施慧, 穆晓清
, 杨兴龙, 战绍斌, 田荣臻, 聂尧, 徐岩 工业生物技术教育部重点实验室, 江南大学酿酒科学与酶技术中心, 江苏 无锡 214122
收稿日期：2016-11-04；修回日期：2016-12-21；网络出版日期：2016-12-29
基金项目：国家“863计划”（2015AA021004）；国家自然科学基金（21336009，21176103）；高等学校学科创新引智计划（111-2-06）
*通信作者：穆晓清, Tel/Fax:+86-510-85918201;E-mail:xqmu@jiangnan.edu.cn
摘要： [目的]烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）在细胞基因表达、氧化还原反应、能量代谢以及调控细胞生命周期中具有重要的作用，其细胞内含量是能量效率的关键因素。强化辅因子合成策略，获得高产NAD+菌株，对于NAD+依赖型氧化还原反应的速率和调节相关生化合成途径的代谢流具有重要意义。[方法]首先通过内源性调节，对代谢途径中的关键酶基因进行强化，过量表达和共表达NAD+合成途径中的关键酶基因pncB、nadD和nadE；其次，通过外源调节增加NAD+前体物，优化诱导条件提高发酵过程中关键酶的表达量，增加NAD+的合成量；最后在单因素优化试验的基础上，以NAD+含量为响应值，采用Box-Bohnken试验设计方法，研究3个显著性影响因素相互作用对NAD+积累量的影响，确定最佳的优化条件。[结果]根据关键酶基因强化策略，构建了7株重组菌，其中重组菌E.coliBL21/pET-21a-nadE-pncB胞内NAD+含量相比初始菌株E.coli BL21/pET-21a提高了405.2%。通过对该菌株诱导条件和NAD+合成前体的优化，使用Design Expert 8.0分析实验数据，得出该重组菌株的最佳发酵条件为：诱导温度控制在15-20℃，OD600为0.6-0.8时添加IPTG 0.63 mmol/L、烟酸15.8 mg/L、诱导时长控制在24 h。NAD+含量在最优条件下实验验证值可达43.16 μmol/g DCW，与优化前相比提高了123.6%，与初始菌株相比提高了1029.8%。[结论]在大肠杆菌中共表达关键酶基因pncB和nadE，胞内NAD+合成量明显增加，前体物以及诱导条件的外源调节使NAD+积累量达到最佳优化值。实现了提高NAD+含量的目标，胞内辅因子浓度的增加为提高生物催化效率奠定了可行性基础。
关键词： 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 大肠杆菌 pncB nadD nadE NAD+前体物质 发酵优化
Cloning and expression of key enzymes for NAD+ synthesis and optimization of fermentation in Escherichia coli
Hui Shi, Xiaoqing Mu
, Xinglong Yang, Shaobin Zhan, Rongzhen Tian, Yao Nie, Yan Xu Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Center for Brewing Science and Enzyme Technology, Wuxi 214122, Jiangsu Province, China
Received 4 November 2016; Revised 21 December 2016; Published online 29 December 2016
*Corresponding author: Xiaoqing Mu, Tel/Fax:+86-510-85918201;E-mail:xqmu@jiangnan.edu.cn
Supported by the Hi-Tech Research and Development Program of China (2015AA021004), by the National Natural Science Foundation of China (21336009, 21176103) and by the Program of Introducing Talents of Discipline to Universities (111-2-06)
Abstract: [Objective]Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) plays a crucial role in controlling metabolism network. Improving its intracellular concentration or getting a high-NAD+-yield strain is of great significance for NAD+-dependent redox reaction rate.[Methods]First, we used endogenous regulation means to enhance the key genes of NAD+ synthesis pathway, such as over-expressing and co-expressing the key enzyme genes pncB, nadD and nadE. Second, we optimized NAD+ precursors supplement and fermentation conditions to increase NAD+ synthesis. Finally, we used Box-Bohnken method for optimal synthesis condition by 3 significant factors' interaction based on single-factor experiments and the response value of NAD+ content.[Results]According to different expression strategies, we constructed seven recombinant strains. Besides, the intracellular NAD+ content of the recombinant strain E. coli BL21/pET-21a-nadE-pncB was 405.2% higher than that of the original strain. Moreover, after optimization of induction conditions and NAD+ precursor concentration by Design Expert 8.0, NAD+ content reached 43.16 μmol/g DCW, 123.6% higher than that before optimization and 1029.8% higher than the original strain.[Conclusion]Co-expression the key enzyme genes pncB and nadE are essential to improve NAD+ synthesis. The recombinant strain with high NAD+ provides the feasibility to improve biocatalytic efficiency.
