基于16S rDNA的系统发育树 Figure 3 Phylogenetic tree of XP-27 strain based on 16S rDNA sequences. Numbers at the nodes represented the bootstrap values based on neighbor-joining analyses of 1000 resampled datasets. Numbers in parentheses represented the sequences' accession number in GenBank. The scale bar indicates 0.5% sequence divergence. Target strain was labeled in bold. |
| 图选项 |
结合XP-27菌株的形态学特征、生理生化反应特征，以及基于16S rDNA序列的系统发育分析结果，鉴定该菌株为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)，命名为B. methylotrophicus XP-27。
2.3 拮抗菌株XP-27发酵液热稳定性检测 内生拮抗菌XP-27菌株发酵液经40、60、80 ℃处理30 min后，其对核盘菌PZ-2的抑菌活性几乎没有改变(图 4-C、D、E)，100 ℃处理30 min之后，指示菌有少量菌丝生长(图 4-F)，热稳定性测试结果表明XP-27发酵液活性物质具有较强的热稳定性，这将有利于该菌株应用于桑椹菌核病的田间防治。
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| 图 4 不同温度处理XP-27菌株无菌发酵液对核盘菌PZ-2抑菌效果检测 Figure 4 Assay the inhibitory activity of XP-27 strain cell-free fermentation supernatant after being treated under different temperatures on Sclerotinia sclerotiorum PZ-2. A: PDA medium; B: PDA medium+XP-27 strain cell-free fermentation supernatant; C–F: PDA medium+XP-27 strain cell-free fermentation supernatant treated at 40 ℃, 60 ℃, 80 ℃ and 100 ℃ for 30 min respectively. Observed the results at the fifth day after inoculation the target strain. |
| 图选项 |
2.4 拮抗菌株XP-27抑菌谱检测 抑菌谱测试结果表明，XP-27菌株对多种病原菌具有较强的抑制作用，尤其对桑椹菌核病病菌桑椹核地杖菌SXSG-5和核盘菌PZ-2的抑菌效果最为显著，抑菌率高达98.23%和99.72% (表 3)。因此，XP-27菌株有望开发成为桑椹菌核病的生防菌株。
表 3. XP-27菌株发酵滤液对多种病原真菌的抑制作用 Table 3. The inhibition of sterile fermentation filtrate of strain XP-27 on plant pathogenic fungi
| Pathogen | Inhibition rate/% (x±s, n=3) |
| Pythium aphanidermatum SWU3 a | 23.16±1.86 |
| Trichoderma sp. SWU11 b | 54.04±0.66 |
| Botrytis cinerea SWU5 b | 77.96±0.69 |
| Rhizoctonia solani SWU22 | 17.73±0.99 |
| Ceratocystis ulmi SWU10 | 25.29±1.63 |
| Phytophthora nicotianae SWU20 | 25.96±0.42 |
| Alternaria alternata SWU26 | 17.26±3.37 |
| Scleromitrula shiraiana SXSG-5 | 98.23±1.39 |
| Sclerotinia sclerotiorum PZ-2 | 99.72±0.16 |
| Verticillium dahlia SWU6 | 26.09±10.65 |
| Inhibition rate were calculated as a percentage of growth inhibition as compared to control test organism in inoculated 7-day for most organisms (a: 2-day, b: 3-day). Tests were conducted in triplicate and results varied as indicated by standard deviation. | |
表选项
2.5 XP-27菌株发酵条件优化
2.5.1 培养基成分优化: 通过单因素试验检测不同碳源、氮源以及无机盐对拮抗菌株产抑菌活性物质的影响。结果表明，利用所选的6种碳源培养的XP-27菌株均可产生抑菌活性物质，其中以淀粉为碳源培养该菌株的发酵液抑菌活性最高，抑菌圈大小为16.84 mm，较对照组提高了70.34%，其次是蔗糖、乳糖、玉米粉和葡萄糖(图 5-A)，故淀粉为最适碳源；利用所选8种氮源培养XP-27菌株均可产生抑菌活性物质，其中牛肉膏为氮源培养该菌的发酵液抑菌活性最高，抑菌圈大小可达17.22 mm，其次是胰蛋白胨、酵母浸出粉(图 5-B)，故牛肉膏为最适氮源；在选用的8种无机盐(5种大量元素和3种微量元素)中，浓度为0.15%的K2HPO4最有利于XP-27菌株产生抑菌活性物质，其抑菌率可达到81.40% (图 5-C)。
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| 图 5 不同碳氮源和无机盐对B. methylotrophicus XP-27发酵液抑菌活性的影响 Figure 5 Effect of different carbon sources, nitrogen sources and inorganic salts on inhibition activity of B. methylotrophicus XP-27 sterile fermentation supernatant. A: Different carbon sources; B: Different nitrogen sources; C: Different inorganic salts. Means represent the value of three replicates. Lines above the bars represent standard error (SE) of the mean within the treatments. |
| 图选项 |
