王茜茜, 宋雪飞, 郭晶晶, 张颖, 乌日娜
沈阳农业大学食品学院, 辽宁 沈阳 110866
收稿日期：2016-12-28；修回日期：2017-03-12；网络出版日期：2017-03-30
基金项目：国家自然科学基金（31471713，31000805）；中国博士后科学基金（2014M560395）；辽宁省农业领域青年科技创新人才培养计划（2014048）；辽宁省高等学校优秀人才支持计划（LR2015059）；江苏省博士后科研资助计划（1402071C）
*通信作者：乌日娜, Tel/Fax:+86-24-88487161;E-mail:wrn6956@163.com
摘要：[目的]对大酱中耐盐性较好的植物乳杆菌进行蛋白质组学研究，为植物乳杆菌盐胁迫应激机制的研究提供实验数据。[方法]本项研究以筛选自东北传统农家大酱的耐盐性较好的植物乳杆菌FS5-5为研究对象，绘制了其在0%、6.0%、7.0%和8.0%（W/V）NaCl浓度下的生长曲线，并利用iTRAQ技术研究了其在0%、6.0%、7.0%和8.0%（W/V）NaCl浓度下的蛋白质表达情况。[结果]植物乳杆菌FS5-5在0%、6.0%、7.0%和8.0%（W/V）NaCl浓度下到达对数生长期中期的时间点分别为5、10、12和12 h；以差异倍数在1.2倍以上且P < 0.05为筛选条件对6.0%、7.0%和8.0%（W/V）NaCl浓度下与0%进行差异蛋白质的筛选，共筛选出1271个差异蛋白质。这些差异蛋白质主要参与糖代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢、核苷酸代谢、应激反应、转运、PTS系统和核糖体代谢等。[结论]植物乳杆菌在高盐浓度下生长与能量合成蛋白质、应激蛋白质以及相容性溶质转运蛋白质的表达上调有密切关系。
关键词： 植物乳杆菌FS5-5 盐胁迫 iTRAQ 差异蛋白质表达
Analysis of salt tolerance of Lactobacillus plantarum FS5-5 based on iTRAQ technology
Wang Qianqian, Song Xuefei, Guo Jingjing, Zhang Ying, Wu Rina
College of Food Sciences, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, Liaoning Province, China
Received 28 December 2016; Revised 12 March 2017; Published online 30 March 2017
*Corresponding author: Wu Rina, Tel/Fax:+86-24-88487161;E-mail:wrn6956@163.com
Supported by the National Natural Science Foundation of China (31471713, 31000805), by the China Postdoctoral Science Foundation Funded Project (2014M560395), by the Cultivation Plan for Youth Agricultural Science and Technology Innovative Talents of Liaoning Province (2014048), by the Program for Liaoning Excellent Talents in University (LR2015059) and by the Jiangsu Province Postdoctoral Science Foundation Funded Project (1402071C)
Abstract: [Objective]Proteomic analysis of Lactobacillus plantarum to salt stress could provide a theoretical basis for salt-tolerant mechanism involved in lactic acid bacteria.[Methods]Lactobacillus plantarum FS5-5 was originally isolated from traditional home-made fermented soybean paste from Northeast China. Growth was observed under 0%, 6.0%, 7.0% and 8.0% (W/V) NaCl, and protein expression was analyzed using iTRAQ technology.[Results]We collected bacteria at 5, 10, 12 and 12 h of the mid-logarithmic growth phase for proteomic analysis. Based on iTRAQ results, a total of 1271 differently expressed proteins were identified under different salt stress. They were involved in carbohydrate metabolism, amino acid metabolism, lipid metabolism, nucleotide metabolism, stress proteins, transporters, phosphotransferase system, ribosome, and so on.[Conclusion]The ability of L. plantarum FS5-5 to grow in high concentration of NaCl is connected with energy synthesis proteins, stress proteins and compatible solutes transporters.
