黄奇洪, 马家兴, 倪金凤, 申玉龙
山东大学微生物技术国家重点实验室, 山东 济南 250100
收稿日期：2017-05-08；修回日期：2017-06-13；网络出版日期：2017-07-05
基金项目：国家自然科学基金（31470200，31670061）；中国博士后科学基金（11200077311030）
作者简介：申玉龙，1989于兰州大学获得硕士学位，1993-1996在英国伯明翰大学学习，并获博士学位。曾在中国农业科学院(1989-1993)、日本农林水产省果树研究所(1997-1999) 和日本通产省生命工学研究所(产业技术综合研究所)工作(1999-2003)，2003年11月回国。近十多年来一直从事极端嗜热古菌方面的研究，主要研究方向为硫化叶菌DNA修复及基因组稳定性维持的机制、古菌细胞分裂与病毒出芽机制，以及蛋白翻译后修饰对上述过程的调控，同时对极端微生物的多样性、嗜热酶的分离、鉴定与应用，以及古菌遗传操作体系的利用与改良等也开展研究。已在Molecular Microbiology、Journal of Molecular Biology、Nucleic Acids Research、Journal of Chemical Biology、DNA Repair、Journal of Bacteriology、Extremophiles等期刊上发表论文多篇
*通信作者：申玉龙, Tel/Fax:+86-531-88362903, E-mail:yulgshen@sdu.edu.cn
摘要：[目的]开发可用于在极端嗜热嗜酸模式泉古菌冰岛硫化叶菌（Sulfolobus islandicus）中进行高效表达的eCGP123（enhanced consensus green protein variant 123）荧光蛋白，并用作S.islandicus的细胞内蛋白定位工具。[方法]绿色荧光蛋白突变体eCGP123具有极高的热稳定性、耐酸性和可逆的荧光特性等。本研究主要对eCGP123的基因根据S.islandicus密码子偏好性进行优化与合成，在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达并研究其蛋白性质；通过在eCGP123的C末端分别融合具有不同细胞内定位的蛋白（包括E.coli来源的FtsZ和S.islandicus来源的UpsE、PCNA1和SiRe_1200等），构建eCGP123及其融合蛋白的表达菌株，用激光共聚焦显微镜分析eCGP123及其融合蛋白在E.coli和S.islandicus活细胞中的亚细胞定位。[结果]我们确认了在E.coli中表达并纯化密码子优化后的eCGP123具有与野生型绿色荧光蛋白相同的吸光值和较高的热稳定性。细胞学分析显示细胞分裂相关蛋白FtsZ和SiRe_1200分别主要定位于E.coli和S.islandicus分裂细胞的中间；鞭毛组分蛋白UpsE呈点状均匀分布，可能定位于细胞膜上；DNA复制滑动夹亚基PCNA1呈区域性点状分布，暗示了DNA复制区域的位置。蛋白的亚细胞定位与预期结果基本吻合。[结论]绿色荧光蛋白eCGP123可以作为报告蛋白，应用于S.islandicus细胞的蛋白定位分析中，可作为该模式菌株中功能基因研究的重要工具，但需要进一步优化条件。
关键词： 绿色荧光蛋白 eCGP123 密码子优化 冰岛硫化叶菌 亚细胞定位
Expression and application of an improved green fluorescence protein in the hyperthermophilic acidophile Sulfolobus islandicus
Qihong Huang, Jiaxing Ma, Jinfeng Ni, Yulong Shen
State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, Jinan 250100, Shandong Province, China
Received 8 May 2017; Revised 13 June 2017; Published online 5 July 2017
*Corresponding author: Yulong Shen, Tel/Fax: +86-531-88362903; E-mail: yulgshen@sdu.edu.cn
Supported by the National Natural Science Foundation of China (31470200, 31670061) and by the China Postdoctoral Science Foundation (11200077311030)