Key words: nicotinamide adenine dinucleotide E.coli pncB nadD nadE NAD+ precursor fermentation optimization
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide)，是一种传递电子(氢离子)的辅酶，KEGG数据库显示NADH/NAD+作为重要的辅因子全程参与微生物细胞内的740多个代谢反应[1-4]，在糖酵解、糖异生、三羧酸循环和呼吸链中发挥着不可替代的作用。NAD (H)能为代谢网络中各种反应提供能量和氧化还原力，其浓度可以调控代谢网络途径，增大代谢流通量，提高氧化还原反应中生物催化效率和目标产物的产率；两者的比例对胞内的氧化还原力水平有一定的调节作用，同时影响代谢产物的分布。
调控NAD (H)的浓度可以改变细胞代谢功能，大量增加NAD+的供给能扩大代谢网络通量，氧化型产物会相对增加[5]；在大肠杆菌中，当NADH/NAD+比例超过0.6时，细胞中NADH的生成速率超过电子传递链氧化磷酸化容量，代谢产物为乙酸积累[6]；降低NAD (H)浓度，会制约质子梯度的形成，ATP生成量减少，糖酵解和三羧酸循环代谢流的效率随之降低[6-7]。例如在利用光滑拟球酵母生产丙酮酸过程中，增加NAD+的含量，增强了3-磷酸甘油醛酶的活力，从而加快糖酵解的速率，提供其氧化推动力，使丙酮酸产量提高了44%[8]。当提高胞内NAD+含量时，NAD+依赖型氧化还原反应速率也随之提高。研究表明在酶促催化生成L-叔亮氨酸氧化还原反应中，外加0.1 mmol/L NAD+能在5 h内实现100%转化，不添加或者少添加辅酶，则不能实现完全转化[9]。Wu等在利用胞内NAD+含量达1.45 μmol/g的活细胞作为生物催化剂时，生物催化效率提高15倍[10]。外加辅酶虽然能提高反应速率，但是价格比较昂贵增加了生产成本，于是很多人开始研究提高细胞自身的辅酶浓度来增强相关代谢反应的效率。
然而，胞内NAD+合成途径复杂、前体物及NAD+降解支路多、积累量少以及合成效率低等都是细胞利用自身NAD+的瓶颈问题，因此，如何增加胞内NAD+含量提高其利用率成为国内外研究热点。强化辅酶合成主要从增加途径中的关键酶和增加前体物两方面考虑。Berríos-Rivera等[11]通过过量表达基因pncB编码的烟酸磷酸核糖转移酶(NAPRTase)，促使E. coli胞内NAD+、NADH和总NAD (H)分别提高了81.8%、29.8%和41.7%；Gou等[12]通过在E. coli NZN111中过量表达基因nadD 编码的烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶(NAMNAT)，NAD+浓度提高3.3倍可达到12.64 μmol/g DCW，从而减少了副产物丙酮酸的积累促进丁二酸的合成。Liu等[8]在发酵培养基中加入NAD+的生物合成前体烟酸(NA)，发现8 mg/L前体物NA能够有效促进细胞内NAD+的合成，使光滑球拟酵母Torulopsis glabrata葡萄糖消耗速度和丙酮酸产量分别提高了48.4%和29%。
目前的报道，大多数是针对某一发酵产物改变辅酶的浓度，并没有以辅酶为主要研究对象，对不同代谢调控策略进行比较。缺少对合成NAD+的系统研究，如：比较NAD+补救途径中3个关键酶作用大小，考察不同前体色氨酸、天冬氨酸、喹啉酸、烟酸和烟酰胺等对NAD+含量的影响。
本研究主要从代谢途径、前体物质添加和发酵条件优化这三方面对提高胞内NAD+含量进行系统研究。首先研究NAD+的生物合成路径见图 1[13-14]，改造补救途径，强化关键酶基因pncB、nadD和nadE，比较单独过量表达和组合共表达对胞内NAD+含量的影响，研究这3个关键基因之间的关系；其次，筛选出最优菌株对其进行外源调节，包括不同前体物质的添加、外部环境的调控，进一步提高NAD+积累量；最后，考察3个影响NAD+含量的显著性因素，通过最陡爬坡试验逼近最大响应区域，得到最佳的发酵条件使胞内NAD+含量能够达到最大化，为解决高效利用底物、增加目标产物和提高NAD (H)依赖型生物催化反应效率等问题提供思路和方案。
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| 图 1 辅酶NAD+合成图 Figure 1 Illustration of NAD+ synthetic pathways. Chemical structures of NAD+ and relevant intermediates (R: ribose sugar, P: phosphoric acid, Ad: adenine). Abbreviations of compounds: L-Trp: L-tryptophane; Asp: asparticacid; QA: quinolinic acid; NA: nicotinic acid; NaMN: nicotinic acid mononucleotide; NaAD: nicotinic acid adenine dinucleotide (Deamino-NAD); NAD+: nicotinamide adenine dinucleotide; NAM: nicotinamide; NR: nicotinamide riboside; NMN: nicotinamide mononucleotide. |
| 图选项 |
1 材料和方法 1.1 材料
