新型隐球酵母U6启动子的鉴定、克隆及功能验证
王宇¹, 肖婷婷¹, 朱项阳¹, 赵雪茹¹, 魏东盛¹, 朱旭东^1,2
1.南开大学生命科学学院, 天津 300071;
2.北京师范大学生命科学学院, 北京 100875

收稿日期：2016-05-18；修回日期：2016-07-06；网络出版日期：2016-07-19
基金项目：天津市自然科学基金（16JCYBJC23800）；国家自然科学基金（81271801）

_*通信作者：魏东盛,Tel/Fax:+86-22-23505961,E-mail:weidongsheng@nankai.edu.cn
朱旭东，Tel/Fax：+86-10-58804266，+86-22-23506510；,E-mail: zhu11187@bnu.edu.cn, zhu11187@bnu.edu.cn


摘要： [目的]鉴定及克隆新型隐球酵母（Cryptococcus neoformans）中Pol Ⅲ型的U6启动子（CnU6启动子），并验证CnU6启动子能否有效转录shRNA及CRISPR/Cas9系统中gRNA。[方法]结合GenBank数据库已公布的新型隐球酵母基因组信息和本实验室RNA-seq文库数据，利用生物信息学技术分析得到新型隐球酵母中具有高转录水平的U6 RNA序列。使用重叠PCR和EasyGeno方法将预测的CnU6启动子分别克隆到shRNA及gRNA的上游区域，通过观察shRNA对靶基因的RNAi效果及gRNA引导Cas9核酸酶对靶位点的切割结果，确定CnU6启动子能否转录短RNA。[结果]CnU6启动子能够转录形成shRNA对靶基因进行沉默，并且能转录形成gRNA引导Cas9核酸酶对靶点进行切割。[结论]新型隐球酵母的CnU6启动子被成功鉴定及克隆，它能有效驱动shRNA和gRNA的转录。
关键词： 新型隐球酵母 CnU6启动子 shRNA CRISPR/Cas9
Identification, cloning and functional verification of U6 promoter from Cryptococcus neoformans
Wang Yu¹, Xiao Tingting¹, Zhu Xiangyang¹, Zhao Xueru¹, Wei Dongsheng¹, Zhu Xudong^1,2
1.College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071, China;;
2.School of Life Sciences, Beijing Normal University, Beijing 100875, China

Received 18 May 2016; Revised 06 July 2016; Published online 19 July 2016
_*Corresponding author: Corresponding author. Dongsheng Wei, Tel/Fax: +86-22-23505961, E-mail: weidongsheng@nankai.edu.cn
Xudong Zhu,Tel/Fax: +86-10-58804266, +86-22-23506510, E-mail: zhu11187@bnu.edu.cn, zhu11187@bnu.edu.cn
Supported by the Natural Science Foundation of Tianjin (16JCYBJC23800) and by the National Science Foundation of China (81271801)

