刘星晨, 谷守芹
, 董金皋 河北农业大学生命科学学院, 真菌毒素与植物分子病理学实验室, 河北 保定 071001
收稿日期：2017-02-28；修回日期：2017-05-23；网络出版日期：2017-07-10
基金项目：国家自然科学基金（31371897，31671983）；河北省自然科学基金（C2014105067，C2017204069，C2017204076）；河北省研究生创新项目（1099009）
作者简介：董金皋，教授，博士，LosAlamos国家实验室博士后，博士生导师，现任河北农业大学生命科学学院院长。主要研究领域包括：植物与病原微生物互作的分子机理；真菌遗传与微生物代谢；植物活性物质分离、功能分析与药物开发；植物病原微生物的生物信息学等。为河北省有突出贡献的中青年科技专家，国家现代农业产业技术体系岗位专家，河北省植物保护首席专家。先后主持和完成国家自然科学基金、国家“863项目”等多项科研课题。获得教育部河北省科技进步一等奖、河北省自然科学二等奖等多项省部级奖励。在国内外期刊发表科研论文200多篇，主编国家面向二十一世纪教材《农业植物病理学(北方本)》和国家“十一五”规划教材《农业植物病理学》等多部教材。
*通信作者：谷守芹, Tel/Fax:+86-312-7528876, E-mail:gushouqin@126.com
董金皋, Tel/Fax:+86-312-7528266, E-mail:dongjingao@126.com
摘要：CRISPR/Cas9技术是在特定的RNA引导下，利用特异的核酸酶实现对基因组进行编辑的新技术。自2013年该技术体系建立起来已成功应用于动物、植物及真菌中。本文简述了3种基于核酸酶的基因编辑技术及其应用，概述了CRISPR/Cas9系统的组成及其作用机理，总结了CRISPR/Cas9在模式真菌酿酒酵母及丝状真菌中的应用，并就在丝状真菌中应用该技术时sgRNA表达盒的设计、Cas9表达盒的优化、抗性标记的筛选、受体的选择等方面提出具体的研究方法。另外，针对该技术应用过程中出现的脱靶效应、Cas9核定位信号的添加、启动子的选择及多个靶基因的编辑等问题提出了建议与展望，希望能够为初次涉足该领域的科研人员提供理论参考和技术支持。
关键词： 基因组编辑 人工核酸酶 CRISPR/Cas9 植物病原真菌
Research progress of CRISPR/Cas9 system in genome targeted editing of filamentous fungi
Xingchen Liu, Shouqin Gu
, Jingao Dong Mycotoxin and Molecular Plant Pathology Laboratory, College of Life Sciences, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, Hebei Province, China
Received 28 February 2017; Revised 23 May 2017; Published online 10 July 2017
*Corresponding author: Gu Shouqin, Tel/Fax:+86-312-7528876, E-mail:gushouqin@126.com
Dong Jingao, Tel/Fax:+86-312-7528266, E-mail:dongjingao@126.com
Supported by the National Natural Science Foundation of China (31371897, 31671983), by the Natural Science Foundation of Hebei Province (C2014105067, C2017204069, C2017204076) and by the Graduate Innovation Project of Hebei Province (1099009)
Abstract: CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 technology, established in 2013, guided by special RNA and initiated by endonuclease, has been developed into the third generation of genome editing technology, which is widely used in genome editing among varieties of species including animals, plants, bacteria and fungi with high efficiency and specificity. This review briefly introduces the characteristics and the application of three genome editing technologies based on endonucleases, describes the composes and mechanism of CRISPR/Cas9 mediated genome editing, summarizes the application of this tool in Saccharomyces cerevisiae and filamentous fungi in genome editing. In the other hand, we put forward the protocol about using CRISPR/Cas9 technology in filamentous fungi, such as the design of sgRNA cassette, the optimization of Cas9 cassette, the screening of resistance marker, the selection of receptor, and so on. Furthermore, some suggestions were given about the problems which often encounter in practical application, such as off-target effects, the addition of Cas9 nuclear localization signal, the selection of promoter, and multi-gene editing, to provide a theoretical and technological references for the beginners in filamentous fungus gene editing field.
