马春草, 周雪娟, 谢福莉, 李友国
农业微生物学国家重点实验室, 华中农业大学, 湖北 武汉 430070
收稿日期：2016-05-06；修回日期：2016-06-08；网络出版日期：2016-07-01
基金项目：国家自然科学基金（31371549，31460056）
*通信作者：李友国, Tel:+86-27-87281685;Fax:+86-27-87280670;E-mail:youguoli@mail.hzau.edu.cn
摘要： [目的]研究hfq基因在Mesorhizobium huakuii 7653R抵抗外界不利环境和共生固氮中的功能特性。[方法]利用pK19mob同源重组方法构建7653R hfq基因的插入失活突变株7653RΔhfq，并构建互补菌株7653RΔhfq-C，对hfq在压力胁迫和共生固氮中的功能特性进行研究。[结果]与野生型7653R相比，突变株7653RΔhfq的生长速率降低，热激处理后致死率升高；hfq突变影响了7653R中部分sRNA的表达；在4.5%乙醇和50 mmol H2O2生长胁迫下，突变株适应性明显较野生型差。另外，接种突变株的紫云英结瘤能力和固氮酶活性都明显降低。[结论]hfq基因作为重要的转录后调控因子，在7653R抵御外界胁迫环境和与宿主紫云英的共生固氮中发挥了重要作用。
关键词： 华癸中慢生根瘤菌7653R hfq基因 共生固氮 sRNA 胁迫应答
Mutant construction and characterization of hfq in Mesorhizobium huakuii 7653R
Chuncao Ma, Xuejuan Zhou, Fuli Xie, Youguo Li
State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei Province, China
Received 06 May 2016; Revised 08 June 2016; Published online 01 July 2016
*Corresponding author: Youguo Li, Tel:+86-27-87281685;Fax:+86-27-87280670;E-mail:youguoli@mail.hzau.edu.cn
Supported by the National Natural Science Foundation of China (31371549, 31460056)
Abstract: [Objective]We studied the functions and characteristics of hfq gene in Mesorhizobium huakuii 7653R in adverse environment and symbiotic with its host plant.[Methods]The hfq mutant of 7653R was constructed via homologous recombination with small cloned fragments on suicide plasmids pK19mob to insert target gene.We applied 7653RΔhfq to characterize stress tolerance and symbiosis with host plant, in comparison with the complementary strains 7653R hfq-C and the wild type.[Results]Mutant 7653RΔhfq presented lower growth rate, and higher mortality after heat shock-pretreated than that of the wild type, as well as the decreasing adaptability under the stress of 4.5% ethanol and 50 mmol H2O2.The defection of hfq affected the expression of some sRNAs in 7653R.Moreover, the mutant displayed significant reduced nodulation ability and nitrogenase activity compared with the wild type.[Conclusion]As a crucial post transcriptional regulatory factor, Hfq plays an important role in Mesorhizobium Huakuii 7653R on both processes of stress resistance and symbiosis with the host plant Astragalus sinicus L.
