周学东1,2
, 徐健3, 施文元4 1.四川大学华西口腔医院, 口腔疾病研究国家重点实验室, 四川 成都 610041;
2.四川大学华西口腔医院, 牙体牙髓病科, 四川 成都 610041;
3.中国科学院青岛生物能源与过程研究所, 单细胞研究中心, 山东 青岛 266101;
4.美国加州大学洛杉矶分校牙学院, 加州 洛杉矶 90095
收稿日期：2017-02-14；修回日期：2017-04-09；网络出版日期：2017-04-14
基金项目：国家自然科学基金（81430011，31425002，81670978）
周学东，1987年毕业于华西医科大学，获医学博士学位，1988年赴丹麦留学。现任四川大学华西口腔医学院主任医师、教授，博士生导师，口腔疾病研究国家重点实验室主任。主要从事口腔微生物与口腔病、全身疾病的基础与临床研究。主持国家“十五”、“十一五”、“十二五”科技攻关及“973前期”、国家重点专项、自然科学基金重点项目等课题10项。发表论文100余篇，获国家级、省部级科技成果奖8项。
主编《实用口腔微生物学与技术》 《口腔微生态学》 《口腔生物膜与感染》 《口腔微生物图谱》等专著16部。获中国青年科技奖、国家教学名师奖、卫生部有突出贡献的中青年专家等，任中华口腔医学会副会长、国际牙医师学院ICD中国区主席、国际牙科研究会IADR中国区主席等.
*通信作者：周学东, Tel: +86-29-85501841, E-mail: zhouxd@scu.edu.cn
施文元, Tel:+01-310-825-8356, E-mail:wshi@dentistry.ucla.edu
摘要：全球超过一半的人口患有口腔疾病，其医护费用与全球十大常见死亡病因的花费相当，而且口腔感染与早产、动脉粥样硬化、肝硬化、糖尿病、阿尔茨海默病等全身性或慢性疾病显著相关，因此，口腔微生物组一直是人类微生物组计划的主要研究对象之一。与人体其他部位比较，口腔微生物组研究具有取样快捷、宿主反应表征方便、干预手段直接有效等特点；同时，超过65%的口腔细菌类群已可培养，诸多代表性菌株的全基因组信息已破译。因此口腔微生物组在菌群内部调控网络及其与宿主互作机制、局部感染对远隔器官的影响机制、以及基于菌群的慢病早期预警等微生物组研究核心科学问题上具备作为模式研究体系与技术示范对象的重要优势。本文在分析口腔微生物组学国际、国内研究现状的基础上，建议尽快启动中国人口腔微生物组计划（China humanoral microbiome project, CHOMP），通过产学研协同攻关，开拓基于口腔菌群的口腔及全身系统性疾病的个体化预防、诊断及治疗策略。
关键词：口腔微生物组 口腔疾病 全身系统性疾病 中国人口腔微生物组计划
Human oral microbiome: progress, challenge and opportunity
Xuedong Zhou1,2
, Jian Xu3, Wenyuan Shi4 1.State Key Laboratory of Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China;
2.Department of Operative Dentistry and Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China;
3.Single-Cell Center, Qingdao Institute of BioEnergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, Shandong Province, China;
4.School of Dentistry, University of California at Los Angeles, Los Angeles, California 90095, USA
Received 14 February 2017; Revised 09 April 2017; Published online 14 April 2017
*Corresponding author: Xuedong Zhou, Tel: +86-29-85501841, E-mail:zhouxd@scu.edu.cn
Wenyuan Shi, Tel: +01-310-825-8356, E-mail:wshi@dentistry.ucla.edu
Supported by the National Natural Science Foundation of China (81430011, 31425002, 81670978)
Abstract: Oral diseases affect over half of world's population and cost the health care the same budget as for the top ten mortality diseases. Moreover, oral infections are associated with systemic or chronic diseases such as preterm birth, atherosclerosis, cirrhosis, diabetes and Alzheimer's disease. Hence, oral microbiome has always been one of the major targets of Human Microbiome Projects. Compared to other body sites, oral microbiome research is characterized by easily-accessible sampling, convenience in phenotyping host responses and directness and high efficacy of intervention approaches. In addition, over 65% of oral bacteria groups are deemed culturable, and genomes of representative strains from these groups have mostly been sequenced. Therefore, oral microbiome is becoming an exceptional research model and basis of technological demonstration for the fundamental questions of human microbiome research, such as inter-species interaction networks, impact of local infection on remote organs, and predictive modeling of chronic diseases, etc. By reviewing the recent scientific and technological progresses in oral microbiome study, here we advocate for the initiation of China Human Oral Microbiome Project (CHOMP), which calls for the collaborative and synergistic efforts from academic, clinical and industrial fronts for exploring and developing strategies and solutions for personalized prognosis, diagnosis and therapy for oral and systemic diseases based on oral microbiome.