1.1.1 菌株质粒与引物: 菌株Escherichia coli BL21(DE3) 由本实验室保存，表达质粒pET-21a (+)由本实验室前期构建与保存，本文所使用的引物序列见表 1。 表 1. 基因克隆所用到的引物 Table 1. The sequences of primers used in gene cloning
| Primers | names Primer sequences (5′→3′) |
| pncB-F | CGCGGATCCATGACACAATTCGCTTCT |
| pncB-R | CCGCTCGAGTTAACTGGCTTTTTTAATATGCGG |
| nadD-F | CGCGGATCCATGAAATCTTTACAGGCTC |
| nadD-R | CCGCTCGAGTCAGCGATACAAGCCTTGTT |
| nadE-F | CGCGGATCCATGACATTGCAACAACAAAT |
| nadE-R | CCGCTCGAGTTACTTTTTCCAGAAATCATCG |
| B-SD-AS-D-F1 | CGCGGATCCATGACACAATTCGCTTCT |
| B-SD-AS-D-R1 | TGTATATCTCCTTCTTTAACTGGCTTTTTTAATATGCGGAAG |
| B-SD-AS-D-F2 | AGAAGGAGATATACAATGAAATCTTTACAGGCTCTGTTTGG |
| B-SD-AS-D-R2 | CCGCTCGAGTCAGCGATACAAGCCTT |
| B-SD-AS-E-F1 | CGCGGATCCATGACACAATTCGCTTCT |
| B-SD-AS-E-R1 | TGTATATCTCCTTCTTTAACTGGCTTTTTTAATATGCGG |
| B-SD-AS-E-F2 | AGAAGGAGATATACAATGACATTGCAACAACAAATAATAAAGGC |
| B-SD-AS-E-R2 | CCGCTCGAGTTACTTTTTCCAGAAATCATCG |
| D-SD-AS-E-F1 | CGCGGATCCATGAAATCTTTACAGGCTC |
| D-SD-AS-E-R1 | TGTATATCTCCTTCTTCAGCGATACAAGCCTTGTTGGT |
| D-SD-AS-E-F2 | AGAAGGAGATATACAATGACATTGCAACAACAAATAATAAAGGC |
| D-SD-AS-E-R2 | CCGCTCGAGTTACTTTTTCCAGAAATCATCG |
| E-SD-AS-B-F1 | CGCGGATCCATGACATTGCAACAACAAATAATAAAGGC |
| E-SD-AS-B-R1 | TGTATATCTCCTTCTTTACTTTTTCCAGAAATCATCG |
| E-SD-AS-B-F2 | AGAAGGAGATATACAATGACACAATTCGCTTCT |
| E-SD-AS-B-R2 | CCGCTCGAGTTAACTGGCTTTTTTAATATGCGG |
| The restriction endonuclease sites are underlined; the sequences of SD-AS linker are bold. | |
表选项
1.1.2 主要试剂: PCR试剂、限制性内切酶、pMD?19-T Vector Cloning Kit、T4 DNA连接酶、DNA marker购自大连宝生物工程有限公司；protein marker (low)购于碧云天；质粒小量抽提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒、PCR引物、氨苄青霉素、卡那霉素、IPTG购自上海生工生物工程有限公司；NAD+、NADH购自Sigma Aldrich公司；酵母膏提取物、胰蛋白胨Oxoid原装进口；其余分析级生化试剂均购自国药集团。
1.1.3 培养基及培养条件：摇瓶种子培养基及发: 酵培养基均采用LB培养基（NaCl 10 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母膏提取物5 g/L，pH 7.2），并添加终浓度为100 μg/mL的氨苄青霉素；培养条件为37 ℃、200 r/min。除摇瓶发酵培养时间为18 h外，其余情况均培养12 h。1.2 基因pncB、nadD和nadE的克隆 根据NCBI上报道的大肠杆菌中基因pncB的序列(Gene ID: 8182321)、基因nadD的序列(Gene ID: 8180157) 和基因nadE的序列(Gene ID: 8179982) 设计上下游引物，提取E. coli BL21(DE3) 的基因组，PCR克隆扩增得到基因pncB、nadD和nadE，引入酶切位点Bam H I和Xho I。PCR反应体系(50 μL)：上下游引物各1 μL，模板DNA1 μL，PrimeSTAR HS (Premix) 25 μL，dd H2O 22 μL。PCR反应条件：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃分别延伸80 s、42 s、55 s，30个循环；72 ℃ 10 min。采用琼脂糖凝胶电泳法验证PCR扩增结果。