Abstract: [Objective]To explore an efficiently expressed fluorescence protein, enhanced consensus green protein variant 123 (eCGP123), and its application on sub-cellular localization of proteins in the thermophilic acidophile Sulfolobus islandicus.[Methods]eCGP123 exhibits extreme thermostability, acid stability and reversible photo-switching. We optimized the sequence of eCGP123 gene according to S. islandicus codon usage. The protein purified from E. coli was characterized. We fused various proteins with different cellular localizations at C-terminal of eCGP123, including FtsZ from E. coli, and UpsE, PCNA1 and SiRe_1200 from S. islandicus. We constructed eCGP123 and its fusion proteins expression strains and analyzed their sub-cellular localizations in the host cells by laser confocal microscopy.[Results]Consistent with previous results, the optimized eCGP123 expressed from E. coli had the same absorption spectrum as the wild type green fluorescence protein and was thermostable in vitro. We found that the cell division proteins FtsZ and SiRe_1200 mainly localized at the mid-cell of E. coli and S. islandicus, respectively. The pili component protein UpsE evenly distributes in the cells as dots, while DNA replication clamp subunit PCNA1 formed several foci in certain area of a cell indicating the locations of DNA replication.[Conclusion]The optimized eCGP123 can utilized as a protein reporter for analysis of protein sub-cellular localizations in S. islandicus. This will be an important tool for functional studies of genes in the model species. However, more improvements are still needed for the application.
Key words: green fluorescence protein (GFP) eCGP123 codon optimation Sulfolobus islandicus subcellular localization
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)最早由Shimomura等于1962年在研究维多利亚多管水母(Aequorea victoria)中冷光蛋白aequorin时所发现[1]，它是一种酸性、呈球状的可溶性生物发光蛋白，在紫外光或蓝光激发下，无论是单独存在还是与其他蛋白质融合都具有自发荧光的特性，而且基本上不影响融合蛋白的结构和功能以及细胞的正常生长。GFP的分子量小，gfp基因序列短，目前已经广泛应用于真核生物和原核生物的基因表达标记、蛋白质的运输和定位、蛋白质的相互作用、蛋白质构象变化以及生物传感器等研究领域。