Key words: Mesorhizobium huakuii 7653R hfq gene symbiotic nitrogen fixation sRNA stress response
非编码RNA (Non-coding RNA，ncRNA)是近年来研究细菌调控网络的热点，原核生物中sRNA通过与其调控目标mRNA的特定区域形成碱基对以实现调节的功能[1-3]。在大肠杆菌中，绝大多数的反式作用sRNA都需要Hfq (Host factor)蛋白才能够有效地发挥其功能[4]。Hfq蛋白是一个广泛存在且高度保守的RNA伴侣蛋白，结构与Sm蛋白类似，通过参与ncRNAs与其靶标mRNAs的互作过程，从而影响mRNAs的稳定性，进而发挥其调控作用[5]。大量研究表明，不同细菌中Hfq的功能不尽相同，会影响细菌对压力应答及细胞内环境适应能力，因此hfq突变株会形成细菌复杂表型。如在大肠杆菌中，hfq突变株生长速度变慢，对温度、氧化条件、渗透压及紫外线敏感性增强[6]。在布鲁氏菌，李斯特菌，沙门氏菌中突变株的毒性均降低[7-9]。在苜蓿中华根瘤菌中，hfq突变株会影响与苜蓿的共生固氮功能并影响碳代谢途径[10]。更有研究表明Hfq能参与RpoS的调控从而影响细菌抗压能力和毒力；Hfq也能影响细菌的密度感应系统(quorum sensing，QS)进而形成多效的复杂表型[11-13]。
华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)是属于α-变形菌纲的革兰氏阴性杆菌，能专一识别宿主紫云英并进行共生固氮。在与植物构建共生固氮网络的过程中，根瘤菌需要形成不同的应答机制来感受外界环境信号的变化，从而形成良好的共生固氮关系[14]。本研究通过同源重组方法构建了Mesorhizobium huakuii 7653R hfq插入失活突变株，并对突变株的生长特性和对共生固氮的影响作了研究。
1 材料和方法 1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 华癸中慢生根瘤菌7653R (Mesorhizobium huakuii 7653R)、大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α、大肠杆菌S17-1、自杀质粒pK19mob (kan)均由本实验室保存；PMD19-T购自TaKaRa公司。
1.1.2 植物材料 紫云英：Astragalus sinicus L.为本实验室保存。
1.1.3 主要试剂和仪器 DNA回收试剂盒购自上海华舜公司；限制性核酸内切酶Fermentas公司产品；Taq DNA聚合酶、Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA分子标准量marker均购自东胜科技公司；氨苄青霉素、卡那霉素、新霉素均为Duchefa公司产品；PCR仪为Bio-Rad生产，摇床、离心机购自Thermo，Step one Real-time PCR system购自ABI。
1.1.4 引物 表 1为本研究中所用引物，根据GenBank登录的基因序列用Primer 5.0软件设计，引物由南京金斯瑞公司合成。 表 1. 目的基因引物序列 Table 1. Primers sequences of target genes
| Primers | Sequences (5′→3′) | Restriction site |
| hfq-F | CGGGATCCAATTCAGTTCGCAAGAGCAA | BamHⅠ |
| hfq-R | CGGAATTCTGGAAATGGCGTGCTTGT | EcoRⅠ |
| hfq-F′ | ATAACCGCACAGGTGGAATG | |
| hfq-R′ | CAGCCGTATGGACAGGGTC | |
| hfq-pbbr-F | GCTCTAGATAACTCGAGCTGAACGAGGAGGAGAACAATGGCGGAACGAT | |
| hfq-pbbr-R | GGACTAGTTCAGGCGCCCTGGCTTTCCTCG | |
| M13-F | GAGCGGATAACAATTTCACACAGG | XhoⅠ |
| M13-R | CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC | SpeⅠ |
| MCHK-R0020-F | GCAAGTTCACCGTGGGTTCG | |
| MCHK-R0020-R | TTGTTGCGCTGGTGGAATGC | |
| MCHK-R0023-F | TTAGGACACCGCCCTTTCAC | |