1.3 单基因重组质粒的构建 先将目的基因产物纯化后，连接到pMD-19T载体，转化筛选阳性克隆并测序。再将载体pET-21a和T载上的目的基因用限制性核酸内切酶Bam H I和Xho I酶切90 min，经琼脂糖凝胶电泳回收纯化目的基因片段和质粒骨架，在T4连接酶作用下16 ℃连接过夜。然后将连接产物转化JM109克隆宿主感受态细胞，在氨苄青霉素抗性平板上筛选阳性克隆转化子。最后挑取转化子，并提取质粒双酶切验证，转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，对重组质粒进行平板筛选和测序。
1.4 双基因共表达重组质粒的构建 关键基因两两组合共表达的构建流程如图 2所示，其中以Bam H I和Xho I为酶切位点，SD-AS序列为共表达体系中的连接肽，将2个基因扩增并连接在载体上。
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| 图 2 双基因组合共表达载体的构建图谱 Figure 2 Map of construction of double gene combined co-expression vector. |
| 图选项 |
1.5 NAD (H)合成相关酶的诱导表达 用LB氨苄青霉素平板活化重组菌株，挑取单菌落接入5 mL含有终浓度100 μg/mL氨苄青霉素的LB试管中，培养12 h后再按1%的接种量转接于50 mL的LB发酵培养基中，37 ℃、200 r/min培养3 h后添加终浓度为0.1 mmol/L的IPTG，17 ℃、200 r/min诱导15 h后进行SDS-PAGE分析和NAD+含量的测定。
1.6 NAD (H)含量的测定 样品中NAD+的提取：收集细胞到离心管内并用超纯水重悬，弃上清，称取0.1 g湿菌体，加入1 mL酸性提取液，超声波破碎(冰浴，功率20%或200 W，超声3 s，间隔10 s，重复30次)，95 ℃水浴5 min (盖紧，以防止水分散失)；冰浴中冷却后，10000× g、4 ℃离心10 min；取500 μL上清液，加500 μL碱性提取液使之中和，混匀。10000× g、4 ℃离心10 min，取上清，置冰上待测[15-16]。
测定原理：采用酶循环法，由于NAD+可被乙醇脱氢酶还原为NADH，NADH通过递氢作用，还原氧化型噻唑蓝(MTT)为甲瓒，在570 nm下检测吸光值的变化。辅酶NAD (H)浓度测定的具体操作步骤参照文献[17-20]。
1.7 重组菌株生物量的测定 细胞培养结束后，12000 r/min离心10 min收集菌体，用超纯水洗涤、离心，去除菌体表面粘附的杂质成分，再将离心好的菌体在抽真空的条件下冷冻干燥至恒重，测定细胞干重(Dry cell weight，DCW)。
1.8 NAD (H)合成前体物质的添加 在发酵培养基中添加NAD (H)合成路径中的前体物质，即色氨酸、天冬氨酸、喹啉酸、烟酸和烟酰胺。前体物质用超纯水配制成5 g/L的母液，过滤除菌、分装并低温保存，在转接于摇瓶发酵培养基时加入。
2 结果和分析 2.1 NAD+合成途径中单个关键基因的克隆及表达 选取NAD+补救途径中烟酸磷酸核糖转移酶(NAPRTase)、烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶(NAMNAT)和NAD+合成酶(NAD+ synthetase)的编码基因，克隆构建获得重组质粒pET-21a-pncB、pET-21a-nadD和pET-21a-nadE，经限制性内切酶Bam H I和Xho I酶切鉴定，其条带大小分别为1203、642和828 bp (图 3-A)，经测序后比对匹配一致，pET-21a-pncB、pET-21a-nadD和pET-21a-nadE构建成功。
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| 图 3 重组质粒双酶切鉴定及SDS-PAGE分析图 Figure 3 SDS-PAGE analysis and identification of the recombinant plasmid by enzyme digestion. A: identification of the recombinant plasmid by enzyme digestion. Lane 1: pET-21a-pncB; lane 2: pET-21a-nadD; lane 3: pET-21a-nadE; M: DL10000 DNA marker. B: SDS-PAGE analysis of recombinant strains for over-expressed enzyme. Lane 1: pET-21a-pncB; lane 2: pET-21a-nadD; lane 3: pET-21a-nadE; lane 4: pET-21a; M: protein molecular marker. |
| 图选项 |
对E. coli BL21/pET-21a和构建的重组菌株进行粗酶液的SDS-PAGE分析验证(图 3-B)。与空白组4号泳道对比，重组菌E. coli BL21/pET-21a-pncB、BL21/pET-21a -nadD和BL21/pET-21a-nadE分别在约45、25和35 kDa处有一条明显特征条带，表明基因pncB、nadD和nadE编码的NAPRTase、NAMNAT和NAD+ synthetase在大肠杆菌中成功表达。