由于野生型GFP及其大多数突变体的蛋白合成和折叠速度较慢，荧光强度受表达温度和酸碱度的影响较大，表达量较低，在高温强酸下结构不稳定，因此无法应用于高温及强酸、强碱条件下的微生物细胞中。Kiss等以之前报道的绿色荧光蛋白突变体CGP (consensus green protein)为模板[2]，通过反复的随机突变和筛选，获得一个增强的绿色荧光蛋白突变体eCGP123 (enhanced CGP variant 123)。eCGP123全长245个氨基酸，分子量约为28 kDa，Gln62、Tyr63和Gly64经环化和氧化形成发光基团。通过体外的生化性质鉴定发现，eCGP123的激发光谱(λmax=495 nm)和发射光谱(λmax=505 nm)与野生型GFP的基本一致，而其蛋白的热稳定性、耐酸性以及蛋白折叠效率均显著提高[3]。因此，eCGP123理论上可作为高温强酸条件下的荧光标记物。硫化叶菌(Sulfolobus)是泉古菌中可以进行遗传操作的模式菌株，其生长条件为pH 1.0-5.5、65-85 ℃，是好氧及兼性自养的古菌[4]。虽然Henche等在研究嗜酸热硫化叶菌(S. acidocaldarius)细胞表面Ⅳ型菌毛不同结构缺失突变体对细胞被膜形成的影响时，首次融合表达了eCGP123[5]。然而，eCGP123能否用于硫化叶菌进行蛋白的亚细胞定位及体内蛋白互作研究还不清楚，如果可行，将极大促进该模式菌株中的各功能基因的研究。
本研究主要对eCGP123的基因进行密码子优化与合成，鉴定表达蛋白的性质，并将eCGP123与具有不同细胞定位的目的蛋白融合，分别在大肠杆菌(Escherichia coli)和冰岛硫化叶菌(S. islandicus)两种细胞中进行表达，同时检测荧光分布，分析目的蛋白的亚细胞定位，探索eCGP123在S. islandicus活细胞中用于蛋白定位的可行性。
1 材料和方法 1.1 菌株、质粒与生化试剂 E. coli DH5α与E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL为本实验室保存，菌株S. islandicus E233S是lacS和pyrEF基因双缺失菌株[6]。所用载体为pET-22b、Sulfolobus-E. coli穿梭载体pSeSD (带pyrEF标记基因)[7]。限制性内切酶、DNA Ligation Kit购自宝生物工程有限公司(TaKaRa)，EasyPfu DNA聚合酶购自北京全式金公司，Gel Extraction Kit、Plasmid Mini Kit、Cycle-Pure Kit购自OMEGA公司，HRP标记的羊抗兔/羊抗鼠二抗、硫化叶菌固体培养基的凝固剂Gelrite/Phytagel购自美国Sigma公司，抗His-tag的多克隆抗体购自杭州华安公司，Ni2+-NTA琼脂糖树脂购自Invitrogen公司，其余试剂均为国产分析纯。
1.2 培养基
1.2.1 硫化叶菌MCSV液体培养基: 无机盐培养基(M)、0.2%酸水解酪蛋白(Casamino acid，C)、0.2%蔗糖(S)与1 mL/L 1000×维生素混合液(V)，pH 3.3[6]。
1.2.2 MTSV液体培养基: 无机盐培养基(M)、0.2%蛋白胨(T)、0.2%蔗糖(S)与1 mL/L 1000×维生素混合液(V)，pH 3.3。
1.2.3 MTAV液体培养基: 无机盐培养基(M)、0.2%蛋白胨(T)、0.2%阿拉伯糖(A)与1 mL/L 1000×维生素混合液(V)，pH 3.3。
1.2.4 硫化叶菌固体培养基: 在相应的液体培养基中增加MgCl2/Ca(NO3)2的含量至10倍，并加入0.8%的凝固剂Gelrite/phytagel，pH 3.6-3.8。
1.3 eCGP123基因的优化与合成 根据eCGP123的氨基酸序列[8]和S. islandicus中密码子的偏好性，由上海捷瑞生物工程有限公司优化eCGP123基因的密码子(不含终止密码子)。优化后的eCGP123基因序列和所用引物的合成、基因的测序均由华大基因完成。
1.4 eCGP123及其融合蛋白表达质粒的构建 从NCBI网站上分别查找E. coli中ftsZ (EG10347)以及S. islandicus中upsE (SiRe_1879)、pcna1 (SiRe_1602)和SiRe_1200等目的基因，设计引物(表 1)并扩增出基因片段。将eCGP123基因分别连接到pET-22b和pSeSD质粒的Nde Ⅰ/Sal Ⅰ和Nde Ⅰ/Mlu Ⅰ酶切位点间，测序成功后，在eCGP123基因的3′-末端连接上目的基因。其中，ftsZ连接到pET22b-eCGP123的Sal Ⅰ/Not Ⅰ之间，而upsE、pcna1和SiRe_1200分别连接到pSeSD-eCGP123的Mlu Ⅰ/Sal Ⅰ之间。通过测序，最后得到pET22b-eCGP123-C-His、pET22b-eCGP123-FtsZ-C-His、pSeSD-eCGP123-C-His、pSeSD-eCGP123-UpsE-C-His、pSeSD-eCGP123-PCNA1-C-His和pSeSD-eCGP123-SiRe_1200-C-His等表达质粒。
