吴优1, 周卫1
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1.武汉科技大学化学与化工学院, 湖北 武汉 430081;
2.中国科学院广州生物医药与健康研究院, 广东 广州 510530
收稿日期:2016-11-30;修回日期:2017-03-14;网络出版日期:2017-03-28
基金项目:国家自然科学基金(21376184);教育部留学回国人员科研启动项目
*通信作者:周卫, E-mail: zhouwei@wust.edu.cn
杨忠华, Tel/Fax: +86-27-86563448, E-mail: yangzh@wust.edu.cn
摘要:[目的]克隆Arthrobacter ureafaciens CZ31丙氨酸脱氢酶的编码基因(alanine dehydrogenase),转化至Escherichia coli Rosetta(DE3)中构建可溶性表达alanine dehydrogenase(ald)的工程菌CZR07并优化产酶条件。[方法]提取A. ureafaciens CZ31菌株的全基因组DNA,设计引物扩增出ald基因,与pET-28a连接后导入E. coli Rosetta中表达并纯化重组蛋白,以单因素实验结果为依据,响应面法优化发酵条件。[结果]ald全长为1119 bp,编码含372个氨基酸残基的蛋白质,分子量约为40 kDa,酶活为2.65 U/mg。响应面分析温度、诱导时间及诱导剂浓度的影响强度为IPTG浓度 > 温度 > 温度×IPTG浓度 > 温度×诱导时间 > IPTG浓度×诱导时间 > 诱导时间。CZR07摇瓶发酵最佳条件为温度22 ℃、IPTG 0.7 mmol/L、诱导时间7 h,此条件下重组酶酶活达到15.23 U/mg,与响应面优化的预测值相似,较优化前提高5.75倍。[结论]克隆并实现了CZ31中ald基因的可溶性表达,采用BBD法优化产酶的诱导条件,获得显著的优化效果,为其他工程菌株产酶条件优化提供借鉴。
关键词: Arthrobacter ureafaciens CZ31 丙氨酸脱氢酶 克隆表达 响应面优化
Expression and production optimization of alanine dehydrogenase from Arthrobacter ureafaciens CZ31
Wu You1, Zhou Wei1
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1.School of Chemistry and Chemical Engineering, Wuhan University of Science and Technology, Wuhan 430081, Hubei Province, China;
2.Guangzhou Institutes of Biomedicine and Health, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510530, Guangdong Province, China
Received 30 November 2016; Revised 14 March 2017; Published online 28 March 2017
*Corresponding author: Wei Zhou, E-mail: zhouwei@wust.edu.cn
Zhonghua Yang, Tel/Fax: +86-27-86563448, E-mail: yangzh@wust.edu.cn
Supported by the National Natural Science Foundation of China (21376184) and by the Project Sponsored by the Scientific Research Foundation for the Returned Overseas Chinese Scholars, State Education Ministry
Abstract: [Objective]Alanine dehydrogenase gene (ald) of Arthrobacter ureafaciens CZ31 was cloned and transformed into Escherichia coli Rosetta (DE3) to construct engineering bacteria CZR07 with soluble expression of ald, and the conditions of alanine dehydrogenase(AlaDH) production were optimized.[Methods]Genomic DNA of Arthrobacter ureafaciens CZ31 was extracted; A pair of specific primers was designed to obtain the ald gene, and then subcloned into expression plasmid, pET-28a-ald, and expressed in E. coli Rosetta. The recombinant protein, AlaDH, was purified by Ni2+ chromatography. Response surface methodology was used to optimize fermentation conditions.[Results]The length of ald gene was 1119 bp, encoding 372 amino acid residues, molecular weight of the target protein was 40 kDa according to SDS-PAGE analysis. Specific enzyme activity of the recombinant enzyme was 2.65 U/mg. The optimal induction conditions were:22 ℃, isopropyl-β-D-thiogalactoside 0.7 mmol/L, induction time 8 h. The specific activity of the enzyme was 15.23 U/mg under optimized conditions, about 5.75 times of the initial.[Conclusion]We optimized the induction conditions of the recombinant enzyme production through Box-Benhnken Design, and achieved the desired results, which provided a reference for the optimization of other genetic engineering bacteria.