Key words: Lactobacillus plantarum FS5-5 salt stress iTRAQ differential protein expression
植物乳杆菌作为一种常见的益生菌，对人体的健康具有很好的益生作用。它们通常要在产品的生产和储存过程中能够耐受高温、高压、强碱、高盐等外界环境压力的变化[1]，同时也需要耐受人体胃肠消化道中低pH值、高胆盐等胁迫的变化。以便能够在人体内更好地发挥益生特性。
为了抵抗和适应生产过程中遇到的高温、强碱、高盐，以及在人体消化过程中遇到的胃酸、胆盐等环境压力的变化，乳酸菌也逐渐进化出了大量的适应机理和压力反应。相关报道指出，对不良环境的适应能力通常与大量基因的诱导、应激蛋白质的生物合成有关[2-3]。也有报道指出，这些适应机理是因为生物体面对压力变化时激活了不同的代谢途径，进而导致其蛋白质图谱发生了改变[4]。因此，利用蛋白质组学研究植物乳杆菌面对生理和环境的变化产生的适应机理是一种非常有效的方法。与传统的双向电泳相比，基于同位素标记与高效液相色谱与质谱联用的iTRAQ技术能够更精确地对蛋白质进行定性和定量分析。
大酱是东北地区一种深受大家喜爱的传统发酵食品。盐作为大酱的一种主要调味品，在发酵过程中是必须添加的，盐的添加不仅能够提高大酱的风味，抑制微生物的生长，也能提高大酱的货架期。在大酱发酵过程中主要存在的微生物是乳酸菌和酵母菌，以前对大酱中耐盐乳酸菌的研究主要集中在嗜盐四联球菌，对耐盐植物乳杆菌的研究则较少。
本项研究以筛选自东北传统农家大酱并且对NaCl环境具有一定耐受性的植物乳杆菌FS5-5为研究对象[5]，利用iTRAQ技术比较分析了该菌株在0%、6.0%、7.0%和8.0% (W/V)的盐浓度下生长至对数期中期的蛋白质表达差异情况，通过生物信息学对差异蛋白质功能进行注释，为进一步探究该菌株的耐盐机理提供理论依据。
1 材料和方法 1.1 材料 菌种：耐盐植物乳杆菌L. plantarum FS5-5 (中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC10331)。
改良的MRS培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉浸膏8，无水乙酸钠5，磷酸氢二钾2，酵母粉4，柠檬酸钠2，七水硫酸镁0.58，四水硫酸锰0.25，吐温1。
裂解液buffer的配制：8 mol/L尿素、30 mmol/L HEPES、1 mmol/L PMSF、2 mmol/L EDTA、10 mmol/L DTT。
1.2 不同盐浓度下植物乳杆菌FS5-5生长至对数生长期中期生长点的确定 将活化至第3代的植物乳杆菌FS5-5供试菌液以1%的接种量接种到NaCl含量分别为0%、6.0%、7.0%和8.0% (W/V)的新鲜配置的改良MRS培养基中(pH用HCl调节至6.5)，同时添加MES、MOPS缓冲剂。以每管5 mL的量分装到灭过菌的试管中，于37 ℃条件下恒温培养24 h，在培养过程中，每隔2 h进行1次取样，振荡均匀后，测定在600 nm下的吸光度值，并且根据不同时间的吸光度值绘制植物乳杆菌FS5-5在不同盐浓度下的生长曲线[6]。
1.3 不同盐浓度下植物乳杆菌FS5-5生长至对数生长期中期时样品的收集 将活化至第3代的L. plantarum FS5-5的供试菌液以1%的接种量分别接种至灭过菌的新鲜配置的含有不同盐浓度的MRS培养基中，在37 ℃条件下恒温培养。待植物乳杆菌L. plantarum FS5-5在各个盐浓度下培养到对数生长期中期，从恒温培养箱中取出，在4 ℃条件下，4000×g离心10 min，吸出上清液，将菌体转移至2 mL离心管中，加入1.5 mL PBS缓冲液，振荡，使菌体重悬，在4 ℃条件下，4000×g离心10 min，吸出上清液，重复3次；再加入1.5 mL灭菌水，振荡，使菌体重悬，在4 ℃条件下，4000×g离心10 min，吸出上清液，重复3次，并将菌体表面残留的灭菌水吸干。
不同盐浓度下的菌体样品分别按照上述方法重复3次，并且将3次分别收集到的菌体样品等量混合，-80 ℃保存备用。
1.4 iTRAQ试验 收集的菌体样品送北京华大蛋白质研发中心有限公司进行iTRAQ试验。