Key words: oral microbiome oral diseases systemic diseases China Human Oral Microbiome Project
人体的健康不但依赖于人体自身的基因组，而且由人体共生菌群所塑造与影响。这一“人体微生物组”赋予了人类不依赖于自身进化而获得的复杂个体特征，以至于已被称为“人体第二基因组”。作为人体微生物组的重要定殖部位，人类口腔微生物数量庞大、种类丰富，是微生物-微生物、微生物-宿主之间相互作用的重要竞技场，也是美国国立卫生院人类微生物组计划(human microbiome project，HMP)的主要研究对象之一。新一代测序技术和信息分析技术的联用已将口腔微生物组学研究从低分辨率的单菌种调查迅速提升至高维度的群落整体研究。这些工作正在深入揭示口腔微生物组对口腔乃至全身健康的影响，挖掘其在疾病诊断及治疗效果预测中的作用，推动着口腔微生物组在精准医学(precision medicine)实践过程中的重要贡献。本文在分析口腔微生物组学研究国际、国内现状的基础上，阐述了启动中国人口腔微生物组计划(China human oral microbiome project，CHOMP)的战略意义，以期把握“中国微生物组研究计划”这一契机，发展基于口腔菌群的口腔及全身系统性疾病的个体化预防、诊断及治疗策略，建立与推广中国口腔微生物组产业化技术标准，加速口腔微生物组学研究成果的临床应用，从而为口腔精准医疗(precision oral medicine)做出应有的贡献。
1 口腔及口腔微生物组 口腔是消化道的起始部分，前接口裂与外界环境相通，后经咽峡与咽、呼吸系统及消化系统延续，是人体内部与外界环境物质传递与交换的重要场所，也是病原菌及毒性物质侵入机体的门户。除自身的组织及分泌物(如牙齿、黏膜、舌、唾液)外，人类口腔中定殖了超过600种不同的细菌、病毒、真菌、支原体及衣原体等微生物物种，这些微生物统称为口腔微生物组(oral microbiome)[1-2]。
1.1 口腔微生物组学研究的重要临床意义和社会意义 口腔微生物组是人体五大菌库之一，是HMP重点关注的人体部位(肠道、口腔、皮肤、鼻腔以及泌尿生殖道)。口腔微生物组生态失衡不仅可诱发多种口腔疾病，如龋病、牙髓根尖周病、牙周病、智齿冠周炎、颌骨骨髓炎，还与肿瘤、糖尿病、类风湿性关节炎、心血管疾病、早产等全身疾病紧密相关，对人类健康影响重大[3]。口腔医学作为与临床医学并列的一级学科，推动全民口腔健康对社会经济发展具有重要意义。根据国际牙科研究协会和美国牙科研究协会(IADR/AADR)报道，口腔疾病影响了全球近39亿人，2010年全球用于牙科疾病治疗的直接费用总计2980亿美元，间接费用总计1440亿美元，与全球十大常见死亡病因的花费相当[4]。未经治疗的恒牙龋齿是最常见的口腔疾病，影响全球35%的人口，重度牙周炎和未经治疗的乳牙龋齿分别影响11%和9%的全球人口[4]。鉴于口腔微生物组与口腔及全身健康的密切关系，美国政府2015年启动的“全民个体微生物组检测项目”再次将口腔、皮肤及肠道微生物群落作为主要监测对象，旨在通过大规模人群微生物群落研究，将人类微生物组学研究结果进行临床转化，从人类“第二基因组”中寻找更加精准的疾病预警分子标记。基于口腔疾病诊疗的临床特点，口腔微生物组学研究较人体其他部位微生物组学研究具有取材经济便捷、易于干预和科普教育推广等优势。此外，口腔是环境微生物与人体交流的重要窗口，因此，口腔微生物组学研究将在“中国微生物组研究计划”中扮演连接环境与人体微生物组学研究的重要纽带，具有重要的战略地位。
1.2 口腔是人体微生物组研究中的领先模式体系 微生物学从孕育、诞生到发展，以至成为生命科学中的一个不可忽略的重要分支，始于人类对口腔微生物的研究。早在300多年前，荷兰人列文·虎克使用自制的显微镜，从牙齿表面白色软垢中首次观察到了细菌这种微小的生命体，这一事件被公认为是微生物学的起源[5]。口腔微生物群落是典型的生物膜，而人类最常见的感染性疾病如龋齿和牙周病是迄今研究最透彻的、由生物膜引发的疾病。口腔生物膜具有多种群特性，是研究微生物之间、微生物-宿主间相互作用的最理想模型之一，也是微生物组学研究的经典模型[6]。相较于人体其他部位，迄今已有超过65%的口腔微生物类群可在体外培养，其代表株的全基因组信息大多数已被破译，而且用于验证口腔微生物致病性的体外多重感染模型及动物模型也相对成熟，这些都为以口腔为模式生态系统的疾病相关人体微生物组学研究的功能验证提供了重要支撑。无独有偶，一些先进的微生物组研究思路与技术手段是依托口腔微生物组率先开发与示范的，如尚难培养微生物的培养技术(SHI培养基)[7]、基于荧光原位杂交的高分辨度生物膜空间分布成像方法[8]、基于特异性抗菌多肽的菌群结构精准调控手段[9]、基于菌群的新发性儿童慢病的预警方法[10]等。因此，也许列文·虎克将深为欣慰的是，在其辞世近3个世纪之后，口腔微生物组仍然是微生物组研究方法学开发的最佳测试载体之一。