Key words: genome editing artificial nucleases CRISPR/Cas9 filamentous fungus
基因组定向编辑技术是指对基因组中的不同功能区段进行编辑，或通过剪除DNA片段来敲除某基因的功能，或通过向基因组中插入新的片段引入新的功能，可实现对染色体特定部位的基因进行改造，是研究基因功能的重要手段之一。早期的基因编辑技术主要是利用基于同源重组原理进行基因打靶，但由于基因重组效率极低，大大限制了基因功能的研究进展。近年来，科研人员研发出基于特殊核酸酶的基因编辑技术使基因编辑效率大为提高，其中CRISPR/Cas9技术目前已经成为基因功能研究中首选的“标准技术”，该技术在未来一段时间里将继续推进功能基因组的研究，不仅可使遗传工程进入崭新的阶段，也将使生命科学各个领域发生日新月异的巨变。本文简述了3种基于核酸内切酶的基因编辑技术及其应用，概述了CRISPR/Cas9系统的组成及作用机理，详细阐述了该技术在模式生物酿酒酵母及植物病原真菌中的应用现状，并根据本课题组的研究经验提出了该技术在丝状真菌中应用的优势及技术要点，以期为初涉本研究领域的****提供理论和技术参考。
1 基于核酸内切酶的基因编辑技术 最早应用的核酸内切酶包括锌指核酸酶(zinc-finger nucleases，ZFNs)和类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)，这2种核酸内切酶都是由DNA结合域和核酸内切酶Fok1组成，在这些酶的作用下首先形成双链断裂(double strand broken，DSB)，然后通过非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)或同源重组(homologous recombination，HR)进行修复。ZFN首先成功应用于人类、动物(秀丽隐形线虫、海胆、果蝇、家蚕、斑马鱼、大鼠、小鼠、中国仓鼠、猪、牛)、植物(烟草、玉米)、微生物(细菌、真菌)中[1]，之后创建的TALEN技术也在植物、小鼠、斑马鱼、猪、牛及人类细胞中成功实现了对基因的修饰[2]。但ZFN和TALEN技术需要对每一个基因位点都进行重新设计、合成和组装2个核酸酶，程序较复杂、效率较低，在一定程度上制约了其应用前景。2013年Zhang等首次将CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9技术应用于哺乳动物细胞的基因编辑[3]，自此CRISPR-Cas9开始被作为一种基因编辑技术而被广泛使用，该技术操作简单、特异性强，仅在短短几年时间里已经在人体细胞、小鼠、大鼠、斑马鱼、秀丽隐形线虫、植物、细菌、真菌等生物中成功实现了对靶基因的定向编辑，目前该技术已经成为靶基因编辑的首选技术[4]。
2 CRISPR/Cas9系统的组成及作用机理 2.1 CRISPR/Cas9系统的组成 CRISPR是规律成簇的间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)的简称，该类序列广泛存在于40%的细菌和90%的古细菌中，是在进化进程中形成的一种获得性自我免疫防御系统，可降解入侵的病毒或质粒DNA，并在自身基因组中留下外来基因片段以对抗该外源DNA的再次入侵[5]。CRISPR由高度保守的重复序列和完全不同的间隔序列交替排列组成[2]。根据目前最新的报道，可将CRISPR-Cas系统分为两大类，进一步又可分为6种类型和19种亚型[6-8]。现在常用的CRISPR/Cas系统由第二大类的类型Ⅱ系统改造而来。Ⅱ型CRISPR/Cas系统比其他CRISPR系统更简单，只需要Cas9蛋白(核酸酶)、成熟的crRNA (CRISPR associate RNA)、tracrRNA (trans-activating crRNA)及RNase Ⅲ 4种组分，即可对特异序列的外源DNA进行识别、剪切[9]。Jinek等进一步将细菌的Ⅱ型CRISPR系统进行了改造和优化，将crRNA和tracrRNA连接成一条单链引导RNA (single-guide RNA，sgRNA)，在sgRNA的引导下可高效介导Cas9蛋白对DNA的定点切割[10]，随后****将该技术在多种真核生物中成功实现了对基因组的修饰(包括删除和插入、激活或抑制基因转录)及同时对多个靶位点的有效切割[3]，后续研究中利用该技术还实现了基于CRISPR-dCas9技术的基因表达调控[11-12]，定点的表观遗传学修饰[13]以及Liu等开发的基因单碱基编辑技术[14]等诸多方面的研究进展。