1.4.1 蛋白质的提取: 收集不同NaCl浓度处理的植物乳杆菌的菌体样品，并采用超声破碎与丙酮沉淀法提取经过不同NaCl浓度处理的植物乳杆菌的蛋白质样品。在500 μg植物乳杆菌菌体样品中加入裂解液1 mL，超声(超声条件：pulse on 2 s、pulse off 3 s、power 180 W)，离心收集上清，在上清中加入丙酮沉淀蛋白质，再加入裂解液复溶。使用Bradford法对提取的蛋白质进行定量，并通过SDS-PAGE检测提取的蛋白质质量。
1.4.2 蛋白质的消化、肽段标记以及肽段纯化: 对经过不同NaCl浓度处理的植物乳杆菌的蛋白质样品进行胰蛋白酶消化，用iTRAQ试剂盒对肽段进行标记，标记信息分别为：0%，113；6.0%，114；7.0%，115；8.0%，116。之后采用Phenomenex Luna SCX 100A对标记后的肽段样品进行预分离，最后用Strata-X C18除盐柱(Phenomenex)对标记后的肽段样品进行纯化。
1.4.3 质谱检测与定性定量分析: 标记后的肽段样品用戴安纳升液相色谱系统进行分离。流动相A为含有0.1%甲酸的水溶液，流动相B为含有0.1%甲酸的乙腈溶液，用C18色谱柱(100 mm×75 mm，300 A，5 μm)进行分离，流速为400 nL/min，洗脱梯度如表 1所示。洗脱的肽段利用Thermo fisher Q-Exactive进行收集并进行质谱检测。Q-Exactive质谱仪检测肽段信号的参数：离子模式为正离子模式；一级扫描范围350-2000 Da；二级扫描范围依赖于一级母离子质荷比自动选择；二级分辨率17500；毛细管温度320 ℃；离子源电压1800 V；破裂模式HCD。
表 1. Nano-LC液相洗脱梯度 Table 1. Elution gradient of nano-LC
| t/min | B liquid/% |
| 0 | 5 |
| 10 | 5 |
| 40 | 30 |
| 45 | 60 |
| 48 | 80 |
| 55 | 80 |
| 58 | 5 |
| 65 | 5 |
| 65.01 | STOP |
表选项
将质谱扫描后得到的总离子流图输入到PD (Proteome Discoverer 1.3，thermo)软件后，对总离子流图进行筛选。总离子流图筛选参数为：母离子质量范围350-6000 Da；二级总离子流图中最小峰数10；信噪比(S/N)域值1.5。PD提取后的谱图用mascot进行搜索，搜索结束后，PD软件根据mascot搜索结果和第一步筛选后的谱图进行定量分析。
1.4.4 生物信息学分析: 通过GO (http://geneontology.org/)数据库和KEGG (http://www.kegg.jp/)数据库对得到的差异蛋白质点的功能和代谢通路进行注释。
2 结果和分析 2.1 不同盐浓度下植物乳杆菌FS5-5的生长 植物乳杆菌FS5-5在NaCl浓度分别为0%、6.0%、7.0%和8.0% (W/V)的改良MRS培养基中能够生长，其生长曲线如图 1所示。植物乳杆菌FS5-5在0%盐浓度下5 h到达对数生长期中期，在6.0%盐浓度下10 h到达对数生长期中期，在7.0%盐浓度下12 h到达对数生长期中期，在8.0%盐浓度下12 h到达对数生长期中期。
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| 图 1 植物乳杆菌L. plantarum FS5-5在不同NaCl浓度条件下的生长曲线 Figure 1 The growth of L. plantarum FS5-5 cultured in MRS medium at different NaCl concentrations. |
| 图选项 |
2.2 植物乳杆菌FS5-5的iTRAQ结果分析
2.2.1 蛋白质定量与质谱鉴定结果: 通过Bradford法对提取的蛋白质样品进行定量，蛋白质浓度分别为1.55、1.07、1.25和1.32 μg/μL。凝胶电泳图谱如图 2所示，由凝胶电泳图可以看出，4个样品条带清晰，各个条带之间相对平行，可以进行后续iTRAQ试验。