分别测定重组菌株的生长情况和胞内辅酶NAD+含量(表 2)，在细胞量上，重组菌株的生物量较原始菌株提高20%；在NAD+含量上，重组菌株中合成NAD+关键酶基因pncB、nadD和nadE得到了过量表达，胞内NAD+的浓度分别提高了252.4%、101.7%和275.4%。可见，过量表达关键酶基因可以使细胞生物量和NAD+总量得到一定的提高。3株重组菌之间也有一定的差异，其中基因pncB和nadE的过量表达对提高辅酶含量的比例较大，而基因nadD提高辅酶的幅度稍小。
表 2. 过表达单基因重组菌株生长情况及NAD+含量 Table 2. Growth and the amount of NAD+ in recombinant strains for over-expressing a single gene
| Recombinant strains | OD 600 | Biomass/(g DCW/L) | NAD+ content/(μmol/g DCW) | Relative ratio/% |
| E. coli BL21/pET-21a E. coli BL21/pET-21a-pncB E. coli BL21/pET-21a-nadD E. coli BL21/pET-21a-nadE | 1.29±0.07 1.75±0.08 1.85±0.07 1.82±0.17 | 1.40±0.03 1.69±0.04 1.72±0.07 1.71±0.13 | 3.78±0.37 13.31±1.20 7.63±0.08 14.19±0.69 | 100.00 352.35±31.73 201.67±16.92 375.40±18.11 |
表选项
2.2 NAD+合成途径中2个关键基因共表达的克隆及表达 为进一步提高胞内NAD+的含量，采用共表达策略，利用重叠延伸PCR技术构建重组质粒pET-21a-pncB -nadD、pET-21a-nadD -nadE、pET-21a-pncB -nadE和pET-21a-nadE -pncB。
经限制性内切酶Bam H I和Xho I双酶切鉴定(图 4)，5000 bp左右的条带为质粒骨架pET-21a而稍小的条带为目的基因。经过测序比对，目的条带序列与已公布的匹配一致，共表达重组质粒构建成功。
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| 图 4 双酶共表达重组质粒的酶切验证 Figure 4 Identification of the co-expression recombinant plasmid by enzyme digestion. Lane 1: pET-21a-pncB -nadD; lane 2: pET-21a-nadD -nadE; lane 3:pET-21a-pncB -nadE; lane 4:pET-21a-nadE -pncB; M: DL5000 DNA marker. |
| 图选项 |
离心收集共表达重组菌株细胞，测定其胞内辅酶NAD+的含量和细胞干重(表 3)，重组菌E. coli BL21/pET-21a-nadE -pncB胞内NAD+含量进一步提高，而E. coli BL21/pET21a-pncB -nadD胞内的辅酶含量比较低，结合SDS-PAGE图(图 5)发现基因pncB编码的NAPRTase和nadD编码的NAMNAT表达量较低。
表 3. 双基因共表达重组菌株生长情况及NAD+含量 Table 3. Growth and the amount of NAD+ in recombinant strains for double gene co-expression
| Recombinant strains | OD 600 | Biomass/(g DCW/L) | NAD+content/(μmol/g DCW) | Relative ratio/% |
| E. coli BL21/pET-21a | 1.29±0.07 | 1.40±0.04 | 3.82±0.27 | 100 |
| E. coli BL21/pET-21a-pncB -nadD | 2.02±0.12 | 1.75±0.14 | 5.67±0.21 | 148.43±5.50 |
| E. coli BL21/pET-21a-nadD -nadE | 1.81±0.07 | 1.68±0.16 | 14.21±0.58 | 371.99±15.18 |
| E. coli BL21/pET-21a-pncB -nadE | 1.82±0.06 | 1.60±0.10 | 16.33±0.93 | 427.49±24.34 |
| E. coli BL21/pET-21a-nadE -pncB | 1.65±0.09 | 1.57±0.15 | 19.30±0.65 | 505.23±17.02 |
表选项
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| 图 5 双酶共表达重组菌株的SDS-PAGE分析 Figure 5 SDS-PAGE analysis of recombinant strains for double-enzyme co-expression. Lane 1: BL21/pET-21a; lane 2: BL21/pET-21a-pncB; lane 3: BL21/pET-21a-nadD; lane 4: BL21/pET-21a-nadE; lane 5: BL21/pET-21a-pncB -nadD; lane 6: BL21/pET-21a-nadD -nadE; lane 7: BL21/pET-21a-pncB -nadE; lane 8: BL21/pET-21a-nadE -pncB; M: protein cellular marker. |
