苹果树腐烂病菌非核糖体多肽合成酶基因VmNRPS12的功能
马晨琛, 李正鹏, 戴青青, 韩青梅, 黄丽丽
西北农林科技大学植物保护学院, 旱区作物逆境生物学国家重点实验室, 陕西 杨凌 712100

收稿日期：2015-10-28；修回日期：2015-12-05；网络出版日期：2015-12-21
基金项目：公益性行业(农业)科研专项(201203034)；国家自然科学基金(31171796)；Ⅲ计划(B07049)

_*通信作者：韩青梅, Tel: +86-29-87080251, E-mail: hanqm@nwsuaf.edu.cn
黄丽丽, Tel: +86-29-87091312, E-mail:huanglili@nwsuaf.edu.cn


摘要： [目的]非核糖体多肽合成酶(NRPS)在植物病原真菌与其寄主互作过程中发挥着重要作用，明确VmNRPS12基因在苹果树腐烂病菌致病过程中的功能，将为今后深入研究苹果树腐烂病菌NRPS作用机制提供理论依据。[方法]基于苹果树腐烂病菌全基因组数据，得到VmNRPS12基因。运用qRT-PCR技术分析VmNRPS12在侵染初期的表达水平，利用Double-joint PCR和PEG介导的原生质体转化获得该基因抗潮霉素的突变体，对突变体进行PCR检测及Southern blot验证得到敲除突变体，进一步通过重新导入该基因全长片段获得互补突变体，最后对野生型、敲除突变体和互补突变体进行菌落、产孢及致病力观察，对检测数据用SPSS软件进行差异显著性分析。[结果]定量分析显示该基因在侵染初期显著上调表达，且接种48 h后的表达量是对照的138.6倍。该基因的敲除突变体在营养生长及产孢方面与野生型菌株03-8相比无显著性差异，但致病力与野生型菌株03-8相比显著减弱，且互补突变体致病力近似恢复至野生型水平。[结论]VmNRPS12基因与苹果树腐烂病菌致病性相关。
关键词： Valsa mali 非核糖体多肽合成酶 基因敲除 互补
Function of nonribosomal peptide synthetase gene VmNRPS12 of Valsa mali
Chenchen Ma, Zhengpeng Li, Qingqing Dai, Qingmei Han, Lili Huang
State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, College of Plant Protection, Northwest A & F University, Yangling 712100, Shaanxi Province, China

Received 28 October 2015; Revised 05 December 2015; Published online 21 December 2015
_*Corresponding author: Qingmei Han, Tel: +86-29-87080251, E-mail: hanqm@nwsuaf.edu.cn
Lili Huang, Tel: +86-29-87091312, E-mail: huanglili@nwsuaf.edu.cn
Supported by the Special Fund for Agro-Scientific Research in the Public Interest of China (201203034), by the National Natural Science Foundation of China (31171796) and by the "ⅢProject"(B07049)