表 1. 本研究中所用的引物 Table 1. Oligonucleotide primers used in this study
| Gene | Primers | Sequence (5′→3′)* |
| eCGP123 | eCGP123-Nde Ⅰ-For | CAGAGAGTCATATGGGAGCACATGCA |
| eCGP123-Mlu Ⅰ-Rev | GGACGCGTTGTAGAGTCTAATCCTA | |
| eCGP123-Sal Ⅰ-Rev | CCTGGTCGACTGTAGAGTCTAATCC | |
| ftsZ | ftsZ-Sal Ⅰ-For | CATCGTCGACATGTTTGAACCAATGGAACTTAC |
| ftsZ-Not Ⅰ-Rev | TATCAACGCGGCCGCATCAGCTTGCTTAC | |
| upsE | upsE-Mlu Ⅰ-For | GGACGCGTATGAATATTCTTCAAGAGTATTCTG |
| upsE-Sal Ⅰ-Rev | CTAGGTCGACAATAGCCTTTGTCTCAACT | |
| pcna1 | pcna1-Mlu Ⅰ-For | GGACGCGTATGTTTAAGATTATTTACCCTAATGCG |
| pcna1-Sal Ⅰ-Rev | GCCGGTCGACTAACCTTGGTGCTAT | |
| SiRe_1200 | SiRe_1200-Mlu Ⅰ-For | GAACGCGTATGGCCTCAAGTAAAGTGG |
| SiRe_1200-Sal Ⅰ-Rev | CGCCGTCGACTTTCTGCTCTTGATTAG | |
| *: The restriction sites were underlined. | ||
表选项
1.5 E. coli中蛋白表达与纯化 将表达质粒pET22b-eCGP123-C-His和pET22b-eCGP123-FtsZ-C-His通过热激法转入到E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL细胞中，在60 mL含100 μg/mL氨苄青霉素、34 μg/mL氯霉素的LB液体培养基中培养。当菌液OD600值达到0.4-0.6时，加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L，在37 ℃下继续振荡培养4-6 h。4 ℃、7000×g离心10 min，收集菌体。加入10 mL破壁缓冲液A (50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L NaCl)，充分重悬菌体沉淀并置于冰上进行超声破壁(功率200 W，超声时间5 s，间隔时间5 s，超声次数100次)。将裂解液于4 ℃、10000×g离心30 min。将蛋白上清于80 ℃热处理30 min，10000×g离心15 min。将热处理后的蛋白上清于4 ℃下进行硫酸铵(0.6 g/mL)沉淀过夜。10000×g离心15 min，将蛋白沉淀用10 mL破壁缓冲液A溶解并置于破壁缓冲液A中于4 ℃过夜透析。将蛋白溶液用0.22 μm滤膜过滤，然后用Ni-NTA亲和层析柱纯化，杂蛋白用含有40 mmol/L咪唑的缓冲液A清洗，目的蛋白用含250 mmol/L咪唑的缓冲液A洗脱，得到目的蛋白于-20 ℃保存。
将诱导后的3个菌株E. coli/pET22b、E. coli/pET22b-eCGP123-C-His和E. coli/pET22b-eCGP123-FtsZ-C-His，置于75 ℃热处理30 min，然后于4 ℃、10000×g离心15 min。将热处理后的蛋白上清进行SDS-PAGE分析，并以His-tag特异性抗体、用Western blot检测蛋白的表达。
1.6 S. islandicus中蛋白表达与分析 将eCGP123及其融合蛋白表达质粒电转入S. islandicus E233S感受态细胞中，电转步骤及转化子筛选方法见文献[9]。将构建好的表达菌株在添加有蔗糖(低诱导水平)或者阿拉伯糖(高诱导水平)的培养基中培养，诱导蛋白的表达。取不同OD600值下相同数量的细胞进行SDS-PAGE和Western blot，分析蛋白的表达。
1.7 eCGP123热稳定性和吸光值分析 将eCGP123蛋白溶液(1.5 mg/mL)于50-80 ℃下处理30 min，然后于4 ℃、10000×g离心15 min。取24 μL热处理后的蛋白上清进行SDS-PAGE分析，检测蛋白的热稳定性。