2 口腔微生物组学研究国际前沿 采用高通量宏基因组学技术，从微生物群落整体出发，是当前研究微生物组与疾病间关系的热点和趋势。宏基因组学技术的发展包括两个方向：一是揭示微生物群落多样性、种群结构及其变化、微生物间相互关系及微生物与环境间的关系；二是通过筛查功能基因，发现微生物群落功能基因及其产物。通过这两方面的研究，达到全面了解微生物群落结构及功能、发掘微生物资源、揭示微生物与疾病间关系的目标。目前，口腔微生物组学研究主要集中于以下方面：(1) 口腔微生物组的生理特点及影响因素；(2) 口腔及全身疾病状态下口腔微生物组的变化；(3) “不可培养”微生物的致病性研究；(4) 人体健康与疾病状态对口腔微生物组的精细调节在疾病风险预警及治疗效果预测中的运用。
2.1 口腔微生物组及其影响因素 口腔微生物组的特点主要包括：(1) 种类复杂：目前全球最大的口腔微生物组数据库HOMD (human oral microbiome database；www.homd.org)已收录有13门619种口腔微生物，其中65%的微生物可在实验室培养[11]。事实上，人类口腔微生物组的复杂程度远超HOMD所收录的物种范围。Keijser等人发现口腔微生物涵盖22个细菌门的318个细菌属，其中唾液、菌斑分别定殖了5600及10000个种系型[12]。(2) 多层次多位点分布：口腔内既含有脱落表面(黏膜)，也有非脱落的固体表面(牙面及义齿表面)，同时还含有流动的唾液，定殖于不同介质表面(中)的口腔微生物组存在显著的空间特异性。例如，牙菌斑菌群、黏膜菌群、唾液菌群的组成存在显著差异，牙菌斑内定殖的微生物丰富度最高，唾液次之，颊黏膜最低[13]。Gizani等人[14]联合使用高通量测序及常规分析技术分析了健康个体唾液、龈上菌斑、龈下菌斑、舌部和颊黏膜等生态位点的微生物组，结果显示牙面和舌部微生物数量较其他部位多。Huse等人[15]对200名志愿者唾液、龈上菌斑、硬腭、腭扁桃体、舌背、颊黏膜、龈下菌斑、角化牙龈等8个口腔位点的微生物组进行对比分析，发现棒状杆菌属在口内各位点分布具有差异性：马氏棒状杆菌几乎全部存在于龈上菌斑中，而银色棒状杆菌大部分存在于唾液当中，在硬腭菌群中几乎不存在，提示口腔微生物组的位点特异性，即不同生态栖息位点具有不同的多样性特征。(3) 年龄及牙列更替压力：Dominguez[16]在新生儿分娩5分钟之内收集其口腔标本并对其中的微生物构成进行分析，结果发现顺产胎儿的口腔微生物组的组成与母体产道中的微生物相似，而剖腹产胎儿的口腔微生物组成则与母体的皮肤微生物组成相似。值得注意的是，初生婴儿的口腔、肠道、皮肤微生物组之间并没有差异存在[16]，因而不同部位的微生物的分化时间及过程值得深入研究。健康个体发育成长过程中口腔微生物组发生着动态变化，即随着年龄增长及牙列的更替，口腔微生物组出现生理性改变，不同年龄组人群的微生物组成具有特异性：乳牙列期菌群以变形菌门为优势菌，具有更多的不动杆菌属、莫拉菌属等；在混合牙列、恒牙列期，菌群以拟杆菌门为主；随着年龄增长，拟杆菌门(普氏菌属为主)、韦荣球菌科、螺旋体菌门以及TM7丰度逐渐增加[17]。周学东等人[13]横向比较研究了3天至76岁不同年龄段人群的口腔微生物组成，发现恒牙列期(青少年期)唾液微生物以厚壁菌门为主，乳牙列期与恒牙列期(成人期)变形菌门为优势菌，而梭菌属在混合牙列、恒牙列期(老年期)丰度较高。牙菌斑及黏膜菌群也表现出随年龄及牙列替换而改变的特征，提示随着年龄增长存在微生物组的转变。(4) 具有个体间差异性：Nasidze等人对全球12个国家和地区120例健康人群唾液样本进行分析，发现口腔菌群具有个体特异性，但几乎不受地理位置的影响[18]。(5) 具有个体内相对稳定性：口腔微生物组在同一个体不同时间点出现的差异性显著低于肠道、皮肤等部位[19]。Lazarevic等人[20]分析了健康个体29天内3个不同时间点的唾液样本，发现唾液微生物组在5天内保持稳定，提示个体的口腔微生物组在短时期内具有相对稳定性。(6) 与遗传背景相关：同卵双生子之间的口腔微生物组相似性高于异卵双生子，提示宿主遗传背景对口腔微生物组结构与功能具有一定影响[21]。(7) 与口腔及全身系统性疾病密切相关：可实时反映人体健康与疾病状态[3]，在疾病预测及治疗预后评估中具有一定运用前景。