Abstract: [Objective]Nonribosomal peptide synthetase (NRPS) plays an important role in plant-pathogenic fungi interaction. In this study, we analyzed the role of VmNRPS12 during Valsa mali (V. mali) infection and pathogenecity, which may shed new insights into the pathogenesis of V. mali.[Methods]Based on the genome of V. mali, we obtained one NPRS, designated as VmNRPS12. The expression profile of VmNRPS12 was analyzed by qRT-PCR. Through Double-joint PCR and PEG-mediated protoplast transformation, VmNRPS12-knockout mutants were generated. PCR and Southern blot hybridization were applied to verify the positive mutant. Then genetic complementation was performed by transforming mutant protoplast with VmNRPS12 original gene. Finally, vegetative growth, conidiation and pathogenicity were examined.[Results]qRT-PCR analyses showed that VmNRPS12 was up-regulated during the early infection stages of V. mali, and expressed remarkably at 48 hours post inoculation (138.6-fold). Compared with the wild type 03-8, VmNRPS12-knockout mutant showed no obvious change in vegetative growth and conidiation on PDA medium. Notably, the VmNRPS12-knockout mutant exhibited significantly reduced virulence on apple twigs. Furthermore, complementation of VmNRPS12 restored the pathogenecity of the VmNRPS12-knockout mutant approximately to the wild type 03-8.[Conclusion]VmNRPS12 contributes positively to the pathogenicity of V. mali.
Key words: Valsa mali non-ribosomal peptide synthetase gene knockout complementation
苹果树腐烂病是由子囊菌苹果黑腐皮壳Valsa mali(V.mali)引起的一种真菌病害，于1903年首次在日本发现，1916年在我国辽宁省南部地区首次发现^[1]。发病时病斑部位隆起，呈水渍状，有酒糟味，后期病部干瘪、塌陷，造成树皮溃烂、树干枯死，甚至毁园，给我国苹果产业的发展带来了严重威胁。由于该病害发生普遍且危害严重，国内外很多****对苹果树腐烂病的病原学^[2]、病菌的侵染致病过程^[3]、病害发生流行规律^[4]以及防治技术^[5]等方面进行了研究，尤其是Yin等^[6] 2015年公布的苹果树腐烂病基因组数据及相关分析，为该病菌侵染致病机理的研究奠定了理论基础。然而，苹果树腐烂病菌侵染致病导致树皮溃烂的因子仍有待进一步深入研究。
非核糖体多肽合成酶(NRPS)是一类多功能酶，其可以整合短肽而不需要核糖体的参与^[7]。在许多真菌中如植物病原真菌旋孢腔菌(Cochliobolus)，镰刀菌(Fusarium)，葡萄灰霉菌(Botrytis)，它们都有着丰富的NRPS基因^[8]。NRPS可合成多种次级代谢产物，并且一些真菌NRPS的产物在病原菌和植物互作中扮演着重要角色^[9]，如苹果斑点落叶病(Alternaria alternata)产生的AM-毒素和玉米圆斑病菌(Cochliobolus carbonum)产生的HC-毒素是致病性的决定因素^[10-11]。对玉米小斑病菌(Cochliobolus heterostrophus)进行全基因组分析，发现12个编码NRPS的基因，分别对它们进行基因敲除，发现NPS6与其致病性相关^[12]，进一步研究发现，它也是水稻胡麻斑病菌(Cochliobolus miyabeanus)和禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)的一个毒力决定基因^[9]。对柑橘褐斑病菌(Alternaria alternata)中的AaNPS6基因进行敲除，发现其突变体在PDA培养基上生长的菌落呈白色绒毛状，而野生型菌落则为黑色并且突变体存在产孢缺陷，致病性与野生型相比显著下降^[13]。这些研究表明NRPS在植物病原真菌致病过程中发挥着重要作用。
本研究基于苹果树腐烂病菌全基因组数据，分析得到1个基因，比对后发现其ORF区域存在NRPS结构域，命名为VmNRPS12，基于前人研究报道，推测该基因可能与苹果树腐烂病侵染致病相关。本研究运用qRT-PCR技术、Double-joint PCR和PEG介导的原生质体转化技术，初步探究该基因的功能，为深入研究NRPS在V.mali侵染致病中的作用机制奠定基础。
1 材料和方法 1.1 材料
1.1.1 菌种来源 苹果树腐烂病菌分离株03-8由西北农林科技大学植物病害综合治理实验室分离并保存。质粒pHIG2RHPH2-GFP-GUS(含有潮霉素磷酸转移酶基因hph，卡那抗性)，由浙江大学宋凤鸣教授惠赠。酵母菌株xk1-25(Trp营养缺陷型)，由西北农林科技大学许金荣教授惠赠。大肠杆菌菌株DH5α，由西北农林科技大学植物病害综合治理实验室保存。pFL₂质粒(含有Trp合成基因，G418抗性)，由西北农林科技大学许金荣教授惠赠。供试基因VmNRPS12由实验室全基因组数据分析获得。
1.1.2 主要试剂 HindⅢ(MBI)、XhoⅠ(TaKaRa)、Fastpfu(Transgene)、崩溃酶(Sigma)、溶壁酶(Sigma)、定量Mix(Genstar)、潮霉素(Roche)、G418(MP)、尼龙膜(GE)、地高辛DNA标记检测试剂盒(Roche)、酵母质粒提取试剂盒(OMEGA)及其他实验室常规化学药品和试剂，引物合成委托上海生工生物工程股份有限公司。
1.1.3 致病性测定材料 苹果枝条采自隔离温室培养的富士(Malus domestica Borkh.cv.Fuji)苹果树，选取粗细均匀的1-2年生枝条备用。 1.2 序列的获得及引物设计 基于实验室基因组序列得到目的基因序列，用Premier 5.0软件分别设计定量引物RT-F/RT-R，上游引物1F/2R，下游引物3F/4R，巢氏引物CF/CR，检测引物5F/6R、7F/8R及互补引物HB-F/HB-R。其中引物2R和3F的5′端带有同hph两端同源的序列(斜体序列)，引物HB-F/HB-R的5′端有同pFL₂XhoⅠ酶切位点两端同源的序列(斜体序列)。引物序列及其相关参数见表 1。
表 1. 本试验所用引物 Table 1. Primers used in this study