Key words: Arthrobacter ureafaciens CZ31 alanine dehydrogenase cloning and expression response surface optimization
丙氨酸脱氢酶是催化丙酮酸跟丙氨酸相互转化的关键酶,在生物体内调节酮酸和氨基酸的动态平衡,与生物体内糖代谢和氨基酸代谢密切相关[1]。丙氨酸脱氢酶存在形式有四聚体、六聚体、八聚体3种,六聚体形式最多。Tripathi[2]解析了Mycobacterium tuberculosis 中丙氨酸脱氢酶的空间结构,为典型的六聚体蛋白。丙氨酸脱氢酶高级结构在辅酶结合区域的氨基酸相当保守,由4条平行的β折叠和1个α螺旋组成,排列顺序基本一致。Galkin和Kulakova[3]对来自2株极地菌中的丙氨酸脱氢酶进行酶学特性研究时发现,Arg残基所构成的盐桥决定了该蛋白酶的热稳定性;Mycobacterium smegmatis中ald的表达在转录水平受到AldR蛋白(Lrp/AsnC蛋白家族)的调控[4]。近年来,研究****已经克隆了Bacillus subtilis[5]、Geobacillus stearothermophilus[6]等不同来源的丙氨酸脱氢酶基因,并实现了在大肠杆菌中的异源表达。
响应面法在生物反应过程优化中有着广泛的应用,响应面优化发酵培养基可以提高单位体积的生物量,同时提高目的产物的产量。常用的响应面分析实验设计主要有CCD (Central composite design)和BBD (Box-benhnken design)两种方法,其中BBD中心组合设计是一种对多个因素优化的方法,用非线性数学模型进行拟合,精度高,次数少,并且具有较好的预测效果,通过拟合方程可以得到各因素的最佳组合并且很好地研究各因素之间的交互作用。目前响应面在生物研究方面的应用主要是采用CCD的实验设计方法,对培养基组分、搅拌转速、通气等发酵培养条件进行优化,都取得了一定的优化效果[7-9],但较少有文献对工程菌的产酶诱导条件进行优化。
A. ureafaciens CZ31是本实验室从受工业废水活性污泥中筛选得到的能够高效同化氨氮的菌株,本研究克隆该菌株中的氨同化酶丙氨酸脱氢酶,构建基因工程菌株进行表达并通过响应面优化工程菌株的发酵产酶条件,为后续AlaDH的分子酶学研究和其他功能基因克隆表达条件的优化及原核生物氨同化机制分析提供借鉴。
1 材料和方法 1.1 菌株及质粒 本研究采用的是实验室保藏的A. ureafaciens CZ31(专利保藏号:CCTCCM 2014165),是从工业废水活性污泥中分离的一种革兰氏阳性菌。宿主细胞E. coli Rosetta及表达载体pET-28a均为本实验室保存。
1.2 主要试剂及培养基 质粒快速提取试剂盒(Plasmid Mini KitⅠ)、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Gel Extraction Kit)、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA marker购自TIANGEN公司,限制性内切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ购自NEB公司。LB培养基用于筛选重组子及诱导重组子在E. coli Rosetta中表达,实验所用引物见表 1。
表 1. PCR扩增引物序列 Table 1. Primers used in PCR
Primer | Primer sequence (5′→3′) | Purpose |
auald01F | ATGATCATCGGCGTCCCTAAAG | ald sequencing |
auald02R | TTATGCGGAGACCAGTTCGTGCCAGT | and preservation |
auald03F | GCA/AGCTTACATGATCATCGGCGTCCCTAAAG | ald cloning |
auald04R | ATCG/GATCCAGTTATGCGGAGACCAGTTCGTG | |
The underlined are the cleavage sites of restriction enzyme. |
表选项
1.3 A. ureafaciens CZ31中ald基因的克隆 采用CTAB/NaCl法提取A. ureafaciens CZ31基因组DNA,根据GenBank上编号为KUR62802.1的同源菌株Arthrobacter sp. ATCC 21022的ald基因序列,利用Primer Premier5软件设计引物,使用auald01F和auald02R引物克隆至pMD-18T载体,构建pMD-18T-ald,再用auald03F和auald04R引物亚克隆至pET-28a,构建pET-28a-ald。PCR反应条件为:95 ℃ 5 min,30次扩增循环(94 ℃ 1 min,65 ℃ 45 s,72 ℃ 90 s),72 ℃ 10 min,4 ℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,使用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收目的基因。