2.2 口腔微生物组与口腔疾病 口腔感染性疾病主要包括龋病、牙龈炎、牙周炎、根尖周炎以及颅颌面部其他软组织和间隙感染。绝大多数口腔感染性疾病为非特异性感染，口腔微生物组以群体的方式参与和(或)促进了疾病的进程。龋病发生发展过程中口腔菌群组成、结构及功能均发生了显著改变，多种细菌在龋病及健康人群之间的分布均有显著差异。更为重要的是，在龋病临床症状出现之前即可检测到口腔微生物组的异常。例如，“奶瓶龋”临床症状出现前，患儿牙面上定殖的口腔微生物群落α及β多样性均有显著提升，与龋洞已形成儿童的口腔微生物群落相似性增加而与健康儿童口腔微生物群落的相似性减小[10]；成年患龋者健康牙齿上定殖的口腔菌群，其物种间“共现关系”(co-occurrence)明显异于无龋者，微生态群落拓扑结构复杂程度显著降低。在牙龈炎的发生过程中，口腔微生物组的改变是循序渐进而非跳跃式的，改变的程度与临床症状密切相关，这种改变在同一个体牙龈炎反复出现时具有可重复性[22]。牙周炎是程度较牙龈炎更严重的牙周组织疾病。牙周炎患者口腔微生物菌群中的梭杆菌、卟啉单胞菌、螺旋体属、产线菌属、优杆菌属、坦纳菌属、霍氏菌属、微单胞菌属、消化链球菌、卡氏菌属等相对丰度显著高于健康人群；而奈瑟菌属、棒状杆菌属、二氧化碳噬纤维菌属、放线菌属等低于健康人群[23-25]。此外，牙周炎患者口腔微生物组成的改变进一步引入了群落功能基因结构[23]及基因表达谱系[26]的改变。其他口腔疾病，如根尖周炎[27-28]、口臭[29]、口腔扁平苔藓[30-31]等患者的口腔微生物组组成与健康人群相比同样存在显著差异。
2.3 口腔微生物组与全身系统性疾病 早在1891年，Miller提出了口腔病灶感染学说，指出口腔微生物感染可进入与其毗邻或较远的身体其他部位，导致多种全身系统性疾病；随后，Billing等****推测，感染的牙齿可能是类风湿性关节炎、肾炎、心内膜炎等疾病的病因；该学说的支持者认为，牙菌斑及其代谢产物可进入血液循环系统，导致多种系统性或退行性改变[32]。因此，通过拔除患牙来治疗全身系统性疾病不仅在牙学界，也在医学界广为流行[32]。然而，口腔病灶学说一直未得到足够的重视及理论支持。近年来，随着微生物组学研究的深入，口腔微生物组与多种重大慢性非传染性疾病间的关联逐渐被证实，包括消化系统疾病、心血管疾病、肿瘤、早产、糖尿病、类风湿性关节炎、神经系统疾病等。
2.3.1 消化系统疾病: 幽门螺杆菌的主要传播途径包括粪–口途径、口–口途径和胃–口途径。研究发现，幽门螺杆菌在口腔普遍存在，是口腔微生物组的成员之一。Miyabayashi等人[33]发现，幽门螺杆菌感染性胃炎的系统性抗菌治疗效果与口腔中幽门螺杆菌的定殖情况有关，提示口腔的健康状况将直接或间接地影响胃部幽门螺杆菌的感染和再感染。牙龈卟啉单胞菌是口腔常驻菌群，其可导致肠道微生物群落结构紊乱，参与肠道炎症发生[34-35]。另一口腔常驻菌——具核梭杆菌在正常情况下几乎无法在肠道中检测出，但该细菌在病理状态下可定殖于肠道，在结直肠肿瘤和炎性肠病中发挥重要作用[36-37]，并与结肠癌预后密切相关[38]。阑尾中可检测出多种口腔常驻细菌(如双球菌属、微单胞菌属和梭杆菌属等)，梭杆菌属与阑尾炎严重程度密切相关[39]。有****发现肝硬化患者肠道微生物组内含有口腔细菌的入侵[40]，这些入侵的口腔微生物可能通过促进小肠内细菌的过度繁殖而参与肝硬化的发生。通过对肝硬化患者以及肝硬化并发肝性脑病患者粪便微生物群落16S rRNA序列分析，发现唾液链球菌可移位到肝硬化患者肠道并过度增殖，是肝硬化以及肝硬化并发肝性脑病的重要诱因[41]。此外，不良口腔卫生保健行为可改变口腔菌丛，引起肠道微生物失衡，导致炎性肠病的发生[42]。