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| 图 2 植物乳杆菌L. plantarum FS5-5在不同NaCl浓度条件下的SDS-PAGE分析 Figure 2 SDS-PAGE analysis of L. plantarum FS5-5 cultured in MRS medium at different NaCl concentrations. Lane 1: 0%; lane 2: 6.0%; lane 3: 7.0%; lane 4: 8.0%; M: marker. |
| 图选项 |
通过质谱扫描后的总离子流图如图 3所示，通过Mascot软件进行搜索，在1578_UNI_Lactobac库(建库日期：2015.08.07；Number of sequences：461115) 中鉴定到的总蛋白质为2056个，其中全部的谱图数为343524个，匹配上的谱图数为85516个，肽段种类数为11215个，匹配上的蛋白质数为2056个。
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| 图 3 Q-Exactive质谱检测总离子流图 Figure 3 Schematic diagram of Q-Exactive. Abscissa: elution time; ordinate: signal strength. |
| 图选项 |
2.2.2 差异蛋白质分析: 以差异倍数在1.2倍以上且P < 0.05为筛选条件，对6.0%、7.0%和8.0% (W/V) NaCl浓度下出现的蛋白质与0% (W/V) NaCl浓度下出现的蛋白质进行差异蛋白质的筛选，共筛选出1271个差异蛋白质。其中6.0% (W/V) NaCl浓度下出现的蛋白质与0% (W/V) NaCl浓度下出现的蛋白质相比，共有372个差异蛋白质点，其中有200个蛋白质表达上调，有172个蛋白质表达下调；7.0% (W/V) NaCl浓度下出现的蛋白质与0% (W/V) NaCl浓度下出现的蛋白质相比，共有440个差异蛋白质点，其中有222个蛋白质表达上调，有218个蛋白质表达下调；8.0% (W/V) NaCl浓度下出现的蛋白质与0% (W/V) NaCl浓度下出现的蛋白质相比，共有459个差异蛋白质点，其中有245个蛋白质表达上调，有214个蛋白质表达下调。
而与0% (W/V) NaCl浓度下出现的蛋白质相比，6.0%、7.0%和8.0% (W/V) NaCl浓度下蛋白质点均发生差异变化的共有255个，其中有140个蛋白质表达上调，有115个蛋白质表达下调。
2.2.3 差异蛋白质生物信息学分析: 通过GO数据库和KEGG数据库对这些差异表达的蛋白质的功能和代谢通路进行分析，这些差异蛋白质主要参与糖代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢、核苷酸代谢、应激反应、ABC转运、PTS系统和核糖体代谢、DNA复制重组与修复蛋白质等。在6.0%、7.0%和8.0% (W/V) NaCl浓度下蛋白质点均发生差异变化的部分蛋白质信息如表 2所示。
表 2. 差异表达的部分蛋白质信息列表 Table 2. The information list of changed expression proteins
| Accession number | Protein name | Gene name | MW/kDa | pI | Differential expression | ||
| 6/1 | 7/1 | 8/1 | |||||
| M4KKC5 | Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase | gpd | 56.7 | 5.49 | 1.24 | 1.27 | 1.47 |
| A0A023MCE4 | Phosphoglycerate mutase | pgm | 24.9 | 7.15 | 1.51 | 1.51 | 1.51 |
| D7V8V6 | 6-phosphogluconate dehydrogenase, decarboxylating | gnd | 52.9 | 5.30 | 1.48 | 1.41 | 1.83 |