使用UV-2802H紫外可见分光光度计(上海尤尼克仪器有限公司)测定eCGP123蛋白溶液吸光光度值。测定前，先设置扫描方式为吸光度，扫描起始波长为400 nm，终止波长为650 nm，扫描次数为1，扫描精度为1 nm。然后以双重蒸馏水为参比，放入样品槽内，通过扫描建立基线。然后将装有1.5 mL eCGP123蛋白溶液(1.5 mg/mL)的比色杯放入样品槽内扫描，得到吸光度图谱。实验至少重复3次。
1.8 eCGP123及其融合蛋白表达细胞的荧光检测 取5 μL处于对数生长期的eCGP123及其融合蛋白表达菌株的细胞滴于载玻片上，盖上盖玻片，置于LSM 780高灵敏度激光共聚焦显微镜(Carl Zeiss)下，通过紫外光的激发，观察细胞中荧光分布情况，分析目的蛋白的亚细胞定位。
1.9 硫化叶菌细胞生长曲线测定 将对照菌株Sis/pSeSD和eCGP123过表达菌株Sis/pSeSD-eCGP123-C-His在MTSV液体培养基中多次活化，转接至MTV液体培养基，当OD600值为0.5-0.6时转接到MTAV培养基中，控制初始OD600值约为0.05，每组做3个平行，每6或12 h测1次OD600值，直至生长趋于平稳或开始下降，然后绘制生长曲线。
2 结果和分析 2.1 eCGP123基因的优化 根据Don Paul等报道的eCGP123氨基酸序列[8]和S. islandicus中密码子的偏好性，我们优化并合成了全长735 bp、编码245个氨基酸的eCGP123基因。在优化的eCGP123基因序列中，多数密码子为S. islandicus的最优密码子，少数为次优密码子，没有Nde Ⅰ、Sal Ⅰ、Not Ⅰ或Mlu Ⅰ等常用酶切位点，方便载体的构建。
2.2 eCGP123热稳定性和吸光值分析 为了检测eCGP123是否能够在高温下稳定存在，我们将Ni-NTA柱纯化后的蛋白在50-80 ℃热处理30 min并离心，蛋白上清进行SDS-PAGE检测(图 1)。从SDS-PAGE结果可以看出，eCGP123 (28.6 kDa)蛋白依然稳定存在于热处理后的上清中，同时我们发现，热处理后的蛋白溶液明显呈绿色。因此，研究结果表明，eCGP123具有较高的热稳定性。此外，我们测定了eCGP123蛋白溶液在400-650 nm波长范围内的吸光光度值(图 2)。结果显示，eCGP123的最大激发光波长为493 nm，与Kiss等的研究结果一致[3]。
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| 图 1 eCGP123蛋白的热稳定性分析 Figure 1 Thermostability analysis of eCGP123. eCGP123 was treated at different temperatures for 30 min after purification by Ni-NTA column. M: molecular size markers; TP: total protein; P: precipitate; S: supernatant. The arrow indicates eCGP123 (28.6 kDa). |
| 图选项 |
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| 图 2 eCGP123吸收光谱的测定 Figure 2 Absorption spectrum of eCGP123. |
| 图选项 |
2.3 E. coli中eCGP123和eCGP123-FtsZ的表达与荧光定位 为了检测eCGP123是否仍然能在常温细胞内作为蛋白定位的工具，我们首先在eCGP123的C-末端融合E. coli来源的FtsZ蛋白，并对融合蛋白诱导表达和分析，通过激光共聚焦显微镜检测荧光的分布情况。FtsZ (filamenting temperature-sensitive mutant Z)蛋白是原核生物中高度保守的微管蛋白同源物，它定位在分裂细胞的中间，形成环状结构，参与细胞的分裂[10-11]。Western blot分析结果表明，通过IPTG的诱导，融合蛋白eCGP123-FtsZ在E. coli细胞中表达(图 3)。同时，荧光定位结果表明，在465-495 nm激发光波长范围内，eCGP123表达细胞中荧光呈均匀分布(图 4-A)，而在eCGP123-FtsZ融合表达细胞中，荧光主要分布在细胞的中间和两端(图 4-B)。以上结果与之前报道的FtsZ功能相吻合，达到了预期的结果，说明eCGP123可以用于E. coli细胞中蛋白质定位的研究。