2.3.2 心血管疾病: 心血管疾病是指发生于心脏和血管循环系统的病变，包括冠心病、心内膜炎、心肌梗死等，是一类具有较高致死率的多发性疾病。大量横断面研究、病例分析和流行病学调查显示，牙周炎是心血管疾病发生发展的重要危险因素。牙周炎患者牙周袋内牙龈上皮易发生破损，有助于细菌进入全身循环系统，导致菌血症，或异位定殖于体内其他器官。与牙周炎发生密切相关的牙龈卟啉单胞菌可侵袭并定殖于患者动脉粥样硬化斑块中[43]，几乎所有的动脉硬化粥样斑块中均可检出牙龈卟啉单胞菌。此外，动脉粥样硬化斑块还可含有链球菌、韦荣菌、具核梭杆菌、福赛斯坦纳菌[44-46]；梭杆菌、链球菌、奈瑟菌的分布水平甚至与该疾病的危险信号如血浆胆固醇的水平相关[43]。牙周病相关细菌可能通过破坏机体免疫，刺激细胞产生TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子，引起相关炎症及血管内皮损伤，促进动脉粥样硬化斑块形成。
2.3.3 口腔癌: 研究发现，口腔癌表面和癌体组织内均存在着特异性微生物，其组成与正常黏膜微生物具有显著差异。Mager等人[47]发现，口腔鳞状细胞癌患者唾液中的牙龈二氧化碳噬纤维菌、产黑色素普雷沃菌和缓症链球菌含量明显增加，将这3种细菌作为诊断标志物，可诊断约80%的口腔鳞状细胞癌，因此，3种细菌具有作为口腔鳞状细胞癌诊断指标的潜在价值。此外，口腔微生物组也可能参与了远隔器官肿瘤的发生或被远隔器官发生的肿瘤所影响。以胰腺癌为例，患者唾液微生物组中缓症链球菌及长奈瑟菌在胰腺癌患者唾液中的比例较健康人群明显低[48]。
2.3.4 胚胎发育: 妊娠期宫内感染可能导致诸多孕期并发症，是早产的危险因素之一。早产胎儿与足月产胎儿的胎盘微生物群落组成存在明显不同，说明胎盘微生物群落与早产之间可能存在关联。Mendz等人[49]通过Meta分析发现761名早产孕妇中349人有宫内感染，病原体多达87种，其中除了生殖道病原体外，还包括呼吸道病原体以及常见口腔微生物。与阴道、肠道、呼吸道等位点相比，胎盘微生物群落组成与口腔微生物最相似[50]。动物模型研究进一步证实，将人唾液和龈下菌斑微生物样本注射入大鼠尾静脉，胎盘中定殖的细菌多为口腔细菌[51]。在羊水中测出的二氧化碳嗜纤维菌、福赛斯坦纳菌、齿垢密螺旋体、微小消化链球菌、血链球菌、口腔链球菌及伴放线放线杆菌等口腔细菌[51]，提示口腔细菌可能通过入侵羊水，在局部产生病理效应从而导致早产风险升高。
2.3.5 糖尿病: 糖尿病是一种常见的内分泌疾病，由于胰岛素分泌绝对或者相对不足或靶细胞对胰岛素敏感性降低引起。目前普遍认为，糖尿病与牙周炎之间存在着双向影响关系：糖尿病病人的牙周炎易感性高于血糖正常人群，而牙周炎的有效控制对血糖的控制具有举足轻重的影响。口腔微生物群落作为牙周炎的始动因子，是导致牙周炎症的“罪魁祸首”。牙周炎患者牙周袋内的口腔微生物与人体免疫系统发生复杂的交互作用，产生持续的慢性炎症，部分口腔微生物还可进入血液循环。大量研究证实糖尿病的发生与牙周炎相关：牙周炎可导致全身系统性炎症因子升高，如细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6等，并增加机体氧化应激水平，影响胰岛素敏感性和血糖代谢。牙周微生物感染导致的人体炎症反应很可能是促进糖尿病发生的机制之一。与非糖尿病牙周炎患者相比，糖尿病伴牙周炎患者龈下菌群的整体群落结构发生显著改变，多种细菌在两者间出现差异性富集[52]：兼性双球菌、艾肯菌、月形单胞菌、放线菌、梭杆菌在群落中的比例显著升高[53]且部分细菌如二氧化碳噬纤维菌属的绝对计数在龈下菌群中也有显著改变[54]。
2.3.6 类风湿性关节炎: 类风湿性关节炎是一种病因未明的以滑膜炎症和关节破坏为主的系统性自身免疫性疾病。关于类风湿性关节炎的病因尚不清楚，其中微生物与类风湿性关节炎的相关性近年来受到诸多关注。流行病学研究显示，牙周炎在类风湿性关节炎患者中普遍存在[55]。近期研究发现，类风湿性关节炎患者的口腔微生物组存在显著生态失调[56]。牙周厌氧菌牙龈卟啉单胞菌及伴放线放线杆菌均可通过其毒力因子促进类风湿性关节炎的疾病进程[55]。
2.3.7 神经系统疾病: 偏头痛反复发作于一侧或两侧颞部的搏动性头痛，多见于女性，发病率约为男性的3–4倍，发病年龄多见于25–34岁。含硝酸盐类食物经细菌代谢产生亚硝酸盐，并最终还原为一氧化氮，被认为是引起偏头痛主要原因之一。近期研究发现，偏头痛患者口腔微生物组编码与硝酸盐、亚硝酸盐和一氧化氮代谢相关酶的基因显著富集，提示口腔中的细菌可能通过“硝酸盐–亚硝酸盐–一氧化氮”途径参与偏头痛的发生[57]。 阿尔茨海默病是一种起病隐匿、进行性、发展性的神经系统退行性疾病，临床症状包括记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等。