2.2 CRISPR/Cas9系统的作用机理 CRISPR/Cas9系统的研发是基于在细菌和古生菌中CRISPR/Cas系统相关的数十年的基础生物学研究[9]，目前对该系统的作用机理已形成了一致的观点，概括起来主要包括3个步骤：(1) 新间隔区序列的获得：当外源噬菌体或质粒等侵染细菌后，CRISPR系统首先识别(protospacer adjacent motif，PAM)序列，Cas1-Cas2蛋白复合物(在某些情况下还包含其他亚单位)参与将外源新间隔序列加工整合到细菌基因组的5′末端的重复序列之间，这些新间隔序列被同向重复序列隔开，保证了CRISPR系统对自身序列和外源序列的正确识别[8]；(2) crRNA的合成与加工：当同类的病毒或者质粒再次入侵该细菌时，CRISPR的短重复序列与插入的新间隔序列一起转录为pre-crRNA初级转录本，加工后形成含有间隔序列的crRNA，进一步与tracrRNA结合形成crRNA-tracrRNA复合体；(3) CRISPR/Cas9介导的沉默免疫干扰：crRNA-tracrRNA (sgRNA)复合体进一步与Cas9形成crRNA-tracrRNA-Cas9复合体，在sgRNA的介导下，Cas9蛋白能够与靶位点序列结合，并对DNA双链进行剪切。Cas9蛋白含有HNH和RuvC两个关键结构域，分别对DNA的两条链进行剪切，HNH结构域能够对与crRNA互补的DNA链进行剪切，RuvC结构域负责剪切与crRNA非互补的DNA链[15]。因此，sgRNA负责识别PAM位点上游的20个核苷酸序列，Cas9蛋白负责将PAM上游3–4 bp处剪切形成平滑末端。因此，CRISPR-Cas9系统中靶位点的选择是由sgRNA序列起始的20 nt及PAM序列共同决定的。
因此，当构建的外源CRISPR/Cas9系统被导入受体细胞后，由sgRNA识别靶标位点，Cas9负责对DNA双链进行切割，细胞可以利用其自身的NHEJ和HR 2条修复途径对受损DNA进行修复。研究者可以根据研究需要向细胞中导入目的DNA片段，如抗性基因/荧光蛋白基因等，即可实现对靶基因的定向编辑。
3 CRISPR/Cas9系统在酿酒酵母基因组定点编辑中的研究进展 近几年来众多研究者将CRISPR/Cas9技术应用于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因功能的研究中，使靶基因编辑的数目和编辑效率显著提高，并实现了对靶基因片段的删除。如DiCarlo等首先利用CRISPR/Cas9技术，使单链及双链靶基因断裂效率分别提高至5倍和130倍，另外将携带sgRNA的质粒与供体DNA (donor DNA)转至含有组成型表达的Cas9细胞中可使供体DNA的同源重组率接近100%[16]。Ronda等利用CrEdit (CRISPR/Cas9 mediated genome editing)技术结合基因同源重组技术，在同源臂减少至60 bp时可使靶基因的敲除效率接近100%；另外，利用该技术实现了对同一代谢途径中多个基因的编辑[17]。Jako?iūnas等成功地利用CRISPR/Cas9系统在一步转化中同时完成了对酵母基因组中5个位点的编辑[18]。Yu等将CRISPR/Cas9与PCS (PCR-mediated chromosome splitting)技术相结合，建立了CRISPR-PCS技术，该技术使染色体断裂(chromosome splitting)效率提高200倍，实现了对多个位点染色体的同时断裂与编辑[19]。Hao等利用CRISPR技术实现了比传统的Latour system更高的基因编辑效率，可删除大于30 kb的大片段基因[20]。由此可见，在酿酒酵母中应用CRISPR/Cas9技术比传统的基因编辑技术展示了更高的编辑效率，尤其在同时编辑多个基因时显示了更强的优势。
4 CRISPR/Cas9系统在丝状真菌基因组定点编辑中的研究进展 在丝状真菌研究领域有关CRISPR/Cas9基因编辑体系的研究报道主要集中在曲霉属(Aspergillus)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)、水稻稻瘟病菌(Pyriculariaoryzae)等(表 1)。目前在该领域的研究重点主要集中于在不同物种中建立CRISPR/Cas9体系并分析其基因编辑效率等方面。如N?dvig等在曲霉属的6个物种中建立了CRISPR/Cas9基因编辑体系，这些物种包括构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、巴西曲霉(A. brasiliensis)、炭黑曲霉菌(A. carbonarius)、泡盛曲霉(A. luchuensis)、黑曲霉(A. niger)、塔宾曲霉(A. tubingensis)等，他们所建立的技术体系不仅可以进行单基因编辑，也实现了对多个基因的同时编辑[21]。Fuller等在烟曲霉(A. fumigatus)也建立了CRISPR/Cas9基因编辑体系，利用该体系使黑色素合成途径的关键基因聚酮合酶基因(pksP)的敲除效率达到25%–53%；也证明了Cas9核酸酶对菌体的生长发育和毒力均无影响，表明了该系统可以用于病菌致病机理研究及基因功能的研究[22]。