2.5.2 正交试验: 以牛肉膏(A)、淀粉(B)、K2HPO4(C)和MgSO4(D)为因素，按L9(34)正交表设计4因素3水平的正交试验，通过测定XP-27菌株对桑树病原菌核盘菌PZ-2的抑菌活性大小，确定最优发酵配方。正交试验的极差分析表明，4个因素对核盘菌PZ-2的抑菌率的影响为A > B > D > C，最佳水平组合是A2B3C1D2 (表 4)；方差分析结果表明，因素A对XP-27发酵液抑菌活性影响显著，因此确定培养基的最佳配方为：牛肉膏1.00%，淀粉1.50%，K2HPO4 0.05%，MgSO4·7H2O 0.10%。
表 4. B. methylotrophicus XP-27发酵培养基正交设计L9 (34)及试验结果 Table 4. Optimization of culture medium design L9 (34) for B. methylotrophicus XP-27 fermentation
| Number | A | B | C | D | Antibacterial rate/% |
| Test 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 2.47 |
| Test 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 11.73 |
| Test 3 | 1 | 3 | 3 | 3 | 46.79 |
| Test 4 | 2 | 1 | 2 | 3 | 12.96 |
| Test 5 | 2 | 2 | 3 | 1 | 19.51 |
| Test 6 | 2 | 3 | 1 | 2 | 77.16 |
| Test 7 | 3 | 1 | 3 | 2 | 66.67 |
| Test 8 | 3 | 2 | 1 | 3 | 67.28 |
| Test 9 | 3 | 3 | 2 | 1 | 71.36 |
| X1 | 20.330 | 27.367 | 48.970 | 31.113 | |
| X2 | 36.543 | 32.840 | 32.017 | 51.853 | |
| X3 | 68.437 | 65.103 | 44.323 | 42.343 | |
| R | 48.107 | 37.736 | 16.953 | 20.740 |
表选项
2.5.3 培养条件的优化: 在确定培养基成分优化结果的基础上，对该拮抗菌株发酵条件进行单因素优化试验。结果表明，不同培养条件对该菌株产生发酵液的抑菌活性影响较大，如图 6所示。pH过高或过低，均会显著降低发酵液的抑菌活性，初始pH值为8.0时抑菌活性最强(图 6-A)；与其他培养温度相比，菌株在30 ℃培养，发酵液抑菌活性最强，抑菌率可达43.51% (图 6-B)；当接种量控制在7.0%时，发酵液活性达到最大值53.02% (图 6-C)；同时，菌株发酵时间亦对发酵液抑菌活性影响较大，随着培养时间延长发酵液抑菌活性逐渐增加，待到菌株培养120 h时其抑菌活性最强，可达65.14%，随后培养时间过长抑菌活性呈现下降趋势(图 6-D)。综上可知，拮抗菌株XP-27发酵培养基的最适初始pH为8.0，最适培养温度为30 ℃，最适初始接种量为7.0%，最适培养时间为120 h。
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| 图 6 不同培养条件对B. methylotrophicus XP-27发酵液抑菌活性的影响 Figure 6 Effect of different culture conditions on the inhibition activity of B. methylotrophicus XP-27 cell-free fermentation supernatant. A: different pH; B: different temperature; C: different inoculation amount; D: different time. Means represent the value of three replicates. Lines above the bars represent standard error (SE) of the mean within the treatments. |
| 图选项 |
利用优化后的培养基配方和发酵条件培养XP-27菌株，进行优化结果的验证。结果表明，优化后XP-27菌株等量发酵上清液的抑菌圈(16.33±1.86) mm显著大于PDB培养基发酵上清液的抑菌圈(9.17±1.72) mm，抑菌效果提高了78.18%。这表明优化后的发酵培养基组成与发酵条件有利于抑菌活性物质的生成。
3 讨论 本研究从桑树品种新伦教健康植株的茎中，选获1株内生拮抗细菌甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus XP-27菌株，其4 d无菌发酵液对肥大性桑椹菌核病菌S. sclerotiorum PZ-2的抑菌率高达99.72%。B. methylotrophicus XP-27菌株对缩小性桑椹菌核病菌桑椹核地杖菌S. shiraiana SXSG-5及灰霉菌B. cinerea SWU5等植物病原菌亦表现出较强的抑菌活性，且其抑菌活性发酵液具有极强的热稳定性，经100 ℃处理30 min后，抑菌活性无显著改变。
芽孢杆菌是一类好氧或兼性厌氧、能产生抗逆性内生芽孢的杆状细菌，广泛分布于土壤、水体等多种自然环境，亦是常见的植物内生菌。玉米[32]、水稻[33]等多种植物组织中均有芽孢杆菌的分布。本小组前期研究亦从健康桑树中分离获得大量芽孢杆菌，且其为桑树内生细菌的优势种群[24]。芽孢杆菌可通过生成抑菌活性物质[34]、竞争性排阻[35]、诱导宿主植物产生抗病性[32]等多种机理抑制植物病原菌生长，提高宿主植物的抗病抗逆能力。甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)作为芽孢杆菌属的重要种群，广泛分布于各类植物，并发挥着潜在生防作用。武利勤等从石斛中分离出的甲基营养型芽孢杆菌RA对石斛黑斑病等8种植物病原菌有较强的抑菌效果[36]；姜云等从人参中分离出的甲基营养型芽孢杆菌NJ13可用于人参锈腐病的防治[37]；蔡丽等从茶树中分离出的甲基营养型芽孢杆菌FH01对核桃叶枯叶病等多种植物病原菌有很强的抑菌作用[38]。本文研究从健康桑树中分离获得的甲基营养型芽孢杆菌XP-27菌株，亦展现出对桑椹菌核病的生物防治潜能。
抑菌活性物质的生成是生防菌株发挥防病功能的重要机制之一，而活性物质的生成效率不仅与菌株自身遗传特性相关，亦受菌株培养条件影响。为提高XP-27菌株抑菌活性物质的产量，本研究对其发酵培养基成分和培养条件进行优化，优化后的培养基成分和培养条件能够显著提高XP-27菌株等量发酵液的抑菌活性。后续研究将在本文研究基础上，分离纯化B. methylotrophicus XP-27菌株抑菌活性发酵液的主要抑菌活性成分，深入探究该菌株对菌核病菌具有抑制作用的相关机理，并评估其用于桑椹菌核病生物防治的安全性及田间防病效果，为在生产中利用该菌株进行桑椹菌核病的生物防治奠定坚实的研究基础。
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