Abstract: [Objective] To identify and clone the polymerase Ⅲ U6 promoter from Cryptococcus neoformans (CnU6 promoter), and verify if CnU6 promoter can effectively transcribe shRNA and gRNA of CRISPR/Cas9 system.[Methods] Combining the C. neoformans genome information published in GenBank database and RNA-seq library data from our laboratory, we obtained the U6 RNA sequence with high transcriptional level by bioinformatics analysis. The putative CnU6 promoter was ligated upstream of shRNA and gRNA by EasyGeno and overlapping PCR respectively. Based on shRNA-mediated target gene silence phenotype by RNAi and gene mutation by gRNA-guided Cas9 nuclease mediated target sites editing by CRISPR/Cas9 system, we could identify if CnU6 promoter could drive the transcription of short RNA.[Results] CnU6 promoter could drive the transcribtion of shRNA, which could silence the target gene, and gRNA, which could guide Cas9 nuclease to cut the target site.[Conclusion] The CnU6 promoter from C. neoformans was successfully identified and cloned, which could drive the transcription of shRNA and gRNA efficiently.
Key words: Cryptococcus neoformans CnU6 promoter shRNA CRISPR/Cas9
新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)作为一种条件致病真菌，能引起免疫缺陷人群的严重感染。近些年来，随着艾滋病患者的不断增加，高致死率隐球菌病的患者数量也在不断增多^[1-2]。现在，新型隐球酵母已发展成为一种模式生物，多种血清型菌株均已完成全基因组测序和注释。然而新型隐球酵母自身同源重组效率极低，很难进行基因定向敲除，这已严重阻碍了新型隐球酵母功能基因方面的研究。目前，国际上通常使用基因枪法对新型隐球酵母的基因进行定向敲除^[3]，但该方法的实验成本较高，且在新型隐球酵母血清型D菌株中发生同源重组的效率依然很低(约1-4%)^[4]，使得筛选正确转化子的工作量极大。
在高等真核生物中，外源DNA与靶细胞DNA序列自然发生同源重组的频率也非常低，如人类ES细胞中同源重组频率仅为10^-5-10^-7[5]。以哺乳细胞为例，对于基因功能的研究主要有两种方式：一种是利用Pol Ⅲ型启动子(如U6、H1、7SK等)转录短发卡RNA (shRNA，short hairpin RNA)，shRNA经Dicer切割后成为siRNA，通过RNAi系统对靶基因表达进行干扰^[6]。因RNAi导致靶基因表达水平降低，使得细胞显现出类似于基因缺失的表型，从而对靶基因的功能进行研究。在各种Pol Ⅲ型启动子中，以U6启动子的转录效果最好，使用最为普遍。U6启动子具有明确的转录起始点G，所有启动子元件均位于转录起始点上游，以位于启动子下游的5′-TTTTT-3′序列作为转录终止信号，转录产物会在3′端悬挂2-4个寡聚U^[7]。另一种是通过基因打靶技术对目标基因进行编辑^[8-10]，其中以近年来新兴的第三代打靶技术CRISPR/Cas9系统操作最为简单、打靶效率最高。目前广泛使用的CRISPR/Cas9系统基于产脓链球菌(Streptococcus pyogenes SF370)中的Ⅱ型CRISPR/Cas9系统改造而成，由gRNA和Cas9人工核酸内切酶构成^[11]。gRNA以5′端17-20 nt作为靶标序列，以碱基互补配对为原则在全基因组范围内寻找位于PAM位点(NGG)5′端且能正确配对的靶点，并引导Cas9核酸酶对正确靶点位置的双链DNA进行切割，形成双链断裂切口(DSB，double-strand break)。无同源序列存在时，细胞将以非同源性末端接合(NHEJ,non-homologous end joining)方式对DSB进行修复，高频率引入移码突变。有同源序列存在时，细胞主要以同源重组方式(HR，homologous recombination)修复DSB，进而能大大提高同源重组频率^[12]。
对于新型隐球酵母，目前主要报道有2种类型的RNAi表达质粒。一类是Liu等报道的通过单启动子转录一段由正反靶基因序列和间隔序列组成的表达框，转录产物内部可自发形成茎环结构，进入RNAi途径^[13]。该方法获得的转化子中约10%可表现出清晰的突变表型。第二类是Bose等报道的通过反向双启动子转录同一段靶基因序列，两个反向启动子的转录产物完全互补，互相也可自发形成双链RNA，进入RNAi途径^[14]。该方法获得的转化子中超过80%可表现出一系列程度的突变表型。然而这两类RNAi表达质粒均使用Pol Ⅱ型启动子驱动转录，它们或需要较长的正反向靶基因序列用于形成双链RNA，或需要两个相同序列的启动子启动转录，而这些较长的同源序列在酵母细胞中易发生重组，引起干扰效果不稳定^[15]。Pol Ⅲ型启动子仅需极短的靶序列(19-21 nt)即可成功介导RNAi，能有效避免同源序列间发生重组，维持干扰效果的稳定。目前尚未有使用Pol Ⅲ型启动子转录shRNA对新型隐球酵母中靶基因进行RNAi的报道。
CRISPR/Cas9系统目前已在包括酵母^[16-18]和丝状真菌^[19-21]在内的多种真菌、植物和动物中成功应用，而在新型隐球酵母中成功应用CRISPR/Cas9系统还未有报道，其中的一个关键问题是没有合适的启动子驱动gRNA的表达。考虑到新型隐球酵母自然重组率低，基因敲除困难的研究现状，本小组尝试将CRISPR/Cas9系统引入新型隐球酵母中，利用该系统对新型隐球酵母的基因进行人工打靶。
CRISPR/Cas9系统中的gRNA需要有明确的转录起点，在高等生物中通常由Pol Ⅲ型的U6启动子驱动gRNA转录。在无U6启动子报道的生物中，主要使用两种策略来产生有功能的gRNA。一种策略以酿酒酵母使用的SNR52启动子为代表^[16]，该启动子转录的初始gRNA带有一段前导序列，但该前导序列能在加工成熟过程中被切除，形成有功能的gRNA。SNR52启动子也被成功用于同为子囊菌门的一些丝状真菌中，如粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)^[20]和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)^[21]等。然而本实验室实验证明，酿酒酵母SNR52启动子不能在担子菌门的新型隐球酵母中发挥功能。另一种策略是使用来源于噬菌体的T7启动子驱动gRNA转录，恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)^[22]和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)^[23]等使用该策略成功表达CRISPR/Cas9系统。然而，T7启动子只能被T7 RNA聚合酶所特异识别，因此必须事先在受体细胞中导入可表达的外源T7 RNA聚合酶基因。
为了能在新型隐球酵母中成功表达shRNA及CRISPR/Cas9系统，寻找一个能高效转录shRNA及gRNA的Pol Ⅲ型启动子显得尤为重要。本研究中，我们通过与人源U6 RNA序列比对，成功找到了新型隐球酵母U6 RNA。根据U6 RNA序列特点，结合本实验室的RNA-seq文库数据，我们成功确定了新型隐球酵母U6 RNA转录起始点、终止序列并克隆了具有U6启动子活性的CnU6启动子。通过使用CnU6启动子转录shRNA，靶基因表达成功被shRNA介导的RNAi系统所沉默。通过使用CnU6启动子转录gRNA，CRISPR/Cas9系统成功对靶点双链DNA进行了切割，靶基因以NHEJ修复方式高频率产生了插入缺失突变。
1 材料和方法 1.1 材料
1.1.1 菌株: E. coliDH5α感受态细胞，购自康为世纪公司。新型隐球酵母野生型菌株JEC21，尿嘧啶营养缺陷型菌株4500FOA，由本实验室保藏。
1.1.2 培养基： YPD培养基(2%葡萄糖，2%蛋白胨，1%酵母浸粉，pH 6.0-6.2)。YPD/0.3%培养基(2.0%葡萄糖，2.0%蛋白胨，0.3%酵母浸粉，pH 6.0-6.2)。YNB培养基(0.17% YNB，0.50%硫酸铵，2.00%葡萄糖，pH 6.2-6.5)。YNBA培养基(YNB培养基灭菌后补加5 mg/L腺嘌呤)。0.1%Asn培养基(0.1%天冬酰胺，0.3% KH₂PO₄，0.1% 葡萄糖，pH 5.1)是诱导漆酶产生培养基，灭菌后补加终浓度25 mg/L MgSO₄和用作黑色素生成底物的终浓度100 mg/L去甲肾上腺素(NE,norepinephrine)，避光保存。所有培养基115 °C、20 min灭菌处理，固体补加2%琼脂粉。
1.1.3 主要试剂和仪器： TRNzol Universal (天根)，EsayGeno快速重组克隆试剂盒(天根)，PrimerSTAR HS高保真酶(TaKaRa)，限制性内切酶(TaKaRa)，DNaseⅠ(TaKaRa)，MLV反转录酶(TaKaRa)，Oligo dT-18 (TaKaRa)，FastStart Universal SYBR Master (Roche)，去甲肾上腺素(Sigma)，电转化仪(BTX)，StepOnePlus实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)。 1.2 siRNA位点预测及shRNA表达质粒构建 使用EasyGeno Primer在线软件(http://123.56. 75.195/)设计3对引物，分别用于从pLV质粒上扩增质粒骨架，从JEC21菌株基因组中扩增URA5筛选标记基因和CnU6启动子。3个PCR目的产物经纯化后，使用EasyGeno重组技术进行无缝克隆，得到pZ-shRNA质粒。pZ-shRNA质粒在CnU6启动子3′端连接有2个BspQⅠ酶切位点，经BspQⅠ酶切后会形成5′端各有3个碱基凸出的线性化质粒。
使用BLOCK-iT™ RNAi Designer软件(http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)对新型隐球酵母JEC21菌株ADE2基因的CDS序列中潜在siRNA序列进行预测分析，选择软件给出的候选位点中评分等级最高的潜在siRNA序列，经与基因组blastn比对确认无高相似度序列后，按GTT-N₁₉ (正义链)-TTCAAGAGA-N₁₉ (互补链)和AAA-N₁₉ (正义链)-TCTCTTGAA-N₁₉ (互补链)模式合成2条以ADE2为靶基因的shRNA引物。将2条shRNA引物等摩尔量混合，PCR仪中95 °C温育5 min后自然冷却至室温，此时2条引物可互相退火形成5′端各带3个突出碱基的双链DNA。将形成退火双链的引物直接连入BspQⅠ线性化的pZ-shRNA质粒中即可获得能转录产生针对ADE2基因的shRNA的pZ-ADE2i质粒，该质粒可使用通用引物SP6测序验证连入的shRNA序列是否正确(图 1)。