Primers	Sequence (5′→3′)
RT-F	CATTCCCGACCATCGCTTAT
RT-R	AGGCCTTGTATCCAGCTTTC
1F	CCTACTGGCTTTCCATCACA
2R	TTGACCTCCACTAGCTCCAGCCA AGCCTCAAGGTCGGTGTCGAATAG
3F	GAATAGAGTAGATGCCGACCGCGGGT TAAGCCATACCACTGGATTTACC
4R	AGCCTTCGTCTCCTTCACAA
5F	GAAAGCTGGATACAAGGTCAG
6R	CTCGGTAGAGCCAATAAGGT
7F	AACCTTGCCATCCTCTTG
8R	CTGGAATCGGATGTGAACGG
CF	AACCTTGCCATCCTCTTG
CR	ATGTTGGCGACCTCGTATTGG
HPH-F	TTCCTCCCTTTATTTCAGATTCAA
HPH-R	GCTGATCTGACCAGTTGC
H850	ATGTTGGCGACCTCGTATTGG
H852	TTCCTCCCTTTATTTCAGATTCAA
H855R	GCTGATCTGACCAGTTGC
H856F	GTCGATGCGACGCAATCGT
HB-F	CGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTAC TCAAATTGGAGACCGTAGGTAACACAGGG
HB-R	GTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACC GGGGTGGTGATGACGCCACTGCGC

表选项






1.3 RNA的提取及定量分析 将活化好的野生型03-8菌株菌饼接种于健康的离体富士枝条上，根据需要取0、6、12、24、36、48 h 6个时间点的病健交界处组织，按照华越洋核酸提取试剂盒操作说明进行RNA的提取并进行第一链cDNA的合成，反转录引物采用Oligod(T)₁₈，内参基因为G6PDH^[14]。
1.4 敲除载体的构建 以苹果树腐烂病菌野生型菌株03-8的基因组DNA为模板，分别以引物1F/2R和3F/4R扩增出目的基因的上下游片段，以质粒pHIG2RHPH2-GFP-GUS作为模板用引物HPH-F/R扩增得到hph片段，胶回收PCR产物，参照Yu^[15]的方法构建敲除载体。
1.5 PCR产物的浓缩 将300μL PCR产物(Double-joint第三轮产物)转移至1.5 mL离心管中，加入300μL TE，60μL NaAc及660μL异丙醇，4℃静置30 min。之后在低温冷冻离心机中4℃、12000 r/min离心30 min，去上清，用70%乙醇及无水乙醇洗涤干燥后加50μL TE在4℃冰箱保存备用。
1.6 原生质体的制备及转化 将野生型03-8接种在铺玻璃纸的PDA平板上，2 d后用牙签刮取幼嫩菌丝置于YEPD培养基(Yeast Extract 3 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L)中，25℃、100 r/min摇培24 h。转化方法参考宋娜等^[16]。
1.7 基因组DNA的提取及突变体的检测
1.7.1 CTAB法提取基因组DNA 将在PDA平板上活化的菌饼装到有100 mL PD培养基的三角瓶中，25℃、120 r/min摇培48 h，用灭菌纱布过滤收集菌丝并置于液氮中冷冻干燥，在灭菌研钵中研磨菌丝，提取方法参照吴发红等^[17]。
1.7.2 突变体的PCR及Southern blot检测 将提取的突变体DNA，用4对引物5F/6R、H856F/8R、7F/H855R、H852/H850进行检测(引物见表 1)。根据基因组序列信息，使用HindⅢ酶切转化子和野生型03-8基因组DNA各20μg，于8 g/L的琼脂糖凝胶20 V电泳过夜，毛吸法将DNA转移至尼龙膜上，预杂交、杂交、洗膜、封阻、免疫反应和显色操作方法参考地高辛DNA标记检测试剂盒(Roche)说明书。 1.8 突变体表型观察及致病力分析 将活化好的突变体和野生型03-8菌株菌饼(直径Φ=7 mm)分别接到含有15 mL PDA培养基的培养皿(直径Φ=9 cm)中心位置，25℃黑暗下倒置培养3 d，观察菌落颜色、形状、气生菌丝生长情况。分别于培养后1、2、3 d测定菌落生长直径，计算菌落生长速率。7 d后转移至25℃光暗交替条件下(光照∶黑暗=12 h/d∶12 h/d)继续培养，观察繁殖体产生情况。每个菌株设置3个重复，试验重复3次。致病性鉴定参照臧睿^[18]的方法，每个菌株接种9根枝条，并设置野生型对照及无菌PDA块(CK)，试验重复3次，数据用SPSS软件进行差异性分析(P=0.05)。
1.9 突变体的遗传互补 用互补引物扩增插入片段(启动子上游约1500 bp且不含终止密码子)，胶回收PCR产物，酵母转化转入XhoⅠ酶切后的pFL₂载体中。对长出的单克隆进行PCR检测，正确后挑取单克隆摇菌并按照酵母质粒提取试剂盒(OMEGA)说明书进行酵母质粒的提取。提取的质粒热转入大肠杆菌中，转化子用引物5F/6R进行PCR检测，筛选出阳性克隆摇菌提取质粒，按照PEG介导的原生质体转化法转入到敲除突变体中，方法如1.6，其中抗生素换为G418。得到的互补突变体进行DNA提取，用引物5F/6R检测正确后，检测其差异表型是否近似恢复至野生型水平。
2 结果和分析 2.1 基因序列分析 基于苹果树腐烂病菌全基因组序列分析得到1个候选基因VmNRPS12(基因编号为VM1G_04745)，该基因的ORF全长3180 bp，编码1060个氨基酸，与nr数据库进行序列比对发现其与编码NRPS的基因序列的最小相似度为66.25%，其中与Diaporthe ampelina中编码NRPS的基因相似度达97%(登录号：KKY30833.1)，并含有A、PCP及SDR 3个结构域^[6]。
2.2 VmNRPS12基因的实时定量PCR分析 运用qRT-PCR技术分析VmNRPS12基因在苹果树腐烂病菌侵染和致病过程不同时段中的表达水平(0、6、12、24、36、48 h)，结果显示(图 1)VmNRPS12在腐烂病菌接种6 h至48 h过程中普遍上调表达，分别为0 h对照的3.7、1.9、20.7、75.8和138.6倍，说明在苹果树腐烂病菌侵染寄主的过程中，该基因是受寄主诱导表达的。