| MCHK-R0023-R | GGGGAGGTCGCCAAGTGTTT | |
| MCHK-R0036-F | AGCCCGGTAGCTCGTCAGG | |
| MCHK-R0036-R | CGGACGGCTGATGAGGGTT |
表选项
1.2 hfq突变株及互补菌株的构建
1.2.1 重组质粒构建 以7653R菌株基因组DNA为模板，用hfq-F和hfq-R引物扩增同源交换臂。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经DNA回收试剂盒纯化回收后连接载体pMD19-T并转化DH5α，PCR验证后将阳性克隆送金斯瑞公司测序。抽提测序正确阳性克隆质粒和载体pK19mob质粒，以BamH I和EcoR I分别双酶切阳性克隆及载体pK19mob，纯化回收后用T4连接酶进行酶连，并转化S17-1。PCR验证阳性克隆并将测序正确的阳性克隆命名为hfq-pK19mob。
1.2.2 7653RΔhfq突变株的筛选 以7653R为受体菌株，以hfq-pk19mob为供体菌株进行两亲本接合转移，在含有Str和Neo的AMS抗性平板上筛选突变株。引物hfq-F′和hfq-R′是7653R基因组上hfq基因上下游引物，M13F和M13R是载体pk19mob上引物，用M13引物与hfq上下游引物匹配验正确的菌株7653RΔhfq。
1.2.3 互补菌株7653RΔhfq-C的构建及筛选 为了确定7653RΔhfq与紫云英共生表型是由hfq基因突变引起的，本研究构建了功能互补菌株，以观察其表型能否恢复。以M. huakuii 7653R总DNA为模板，以带有核糖体结合位点及酶切位点的引物hfq-pbbr-F和hfq-pbbr-R进行PCR扩增得到hfq的开放阅读框，经酶切回收后与同样双酶切的载体pBBRMCS-5酶连，构建组成型转化载体pBBR-hfq，测序正确后进行两亲本接合转移导入突变株7653RΔhfq中，在含有Str、Neo和Gm的AMS抗性平板上筛选。 1.3 7653RΔhfq共生表型鉴定
1.3.1 植株表型分析 挑取颗粒饱满紫云英种子进行表面灭菌后平铺于素琼脂平板，22 ℃培养箱倒置培养2 d后种植到灭菌沙子中，约5 d后分别接菌7653R、7653RΔhfq和7653RΔhfq-C，以不接菌作为空白对照进行盆栽实验。光照培养箱中培养28 d后收集植株，观察植株长势并测定植株地上部分鲜重、瘤数和瘤重。
1.3.2 固氮酶活测定 根瘤中的固氮酶可将乙炔还原为乙烯，因此我们一般使用乙炔还原法来衡量其固氮酶活性。将接菌植物根部放于PA瓶中，用橡皮塞密封。用注射器吸取PA瓶中2 mL空气，并注入2 mL乙炔。放于28 ℃培养箱中反应2 h。用微量吸样器吸取PA瓶中100 μL反应后的气体，用气象色谱仪测定乙烯吸峰值。在相同条件下测定其标准乙烯绘制标准曲线，并计算样品的固氮酶活。 固氮酶活的表示公式： 固氮酶活=C2H2 μmol/[瘤鲜重(g)×反应时间(hr)] C2H2 μmol=C2H2体积(μL)×(1/22.4)×[273/(273+toc)]× P/760 公式中：toc，气体温度；P，气压，毫米汞柱。 1.4 7653R和7653RΔhfq自生及共生条件下部分sRNA表达量测定 Hfq能与sRNA茎环结构中富含AU的区域结合，根据本实验室对自生及共生固氮期对sRNA进行的高通量深度测序结果分析，表达丰度较高，大小合适，对其二级结构进行分析，可能与Hfq互作的3条sRNA，MCHK-R0020、MCHK-R0023和MCHK-R0036，设计荧光定量引物。抽提自生条件下7653R和7653RΔhfq的总RNA及接种7653R和7653RΔhfq 28 d后紫云英的根瘤RNA，并反转录为cDNA，以得到的cDNA为模板进行RT-PCR。按照SYBR Green Realtime PCR Master Mix (TOYOBO)说明书配制Real-time PCR反应体系。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40个循环。
1.5 生长曲线测定 为观测hfq突变对自生状态下7653R菌株生长状态是否有影响，进行了OD600曲线测定。分别将7653R、7653RΔhfq和7653RΔhfq-C活化后的菌体以1:100接种量接种于新鲜TY培养基，于28 ℃、200 r/min振荡培养，每隔4 h取样测定OD600值。
1.6 7653R和7653RΔhfq抗胁迫能力测定
1.6.1 hfq基因突变对热应激的影响 挑取7653R及7653RΔhfq单菌落接种到新鲜TY培养基中，28 ℃摇床振荡培养2 d后以1:100接种量接种于TY培养基，培养至对数后期时取1 mL菌液42 ℃处理30 min，分别对未处理组和处理组进行细菌计数，重复3次。