早在20世纪90年代，Miklossy等人就提出，口腔微生物与阿尔茨海默病的发生有密切关系[58]；通过分子生物学技术手段从脑组织中检测到口腔源性螺旋体[59]及牙龈卟啉单胞菌脂多糖[60]，给予了这一假说有力的支持。口腔细菌及其释放的内毒素在侵入大脑后，可能使小胶质细胞活化，进一步导致促炎症细胞因子如TNF-α和IL-1的释放，而脑组织长时间暴露于高浓度的TNF-α和IL-1中，可使细菌或内毒素更容易渗入脑组织加重疾病临床症状[61]。 2.4 “不可培养”微生物的致病性研究 宏基因组学技术的快速发展使得高通量解析口腔微生物组的变化、发掘新的可疑致病菌成为可能。然而，对于新的、可疑的、尚未被培养的致病菌(群)，其毒力及致病机制验证是主要的技术瓶颈。目前的研究策略主要包括：(1) “不可培养”口腔微生物的可培养化。Tian等人在对常用培养基关键营养成分进行深入分析的基础上，开发研制了新一代SHI培养基[62]。经PCR-DGGE及454焦磷酸测序验证，SHI培养基可最大限度还原口腔微生物群落多样性及组成。在此基础上成功地从口腔微生物组中分离出以往认为不可培养的细菌，如微生物界“暗物质”TM7，并研究了该菌种的形态学特征、生长特点及致病性[7]，为深入探究口腔微生物组在人体健康及疾病中的作用奠定了重要基础。(2) 菌群功能/状态的单细胞功能成像、分选与测序。既然菌群中大部分细胞难以培养，绕过细菌分离培养难关，直接通过单细胞功能成像技术，实现菌群功能/状态的实时识别也是一种策略。现有的活体单细胞表型分析技术，如荧光流式细胞仪，通常无法分析没有生物标识物或无法标记的微生物细胞。而基于单细胞拉曼成像的拉曼组与元拉曼组技术[63]，可无需标记、不依赖于细胞扩增，在单个细菌细胞精度快速测量针对特定底物的细胞活性[64]、细胞中化合物种类与含量[65-66]、细胞应激反应及其机制[67]、药敏性与耐药性[68]、物种之间的代谢互作[69]等关键表型。在此基础上，近期发明的单细胞拉曼弹射分选技术[70]、单细胞拉曼流式分选技术[71]、单细胞微液滴分选技术[72]等共同组成的“活体单细胞拉曼分选”(RACS)技术体系[73]可根据活体细胞的功能，在单细胞精度实现菌群功能及状态的实时识别，进而实现基于功能分选的单细胞测序和单细胞培养[63]。
2.5 口腔微生物组在疾病风险与治疗效果预测中的作用 口腔作为消化系统的入口，为连通人体内外的交通枢纽。口腔微生物组受到人体健康与疾病状态的精细调节，并可敏感地对这些调节因素迅速产生适应性调整，放大机体发生的临床前症状。此外，口腔微生物组在疾病状态下的改变具有渐进式、可重复性的特点。口腔微生物组的以上特点提示其在疾病的风险预警及疗效预测中具有重要价值。
以龋病为例，传统龋病风险评估措施包括单一细菌的微生物参数(如变异链球菌和乳杆菌菌落计数)、唾液生化参数(唾液流速、pH值、缓冲能力检测)、既往龋病经历、个体口腔卫生状况、刷牙习惯、饮食习惯及社会经济条件等[74]。上述评估参数和检测模型存在根本的局限性[75]，如主观性、费时费力、无法远程监控，并且基于“既往龋病经历”的风险评估无法弥补龋病已带来的不可逆性损伤。因此，这些龋病风险评估模型尚未能得到广泛的临床应用。Teng等人通过高通量测序技术发现口腔菌群变化先于龋病临床症状出现，基于此构建了“龋病的菌群指数”(microbial indicators of caries，MiC)[10]。MiC不依赖于牙医或患者之主观判断、也不依赖于细菌培养，因而在准确性、客观性、可重复性、可比较性等方面具有核心优势，能够在临床龋病发生之前(即亚健康状态)时，以81%的准确率预测儿童早期龋的发生，可有效帮助医生在疾病出现前进行临床干预，达到早期预防、早期诊断的目的。该课题组同时对牙龈炎的菌群预测模型进行了探究，通过监测牙龈炎康复、发展和再康复过程中牙菌斑菌群结构和功能变化，提出了一种基于微生物的新型口腔感染严重程度诊断方法，命名为“牙龈炎的菌群指数”(microbial index of gingivitis，MiG)[22]。与基于“视诊”和“探诊”的传统牙龈炎诊断手段相比，MiG作为一种“非侵害性”、不依赖于牙医主观判断的新型检测方法，在病人友好度、可重复性、可比较性等方面具有关键优势。此外，菌群结构的变化有望反映远期疗效。指导患者正确清洁牙齿及使用漱口水是牙龈炎发作时常规的临床处理。龈上洁治、刷牙、刷牙-漱口水联合使用均可缓解患者临床症状、通过推动疾病状态下的微生物组向健康状态回复达到疾病治愈目的。这3种口腔护理方式均有特征性的牙龈菌群变化图谱，其中洁牙(目前业界公认最有效的牙龈炎治疗方式)导致了最广谱、最显著的菌群结构变化，而常规牙膏的使用仅导致5个细菌属的丰度改变[76]。以洁牙后菌群变化特征为参照，研究人员提出了各种牙龈健康护理方案“相对菌群恢复程度指数”(简称RMRI)的概念[76]。这一指数可纵向反映每种方式在处理过程中的菌群动态变化，进而推测远期临床效果，指导医生适时调整治疗方案，达到最佳临床效果。