| 图选项 |
与E. coli BL21/pET-21a相比，NAD+合成途径中关键酶组合共表达后，对于NAD+的含量和细胞干重产生了不同的效应。在生物量上，与E. coli BL21/pET-21a相比，共表达双基因重组菌均有所提高。在NAD+含量上，重组菌株虽然均有所提高，但是它们之间也存在较大的差异性。E. coli BL21/pET-21a-pncB -nadD胞内NAD+含量相对比例为148%，略低于单个表达基因pncB和nadD；E. coli BL21/pET-21a-nadD -nadE胞内NAD+含量相对比例为372%，与过表达单个基因nadE时提高了2.75倍基本一致；而E. coli BL21/pET-21a-pncB -nadE和E. coli BL21/pET-21a-nadE -pncB都具有叠加效应，比单个基因过量表达时效果更好，这两者之间由于次序不同，NAD+含量相差3 μmol/g DCW，提高的比例相差77.7%，E. coli BL21/pET-21a-nadE -pncB相对E. coli BL21/pET-21a-pncB -nadE提高了18.2%。
2.3 诱导条件对NAD+合成的影响 重组菌株中E. coli BL21/pET-21a-nadE -pncB合成NAD+的能力最强，为了探究诱导条件对该重组菌株胞内NAD+合成积累的影响，对诱导条件进行优化，包括诱导温度、诱导时机、诱导时长和IPTG添加量。
测定不同诱导温度下E. coli BL21/pET-21a-nadE -pncB的NAD+含量(图 6-A)，发现诱导温度对辅酶含量影响很大。诱导温度高于25 ℃时，NAD+的含量下降明显。过高的诱导温度会影响酶的活性和表达，导致关键酶NAPRTase和NAD+ synthetase表达不正常，影响NAD+的合成[14]。当诱导温度维持在15-20 ℃之间，辅酶含量较高，且波动较小，表明低温有利于胞内NAD+的合成和积累。
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| 图 6 诱导条件优化对NAD+含量的影响 Figure 6 Effect of inducing conditions optimization on the content of NAD+. A: effect of induction temperture on NAD+ content. B: effect of induced occasion on NAD+ content. C: effect of induction duration on NAD+ content. D: effect of IPTG content on NAD+ concentration. Standard deviation is the dispersion degree of 3 parallel experimental data relative to mean value. Data in A, B, C and D are the mean±S.D. of triplicate samples. |
| 图选项 |
不同浓度的诱导剂对E. coli BL21/pET-21a-nadE -pncB胞内NAD+的影响较大(图 6-D)，发现随着IPTG添加量的增加，NAD+含量的变化趋势是先增加后降低，当IPTG浓度达到0.6 mmol/L时，NAD+含量到达较大值，IPTG浓度维持在0.4-0.8 mmol/L时，NAD+含量能够稳定在30 μmol/g DCW。
诱导时机和诱导时长对NAD+含量也有一定的影响(图 6-B/C)，在OD600为0.6时诱导最佳。诱导培养24 h辅酶含量达到较大值，随着时间继续延长，辅酶的含量开始下降。发酵后期培养时间过长，不仅造成培养基中的营养物质不足，大肠杆菌生长受到抑制，而且随着代谢副产物的大量生成，会不断消耗NAD (H)[21]。因此，控制诱导时长对辅酶NAD+的积累量有重要意义。
2.4 前体物质对NAD+合成的影响 NAD (H)从头合成途径是以天冬氨酸、色氨酸或者喹啉酸为前体，而补救合成途径中是以烟酸和烟酰胺作为烟酸单核苷酸(NaMN)的前体，进一步合成NAD+。因此，添加终浓度为20 mg/L的前体物质：色氨酸、天冬氨酸、喹啉酸、烟酸和烟酰胺，分别测定胞内辅酶NAD+含量以及生物量的变化情况。
由表 4可知，添加不同的前体物质，对共表达重组菌E. coli BL21/pET-21a-nadE -pncB胞内NAD+的含量均有一定的影响，其中添加烟酸的效果最为明显，较空白对照组提高69.4%。当细胞内大量存在上述NAD+前体时，补救途径中被强化的关键酶NAPRTase和NAD+ synthetase，大量利用前体物质重新合成NAD+。
表 4. 添加不同前体对辅酶含量及生物量的影响 Table 4. Effect of different precursors on coenzyme content and biomass
| Different precursors | c(NAD+)/(μmol/g DCW) | Biomass liveweight/(g DCW/L) | Relative ratio/% |
| Control group | 18.98±0.93 | 1.23±0.05 | 100 |