1.6.2 hfq基因突变对乙醇和H2O2耐受性实验 挑取7653R及7653RΔhfq单菌落接种到新鲜TY培养基中，28 ℃摇床振荡培养2 d后以1:100接种量接种于正常TY培养基及含4.5%乙醇、50 mmol H2O2的TY培养基中，恒温摇床180 r/min条件下振荡培养。每隔4 h用酶标仪检测其OD600值，并绘制生长曲线，观察hfq基因缺失对7653R在乙醇及氧化胁迫下耐受性影响。 2 结果和分析 2.1 重组菌株构建
2.1.1 重组质粒构建 以7653R总基因组DNA为模板，扩增大小为156 bp的同源片段，电泳结果显示大小与预期相符(图 1)；测序正确克隆经BamH I和EcoR I双酶切与同样双酶切载体pK19mob酶连后转化E. coli S17-1，抽提质粒酶切验证，得到大小156 bp和3793 bp的片段，电泳显示大小正确(图 2)。
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| 图 1. PCR扩增同源臂 Figure 1. Homologous arms amplified by PCR. M: marker 1; 1: homologous arm products. |
| 图选项 |
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| 图 2. 重组质粒酶切验证 Figure 2. Recombinant plasmid enzyme digestion. M: 1 kb DNA ladder; 1: homologous arm products; 2: pK19mob by double enzyme digestion; 3: recombinant plasmid identified by double enzyme digestion. |
| 图选项 |
2.1.2 突变株的鉴定 重组质粒导入7653R后通过同源重组引起hfq基因的插入失活，菌落PCR鉴定转化结果，突变体在390 bp处扩增出相应条带，而野生型7653R并未出现相应条带，证明载体同源重组整合到7653R基因组中，得到hfq基因插入失活突变株(图 3)。
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| 图 3. hfq突变体验证 Figure 3. Identify of hfq mutunt. CK: 7653R wild type; M: marker 1; 1-7: PCR amplication with M13F and hfq-F′. |
| 图选项 |
2.2 互补菌株构建及筛选 以7653R总基因组DNA为模板，扩增包括酶切位点在内的hfq完整的开放阅读框282 bp，与酶切后的载体pBBRMCS-5酶连构建互补载体pBBR-hfq，以测序正确的载体pBBR-hfq为供体质粒，以7653RΔhfq为供体菌进行两亲本接合转移，经过抗性筛选并进行菌落PCR验证(图 4)。构建成功的互补菌株中有插入突变后可扩增得到的390 bp的片段，也有完整的hfq基因，证明互补菌株7653RΔhfq-C构建成功。
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| 图 4. 互补菌株菌落PCR鉴定 Figure 4. Identification of the complementation strain by conlony PCR. 1-4: PCR amplication with hfq-pbbr-F and hfq-pbbr-R; M: DL2000; 5-8: PCR amplication with M13F and hfq-F′. |
| 图选项 |
2.3 hfq突变株对共生作用的影响 收集接菌28 d后紫云英进行共生表型观察及测定，由地上部分表型可看出接种7653R的紫云英植株，长势正常、叶片绿色，而接种7653RΔhfq的紫云英植株长势矮小、叶片发黄，表现出明显的缺氮表型，接种互补菌株7653RΔhfq-C的紫云英植株长势也恢复正常(图 5-A)。由植株地下部分可以看出接种7653R的植株根系发达，根瘤数量多且为粉色椭圆形根瘤，而突变株根瘤为白色圆形根瘤，互补菌株根瘤也为粉色，对照植株不结瘤(图 5-B)。