图 1. shRNA表达载体pZ-shRNA构建示意图 Figure 1. Schematic diagram of the construction of shRNA expression vector pZ-shRNA.

图选项

1.3 CRISPR/Cas9靶点筛选及质粒构建 CRISPR/Cas9系统识别的靶位点为N₂₀-NGG，其中NGG作为PAM位点进行识别，不含在gRNA靶点序列中。我们以GN₁₉-NGG为标准进行靶点筛选，当无合适GN₁₉-NGG序列时，选择N₁₉-NGG序列，并人工在5′端添加一个G，作为CnU6启动子的转录起始信号。靶点尽量靠近目标基因编码序列(CDS，coding sequence)的5′端，此时靶点区域发生移码突变造成基因功能失活的可能性最大。同时，靶点序列应在全基因组中无高风险脱靶位点，以避免CRISPR/Cas9系统对非靶点位置进行错误切割。根据上述原则，我们利用sgRNAcas9靶点设计软件^[24]，在Lac1编码区中确定了一个最优的CRISPR靶点，序列为5′-GGGCA TGGTTTGCGGCAGCT-GGG-3′，5′端第一个G为人工添加，用作CnU6启动子转录起始信号。
通过PCR及酶切连接将URA5筛选标记基因和actin启动子驱动的Cas9基因依次连入pBluescript Ⅱ KS(+)克隆载体中，获得pBS-URA5- Cas9质粒。以Lac1基因的CRISPR靶点作为重叠区，通过重叠PCR将CnU6启动子、Lac1靶点、gRNA和6个连续T顺次连接成为1个完整的gDNA表达框，经XhoⅠ和ClaⅠ双酶切后连入pBS-URA5-Cas9载体中，获得能在新型隐球酵母中以Lac1基因为靶标的pBS-URA5-CRISPR/Lac1质粒，该质粒可使用通用引物T3测序验证连入的gDNA序列是否正确。
本实验中，目的产物用于克隆连接的PCR均使用PrimerSTAR HS高保真酶，所构建的质粒均经过DNA测序验证。本实验所使用的所有引物见表 1。
表 1. 本实验所用的引物 Table 1. Primers used in this study