| Tryptophane | 23.53±1.33 | 1.01±0.04 | 123.97 |
| Aspartic acid | 25.39±1.10 | 1.14±0.07 | 133.77 |
| Quinolinic acid | 27.96±0.91 | 1.12±0.07 | 147.31 |
| Nicotinamide | 29.64±1.27 | 1.13±0.06 | 156.16 |
| Nicotinic acid | 32.16±1.28 | 1.24±0.06 | 169.44 |
表选项
优化烟酸的添加量(图 7)，当烟酸浓度为15-20 mg/L时，NAD+含量维持在32 μmol/g DCW左右，而当添加的烟酸超过20 mg/L后NAD+含量逐渐下降。随着烟酸浓度的增加，整个培养基的pH值也有一定的降低，烟酸含量超过40 mg/L时，pH降低至6.5左右。因此，控制烟酸的添加量是提高胞内辅酶含量要考虑的重要因素之一。
 |
| 图 7 不同浓度烟酸对NAD+含量的影响 Figure 7 Effect of different concentrations of nicotinic acid on the NAD+ content. Standard deviation is the dispersion degree of 3 parallel experimental data relative to mean value. Data in figure is the mean±S.D. of triplicate samples. |
| 图选项 |
2.5 响应面优化NAD+合成的发酵条件
2.5.1 响应面试验设计与结果分析: 在单因素优化结果的基础上，选择对NAD+含量影响较大的3个因素(IPTG浓度、烟酸浓度和诱导时长)，取-1、0、1代表量的3个水平，以NAD+含量为响应值建立二次响应面分析模型。共进行17个试验，其中12个为析因点，5个为零点用于估算误差。每个试验重复3次，实验结果表示为测定结果的平均值正负标准偏差。响应面因素与水平见表 5。 表 5. CCD实验设计因素水平及编码值 Table 5. CCD experimental design factors level and coded values.
| Factors | Level | ||
| -1 | 0 | 1 | |
| c(A-IPTG)/(mmol/L) | 0.4 | 0.6 | 0.8 |
| c(B-Nicotinic acid)/(mg/L) | 10.0 | 15.0 | 20.0 |
| C-induction duration/h | 20.0 | 24.0 | 28.0 |
表选项
利用Design-Expert 8.0对响应面实验结果(表 6)进行二次多元回归分析，除去不显著项得到模型的二次多项回归方程为：Y =42.47+1.44 A + 1.37 B -1.26 AC -4.81 A 2-4.47 B 2-1.52 C 2。由表 7可知，模型P < 0.0001，而失拟项不显著(P =0.1853 > 0.05)。同时，复相关系数RAdj2为97.7%，说明该模型具有拟合度好、误差较小的特点，可用于预测NAD+含量的最佳条件。 表 6. CCD实验设计及结果 Table 6. CCD experimental design and results
| Numbers | Factors | NAD+ content/(μmol/g) | |||
| A | B | C | Actual value | Predicted value | |
| 1 | 0 | 1 | -1 | 36.81±0.30 | 37.40 |
| 2 | 0 | -1 | -1 | 35.62±0.32 | 35.26 |
| 3 | -1 | 0 | 1 | 35.90±0.07 | 36.06 |
| 4 | -1 | 0 | -1 | 33.61±0.55 | 33.34 |
| 5 | 1 | -1 | 0 | 32.49±1.57 | 32.82 |
| 6 | 0 | 0 | 0 | 42.38±0.17 | 42.47 |
| 7 | 1 | 0 | -1 | 38.89±0.39 | 38.73 |
| 8 | 0 | 1 | 1 | 38.06±0.26 | 38.22 |
| 9 | 0 | 0 | 0 | 41.98±0.18 | 42.47 |
| 10 | -1 | -1 | 0 | 30.32±0.43 | 30.75 |
| 11 | 1 | 1 | 0 | 36.88±0.29 | 36.38 |
| 12 | 0 | 0 | 0 | 42.75±0.16 | 42.47 |
| 13 | 0 | 0 | 0 | 42.12±0.18 | 42.47 |
| 14 | 1 | 0 | 1 | 36.13±0.31 | 36.40 |
| 15 | 0 | -1 | 1 | 35.42±0.29 | 34.83 |
| 16 | 0 | 0 | 0 | 43.10±0.16 | 42.47 |
| 17 | -1 | 1 | 0 | 33.06±0.27 | 32.73 |
表选项
表 7. 响应面方差分析二次模型方差分析表 Table 7. ANOVA for response surface quadratic model analysis of variance