1.4 重组质粒pET28a-ald的构建 对表达载体pET-28a和ald基因分别用BamHⅠ和Hind Ⅲ进行双酶切,纯化回收后,16 ℃过夜连接,将连接产物转化至E. coli DH5α,在LB/Kan(30 μg/mL)抗性平板上筛选转化子,转化子经菌液PCR和重组质粒双酶切鉴定,将鉴定正确的重组质粒PCR产物送至北京擎科新业生物技术有限公司测序。
1.5 ald基因在E. coli Rosetta中的诱导表达 将测序正确的重组质粒用热激法转化至E. coli Rosetta中,挑取阳性重组子至LB/Kan(30 μg/mL)中,37 ℃培养至OD600为0.4–0.6时,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,30 ℃诱导8 h,取100 mL菌液,离心收集菌体,用7 mL PBS (0.2 mol/L,pH7.4)洗涤2次后重悬,超声波破碎细胞,经4 ℃、10000×g离心,上清液即为粗酶液,对粗酶液进行SDS-PAGE检测和酶活检测,以空载体pET-28a转化至E. coli Rosetta为对照。
1.6 细胞内含物提取及酶活测定 将100 mL菌液用50 mL离心管4 ℃、8000 r/min离心10 min,收集菌体,Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L,pH8.0)振荡洗涤2次,5 mL Tris-HCl缓冲液(含300 μg/mL溶菌酶)重悬,反复冻融3次;采用细胞超声破碎仪,在冰浴中3 s超声,5 s间隔,功率400 W,99次,2轮超声后,22000×g离心30 min即获得细菌胞内液(粗酶液)。
AlaDH酶活测定的反应体系为:1.0 mL丙酮酸反应液+0.8 mL ddH2O+0.1 mL 0.3 mmol/L的NADH+0.1 mL粗酶液,将反应液预热后加入NADH和粗酶液,30 ℃反应1 min,340 nm处测定吸光值。以去离子水代替丙酮酸反应液和未导入目的基因的宿主菌诱导后的上清液作为对照。将1 min内还原1 μmol NADH所需要的酶量定义为1个酶活单位。
1.7 表达条件的响应面优化 在LB培养基基础上探究诱导温度、诱导时间、IPTG浓度对重组菌产酶的影响,对每个因素进行单因素梯度实验,诱导温度10–30 ℃,5 ℃为一个梯度;诱导时间3–11 h,2 h为一个梯度;IPTG浓度0.2–1.0 mmol/L,0.2 mmol/L为1个梯度。
在单因素实验确定3个因素最佳值的基础上用BBD实验设计方案,探究3个因素对重组菌产酶的交互影响,以重组丙氨酸脱氢酶的酶活为响应值,运用Design-Expert软件建立回归模型,确定最佳的产酶条件,对模型拟合方程进行验证。
2 结果和分析 2.1 ald基因序列分析 将A. ureafaciens CZ31的ald基因PCR产物回收纯化后测序,并将序列提交至GenBank (GenBank:KC213816),结果表明ald基因的开放阅读框长度为1119 bp,推测该基因编码由372个氨基酸残基组成的分子量为40 kDa的蛋白。对Arthrobacter属的AlaDH氨基酸序列相似性进行了分析,选择同属的6个种,采用DNAMAN软件对属内的同源性进行比对分析,结果显示属内种有高达97.31%以上的相似性,表明Arthrobacter属内的丙氨酸脱氢酶具有很高的同源性。在NCBI Protein Blast数据库输入CZ31的AlaDH氨基酸序列进行比对,选择相近菌种的序列,采用Clustal X和MEGA 5.0软件构建系统进化树(图 1),对AlaDH蛋白氨基酸序列在进化上的关系进行分析,发现CZ31与A. aurescens TC1亲源关系最近,序列同源性为98%。以Mycobacterium tuberculosis 2vhw.1中的ald基因序列作为模板进行蛋白分子三维建模,发现A. ureafaciens CZ31丙氨酸脱氢酶是一个同源六聚体,外形呈桶状。每个亚基由2个相似的结构域组成,结构域之间以α螺旋相连,每个结构域含有14个β折叠和16个α螺旋,α螺旋包裹在β折叠周围。
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图 1 AuAlaDH系统进化树分析 Figure 1 Phylogenetic tree based on ald gene sequence (1119 bp) of A. ureafaciens CZ31 strain and reference strains. The numbers at each branch points is the percentage supported by bootstrap. |