Primers	Sequences (5′→3′)
shpLV-F	CTATAGTGTCACCTAAATCCGCGGAACCCCTATTTGTTT
shpLV-R	GAATTCAGGGGATAACGCAGGAAAG
shURA5-F	TTATCCCCTGAATTCATCCCAGTACTACCCGCTCT
shURA5-R	AGCTAGCTCTTCATTTTTTGATCTTGGGGATGGTATTGA
shCnU6-F	AATGAAGAGCTAGCTCTTCAAACAGTATACCCTGCCGGTGTATG
shCnU6-R	TAGGTGACACTATAGTTGCATTAGAACTAAAAACAAAGCA
ADE2-shRNA-F	GTTGCGATGCTGAGCTCAATGATTCAAGAGATCATTGAGCTCAGCATCGC
ADE2-shRNA-R	AAAGCGATGCTGAGCTCAATGATCTCTTGAATCATTGAGCTCAGCATCGC
ADE2-seqF	CCTGCACATACTCCATGACA
ADE2-seqF	TGAAGAAGAAGAGCAGGAGG
Control-shRNA-F	GTTGCTGAAGGTGACCAAGGGCTTCAAGAGAGCCCTTGGTCACCTTCAGC
Control-shRNA-R	AAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCTCTCTTGAAGCCCTTGGTCACCTTCAGC
SP6	GATTTAGGTGACACTATAG
CnU6-F	CCATCGATTTGCATTAGAACTAAAAACAAAGCA
Lac1-CnU6-R	AGCTGCCGCAAACCATGCCCAACAGTATACCCTGCCGGTG
Lac1-gRNA-F	GGGCATGGTTTGCGGCAGCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT
gRNA-R	CCGCTCGAGTAAAACAAAAAAGCACCGAC
T3	ATTAACCCTCACTAAAGGGA
Lac1-seqF	CTAATCACTGTTCAGGTCGCC
Lac1-seqR	TACCTCACCACCGCCAAT
Tsp-CnU6-R	CCTAAGCTTTGGCTTCTTCCAACAGTATACCCTGCCGGTG
Tsp-gRNA-F	GGAAGAAGCCAAAGCTTAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT
Tsp-seqF	ATTCGCTCCCCATTCTGATC
Tsp-seqR	GAGAACGCGACGTTCAAGAC