图 1. 不同侵染时期VmNRPS12基因表达水平的实时荧光定量PCR分析 Figure 1. Real-time RT-PCR analysis of VmNRPS12 expression at different infection stages. The asterisk indicates a significant difference from 0 h by more than two folds.

图选项

2.3 敲除载体的构建 以野生型菌株03-8的DNA为模板，分别以1F/2R，3F/4R为引物扩增出VmNRPS12的上下游片段。以质粒pHIG2RHPH2-GFP-GUS为模板，以HPH-F/HPH-R为引物扩增出hph片段。扩增片段大小分别为1717 bp、1887 bp和1379 bp(图 2-A、B)。

图 2. 构建敲除载体的PCR检测 Figure 2. PCR screening of the knockout vector. A: Amplification of upstream and downstream of VmNRPS12. lane F: target upstream, lane R: target downstream, M: DL2000 marker. B: Amplification of hph cassette; M: DL2000 marker. C–D: Construction of the knockout vector. lane 1: fusion fragment of double-joint PCR; lane 2: nested PCR fragment, M: DL5000.

图选项

利用Double-joint PCR对上游片段、下游片段和hph片段进行融合PCR，融合片段大小为4983 bp(图 2-C)。以Double-joint PCR第二步产物稀释10倍为模板，以CF/CR为引物进行巢式PCR反应，得到了大小为3963 bp的目的条带，说明敲除载体构建成功(图 2-D)。
2.4 PEG介导的原生质体转化及突变体的确定 经过PEG介导的原生质体转化，得到了能在含有潮霉素的PDA培养基上生长的突变体83个，用4对检测引物(表 1)对83个突变体进行PCR检测，琼脂糖凝胶电泳结果显示有1个突变体发生了同源重组，编号为ΔVmNRPS12-37(图 3-A)。以hph片段(750 bp)为探针，选择hph全长片段(1379 bp)中无酶切位点的限制性内切酶HindⅢ酶切野生型菌株03-8和ΔVmNRPS12-37基因组DNA，对其进行Southern blot验证。结果显示野生型菌株03-8基因组无杂交信号，而突变体ΔVmNRPS12-37基因组呈现单条杂交带，且条带大小正确(图 3-B)，说明敲除载体已与苹果树腐烂病菌基因组整合，且突变体为单拷贝插入，表明成功得到了目的基因单拷贝敲除突变体ΔVmNRPS12-37。

图 3. 突变体的验证 Figure 3. Detecting of the mutants. A–B: Applification of the deletion mutant using the four pairs of primers and Southern blot detection; C: PCR screening of the complementation mutants. lane 1–4: primer pairs. lane 1: 5F/6R (targeted gene), lane 2: H856F/8R (downstream region), lane 3: 7F/H855R (upstream region), lane 4: H850/H852 (hph cassette).