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| 图 5. 供试菌株在紫云英上的结瘤情况 Figure 5. Nodules induced by strains tested on Astragalus sinicus L.. A: from left to right are plants inoculated with 7653R, 7653RΔhfq-C, 7653RΔhfq and CK; B: from left to right are the roots of plants inoculated with 7653R 7653RΔhfq-C, 7653RΔhfq and CK. |
| 图选项 |
定量检测结果表明：突变株的紫云英植株地上部分鲜重下降、根瘤数量和根瘤鲜重都减少，用乙炔还原法测定根瘤固氮酶活性与接种野生型7653R的对照组相比固氮酶活显著降低，互补菌株的各项指标都回复到野生型水平，证明互补菌株可以回复突变株的固氮功能(表 2)。以上结果表明hfq在7653R与紫云英共生固氮过程中发挥重要作用。
表 2. M. huakuii hfq基因突变株共生表型 Table 2. Symbiotic phenotype of M. huakuii hfq mutant
| Strains | Fresh weight of plant (g/plant) | Number of nodule (/plant) | Fresh weight of nodule (g/plant) | Nitrogen fixation activity[μmol/(g·h)] |
| M. huakuii 7653R | 0.532a±0.090 | 30.33a±6.30 | 0.047a±0.021 | 9.50a±2.56 |
| 7653RΔhfq | 0.227b±0.016 | 17.60b±4.10 | 0.013b±0.001 | 4.92b±0.98 |
| 7653RΔhfq-C | 0.495a±0.057 | 26.70a±5.30 | 0.047a±0.005 | 8.10a±1.56 |
| CK | 0.120b±0.002 | 0 | 0 | 0 |
| *: The date is average of three replicate. a, b, c values in each column followed by the same letter are not significance difference (P < 0.05). | ||||
表选项
2.4 7653R和7653RΔhfq中部分sRNA表达量变化 以M. huakuii 7653R编码RNase P的rnpB基因为内部参照基因进行RT-PCR，结果显示在自生条件下7653RΔhfq中3个sRNA的表达量均降低(图 6)，而在共生条件下hfq突变后MCHK-R0023和MCHK-R0036的表达量降低，MCHK-R0020的表达量与野生型基本相同(图 7)。大部分sRNA行使功能都需要Hfq的参与，利用RNAfold软件在线分析这3条sRNA，形成的茎环结构中含有富含AU的序列，符合与Hfq互作的RNA结构模式，hfq的突变在一定程度上影响了这些sRNA的表达，表明hfq可能通过调控这些sRNA与靶基因的作用从而影响7653R与植物正常固氮关系的建立。
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| 图 6. 自生条件下RT-PCR Figure 6. RT-PCR under free living. |
| 图选项 |
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| 图 7. 共生条件下RT-PCR Figure 7. RT-PCR under the symbiotic condition. |
| 图选项 |
2.5 生长曲线测定 将7653R野生型、7653RΔhfq和7653RΔhfq-C在TY培养基中扩大培养，每隔4 h取样测定OD600吸光度绘制生长曲线。由图 8结果可知在自然生长条件下，与野生型相比，7653RΔhfq的生长速率变慢，而互补菌株的生长速度回复到野生型的状态，说明hfq基因突变影响了7653R的正常生长。
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| 图 8. 7653R、7653RΔhfq和7653RΔhfq-C生长曲线 Figure 8. Growth characteristics of 7653R, 7653RΔhfq and 7653RΔhfq-C. |
| 图选项 |
2.6 不同胁迫环境中处理结果