表选项






1.4 新型隐球酵母的转化 本实验采用电转化的方式将线性化质粒转化进新型隐球酵母中，大致流程为：按2%接种量将过夜培养的新鲜菌液接种至50 mL YPD液体中，30 °C、180 r/min振荡培养3-4 h至OD₆₀₀值为0.3-0.4后，将菌液冰浴30 min以上。5000 r/min离心5 min取菌体，预冷无菌水洗涤2遍，预冷无菌EB缓冲液洗涤3遍后，将菌体溶于50 μL EB缓冲液中，并与3-5 μg线性化质粒(不超过10 μL)混合，冰浴30 min后使用1400 V电压进行电击。电击后的细胞在YPD液体中复苏2-4 h，预冷无菌水洗涤3遍，涂布相应的筛选平板，倒置于30 °C培养箱中培养4 d至转化子长出^[25]。
1.5 酵母总RNA提取及实时定量荧光PCR(RT- qPCR)检测 取新鲜的酵母培养物，使用血球计数板对酵母细胞进行计数后，取2×10⁸个细胞接种于5 mL YPD/0.3%液体试管中，30 °C、180 r/min振荡培养24 h后收集酵母细胞，无菌水洗涤1遍，使用TRNzol Universal试剂提取总RNA，提取方法参见说明书，略有修改。反转录反应体系为10 μL，以Oligo dT-18为反转录引物，使用MLV反转录酶对1 μg总RNA进行反转录，反转录体系配置及流程参见说明书。每个RT-qPCR反应体系为 20 μL，其中加入约50 ng cDNA，每种引物终浓度为250 nmol/L，荧光染料为FastStart Universal SYBR Green Master，每个样品设置3个平行样。本实验以actin作为内参基因，采用相对定量法，对样品中的ADE2基因表达水平进行测定。总RNA提取及RT-qPCR实验均使用DNase/RNase-free去离子水。
2 结果和分析 2.1 新型隐球酵母U6 RNA及CnU6启动子鉴定 以人源U6 RNA序列与NCBI上的新型隐球酵母JEC21菌株(C. neoformans var. neoformans，血清型D)基因组序列进行blastn比对，仅获得一条高相似度序列，该序列位于JEC21菌株的8号染色体上。再以人源U6 RNA序列与NCBI上的新型隐球酵母H99菌株(C. neoformans var. grubii，血清型A)基因组序列进行blastn比对，也仅获得一条高相似度序列，该序列位于H99菌株的14号染色体上。运用DNAMAN软件对人源U6 RNA序列、JEC21疑似U6 RNA序列和H99疑似U6 RNA序列进行多序列比对，结果显示JEC21菌株和H99菌株的疑似U6 RNA序列完全相同，与人源U6 RNA序列相似度为84.02%。根据U6 RNA以G为转录起始点、5-6个T为转录终止序列的特性，并结合本实验室新型隐球酵母RNA-seq文库数据，成功确定了JEC21和H99菌株中疑似U6 RNA序列的转录起始点和终止位置。通过参考人源U6启动子和鼠源U6启动子长度，并结合JEC21菌株U6 RNA转录起始点上游273 bp与H99菌株U6 RNA转录起始点上游267 bp具有较高相似度的特点，我们截取JEC21菌株U6 RNA转录起始点上游的273 bp作为CnU6启动子使用，后续实验结果表明该长度序列已具有U6启动子功能。
2.2 新型隐球酵母中shRNA表达载体的构建 为了构建能在C. neoforman JEC21菌株中进行RNAi的shRNA表达载体，我们以pLV质粒为模板，扩增得到1831 bp的Amp抗性质粒骨架；以JEC21菌株基因组为模板，扩增得到293 bp的CnU6启动子片段和2032 bp的URA5筛选标记基因(图 2-A)。将质粒骨架、URA5和CnU6启动子片段纯化后等摩尔比混合，使用EasyGeno无缝克隆试剂盒进行连接，获得pZ-shRNA质粒。pZ-shRNA质粒在CnU6启动子和终止序列间反向接入2个BspQⅠ酶切位点，经BspQⅠ酶切线性化后接入退火得到的shRNA寡核苷酸引物双链，构成完整的shRNA表达框。按照预期，CnU6启动子在RNA聚合酶Ⅲ的催化作用下转录shRNA，shRNA再经过Dicer核酸内切酶及其他RNAi相关酶系的加工，形成每条链3′末端带有2个悬挂U碱基的成熟siRNA，以RNAi方式干扰靶基因的表达(图 2-B)。

图 2. CnU6启动子转录shRNA，以RNAi方式介导靶基因ADE2沉默 Figure 2. CnU6 promoter could drive the expression of shRNA,which mediated target gene silenceof ADE2 by RNAi.

图选项

2.3 shRNA介导ADE2基因沉默 ADE2基因，编码磷酸核糖酰氨基咪唑羧化酶(phosphoribosylaminoimidazole carboxylase)，是腺嘌呤生物合成途径的一个关键酶^[13]。细胞在低腺嘌呤培养基上培养时，由于环境中的腺嘌呤含量不足生长所需，会自行合成腺嘌呤。此时若ADE2基因功能失活或表达量降低，将会导致上一步代谢产物积累，使得菌体显现粉红色，这是一个直观的表型用于观测CnU6启动子能否转录shRNA沉默靶基因。同时，我们以新型隐球酵母基因组中不存在且无同源序列的mCherry基因作为对照。
分别将测序正确的pZ-ADE2i质粒和pZ- mCherryi对照质粒使用EcoRⅠ酶切线性化后，通过电转化导入4500FOA营养缺陷株中，涂布YNBA平板，置于30 °C培养箱倒置培养4 d。转化子长出后，将YNBA转化子平板转置于14 °C低温培养箱继续培养，观察菌落颜色变化。低温处理1周后，可观察到约60%的ADE2i转化子呈现粉红色(图 2-C)，而作为对照组的mCherryi转化子均为白色。从粉红色菌落中挑取2个颜色最深的单菌落ADE2i-1和ADE2i-2在酵母浸粉仅为正常浓度30%的YPD/0.3%培养基划线传代，同时随机挑选一个mCherryi-1单菌落及野生型JEC21菌株划线作为对照。30 °C培养箱倒置培养3 d至菌体长出后，转至14 °C低温处理1周，可观察到ADE2i-1和ADE2i-2菌体呈现出粉红色，而JEC21和mCherry-1i菌体仍为白色(图 2-D)。DNA测序表明ADE2i-1和ADE2i-2菌株的ADE2基因未发生突变。此外我们以actin作为内参基因，采用RT-qPCR从转录水平检测了这4个划线菌株中ADE2基因的表达量，结果表明ADE2i-1和ADE2i-2菌株中ADE2mRNA水平明显降低，分别仅为野生型的21.7%和18.4%，而mCherryi-1菌株的ADE2mRNA水平与野生型相比无显著变化(P＜0.05)(图 2-E)。以上结果表明，CnU6启动子能有效转录shRNA，该方法介导的RNAi沉默效率介于Liu等^[13]与Bose等^[14]之间。
2.4 新型隐球酵母中CRISPR/Cas9系统表达载体的构建 为了构建能在C. neoformanJEC21菌株中成功应用的CRISPR/Cas9系统，我们以Lac1靶点序列作为重叠区，利用重叠PCR将CnU6启动子、靶点区、gRNA和终止序列无缝连接成一个完整的gRNA表达框，并通过gRNA表达框两侧的XhoⅠ和ClaⅠ酶切位点连接进pBS-URA5-Cas9质粒中，构成以URA5作为筛选标记基因的pBS- URA5-CRISPR质粒。T3引物测序结果表明，gRNA表达框已成功重叠。按照预期，CnU6启动子将以靶序列的第1个碱基G为起始点，直接转录有功能的gRNA。gRNA将与Cas9蛋白形成复合体，引导Cas9核酸酶切割靶点双链DNA(图 3-A)。