图选项 |
2.2 重组质粒的构建及转化 重组质粒与双酶切鉴定结果如图 2所示,初步说明目的基因成功导入E. coli Rosetta,以所提取的重组质粒为模板扩增目的基因ald,PCR产物送至北京擎科新业生物技术有限公司测序,测序结果与原宿主菌A. ureafaciens CZ31ald序列测序结果匹配度100%,进一步验证菌株A. ureafaciens CZ31的ald已成功导入E. coli Rosetta宿主菌,将该工程菌株命名为E. coli CZR07。
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图 2 pET28a-ald构建与酶切鉴定图 Figure 2 The plasmid of pET28a-ald identified by restriction endonuclease analysis. M: DNA marker; lane 1: pET28a; lane 2: pET28a-ald; lane 3: pET28a-ald digested by BamHⅠand Hind Ⅲ. |
图选项 |
2.3 重组酶的诱导表达及酶活检测 对粗酶液进行SDS-PAGE检测到约为40 kDa的目的蛋白,酶活测定发现粗酶液具有较高的丙氨酸脱氢酶活性,酶活为(2.650±0.012) U/mg (0.5 mmol/LIPTG,30 ℃诱导8 h),经镍柱纯化后SDS-PAGE检测到纯度较高的目的条带(图 3),说明ald在CZR07中成功表达。
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图 3 表达产物经镍柱纯化后的SDS-PAGE检测结果 Figure 3 SDS-PAGE result of expression products purified by Ni column. Lane 1: lysing solution; lane 2: supernatant; lane 3: flow through solution; lane 4–5: washing buffer; lane 6: elution buffer; M: marker. |
图选项 |
2.4 重组酶诱导条件的响应面实验 对CZR07中目的基因ald表达的发酵诱导条件进行单因素实验,选取发酵诱导条件中影响显著的3个因素温度、诱导时间及IPTG浓度,以酶酶活为纵坐标作条形图(图 4)。实验结果显示,当诱导温度为20 ℃时,重组酶AlaDH的酶活最高,随着诱导温度的逐渐升高,酶活下降。最佳诱导温度为15–25 ℃ (图 4-A)。该实验结果表明,温度较高时,菌体合成蛋白的速率较高,推测多肽链的过量积累容易造成多肽链无法正确折叠,进而形成没有活性的包涵体。低温状态下,目标蛋白的合成速率相对较低,菌体内部有足够多的时间和空间让多肽链进行折叠,使得AlaDH有较高的酶活。IPTG浓度为0.6 mmol/L时,重组酶AlaDH的酶活最高,最佳IPTG浓度为0.4–0.8 mmol/L(图 4-B)。实验结果说明IPTG对细胞有毒性,过高会抑制菌体生长,进而抑制蛋白的表达。只有合适的IPTG浓度才能使启动子完全开放,更好地表达外源蛋白。诱导时间实验结果显示,随着诱导时间的增长,重组酶AlaDH酶活不断增加,9 h后酶活基本维持稳定。最佳诱导时间为5–9 h (图 4-C)。说明诱导时间较短时,诱导剂还未发挥作用启动转录且菌体量少导致产酶量少,酶活低;诱导时间变长时,菌体进入衰亡期产酶速率下降。
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图 4 单因素分析结果 Figure 4 Result of single factor analysis. A: Effect of temperature on specific activity; B: Effect of IPTG concentration on specific activity; C: Effect of induction time on specific activity. The standard deviation reflects the dispersion degree of the value relative to the average. |
图选项 |
通过单因素实验确定了各因素的最佳值范围,BBD实验在单因素实验基础上每个因素设置3个水平:诱导温度(15、20、25 ℃)、IPTG浓度(0.4、0.6、0.8 mmol/L)、诱导时间(5、7、9 h),数据见表 2,响应面方差分析显著性检验结果见表 3。从BBD实验结果可以发现上述3个因子对CZR07产酶具有显著影响的因子为IPTG浓度(P=0.007)和温度(P=0.0204),诱导时间(C)对重组酶产酶的影响不显著(P=0.9196)。诱导时间、温度和IPTG浓度均为正效应,符合单因素筛选实验结果。