此外，类风湿性关节炎患者的口腔微生物群落与健康人相比存在显著失调，这种生态失调可通过类风湿性关节炎的治疗而恢复，且恢复程度与患者对治疗的反应密切相关；根据口腔及肠道微生物菌群元基因组关联分析，构建人群分类诊断模型在区分健康人及类风湿性关节炎患者的诊断准确率接近100%，提示口腔微生物群落可根据机体疾病的恢复情况进行适应性调整，对全身疾病的发生、发展及预后具有极高的敏感性[56]。
一些基于微生物组的治疗技术突破也来自于口腔。例如，我们开发了一类名为“目标特异性抗菌多肽”(specifically targeted anti-microbial peptides，STAMPs)的新型抗菌素。每个STAMP由1个非特异性的杀菌模块和1个针对特定菌种的目标结合模块2个部分组成。其工作原理是目标结合模块特异性地结合病菌，进而通过与其连接的杀菌模块来杀灭该菌。我们根据口腔致龋菌——变异链球菌的信息素(competence-stimulating peptide，CSP)蛋白序列设计了STAMP目标结合模块，从而将杀菌模块靶向投送到变异链球菌。这种STAMPs可从诸多物种组成的微生物群落中清除变异链球菌，同时不影响种系关系相近却非致龋的其他口腔链球菌，具有在不破坏正常菌群结构功能的前提下选择性杀灭病原菌的潜力[9, 77]。这一基于变异链球菌的靶向抗菌技术也为设计和制备针对其他病原菌或服务于人体其他部位的STAMPs奠定了良好的基础。
3 口腔微生物组学国内研究现状 经过多年的发展，我国口腔微生物组学研究已具备了较好基础，在科学问题探讨、科研队伍培养、基础设施建设等方面取得了长足进展，人才队伍颇具规模、科研成果不断涌现。
基础研究方面，我国口腔微生物学家采用各种高通量分析技术，在宏基因组学层面对口腔微生物组进行了系统研究。通过分析双生子[21]、不同年龄(新生儿、婴幼儿期、青少年、成人、老人)[13]、不同民族[78]人群的口腔微生物组样本，解析了生理状态下口腔微生物组的特点及影响因素，绘制了口腔微生物“核心微生物组”结构图[13]，并提出了更为科学的“口腔核心微生物组”概念，即应针对人群不同年龄/牙列阶段口腔内环境的生态学特点，对“口腔核心微生物组”进行个性化划分[13]；通过研究龋病[10, 79-80]、牙周病[22-23, 76]、扁平苔藓[30]患者口腔微生物组，确定了口腔菌群结构与这些疾病的关联性；通过监测微生物结构和功能的动态变化，揭示了中国典型人群中口臭发展过程的微生物的改变，为口臭的前期诊断提供了新的思路[81]；通过研究全身系统性疾病(白血病[82]、放化疗[83]、头颈部肿瘤[84]、HIV[85]、糖尿病[52])患者的口腔微生物组，进一步明确了口腔微生物组在全身系统性疾病发生及发展中的作用。同时，我国****根据口腔内不同生态位点中菌群分布的规律在国际上首次提出了龋病的菌群指数MiC[10]、牙龈炎的菌群指数MiG[22]、以及用于客观评价牙龈健康护理方案的相对菌群恢复程度指数RMRI[76]，并通过类风湿性关节炎示范了口腔微生物群落在全身疾病诊断及预后判断中的潜在作用[56]。
在平台建设方面，四川大学华西口腔医学院口腔疾病研究国家重点实验室通过20多年来对口腔微生物资源的保藏研究，结合多地域、多民族、不同年龄阶段健康与疾病人群口腔微生物群落的临床资料与微生物宏基因组学大数据，创立了首个中国人口腔微生物资源数据库，建立了临床样本收集、分离鉴定保藏、样本信息管理技术规程，并提供细菌16S rRNA序列信息的比对功能，根据临床样本基因序列，预测口腔微生物分型及相关临床信息，为研究发病机制、临床防治新技术提供重要的共享资源。随着四川大学华西口腔医院国家口腔疾病临床研究中心建设的深化，加强口腔微生物与全身健康的多中心研究，建立基于口腔微生物群落信息的疾病预警系统将成为该中心的工作重点之一。