图 3. CnU6启动子转录gRNA，通过CRISPR/Cas9系统引导Cas9核酸酶切割Lac1靶点 Figure 3. CnU6 promoter could drive the expression of gRNA,which could guide Cas9 nuclease to cleave the target site of Lac1 by CRISPR/Cas9 system.

图选项

2.5 CRISPR/Cas9系统介导Lac1基因编辑 Lac1基因编码一种含铜的多酚氧化酶，称作隐球菌漆酶。在新型隐球酵母中，隐球菌漆酶是唯一一种可氧化酚类底物形成黑色素的酶类^[26]。Lac1突变株不能产生黑色素，在含NE的0.1%Asn平板上形成白色菌落，而野生型菌株形成黑色菌落，这便于我们从表型上区分Lac1基因是否被CRISPR/Cas9系统所突变。
通用引物T3测序正确的pBS-CRISPR/Lac1质粒被KpnⅠ酶切线性化后，以电转化方式转化4500FOA营养缺陷菌株，YPD液体中复苏2 h后涂布YNB平板，置于30 °C培养箱倒置培养4 d至转化子长出。随机挑取15个转化子单菌落，使用无菌牙签点接在添加有NE的0.1% Asn平板上，同时点接野生型JEC21菌株作为对照。
黑色素诱导平板置于3 °C避光培养3 d后，可观察到JEC21菌株产生大量黑色素，而各转化子基本也有不同程度的黑色素产生，但与野生型相比明显减少(图 3-B)。我们分析猜测，细胞导入线性化pBS-URA5-CRISPR/Lac1质粒后即可在YNB筛选平板上传代生长，此时CRISPR/Cas9系统还未能将Lac1基因突变。在不断的传代中，CRISPR/Cas9系统才逐渐对靶点进行突变。简而言之，单菌落在传代过程中CRISPR/Cas9系统切割Lac1靶点的时间越早，突变细胞所占比例越大，则菌落产生的黑色素越少。我们挑取了其中颜色最浅的Lac1-3、4、5号转化子，在含NE的0.1% Asn平板上继续划线纯化。避光培养3 d后，可看到每个转化子平板上都有一些单菌落呈白色。每个转化子划线平板上各挑取一个白色单菌落点接在一块新的含NE的0.1%Asn平板上，避光培养 2 d后可观察到JEC21菌体已呈现深棕色，而3个转化子单菌落菌体都依然为白色(图 3-C)。提取这3个白色单菌落的基因组DNA，扩增Lac1靶点区域进行测序，结果显示Lac1靶点处确实产生了插入缺失突变(图 3-D)。该结果与之前报道的细胞以NHEJ方式修复CRISPR/Cas9系统所造成的DSB结果一致，表明CnU6启动子能有效转录CRISPR/ Cas9系统中有功能的gRNA。
2.6 CRISPR/Cas9系统介导Tsp2-1基因编辑 为检测新型隐球酵母中CRISPR/Cas9系统介导的靶基因编辑效率，我们选择以新型隐球酵母生长非必需的Tsp2-1基因为新的靶基因。Tsp2-1功能的缺失与否，不影响酵母转化子在YNB筛选平板上的生长与表型^[26]。
我们使用sgRNAcas9软件在Tsp2-1编码区中确定了一个最优的CRISPR靶点，序列为5′-GGAAGAAGCCAAAGCTTAGGTGG-3′。该靶点序列中含有Hind Ⅲ酶切位点5′-AAGCTT-3′，且Cas9核酸酶的切点位于Hind III酶切位点内。当Tsp靶点被CRISPR/Cas9系统编辑后，该靶点将不能被Hind Ⅲ切割。
测序正确的线性化pBS-CRISPR/Tsp质粒以电转化方式转化4500FOA营养缺陷型菌株，考虑到CRISPR/Cas9系统介导编辑过程发生的滞后性，YPD液体中延长复苏时间至4 h后涂布YNB筛选平板，同时以线性化的pBS-CRISPR/Lac1质粒作为对照组。随机在YNB筛选平板上挑取 50个以Lac1为靶点的酵母转化子和50个以Tsp为靶点的酵母转化子，提取它们的基因组DNA，扩增Tsp靶点区域并进行Hind Ⅲ酶切验证。结果显示：经充分酶切后，对照组50个转化子的Tsp靶点全部可被Hind Ⅲ切割(图 4-A)；而实验组 50个转化子中，32个不能被Hind III切割，10个可被Hind III完全切割，8个可被Hind III部分切割(图 4-B)。以上结果表明，复苏时间为4 h时，新型隐球酵母中CRISPR/Cas9系统对Tsp靶点的编辑效率约为64% (32/50)。