Zhang等也在烟曲霉(A. fumigatus)中建立了以CRISPR/Cas9技术为基础的微同源臂介导的末端连接(microhomology-mediated end joining，MMEJ)靶基因突变系统，不仅实现了精确高效的靶基因编辑，可在同源臂仅为35 bp时使基因的编辑效率高达95%–100%[23]。Liu等在里氏木霉(Trichoderma reesei)建立了CRISPR/Cas9系统，不仅可以在同源臂较短的条件下实现靶基因高效率的同源重组，也可对多个靶基因进行同时编辑[24]。Schuster等在玉米黑粉菌(Ustilago maydis)中建立了CRISPR/Cas9体系，使供试靶基因的平均编辑效率达70%[25]。Arazoe等在水稻稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)中建立了CRISPR/Cas系统，利用在丝状真菌中具有密码子偏好的Cas9酶、内源的RNA聚合酶Ⅲ、U6启动子和RNA聚合酶Ⅱ真菌启动子表达sgRNA (single-guideRNA)，并例证了该系统可以识别目标序列、通过基因同源重组方式高效编辑靶基因[26]。总之，目前在上述真菌中的研究结果表明，利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术可以有效地对丝状真菌的靶基因进行编辑，利用该体系不仅可以对单个的目的基因进行编辑，也可对基因家族、整个基因座及代谢通路中的多个基因同时进行编辑。
表 1. 丝状真菌中已报道利用CRISPR/Cas9实现基因编辑的部分实例 Table 1. Partial examples using CRISPR/Cas9-mediated genome editing in filamentous fungi
| Species | Genes | Transformation efficiency/% | Screening markers | References |
| A. nidulans | yA | 70–80 | AN_argB | [21] |
| A. aculeatus | albA, pyrG | – | hygR | [21] |
| A. niger | albA | – | – | [21] |
| A. luchuensis | albA | – | – | [21] |
| A. brasiliensis | albA | – | – | [21] |
| A. carbonarius | albA | – | – | [21] |
| A. fumigatus | pksP | 25–53 | hph | [22] |
| A. fumigatus | pksP | 95–100 | hph | [23] |
| T. reesei | Lae1, vib1, clr2 | ≥93 | – | [24] |
| U. maydis | bE1, bW2 | 70–100 | – | [25] |
| M. grisea | – | – | – | [26] |
| The lines in the table indicate that the related data are not shown in the references. | ||||
表选项
5 植物病原真菌中CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建方法及技术要点 本课题组李坡等利用RNAi、靶基因敲除技术分析玉米大斑病菌基因功能过程中发现，靶基因编辑的效率很低[27-28]，这很可能是由于在正常条件下形成双链断裂的几率很低造成的。近两年我们尝试在玉米大斑病菌中建立CRISPR/Cas9基因编辑系统，并总结出了在丝状真菌中建立该体系的基本技术流程及注意的问题，概括起来主要包括以下几个方面：(1) 确定sgRNA表达盒。sgRNA表达盒由启动子、gRNA、sgRNA scaffold序列和终止子所组成。其中，筛选合适的sgRNA序列是决定基因编辑成功与否的关键因素，首先需要在靶标DNA区域寻找PAM (protospacer associated motif)序列NGG/NAG，在PAM序列上游20 bp左右序列即为sgRNA序列，之后需要在基因组数据库中检测sgRNA靶序列的特异性。目前的研究表明，靶序列最好含有11–14个C/G，因为靶序列C/G含量百分比的提高可提高打靶效率[29]；sgRNA序列的设计及评估通常需要借助特定软件完成，如CRISPR Design、ZiFiT、Cas9 Design、E-CRISP、CRISPR-P、sgRNAcas9[30-44]等(表 2)。另外，启动子的选择也是影响sgRNA表达的因素，目前在丝状真菌中常用的启动子为U3、U6等[45]。