表 2. BBD设计和响应值 Table 2. BBD design and response values
Number | T/℃ | c (IPTG)/(mmol/L) | t/h | Total protein/mg | Specific activity/(U/mg) |
1 | 25 | 0.4 | 7 | 2.917±0.031 | 10.227±0.003 |
2 | 20 | 0.6 | 7 | 2.357±0.022 | 16.243±0.010 |
3 | 15 | 0.8 | 5 | 2.974±0.032 | 10.411±0.012 |
4 | 15 | 0.6 | 9 | 3.591±0.011 | 7.978±0.015 |
5 | 15 | 0.4 | 7 | 3.240±0.043 | 4.813±0.032 |
6 | 25 | 0.6 | 9 | 2.769±0.031 | 10.719±0.025 |
7 | 15 | 0.8 | 7 | 2.471±0.022 | 12.032±0.013 |
8 | 15 | 0.6 | 5 | 2.374±0.051 | 6.966±0.016 |
9 | 20 | 0.6 | 7 | 3.420±0.043 | 12.032±0.023 |
10 | 25 | 0.8 | 7 | 2.614±0.031 | 11.956±0.026 |
11 | 20 | 0.6 | 7 | 3.049±0.012 | 15.040±0.014 |
12 | 20 | 0.4 | 5 | 2.900±0.033 | 6.618±0.008 |
13 | 20 | 0.8 | 9 | 3.417±0.021 | 9.582±0.007 |
14 | 20 | 0.6 | 7 | 3.443±0.032 | 12.634±0.026 |
15 | 20 | 0.6 | 7 | 3.794±0.021 | 15.641±0.017 |
16 | 25 | 0.6 | 5 | 3.014±0.024 | 11.339±0.013 |
17 | 20 | 0.4 | 9 | 3.049±0.042 | 6.617±0.026 |
表选项
表 3. BBD设计二次方模型方差分析 Table 3. Analysis of variance for Quadratic Model (Partial sum of squares -Type Ⅲ)
Source | Sum of squares | df | Mean square | F value | P-value Prob > F | Significant |
Model | 158.87 | 9 | 17.65 | 8.120 | 0.0058 | Significant |
A-Temperature/℃ | 19.38 | 1 | 19.38 | 8.910 | 0.0204 | |
B-IPTG concentration/(mmol/L) | 30.38 | 1 | 30.83 | 14.180 | 0.0070 | |
C-Induction time/h | 0.024 | 1 | 0.024 | 0.011 | 0.9196 | |
AB | 7.53 | 1 | 7.53 | 3.460 | 0.1050 | |
AC | 0.66 | 1 | 0.66 | 0.310 | 0.5975 | |
BC | 0.17 | 1 | 0.17 | 0.079 | 0.7867 | |
A2 | 13.78 | 1 | 13.78 | 6.330 | 0.0400 | |
B2 | 31.89 | 1 | 31.89 | 14.660 | 0.0065 | |
C2 | 44.72 | 1 | 44.72 | 20.560 | 0.0027 | |
Residual | 15.22 | 7 | 2.17 | |||
Lack of fit | 1.18 | 3 | 0.39 | 0.110 | 0.9485 | Not significant |
Pure error | 14.04 | 4 | 3.51 | |||
Cor total | 174.09 | 16 |
表选项
利用Design-Expert分析软件对表 2中的数据进行多次多元回归拟合,得到酶活对诱导温度(A)、IPTG浓度(B)、诱导时间(C)的二元多项回归方程(公式1)。
![]() | 公式(1) |