| A0A023MFR5 | Alcohol dehydrogenase, zinc-containing | I526_2330 | 36.7 | 5.59 | 2.22 | 2.90 | 3.44 |
| D7V979 | FabA-like domain protein | fabZ2 | 15.1 | 7.46 | 0.70 | 0.54 | 0.67 |
| V7Z5W3 | 3-ketoacyl-ACP reductase | fabG2 | 23.2 | 7.56 | 0.72 | 0.55 | 0.62 |
| A0A023MB83 | Malonyl CoA-acyl carrier protein transacylase | fabD | 33.2 | 5.44 | 0.73 | 0.58 | 0.55 |
| D7V978 | Putative acetyl-CoA carboxylase, biotin carboxyl carrier protein | accB | 16.3 | 4.55 | 0.76 | 0.54 | 0.57 |
| A0A023MC38 | Acetyl-CoA carboxylase, biotin carboxylase subunit | accC | 48.2 | 7.18 | 1.31 | 1.31 | 1.21 |
| V7Z294 | Orotate phosphoribosyltransferase | pyrE | 22.4 | 6.09 | 0.22 | 0.25 | 0.31 |
| A0A023MFH5 | Carbamoyl-phosphate synthase small chain | carA | 40.0 | 6.09 | 0.24 | 0.26 | 0.27 |
| D7VCT9 | Dihydroorotate dehydrogenase | pyrD | 31.2 | 6.64 | 0.27 | 0.27 | 0.42 |
| Q88SV6 | Adenylosuccinate synthetase | purA | 47.2 | 5.64 | 0.29 | 0.34 | 0.48 |
| P77883 | Aspartate carbamoyltransferase | pyrB | 34.7 | 6.54 | 0.31 | 0.53 | 0.51 |
| A0A023MEY2 | Bifunctional purine biosynthesis protein PurH | purH | 55.3 | 6.33 | 0.37 | 0.39 | 0.48 |
| Q88SV5 | GMP reductase | guaC | 35.4 | 6.87 | 0.38 | 0.47 | 0.52 |
| M4KK14 | Dihydroorotase | pyrC | 45.4 | 6.18 | 0.38 | 0.42 | 0.44 |
| P77888 | Orotidine 5'-phosphate decarboxylase | pyrF | 24.9 | 7.59 | 0.45 | 0.40 | 0.39 |
| A0A023MGM5 | Adenylosuccinate lyase | purB | 49.0 | 5.97 | 0.48 | 0.62 | 0.71 |
| Q88Z76 | CTP synthase | pyrG | 59.7 | 5.69 | 0.63 | 0.59 | 0.57 |
| U2HMA7 | Universal stress protein | uspA | 17.6 | 9.92 | 1.71 | 1.87 | 1.92 |
| A0A023M9S1 | Small heat shock protein | hsp | 16.0 | 4.70 | 1.82 | 2.22 | 2.06 |
| A0A023MBA8 | Alkaline shock protein | asp | 16.1 | 4.94 | 2.36 | 1.95 | 1.92 |