2.6.1 hfq基因突变对热应激影响的实验结果 7653R正常在28 ℃生长，本实验探索了42 ℃处理时7653R与7653RΔhfq细菌存活数的差异。图 9中的实验结果显示42 ℃处理30 min后，野生型存活率比突变株高3倍左右，表明hfq对7653R的热应激有正调控作用。
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| 图 9. 7653R和7653RΔhfq热应激实验结果 Figure 9. Heat stress tolerance of 7653R and 7653RΔhfq. |
| 图选项 |
2.6.2 突变株耐受乙醇和H2O2的实验结果 将7653R及7653RΔhfq在含4.5%乙醇以及50 mmol H2O2的TY培养基中培养，每隔4 h检测其600 nm处OD值并绘制生长曲线。图 10和图 11结果显示hfq突变株生长速率较野生型明显降低，表明hfq基因参与了7653R对4.5%乙醇以及50 mmol H2O2的适应过程，对7653R的压力应答及氧化应激过程有正调控作用。
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| 图 10. 7653R和7653RΔhfq耐受乙醇实验结果 Figure 10. Ethanol stress tolerance of 7653R and 7653RΔhfq. |
| 图选项 |
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| 图 11. 7653R和7653RΔhfq耐受H2O2实验结果 Figure 11. H2O2 stress tolerance of 7653R and 7653RΔhfq. |
| 图选项 |
3 讨论 Hfq是广泛存在于细菌中的一种重要的转录后调节因子，其主要生物学功能是通过与RNA结合影响其稳定性或通过辅助sRNA与mRNA的结合来调节靶基因的表达[14]。已有研究表明，细菌中有大量靶基因受Hfq调控，如苜蓿根瘤菌hfq突变失活后蛋白质组分析显示大量与压力应答，蛋白转运等相关的基因表达发生变化[15]。本研究通过同源重组方法成功构建了华癸根瘤菌7653R hfq突变株，并通过一系列实验对hfq在共生固氮和根瘤菌抵御外界胁迫环境中发挥的作用进行了研究。
Hfq蛋白在根瘤菌中的研究近几年多有报道，Drepper等[16]研究了荚膜红细菌Rhodobacter capsulatus中与E. coli Hfq蛋白高度相似的NrfA，表明NrfA能通过编码其他固氮基因的转录激活因子在转录水平上调控nifA1，nifA2和anfA这些监管因子的表达；Lise Barra-Bily等[17]研究表明苜蓿根瘤菌中hfq的突变会影响固氮基因nifA和nfeB的表达引起缺氮表型。在Sinorhizobium meliloti中，hfq的突变主要影响了根瘤菌的入侵，大部分根瘤出现的侵入线形成异常，不能进行正常的延伸和类菌体分化，因此结瘤为没有固氮活性的白色圆形根瘤[17-19]。本研究中通过hfq突变株的共生表型分析可以看出其在共生固氮中有重要作用。突变株结瘤多为白色无效根瘤，固氮能力较野生型大大降低，植株长势偏弱，推测可能是影响了根瘤菌的定殖和侵入线的形成，从而影响了共生结瘤过程，进而不能建立正常的共生固氮关系。
Hfq是一个同源六聚体蛋白，其Sm结构域近端(proximal side)结合富含尿嘧啶(U-rich)的单链RNA，而富含腺嘌呤(A-rich)的单链RNA结合在远端(distal side)[5, 20]。3条sRNA的荧光定量PCR结果显示，在自生状态下表达量均降低，而共生时MCHK-R0023和MCHK-R0036表达量降低，hfq突变后会直接影响这些sRNA与靶基因互作，间接影响固氮过程中的碳代谢、细胞运输、脂质运输等一系列固氮相关过程，进而影响共生关系建立，但Hfq与这些sRNA的相互作用及这些sRNA的作用还需进一步实验验证。
根瘤菌与豆科植物的共生固氮过程是由大量蛋白参与的复杂调控过程，而Hfq作为重要的全局调控因子，基因突变会产生复杂表型，细菌的生长及对外界环境的适应性都会发生变化[20]。本研究结果显示，hfq突变株的生长速度变慢，热激处理时突变株的生存率较野生型降低。在4.5%乙醇以及50 mmol H2O2的胁迫处理中，野生型和突变株的生长速度均降低，但突变株的耐受性明显比野生型低，证明Hfq蛋白在7653R抵御外界不利因素中发挥重要作用。
本研究为进一步研究Hfq蛋白在共生固氮中的调控功能奠定了基础，但具体是如何影响7653R与宿主的共生固氮关系建立还需要进一步研究证明。
参考文献
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