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| 图 3 E. coli中eCGP123和eCGP123-FtsZ的表达与分析 Figure 3 Expression and identification of eCGP123 and eCGP123-FtsZ in E. coli by Western blot analysis using an anti-His-tag antibody (α-His). The samples from each E. coli strain are loaded onto SDS-PAGE (upper panel) after heat-treatment at 75 ℃ for 30 min. M: molecular size markers; Lane 1: proteins purified from E. coli/pET22b, as a negative control; lane 2 and lane 3: eCGP123 and eCGP123-FtsZ. Predicted protein sizes of eCGP123 and eCGP123-FtsZ are 28.6 kDa and 69.6 kDa, respectively. |
| 图选项 |
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| 图 4 E. coli细胞中eCGP123-C-His和eCGP123-FtsZ-C-His的荧光定位 Figure 4 Localization of eCGP123 (A) and eCGP123-FtsZ (B) expressed in E. coli cells. eCGP123 distributes evenly in the cells, while eCGP123-FtsZ mainly localizes at the mid-cell division site and both ends of the rod-shaped cells. Scale bar=2 μm. |
| 图选项 |
2.4 S. islandicus中eCGP123及其融合蛋白的表达与荧光定位 为了进一步检测eCGP123能否在嗜热嗜酸的S. islandicus中作为蛋白定位工具，我们选择若干已知细胞定位的目的蛋白与之融合。其中，UpsE (UV-inducible pili operon of Sulfolobus E)是古菌经过紫外线照射后在细胞表面形成Ⅳ型菌毛结构(type Ⅳ pili-like structure)的一个重要组成成分，是一种分泌型ATPase，定位于细胞膜上[12-13]。PCNA1是组成泉古菌中参与DNA复制的异源三聚体PCNA (proliferating-cell nuclear antigen，增殖细胞核抗原)的重要亚基之一[14]，主要定位于细胞质中DNA复制的区域[15]。我们实验室研究结果发现，ESCRT-Ⅲ (endosomal sorting complex required for transport Ⅲ)同源蛋白SiRe_1200参与细胞分裂，用蛋白特异性抗体进行免疫荧光定位分析发现，该蛋白位于正在分裂的2个细胞中间，过表达其羧基端loop区缺失突变体会导致细胞生长缓慢，引起细胞的分裂缺陷[16]。
我们将eCGP123融合蛋白表达质粒电转入S. islandicus细胞中，筛选出表达菌株，并在培养基中加入阿拉伯糖进行诱导表达，然后在不同OD600值取相同数量的细胞，进行Western blot分析。结果表明，eCGP123及其融合蛋白eCGP123-UpsE、eCGP123-SiRe_1200都可以表达，但检测不到eCGP123-PCNA1的信号，多次重复实验的结果类似(图 5)。S. islandicus细胞中，pSeSD-eCGP123-PCNA1-C-His质粒重提取验证结果显示，表达质粒存在于细胞中，在高灵敏度激光共聚焦显微镜下能检测到表达细胞产生的荧光。此外，我们在E. coli中可以检测到eCGP123-PCNA1的表达。因此，我们推断，可能是由于S. islandicus中该蛋白的表达量较低，无法检测到信号。此外，为了分析eCGP123在S. islandicus中过表达会不会影响细胞生长，进而影响其应用，我们检测了eCGP123过表达菌株的生长曲线，结果表明eCGP123过表达菌株与含有空质粒的对照菌株生长没有区别，因此eCGP123过表达并不影响S. islandicus细胞的生长(图 6)。而另外3个融合蛋白的过表达菌株中，只有eCGP123-SiRe_1200过表达导致细胞生长缓慢，可能与SiRe_1200参与细胞分裂有关(结果未展示)。