| A0A023M8Y1 | ABC transporter, ATP-binding protein | I526_0147 | 33.8 | 8.50 | 0.33 | 0.42 | 0.37 |
| A0A023MB03 | Maltose/maltodextrin ABC transporter, substrate binding protein | malE | 45.6 | 9.69 | 0.50 | 0.70 | 0.66 |
| A0A023MCW7 | Oligopeptide ABC transporter, permease protein | I526_1074 | 37.6 | 9.31 | 0.62 | 0.57 | 0.54 |
| U2HNB3 | Peptide ABC transporter substrate-binding protein | N876_09685 | 36.6 | 6.02 | 0.74 | 0.66 | 0.59 |
| A0A023MAZ6 | Lipoprotein, peptide binding protein OppA-like protein | I526_0648 | 59.9 | 9.61 | 0.74 | 0.57 | 0.62 |
| A0A023MDM8 | ABC-type dipeptide/oligopeptide/nickel transport system, ATPase component | I526_1075 | 39.7 | 5.87 | 0.81 | 0.55 | 0.65 |
| A0A023ME81 | Glycine betaine/carnitine/choline ABC transporter, substrate binding protein | I526_1355 | 34.8 | 9.36 | 1.26 | 1.29 | 1.28 |
| A0A023MDL1 | Glycine betaine/carnitine/choline ABC transporter, permease protein | I526_1354 | 22.4 | 8.40 | 1.37 | 1.47 | 1.56 |
| F9UNY1 | Glycine betaine/carnitine/choline ABC transporter, ATP-binding protein | opuA | 44.4 | 5.16 | 1.43 | 1.39 | 1.43 |
| R9X8D2 | Glycine/betaine/carnitine ABC transporter, ATP-binding subunit(ProV) | Lp16_F055 | 43.9 | 6.06 | 1.54 | 1.82 | 1.99 |
| R9XAV7 | Glycine/betaine/carnitine ABC transporter, substrate binding lipoprotein | Lp16_F053 | 33.5 | 10.04 | 1.64 | 1.74 | 1.55 |
| Q88XZ0 | 30S ribosomal protein S12 | rpsL | 15.2 | 11.25 | 0.57 | 0.42 | 0.35 |
| Q88WN3 | 50S ribosomal protein L27 | rpmA | 10.1 | 10.95 | 0.62 | 0.61 | 0.58 |
| Q88WU7 | 50S ribosomal protein L35 | rpmI | 7.4 | 12.04 | 0.64 | 0.23 | 0.21 |
| Q88VD4 | 30S ribosomal protein S20 | rpsT | 9.1 | 10.52 | 0.67 | 0.58 | 0.61 |
| Q88WK6 | 50S ribosomal protein L28 | rpmB | 7.0 | 11.91 | 0.71 | 0.43 | 0.44 |
| Q88XY2 | 30S ribosomal protein S19 | rpsS | 10.3 | 9.82 | 0.74 | 0.58 | 0.82 |