此外，在微生物组大数据分析技术方面，中科院青岛生物能源所单细胞中心以口腔微生物组为模式体系，通过发展Parallel-Meta等一系列算法和软件[86-91]，建立了对海量元基因组数据进行有效组织管理、质量监控与大规模数据比对分析的微生物组大数据引擎。与该中心开发的拉曼组、元拉曼组，以及单细胞拉曼分选、测序与培养等新技术与新仪器[63-73]相结合，这些努力为基于口腔微生物组的慢病诊断和预警技术平台奠定了良好的基础。
4 启动中国口腔微生物组计划的战略意义及发展规划建议 截至2016年，有资料可查的国际微生物组研究计划有13项与人类健康相关。美国、加拿大、爱尔兰和法国是这些计划的主要参与国家。中国科学家积极参与了人类肠道宏基因组计划(MetaHIT)和国际微生物组联盟(IHMC)计划。从国际科技竞争态势和服务国家需求出发，启动中国微生物组研究计划已势在必行。目前，世界各国对人体微生物组的研究投入主要集中于肠道，在口腔微生物组学研究领域投入相对较少。美国2012–2014年3个财政年对于口腔微生物组学研究的投入仅占人体微生物组学研究总投入的5%左右，远落后于肠道微生物组学研究( > 55%)[92]，与口腔医学作为与临床医学并列的一级学科的学科地位不符。口腔与肠道作为解剖结构的延续，口腔微生物组与肠道微生物组是人体最重要的两大“菌库”。单纯针对口腔微生物组或肠道微生物组的研究并不能全面解析微生物在人体疾病发生发展过程中的作用与机制，限制了疾病防治临床新技术的研发。因此，从整体出发，深入研究口腔微生物群落与肠道微生物群落交互作用，有望成为我国疾病微生物组学研究的特色，并极有希望在该领域实现国际领跑。
在围绕人类口腔微生物组学研究所开展的口腔医学未来格局的竞争中，中国与美国尚处于同一起跑线，亟需国家大力投入与布局，立足国情，明确自身优势，启动中国人口腔微生物组计划(China human oral microbiome project，CHOMP)，加速利用我国巨大的口腔疾病临床资源转化为促进口腔临床诊疗技术进步的战略资源，把握我国口腔医学国际领跑的重要契机，在国际微生物组学研究计划中掌握更大的主动权与话语权。对于启动和实施中国口腔微生物组计划有以下几点建议：
(1) 建议启动国家层面的中国人口腔微生物组计划，依托国家重点实验室及国家临床研究中心等国家级研究平台的引领与辐射作用，成立中国人口腔微生物组研究计划联盟，组织全国专家进行顶层优化设计，规划口腔微生物组研发路线图，明确发展各阶段目的，将政府、患者、临床医生、微生物学家、分子生物学家、计算科学家及生物信息学家有机地结合及统一起来。
(2) 基础研究目标是解决临床实际，产生更多具有中国自主知识产权的理论、临床新技术新方法、临床指南和专家共识。中国人口腔微生物组计划必须与临床转化医学紧密结合，围绕口腔与全身重大疾病防治，解决临床实际问题。建议基于中国人口腔微生物组的生物学特性，围绕国人常见口腔与全身疾病开展基于口腔微生物组的疾病个体化精准治疗，创建疾病风险预警与预后评估系统，推动口腔微生物组学研究成果的临床转化。在此基础上，建立产业共识，明确努力方向，推广中国口腔微生物组学产业化技术标准，加速科技成果的产业化进程，构建高效的人才培养、成果推广体系和高水平的创新平台。
(3) 建立国家级口腔微生物组数据中心，实现大数据集成与综合应用。海量数据的解析与挖掘是微生物组研究的关键环节之一，只有建立可靠、灵活和安全的大数据引擎和可视化工具，实现数据的规范化存储及中心内数据在云端的安全实时共享，才有可能实现口腔微生物组服务与支撑精准医疗产业的潜力。
(4) 加强国内外交流合作，针对学术领域的重点和热点，加强学科交叉，特别重视口腔与肠道微生物组学研究的协同创新，组织相关研讨会、产业论坛，举办国际学术会议、推广国际口腔及人体微生物组学研究最新科技成果和技术标准。
5 结语 人类的“第一基因组”(人类基因组)及“第二基因组”(人类微生物组)共同决定了人体的疾病健康状态。将“人类微生物组”计划的研究结果用于临床，从“第二基因组”中寻找更加精准的疾病早期诊疗的分子标记，是最终实现个性化精准医疗的根本途径。口腔微生物组是口腔疾病及全身系统性疾病的窗口；而且在人体微生物组学的核心科学问题探讨与共性技术开发方面，口腔作为一个模式研究体系具有诸多特色与优势。因此，中国口腔微生物组学研究应抓住机遇，整合信息化医疗技术、基因组技术和人体微生物基因组技术，切实推动微生物组学研究成果在口腔医学领域的应用。
致谢: 特别感谢四川大学华西口腔医学院徐欣副教授和美国加州大学洛杉矶分校何雪松副教授在本文撰写过程中所提供的各方面协助。
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