图选项

2.5 互补突变体的获得 利用PEG介导的原生质体转化，得到了能在含有G418的PDA培养基上生长的突变体108个，选取10个用引物5F/6R进行检测，得到了3个阳性互补突变体(图 3-C)。
2.6 突变体表型观察及致病性分析
2.6.1 突变体表型及生物学观察 基因缺失突变体ΔVmNRPS12-37在PDA平板上生长3 d后，与野生型03-8相比，颜色、菌落形态及生长速率均无显著性差异(图 4-A)。继续在光暗交替条件下培养15 d左右即见黑色繁殖体生成，30 d左右溢出黄色的分生孢子角。对成熟的繁殖体进行数据统计发现，ΔVmNRPS12-37与野生型03-8相比产孢量差异不显著(P=0.05)(图 4-B)，表明该基因并不是影响苹果树腐烂病菌营养生长及孢子产生的关键基因。

图 4. 野生型菌株03-8和突变体ΔVmNRPS12-37在PDA培养基上的菌落形态(A)及产孢情况(B) Figure 4. Colony morphology (A) and pycnidium formation (B) of the wild-type strain 03-8 and the mutantΔVmNRPS12-37 inoculate on PDA medium.

图选项

2.6.2 突变体的致病性分析 对25℃保湿培养7 d的枝条测量病斑直径，数据分析发现(P=0.05)，接种03-8菌株菌饼的枝条病斑平均直径为6.65 cm，接种ΔVmNRPS12-37菌株菌饼的枝条病斑平均直径为4.68 cm，接种互补菌株菌饼的枝条病斑平均直径为6.45 cm。接种突变体的枝条病斑直径显著小于接种野生型03-8的枝条病斑直径，敲除突变体致病力较野生型下降29.6%，并且互补突变体的病斑直径近似恢复到野生型水平(图 5)，表明该基因在苹果树腐烂病菌致病过程中的确发挥了作用。

图 5. 野生型菌株03-8及突变体ΔVmNRPS12-37的致病力测定及分析(7 d)(标尺=1 cm) Figure 5. Virulence experiments and analysis of the wild-type strains 03-8 and the mutants (vaccinated for 7 days) Bars=1 cm. The different lowercase letters indicate significant difference.

图选项

3 讨论 本研究首次对苹果树腐烂病菌中的NRPS12基因进行了探究，该基因在接种苹果树枝条48 h后的表达量达到对照的138.6倍，与野生型03-8相比，敲除突变体ΔVmNRPS12-37在PDA上的菌落形态、生长速率无显著性差异，而致病力下降29.6%，表明该基因与苹果树腐烂病菌的侵染致病相关。
有报道显示，在真菌致病中起作用的一些致病基因在侵染初期会表现出一定的上调表达^[19]，这与本实验qRT-PCR的结果相符(图 1)。在真菌中已证实部分NRPS可以影响致病力，如玉米小斑病菌NPS6基因的缺失可导致其对玉米致病力的减弱，同时，水稻胡麻斑病菌(Cochliobolus miyabeanus)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、拟南芥黑斑病菌(Alternaria brassicicola)NPS6基因的缺失分别导致他们对水稻、小麦和拟南芥致病力的下降^[9]。稻瘟病菌中的NRPS对于病原菌适应多种环境，干扰寄主代谢最终造成植物细胞死亡的过程中发挥作用^[18]，因此NRPS已成为探究致病性的候选因子，但其在苹果树腐烂病致病性中的影响还未见报道。本研究的结果表明了VmNRPS12基因的缺失的确会对病菌的致病力产生影响，导致其致病力的显著性下降(图 5)。另一方面NRPS参与合成多种次级代谢产物，并且一些NRPS的产物已经被证明是毒素类物质^[20-21]，如座囊菌植物病原菌NRPS合成的次级代谢产物寄主选择性毒素(HSTs)^[22]。毒素与病原菌的致病性相关，许多病原菌可产生毒素从而使植物发病^[22]，如来自曲霉属真菌的霉菌毒素、黄曲霉毒素、柄曲霉素和来自轮状镰刀霉菌的伏马菌素等^{[21, 23-25]}。
本研究初步探索了VmNRPS12基因的功能，为解析NRPS在苹果树腐烂病菌侵染致病过程中的作用奠定基础，但对于VmNRPS12基因具体合成哪类物质从而影响致病力仍不清楚，有待进一步的深入研究。


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