| U2I5Q9 | 50S ribosomal protein L30 | N876_10145 | 4.4 | 8.69 | 0.77 | 0.67 | 0.82 |
| Q88XY3 | 50S ribosomal protein L2 | rplB | 30.2 | 10.55 | 0.77 | 0.62 | 0.63 |
| Q88YW7 | 50S ribosomal protein L7/L12 | rplL | 12.6 | 4.48 | 0.79 | 0.70 | 0.79 |
| Q88XW7 | 50S ribosomal protein L15 | rplO | 15.3 | 10.64 | 0.82 | 0.79 | 0.78 |
| A0A023MFT5 | Ribonuclease H | I526_2100 | 32.6 | 9.85 | 1.20 | 1.27 | 1.21 |
| Q88UZ4 | Protein RecA | recA | 40.6 | 5.72 | 1.26 | 1.71 | 2.05 |
| A0A023MA12 | DNA ligase | ligA | 74.4 | 5.24 | 1.34 | 1.36 | 1.58 |
| U2WPA2 | Single-stranded DNA-binding protein | N644_0531 | 20.9 | 5.12 | 1.42 | 1.82 | 2.13 |
| Q88YI8 | UvrABC system protein B | uvrB | 76.1 | 5.20 | 1.44 | 1.91 | 2.39 |
表选项
在本实验中，与糖酵解相关的蛋白质主要有磷酸甘油酸酯变位酶和乙醇脱氢酶。与NaCl浓度为0%相比，在NaCl浓度为6.0%、7.0%和8.0% (W/V)时，这两种酶的表达是上调的，这说明在盐胁迫条件下，可能需要产生更多的能量来抵抗不利环境。与磷酸戊糖途径相关的蛋白质主要有6-磷酸葡萄糖脱氢酶(Gpd)和6-磷酸葡萄糖酸脱羧酶(Gnd)，与NaCl浓度为0%相比，在NaCl浓度为6.0%、7.0%和8.0% (W/V)时，这两种酶的表达是上调的，这也说明在盐胁迫条件下，菌体可能启动多种反应相互协调相互配合来抵抗不利环境，同时也需要产生更多的能量来维持自身细胞的生长繁殖。
与NaCl浓度为0%相比，NaCl浓度为6.0%、7.0%和8.0% (W/V)时的AccB、AccC、FabZ2、FabG2、FabD蛋白质均发生了明显的变化，并且表达均是下调的，这说明NaCl的加入可能抑制了菌体细胞的生长，导致细胞生长繁殖过程中脂肪酸生物合成中的相关酶活性减弱。Heunis等[7]发现植物乳杆菌423在酸胁迫时FabD的蛋白质表达也是下降的，这可能是其在不良环境下通过减少脂肪酸的生物合成来减少自身的生长[8]。
与NaCl浓度为0%相比，NaCl浓度为6.0%、7.0%、8.0% (W/V)时的GuaC、PurH、PurA和PurB的蛋白质均发生了明显的变化，并且表达均是下调的，这说明NaCl的加入可能抑制了菌体细胞的生长，导致细胞生长繁殖过程中嘌呤代谢中相关酶的活性减弱。Pang等[9]研究表明，PurA含量的减少，可以增加核苷酸代谢中次黄嘌呤的浓度，进而合成RNA和DNA。Sun等[10]发表的论文中也有类似的结果，Escherichia coli在酸胁迫条件下的差异蛋白质中，Adk、PurA的表达也是下调的。与NaCl浓度为0%相比，NaCl浓度为6.0%、7.0%和8.0% (W/V)时的CarA、PyrB、PyrC、PyrD、PyrE、PyrF和PyrG的蛋白质均发生了明显的变化，并且表达均是下调的，这说明NaCl的加入可能抑制了菌体细胞的生长，导致细胞生长繁殖过程中嘌呤代谢相关酶的活性减弱。