(2) Cas9表达盒的选择。Cas9蛋白的表达量是决定靶基因双链断裂效率的决定因素，通过选用真菌内源的组成型启动子，如gpdA启动子及木霉属pki1启动子[46]等；或采用对Cas9密码子进行优化也可显著提高Cas9蛋白的表达量并提高基因组编辑的效率；此外，还可对Cas9蛋白进行适当的修饰，如添加核定位信号(nuclear localization signal，NLS)或标签蛋白(GFP)等以提高基因组编辑效率或作为筛选标记。(3) 抗性标记的筛选。在丝状真菌靶基因编辑研究中，大多引入同源重组介导的修复(homology-directed repair，HR)，转入受体细胞的同源臂中含有抗性基因盒及靶基因的同源臂，目前常用的抗性标记为潮霉素B或草铵膦，所采用的同源臂长度一般在200 bp至几十bp不等。(4) 受体的选择。目前在植物病原真菌中一般将Cas9-sgRNA、同源臂及抗性基因盒等利用酶切连接或Overlap PCR技术克隆至一个质粒中，之后同时转入丝状真菌的原生质体中，通过抗性及分子生物学手段筛选得到靶基因编辑突变菌株。
表 2. sgRNA设计与脱靶效应评估软件的部分实例 Table 2. Part software examples of sgRNA design and off-target effect evaluation
| Names of software | Research institutions | Internet sites | Application scope and function | References |
| Cas9 Design | Engineering College, BeijingUniversity | http://cas9.cbi.pku.edu.cn/ | sgRNA design and transcriptional efficiency assessment in 10 modelanimals including mice, rats, zebrafish and so on | [30] |
| E-CRISP | http://www.e-crisp.org/E-CRISP/index.html | sgRNA design and off-target effectassessment; "Paired-gRNA" design | [31] | |
| Cas-OFFinder | Laboratory of Professor Jin-SooKim in Seoul National University | http://www.rgenome.net/cas-offinder/ | Searching for potential off-target sites in a given genome or user-defined sequences | [32] |
| CRISPR-P | National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement at Collegeof Life Science and Technology in Huazhong Agricultural University | http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/ | Selecting sgRNA in plants and marking comprehensive restriction enzyme cutting sites for eachsgRNA | [33] |
| CHOPCHOP | https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/index.php | CRISPR/Cas9 or TALENsystem-mediated genome editingtechnology | [34] | |
| CRISPRdirect | http://crispr.dbcls.jp/ | Designing special sgRNA | [35] | |
| COSMID | https://crispr.bme.gatech.edu/crispr/ | Identifying and validatingCRISPR/Cas off-target sites | [36] | |
| CRISPR Design | Laboratory of Zhang Feng inBroad Institute of MassachusettsInstitute of Technology | http://crispr.mit.edu/ | sgRNA design and off -target effect evaluation | [37] |