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| 图 5 S. islandicus中eCGP123及其融合蛋白的表达与分析 Figure 5 Analysis of eCGP123 and its fusion proteins with C-terminal 6×His-tag in S. islandicus by Western blot. The cell extracts of the expression strains at different OD600 values were taken for loading onto SDS-PAGE (upper panel). M: molecular size markers. Predicted protein sizes are 28.57 kDa (eCGP123), 82.60 kDa (eCGP123-UpsE), 56.04 kDa (eCGP123-PCNA1) and 53.59 kDa (eCGP123-SiRe_1200), respectively. |
| 图选项 |
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| 图 6 eCGP123过表达不影响S. islandicus生长 Figure 6 eCGP123 overexpression has no effect on the cell growth of S. islandicus. The OD values were measured every 6 or 12 h. The growth curves were obtained from three independent cultures. Error bars indicate standard deviation. |
| 图选项 |
我们对S. islandicus细胞中的eCGP123及其融合蛋白进行了荧光定位。在含有阿拉伯糖的培养基中培养表达菌株，取处于对数生长期的细胞，置于高灵敏度激光共聚焦显微镜下，检测荧光的分布。如图 7所示，在阿拉伯糖诱导后的eCGP123表达细胞中，其荧光充满整个细胞，均匀分布在细胞质中，表达量较高，与Western blot结果一致。在eCGP123-UpsE表达细胞中，荧光也均匀分布，但呈稀疏的点状分布，很可能是位于细胞膜上，因此各个蛋白荧光点之间相互隔离。由于表达量较低，难以通过膜质分离实验进一步确认荧光是否定位在细胞膜上(图 8)。
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| 图 7 S. islandicus细胞中eCGP123的荧光定位 Figure 7 Localization of eCGP123 in S. islandicus cultured in the medium containing arabinose (0.2%). Scale bar=2 μm. |
| 图选项 |
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| 图 8 S. islandicus细胞中eCGP123-UpsE的荧光定位 Figure 8 Localization of eCGP123-UpsE in S. islandicus in arabinose medium. Scale bar=2 μm. |
| 图选项 |
DNA复制滑动夹PCNA已广泛应用于真核细胞复制体(replisome)的细胞内定位，生化和遗传实验已经证明PCNA在硫化叶菌DNA复制中也发挥重要功能。PCNA1 (SiRe_1602) 是组成泉古菌中参与DNA复制的异源三聚体PCNA的重要亚基之一。此前，Bell课题组使用PCNA1特异性抗体对同步至G1期的S. acidocaldarius细胞进行免疫荧光标记，分析复制体的荧光定位。研究结果发现，大多数被标记的细胞中含有1个、2个或3个PCNA1 foci，部分细胞中含有4个、5个和6个PCNA1 foci，同时少数细胞也出现PCNA1 foci遍及整个细胞的现象，但是foci基本都是位于DNA区域[14-15, 17]。
我们在观察阿拉伯糖诱导后的eCGP123-PCNA1表达细胞时发现，只有少数细胞中含有1个PCNA1 focus，大多数细胞中的PCNA1 foci数目多达4-6个及以上，但是这些foci有一定的区域分布，并没有完全遍及整个细胞，与之前的研究类似，可能是位于DNA的区域(图 9)。通过免疫荧光和绿色荧光蛋白两种方法对PCNA1进行定位，得到了比较类似而又有细微差异的结果。我们推测可能是因为两种蛋白定位方法之间的差异所致，即前者以荧光染料标记抗体对固定的细胞进行标记，往往具有较高的特异性和荧光量子产率，但活细胞受到损坏；而后者是利用绿色荧光蛋白对处于生理条件下活细胞内的蛋白质进行实时定位，但在荧光显微镜下荧光易淬灭，荧光信号较弱。总体而言，eCGP123在一定程度上发挥了对S. islandicus细胞中PCNA1的亚细胞定位的作用。