在本实验中，出现大量的核糖体蛋白质，如30S核糖体蛋白质S12、50S核糖体蛋白质L27、50S核糖体蛋白质L35、30S核糖体蛋白质S20、50S核糖体蛋白质L28、30S核糖体蛋白质S19、50S核糖体蛋白质L30、50S核糖体蛋白质L2等等，但核糖体蛋白质的表达量大多是下调的，这说明在盐胁迫环境下，可能减少了菌体细胞自身的生长，所需蛋白质的量减少，核糖体蛋白质的表达量随之减少。在本实验中出现的通用应激蛋白质、小热休克蛋白质、碱性休克蛋白质的表达均是增强的，在NaCl浓度6.0%、7.0%和8.0% (W/V)的环境下，增强倍数均达到了1.7倍以上。应激蛋白质对蛋白质和DNA的维护和修复作用也是乳酸菌适应胁迫环境的机制之一[11]。以前的一些关于双向电泳的研究中，热休克蛋白质如GroES、GroEL和DnaK经常在胁迫环境下被诱导表达出来。ABC转运蛋白质在转运磷酸腺苷蛋白质、麦芽糖、麦芽多糖、多肽、寡肽、谷氨酰胺、脂蛋白质相关的蛋白质时的差异表达下调，而与此同时，ABC转运蛋白质在转运甘氨酸甜菜碱、肉碱、胆碱等相关蛋白质时的差异表达上调。
3 讨论 NaCl的添加会影响植物乳杆菌自身的生长繁殖，同时也会刺激植物乳杆菌调控自身的耐盐机制来抵抗NaCl的胁迫作用，以便维持自身细胞的稳定性。曾经提出的耐盐机制主要包括“相容性溶质”策略、应激蛋白质的表达、代谢途径的调控等方面。本实验中出现的差异蛋白质主要有糖代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢、核苷酸代谢、应激蛋白质、ABC转运蛋白质、PTS系统、核糖体蛋白质、DNA复制重组与修复蛋白质等。
在糖代谢过程中最主要的方式是糖酵解，在厌氧条件下，乳酸菌几乎完全依靠糖酵解途径来提供能量供应[12]。磷酸戊糖途径也是糖代谢中的主要代谢途径之一，在磷酸戊糖途径中，6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化6-磷酸葡萄糖生成磷酸葡萄糖酸酯，同时生成NADPH；6-磷酸葡萄糖酸脱羧酶催化6-磷酸葡萄糖生成D-核酮糖-5-磷酸，同时生成NADPH，再进一步形成核糖-5-磷酸。在该途径中生成的NADPH可以用来还原谷胱甘肽，以及参与还原性生物分子的合成；中间产物D-核酮糖-5-磷酸是核苷酸及其重要辅酶的主要组成成分之一。6-磷酸葡萄糖脱氢酶是一种速率限制酶，由于其具有的不可逆性也赋予该酶一种特殊的信号作用，即表征盐胁迫下细胞生长所处的较合适的氧化还原状态[13]。
核糖体蛋白质的功能除了促进蛋白质的生物合成外，还可以感受环境的变化，如热、冷、酸、渗透压等的变化[14]。核糖体蛋白质的产生是细胞代谢的主要支出，细胞需要的翻译机制的量与细胞生长率有关，在不同的环境条件下，核糖体与蛋白质合成之间保持着合适的水平[15]。当乳酸菌处在胁迫环境(如酸胁迫、胆盐胁迫等)下时，应激蛋白质通常被诱导表达，应激蛋白质在基因和蛋白质的表达和修复过程中起着至关重要的作用，常见的应激蛋白质主要包括热休克蛋白质、冷休克蛋白质和通用应激蛋白质[16]。
ABC转运蛋白质可以转运甘氨酸甜菜碱、多肽、腺苷、多糖、脂蛋白质到细胞内，但在转运的过程中需要消耗ATP。ABC转运蛋白质在转运磷酸腺苷蛋白质、麦芽糖、麦芽多糖、多肽、寡肽、谷氨酰胺、脂蛋白质相关的蛋白质时的差异表达下调，这说明了NaCl的加入抑制了菌体细胞的生长，使菌体细胞自身生长繁殖代谢相关的代谢途径减弱，需要的前提物质减少，也使得转运前体物质的转运蛋白质的含量减少，所以与NaCl浓度为0%相比，蛋白质表达下调。而与此同时，ABC转运蛋白质在转运甘氨酸甜菜碱、肉碱、胆碱等相关蛋白质时的差异表达上调，菌体细胞在NaCl浓度较高的溶液中，溶液的水势随着NaCl浓度的增加而逐渐降低，同时细胞内的自由水会从细胞内的高水势流向细胞外的低水势，从而造成细胞脱水，在此情况下，通常利用“相容性溶质”来维持菌体细胞内可以维持细胞内的低水势[17]，进而保护菌体细胞内的渗透压平衡，而甘氨酸甜菜碱、肉碱、胆碱等就属于相容性溶质，所以在NaCl环境下，与转运相容性溶质相关蛋白质的ABC转运蛋白质的表达上调了。
本文利用iTRAQ技术比较分析了筛选自东北传统农家大酱的植物乳杆菌FS5-5在0%、6.0%、7.0%和8.0% (W/V)的盐浓度下，生长至对数期中期的蛋白质表达差异情况，在本项研究中，随着盐浓度的不断提高，与供能相关的糖代谢、应激蛋白质、以及与相容性溶质转运相关的蛋白质表达上调；而与生长相关的核苷酸代谢以及脂肪酸代谢等相关的蛋白质表达下调。
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