| CasOT | College of Life Sciences in Beijing University | http://eendb.zfgenetics.org/casot/index.php | sgRNA design and off -target effect evaluation | [38] |
| sgRNAcas9 | National Key Laboratory of CropGenetic Improvement inHuazhong Agricultural University and Laboratory of Huang Xingxu in Shanghai University of Science and Technology | http://www.biootools.com/ | sgRNA design and off -target effect evaluation | [39] |
| SSFinder | https://code.google.com/p/ssfinder/ | sgRNA design and off -target effect evaluation | [40] | |
| GT-Scan | http://gt-scan.braembl.org.au/gt-scan/submit | sgRNA design and off-targetprediction | [41] | |
| flyCRISPR Optimal TargetFinder | http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/ | sgRNA design and off -target effectevaluation | [42] | |
| Off-Spotter | https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/ | sgRNA design and off -target effect evaluation | [43] | |
| CCTop | http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/index.html | sgRNA design and off -target effect evaluation | [44] |
表选项
6 问题与展望 CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术只需要根据靶基因序列设计出sgRNA，即可实现对基因组的定点编辑，实验操作简单、周期短、高效、通用性广、费用低，但该技术仍存在一定的局限性，主要表现在以下两个方面：(1) 存在脱靶效应，可能引起基因组非靶向位点的突变，把无意义的片段带入靶向基因组中，从而增加了研究结果的不确定性；(2) 靶基因编辑的效率仍然较低。由于在丝状真菌中应用该技术的物种的报道还比较少，目前在很多物种中尚未建立成熟的基因编辑体系，笔者认为在该研究领域尚存在诸多需要深入研究的内容。(1) 如何获得高效的丝状真菌偏好的Cas9酶。研究者可以探索丝状真菌偏好的密码子优化的Cas9酶，或者解析Cas9蛋白结构并对酶本身进行改造，使Cas9蛋白特异结合或切割DNA靶点，提高其特异性。(2) 对Cas9添加核定位信号，有效地指导Cas9蛋白入核或促使其在丝状真菌细胞核内特异表达。(3) 对比不同来源的各种启动子(比如H1启动子、拟南芥U6启动子、烟草U6启动子、UBI启动子、35S启动子等)的靶标范围、精准度和表达效率，选取适用于目标真菌的启动子。(4) 针对一条代谢途径、多基因控制的性状或代谢过程，设计能同时对多个靶标基因进行编辑的sgRNA表达盒，这样我们可以对某个代谢途径、代谢过程及功能相关的多个基因同时进行分析。(5) 如何应对脱靶效应方面，可以借鉴植物中CRISPR/Cas9的研究方法和思路，建立对脱靶效应进行全面准确评估的评价体系，最大限度地降低可能存在的脱靶效应，提高CRISPR/Cas9的特异性和编辑效率[47]。
总的来说，CRISPR/Cas9系统在丝状真菌基因组编辑的应用方面还处于初级阶段，目前的报道也仅限于几个物种中，如何将该技术应用于大型且与人类生产生活密切相关的真菌物种中，是否可以建立不局限于某个真菌物种的通用Cas9、sgRNA及基因编辑体系，如何提高同源重组效率，如何定向地插入和删除超长的目的基因片段等问题仍亟待解决。随着更广泛的真菌功能基因组研究的开展，在不远的将来希望该技术可以广泛应用于人类病原真菌、动物病原真菌、植物病原真菌、药用真菌、食用真菌等的遗传改造、品质改良等方面。
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