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| 图 9 S. islandicus细胞中eCGP123-PCNA1的荧光定位 Figure 9 Localization of eCGP123-PCNA1 in S. islandicus in arabinose medium. Scale bar=2 μm. |
| 图选项 |
我们实验室前期使用特异性抗体标记S. islandicus中ESCRT-Ⅲ同源蛋白SiRe_1200，通过添加阿拉伯糖大量诱导蛋白表达发现，整个细胞都是荧光，可能是蛋白量太高，难以定位。之后换成蔗糖诱导蛋白低表达并进行原位免疫荧光定位分析发现，SiRe_1200定位于即将分裂细胞的中间，参与细胞的分裂。此外，绿色荧光也分布于细胞周围，可能与样品所处的时期有关。我们观察蔗糖诱导后的eCGP123-SiRe_1200表达细胞中的荧光发现，在单个细胞中，一般存在3-5个SiRe_1200形成的foci。同时，我们也在细胞的中间位置观察呈带状的荧光分布，与实验室前期免疫荧光定位结果相似，但荧光比较弱(图 10)。
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| 图 10 S. islandicus细胞中eCGP123-SiRe_1200的荧光定位 Figure 10 Localization of eCGP123-SiRe_1200 in S. islandicus in arabinose medium. Scale bar=2 μm. |
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3 讨论 由于S. islandicus生活在75-80 ℃、pH 2-3的高温强酸环境中，因此，广泛应用于真核生物和原核生物中的绿色荧光蛋白GFP及其突变体几乎无法适用于超嗜热嗜酸的冰岛硫化叶菌中。绿色荧光蛋白突变体eCGP123具有较高的蛋白折叠效率、蛋白热稳定性和耐酸性等性质，适用于高温强酸条件下，因此有可能应用于S. islandicus蛋白的亚细胞定位研究中。
通过eCGP123密码子优化并合成基因，我们分别构建了在E. coli和S. islandicus中的eCGP123融合蛋白表达质粒和表达菌株。蛋白表达检测和荧光观察表明，在E. coli中，eCGP123-FtsZ的荧光主要分布在细胞的中间，呈带状，与以前的研究结果一致，eCGP123对FtsZ的定位基本上达到了预期结果。
在S. islandicus中，eCGP123单独表达时的荧光均匀分布于细胞中。eCGP123-UpsE的荧光也呈均匀点状分布，可能分布在细胞膜上，需要进一步确认。我们只在很少的细胞中观察到1-4个PCNA1 foci，而在大多数细胞中，PCNA1 foci的数目多达6个及以上，并定位与细胞某个区域，与之前报道结果类似，推测位于细胞复制区域。本底表达的SiRe_1200通过eCGP123能够定位于细胞中间，荧光呈带状分布。此外，我们也发现，SiRe_1200在阿拉伯糖诱导的过表达时，荧光遍布在整个细胞中，影响蛋白的定位。
通过绿色荧光蛋白eCGP123对S. islandicus中已知定位的蛋白进行定位分析发现，eCGP123具有一定的定位功能。但是，相对于免疫荧光定位，通过eCGP123对蛋白定位的方法存在一定的缺陷，如荧光较弱，荧光易淬灭。此外，该方法可能还受到目的蛋白表达量的影响，表达量过高或过低都会干扰目的蛋白的定位，再加上S. islandicus细胞直径小(直径1-2 μm)，对目的蛋白的定位造成了一定的困难。因此，eCGP123应用于S. islandicus中进行蛋白的亚细胞定位，还需进行条件优化，如通过改进取样时间，对细胞进行特殊处理(如DNA损伤剂处理分析DNA修复蛋白的定位)，提高显微观察技术，观察和统计大量的细胞等。
根据Paul等的研究报道，将eCGP123进行定点突变(Q66M，T73V，H197Q)得到的橙色荧光蛋白Phanta，其荧光较微弱，激发光谱与许多GFP的发射光谱有很大的重叠，能够与eGFP组成光致变色荧光共振能量转移对[photochromic fluorescence resonance energy transfer (FRET) pair]，检测HeLa活细胞中Caspase 3蛋白的活性[18]。在前期实验中，我们已经获得Phanta蛋白，发现其同样具有较高的热稳定性，有可能与eCGP123组成新的FRET供体/受体对。在eCGP123荧光显微观察条件优化后，以上蛋白可以通过FRET技术研究古菌体内以及体外蛋白的相互作用。
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