图 4. CRISPR/Cas9系统介导Tsp靶点编辑效率检测 Figure 4. Efficiency detection for CRISPR/Cas9 system mediated editing of Tsp target site.

图选项

3 讨论 作为模式病原真菌，新型隐球酵母由于同源重组频率低，基因敲除困难，基因功能研究进展缓慢。本实验室希望将目前热门的第三代人工打靶技术CRISPR/Cas9系统应用于新型隐球酵母中，实现对目的基因的人工打靶，从而克服新型隐球酵母基因敲除困难的瓶颈。在高等生物中，CRISPR/Cas9系统中的gRNA通常由Pol Ⅲ型的U6启动子转录，而新型隐球酵母中尚未有U6启动子的报道。为解决此问题，本实验根据NCBI上的新型隐球酵母基因组信息，结合本实验室RNA-seq文库数据，利用生物信息学方法成功鉴定和克隆了新型隐球酵母的U6 RNA及其CnU6启动子。在血清型D菌株JEC21和血清型A菌株H99中U6 RNA序列完全相同，但启动子序列具有一定的差异性。我们以基因敲除更为困难的JEC21菌株为研究对象，它的CnU6启动子能有效驱动shRNA转录，通过RNAi途径介导靶基因沉默。更为重要的是，CnU6启动子还能直接转录有功能的gRNA，通过CRISPR/Cas9系统介导靶基因移码突变。实验结果表明，当CRISPR靶点位于靶基因CDS区5′端时，移码突变的产生可造成基因功能完全失活，其结果相当于基因敲除。CnU6启动子的发现，为shRNA表达及CRISPR/Cas9系统在新型隐球酵母中的成功应用奠定了基础，它将有助于加快新型隐球酵母的功能基因研究。
CRISPR/Cas9系统虽然能对新型隐球酵母进行高效的基因编辑，但若将该系统在新型隐球酵母中广泛应用，还需进行很多的检测和优化。作为一个外源系统，Cas9和gRNA在新型隐球酵母细胞中的持续表达对酵母的生长和致病性是否具有毒性，还需进行检测。基因的敲除和回补，是现代功能基因研究的基本流程。CRISPR/Cas9系统介导的突变菌株，无法进行靶基因的回补，否则回补的靶基因将再次被细胞内持续表达的CRISPR/Cas9系统编辑。能否通过使用诱导型启动子或其他方法对CRISPR/Cas9系统的表达进行精确调控，从而实现靶基因回补，还需进行实验研究。CRISPR/Cas9系统已在新型隐球酵母中表现出高效的基因编辑效率，我们计划通过串联多个gDNA，尝试进行多靶点同时编辑，拓宽CRISPR/Cas9系统在新型隐球酵母中的应用范围。
CRISPR/Cas9系统在新型隐球酵母中的成功表达，意味着它将成为新型隐球酵母的一个高效率基因组编辑工具，这对于理解新型隐球酵母的致病机理和进一步的基因组研究具有重要的意义。