| Source | df | Sum of squares | Mean square | F | P | Significance |
| Model | 9 | 248.30 | 27.59 | 76.49 | < 0.0001 | Significant |
| A-IPTG content | 1 | 16.53 | 16.53 | 45.83 | 0.0003 | |
| B-NA content | 1 | 15.02 | 15.02 | 41.63 | 0.0003 | |
| C-induction duration | 1 | 0.042 | 0.042 | 0.12 | 0.7428 | |
| AB | 1 | 0.68 | 0.68 | 1.89 | 0.2199 | |
| AC | 1 | 6.38 | 6.38 | 17.68 | 0.0040 | |
| BC | 1 | 0.53 | 0.53 | 1.46 | 0.2666 | |
| A2 | 1 | 97.49 | 97.49 | 270.28 | < 0.0001 | |
| B2 | 1 | 84.01 | 84.01 | 232.91 | < 0.0001 | |
| C2 | 1 | 9.75 | 9.75 | 27.03 | 0.0013 | |
| Residual | 7 | 2.52 | 0.36 | |||
| Lack of fit | 3 | 1.68 | 0.56 | 2.65 | 0.1853 | Not significant |
| Pure error | 4 | 0.85 | 0.21 | |||
| Total | 16 | 250.82 |
表选项
2.5.2 响应曲面图分析: IPTG添加量、烟酸添加量和诱导时长3个因素间交互作用对NAD+含量的影响如图 8所示。IPTG与诱导时长交互作用对NAD+的影响较大，其曲线图最陡峭，随着IPTG浓度和诱导时长的增加，NAD+含量呈先上升后降低的趋势。然而，AB以及BC之间的交互作用对NAD+含量的曲面图较为平滑，影响不显著。
 |
| 图 8 3个因素交互作用对NAD+含量影响的响应面 Figure 8 Three-dimensional curved surface for effect of 3 factors interaction on NAD+ content. |
| 图选项 |
2.5.3 验证试验结果: 在实验因素的水平范围内预测菌株E. coli BL21/pET-21a-nadE -pncB胞内NAD+含量的最佳培养条件为：IPTG添加量0.63 mmol/L、烟酸添加量15.8 mg/L、诱导时长为24 h，此时的NAD+含量理论预计值为42.69 μmol/g DCW。在最优条件下进行3次验证试验检验回归方程预测结果，实际得到的NAD+含量为(43.16±0.65) μmol/g DCW，与理论值的平均误差小于5%。试验结果验证了模型所得到的二次多项回归方程可较准确地预测NAD+含量。3 讨论 论文采用单基因过量表达和双基因共表达策略，通过调节表达量考察了合成途径3个关键酶对辅酶NAD+合成水平的影响，研究发现单基因过表达重组菌E. coli BL21/pET-21a-pncB、E. coli BL21/pET-21a-nadD和E. coli BL21/pET-21a-nadE胞内NAD+含量分别提高了252.4%、101.7%和275.4%。三者之间存在的差异可能是由于基因nadD编码的烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶(NAMNAT)既可以催化烟酸单核苷酸(NaMN)生成烟酸腺嘌呤二核苷酸(NaAD)又可以降解NAD+生成烟酰胺单核苷酸(NMN)[13, 22]。结合实验数据和文献，发现基因pncB和nadE提高NAD+含量的能力比基因nadD强。
结合双基因共表达重组菌株的实验数据和NAD+合成路径来看，脱氨基的NAD+在NAD+合成酶催化下氨基化生成NAD+可能直接影响了NAD+的合成量，基因nadE在宿主菌E. coli BL21中对NAD+合成量贡献更大。其中，重组菌E. coli BL21/pET-21a-nadE -pncB的NAD+含量提高405.2%，结果表明在研究对象E. coli BL21中，烟酸磷酸核糖转移酶和NAD+合成酶在NAD+合成途径中起到了关键性的作用。
通过对重组菌株BL21/pET-21a-nadE -pncB的诱导条件和NAD+合成途径的关键前体物质进行研究和优化，增加了蛋白的表达量并保证了菌体生长代谢的良好环境，有利于NAD+含量的增加与积累，使胞内NAD+水平维持在32 μmol/g DCW左右。
利用响应面分析优化IPTG浓度、烟酸浓度及诱导时长，确定最佳发酵条件，当诱导温度控制在15-20 ℃，在OD600为0.6-0.8时添加IPTG0.63 mmol/L，烟酸15.8 mg/L，诱导时长24 h，E. coli BL21/pET-21a-nad E-pncB胞内辅酶含量能达到43.16 μmol/g DCW左右。与未优化前相比，胞内NAD+含量提高了123.6%，与未强化NAD+合成途径的初始菌株E. coli BL21/pET-21a相比提高了1029.8%。对利用细胞自身辅酶NAD+，促进微生物最大化的合成目标代谢产物，增加代谢速率，提高氧化还原反应中生物催化效率具有较好的借鉴性。
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