2.5 CZR07产酶诱导条件的响应面优化 由拟合的公式(1)得出的响应面三维图示见图 5、6、7,分别表示了影响重组菌产酶3个因素间的交互作用。等高线近似圆形说明二者交互作用不显著,椭圆形说明交互显著[10],由实验结果可知温度和IPTG浓度、温度和诱导时间的交互作用不显著,而IPTG浓度和诱导时间的交互作用显著。对于模型方程,采用Design-Expert软件进行分析,求得曲面极值点(酶活14.85 U/mg)对应的最佳培养条件为温度21.65 ℃、IPTG浓度0.66 mmol/L,诱导时间6.92 h。考虑到实验操作的简便性,将诱导产酶条件改为温度22 ℃、IPTG浓度0.7 mmol/L、诱导时间7 h,采用上述发酵条件进行3次重复验证实验,得出CZR07发酵产酶酶活平均值为(15.23±0.025) U/mg,与预测值基本吻合,其相对误差为2.58%。说明响应面分析法所得的诱导产酶条件准确可靠,可以用来预测CZR07发酵产酶情况。
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图 5 温度和IPTG浓度对酶活交互影响的等高线和响应面图 Figure 5 Responsive surfaces (A) and contour plot (B) between temperature and IPTG concentration on specific activity. |
图选项 |
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图 6 温度和诱导时间对酶活交互影响的等高线和响应面图 Figure 6 Responsive surfaces (A) and contour plot (B) between temperature and induction time on specific activity. |
图选项 |
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图 7 IPTG浓度和诱导时间对酶活交互影响的等高线和响应面图 Figure 7 Responsive surfaces (A) and contour plot (B) between IPTG concentration and induction time on specific activity. |
图选项 |
从实验结果可以看出,优化后(0.7 mmol/L,22 ℃诱导7 h) CZR07的AlaDH酶活性为15.23 U/mg,比优化前(0.5 mmol/L IPTG,30 ℃诱导8 h)的活性提高了5.75倍,说明采用BBD设计对产酶的诱导条件进行优化获得了很好的优化效果,达到响应面优化的目的。
3 讨论 丙氨酸脱氢酶在A. ureafaciens CZ31高浓度氨同化中扮演十分重要的角色,经序列分析和蛋白结构模拟发现该蛋白是一个同源六聚体,在Arthrobacter属内具有高度同源性,克隆至E. coli Rosetta并对其进行高效表达,为后期进一步研究AlaDH的酶活特性及其铵离子存在条件下的表达调控机制奠定基础。
响应面优化方法在生物领域主要用于微生物培养基成分和发酵条件的优化,较少有文献对工程菌诱导条件进行优化。BBD和CCD实验可以研究多个因素的交互影响,对培养基成分进行PB筛选实验可以得到主要影响因子,也可以选择最优碳源。Tanyildizi等[11]通过采用CCD响应面对枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶的培养基成分进行优化,大大降低了发酵生产成本。响应面实验分析葡萄糖跟橄榄油作为碳源对Candida cylindracea产脂肪酶的影响得到最佳碳源为橄榄油,减短发酵时间,节约发酵成本[12]。Ye[5]等将Bacillus subtilis中丙氨酸脱氢酶基因在Lactobacillus中异源表达,并用来自Streptococcus thermophilus的Idh启动子促进Lactobacillus中丙氨酸脱氢酶的表达,酶活为48.3 U/mg。Enterobacter aerogenes ICR0220的AlaDH在E. coli JM109中进行原核表达酶活为4.01 U/mg[13]。对来自Phormidiun lapideunm的AlaDH进行Blue-Sepharose纯化后比活为0.95 U/mg[14]。本研究通过对工程菌CZR07产酶的IPTG诱导条件进行BBD实验设计得到3个主要诱导因素之间的交互影响,得到了拟合公式,并设计试验进行验证,结果显示响应面优化诱导条件后A. ureafaciens CZ31中的AlaDH酶活显著提高达到15.23 U/mg,获得较好的优化效果,实验结果与预测值相符,本研究将克隆表达及诱导条件与响应面分析结合起来,得到了高效生产目的蛋白的工程菌和较好的发酵诱导条件,为后续研究有力的支持,研究结果对于其他工程菌发酵过程的控制有较高的借鉴意义。
References
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