参考文献

[1]	Olszewski MA, Zhang YM, Huffnagle GB. Mechanisms of cryptococcal virulence and persistence.Future Microbiology, 2010, 5(8): 1269–1288DOI:10.2217/fmb.10.93.
[2]	Voelz K, Msy RC. Cryptococcal interactions with the host immune system.Eukaryotic Cell, 2010, 9(6): 835–846DOI:10.1128/EC.00039-10.
[3]	Toffaletti DL, Rude TH, Johnston SA, Durack DT, Perfect JR. Gene transfer in Cryptococcus neoformans by use of biolistic delivery of DNA.Journal of Bacteriology, 1993, 175(5): 1405–1411DOI:10.1128/jb.175.5.1405-1411.1993.
[4]	Davidson RC, Cruz MC, Sia RAL, Allen B, Alspaugh JA, Heitman J. Gene disruption by biolistic transformation in serotype D strains of Cryptococcus neoformans.Fungal Genetics and Biology, 2000, 29(1): 38–48DOI:10.1006/fgbi.1999.1180.
[5]	Smithies O, Gregg RG, Boggs SS, Koralewski MA, Kucherlapati RS. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal β-globin locus by homologous recombination.Nature, 1985, 317(6034): 230–234DOI:10.1038/317230a0.
[6]	Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.Science, 2002, 296(5567): 550–553DOI:10.1126/science.1068999.
[7]	Lin XY, Yang JG, Chen J, Gunasekera A, Fesik SW, Shen Y. Development of a tightly regulated U6 promoter for shRNA expression.FEBS Letters, 2004, 577(3): 376–380DOI:10.1016/j.febslet.2004.10.033.
[8]	Urnov FD, Miller JC, Lee YL, Beausejour CM, Rock JM, Augustus S, Jamieson AC, Porteus MH, Gregory PD, Holmes MC. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.Nature, 2005, 435(7042): 646–651DOI:10.1038/nature03556.
[9]	Li T, Huang S, Zhao XF, Wright DA, Carpenter S, Spalding MH, Weeks DP, Yang B. Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes.Nucleic Acids Research, 2011, 39(14): 6315–6325DOI:10.1093/nar/gkr188.
[10]	Cong L, Ran FA, Cox D, Lin SL, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu XB, Jiang WY, Marraffini LA, Zhang F. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.Science, 2013, 339(6121): 819–823DOI:10.1126/science.1231143.
[11]	Jinek M, Chylinski, Fonara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.Science, 2012, 337(6096): 816–821DOI:10.1126/science.1225829.
[12]	Mali P, Yang LH, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, Norville JE, Church GM. RNA-guided human genome engineering via Cas9.Science, 2013, 339(6121): 823–826DOI:10.1126/science.1232033.
[13]	Liu H, Cottrell TR, Pierini LM, Goldman WE, Doering TL. RNA interference in the pathogenic fungus Cryptococcus neoformans.Genetics, 2002, 160(2): 463–470.
[14]	Bose I, Doering TL. Efficient implementation of RNA interference in the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans.Journal of Microbiological Methods, 2011, 86(2): 156–159DOI:10.1016/j.mimet.2011.04.014.
[15]	Janbon G, Maeng S, Yang DH, Ko YJ, Jung KW, Moyrand F, Floyd A, Heitman J, Bahn YS. Characterizing the role of RNA silencing components in Cryptococcus neoformans.Fungal Genetics and Biology, 2010, 47(12): 1070–1080DOI:10.1016/j.fgb.2010.10.005.
[16]	Dicarlo JE, Norvillie JE, Mali P, Rios X, Aach J, Church GM. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.Nucleic Acids Research, 2013, 41(7): 4336–4343DOI:10.1093/nar/gkt135.
[17]	Jacobs JZ, Ciccaglione KM, Tournier V, Zaratiegui M. Implementation of the CRISPR-Cas9 system in fission yeast.Nature Communications, 2014, 5: 5344DOI:10.1038/ncomms6344.
[18]	Schwartz CM, Hussain MS, Blenner M, Wheeldon I. Synthetic RNA polymerase III promoters facilitate high-efficiency CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Yarrowia lipolytica.ACS Synthetic Biology, 2016, 5(4): 356–359DOI:10.1021/acssynbio.5b00162.
[19]	Liu R, Chen L, Jiang YP, Zhou ZH, Zou G. Efficient genome editing in filamentous fungus Trichoderma reesei using the CRISPR/Cas9 system.Cell Discovery, 2015, 1: 15007DOI:10.1038/celldisc.2015.7.
[20]	Matsu-rua T, Baek M, Kwon J, Hong C. Efficient gene editing in Neurospora crassa with CRISPR technology.Fungal Biology and Biotechnology, 2015, 2(1): 4DOI:10.1186/s40694-015-0015-1.
[21]	Fuller KK, Chen S, Loros JJ, Dunlap JC. Development of the CRISPR/Cas9 system for targeted gene disruption in Aspergillus fumigatus.Eukaryotic Cell, 2015, 14(11): 1073–1080DOI:10.1128/EC.00107-15.
[22]	Wagner JC, Platt RJ, Goldfless SJ, Zhang F, Niles JC. Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum.Nature Methods, 2014, 11(9): 915–918DOI:10.1038/nmeth.3063.
[23]	Waaijers S, Portegijs V, Kervek J, Lemmens BBLG, Tijsterman M, Van den Heuvel S, Bosem M. CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis in Caenorhabditis elegans.Genetics, 2013, 195(3): 1187–1191DOI:10.1534/genetics.113.156299.
[24]	Xie SS, Shen B, Zhang CB, Huang XX, Zhang YL. sgRNAcas9:a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites.PLoS One, 2014, 9(6).
[25]	Zhang P, Wei D, Li Z, Pan J, Zhu X. Cryptococcal phosphoglucose isomerase is required for virulence factor production, cell wall integrity and stress resistance.FEMS Yeast Research, 2015, 15(7).
[26]	Li ZM, Bi JN, Yang J, Pan J, Sun ZX, Zhu XD. Requirement of a Tsp2-type tetraspanin for laccase repression and stress resistance in the basidiomycete Cryptococcus neoformans.Applied and Environmental Microbiology, 2012, 78(1): 21–27DOI:10.1128/AEM.06072-11.