荆瑞勇1,2, 曹焜1,2, 刘俊杰1, 刘居东1, 金剑1, 刘晓冰1, 王光华1
1.中国科学院黑土区农业生态重点实验室, 中国科学院东北地理与农业生态研究所, 黑龙江 哈尔滨 150081;
2.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院, 黑龙江 大庆 163319
收稿日期：2016-05-21；修回日期：2016-07-04；网络出版日期：2016-09-07
基金项目：国家自然科学基金（41271262，31300425）；中国科学院“****”项目
*通信作者：王光华, Tel:+86-451-86602745;Fax:+86-451-86603736;E-mail:wanggh@iga.ac.cn
摘要： [目的]揭示东北稻田噬藻体psbA基因多样性，分析其系统进化地位，为噬藻体生态学研究提供数据支持。[方法]采用滤膜分离并浓缩噬体、PCR-克隆测序技术对我国东北稻田水体中噬藻体psbA基因进行调查。[结果]在东北稻田水体中共得到17条来自于噬藻体的psbA基因，经系统进化分析表明，我国东北稻田具有新的噬藻体的类群，与日本稻田生态系统中psbA基因类群相比，两地间噬藻体类群存在显著的差异，稻田水体中噬藻体psbA基因类群有别于海洋、湖泊类群。[结论]采用PCR-克隆测序技术以psbA基因为分子标记首次对我国东北稻田水体噬藻体类群进行调查，发现有新的噬藻体类群。
关键词： 噬藻体 psbA基因 稻田水体
Genetic diversity of psbA of cyanophage from paddy floodwater in northeast China
Jing Ruiyong1,2, Cao Kun1,2, Liu Junjie1, Liu Judong1, Jin Jian1, Liu Xiaobing1, Wang Guanghua1
1.Key Laboratory of Mollisols Agroecology, Northeast Institue of Geography and Agroecology, Chinese Academy of Science, Harbin 150081, Heilongjiang Province, China;
2.College of Life Science and Technology, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, Heilongjiang Province, China
Received 21 May 2016; Revised 04 July 2016; Published online 07 September 2016
*Corresponding author: Guanghua Wang, Tel:+86-451-86602745;Fax:+86-451-86603736;E-mail:wanggh@iga.ac.cn
Supported by the National Natural Science Foundation of China (41271262, 31300425) and by the Hundred-talents Project of Chinese Academy of Science
Abstract: [Objective]To provide scientific data for studying the ecology of cyanophage, we studied the genetic diversity of psbA of cyanophage from paddy floodwater in northeast China and its phylogenetic positions.[Methods]Membrane separation and concentration of cyanophage, PCR-cloning-sequencing were applied to study the diversity of psbA of cyanophage from paddy floodwater in northeast China.[Results]In total 17 psbA sequences of cyanophage were obtained.Novel cyanophages were found by phylogenetic analysis.Compared to those of Japanese paddy floodwater, marine and lakes, psbA gene assemblage of paddy floodwater in northeast China was significantly different.[Conclusion]This is the first report to study genetic diversity of cyanophage from paddy floodwater in northeast China with a molecular marker of psbA by PCR-cloning-sequencing.The novel psbA assembly of cyanophage was found in paddy floodwater in northeast China.
Key words: cyanophage psbA gene paddy floodwater
噬藻体是侵染蓝藻的细菌病毒，广泛分布于地球生物圈的生命体[1]。细菌病毒作为遗传物质的交换载体[2]，在病毒侵染过程中引起原核生物的遗传变异，影响着原核生物的群落结构[3]，在水体食物网结构与功能起关键作用[4]，被认为是生态功能和物种进化的驱动力[5-6]。
psbA是编码光合系统Ⅱ反应中心蛋白D1亚基的基因，可作为水体中光合微生物类群很好的分子标记[7]。很多噬藻体中也含有psbA基因[8-9]。研究发现在供试的33株噬藻体中，psbA基因只在肌尾病毒和原绿球藻短尾病毒中发现，而原绿球藻长尾病毒和聚球藻短尾病毒未发现psbA基因，可能与噬藻体的宿主范围及噬藻体间水平或垂直基因转移有关[10]。在自然海洋水体宏基因组数据显示，海洋表层水中约60%的psbA基因来源于噬藻体源[11]。噬藻体含有psbA基因是使病毒在侵染宿主过程中保护宿主的光合营养功能，免受光抑制，为病毒在宿主体内复制提供能量的适应性表现[12-14]，psbA基因通过在噬藻体介导下于聚球藻和原绿球藻间穿梭，达到噬藻体和蓝藻的共进化[15]。
稻田是一类典型的人工湿地环境，蓝藻是生态环境中主要的成员，参与水体的碳氮物质循环。psbA基因作为分子标记在湖泊、海洋生态系统中研究较多[16-17]，而在稻田生态系统的分布鲜有报道。王光华等[18]曾首次利用psbA基因对日本稻田生态系统中噬藻体多样性进行研究，发现与海洋水体相比，稻田水体中的psbA基因序列更接近于淡水水体。本研究主要目的主要探索中国东北稻田水体中psbA基因多样性的组成，同时比较中国东北稻田水体与日本稻田水体psbA基因多样性的差别。为此，本文采用PCR-克隆测序的方法对东北不同类型稻田水体中psbA基因多样性进行调查，为病毒资源的调查提供数据支持。
1 材料和方法 1.1 稻田水样的采集 本试验于2013年7月14日至7月18日在中国东北3种不同类型稻田采集稻田水体。这是3块稻田包括黑龙江省建三江(47°14' N，132°33' E)、阎家岗(45°35' N，126°20' E)、吉林省大安(45°36' N，123°50' E)。水稻插秧于2013年5月20日至6月10日期间，其他与当地农艺措施相同。稻田水体采集及稻田水样预处理的方法同参考文献[19]。
1.2 DNA提取及PCR扩增 水样中的病毒DNA提取方法见参考文献[19]，但在用DNA酶和RNA酶(各40 μg/mL，宝泰克) 37 ℃处理时5 h改为7 h。psbA基因由引物psbA-F (5'-GTNGAYATHGAYGGNATHMGNGAR CC-3')和psbA-R (5'-GGRAARTTRTGNGCRTTNC KYTCRTGC-3')进行PCR扩增[7]。PCR扩增体系为50 μL，其中包含0.5 μL上游和下游引物(50 pmol)，1-2 μL DNA模板，5 μL dNTPs (2.5 mmol/L TaKaRa，大连)，5 μL rTaq缓冲液(TaKaRa，大连)，1 μL rTaq酶合酶(5 U/μL，TaKaRa，大连)，加入无菌去离子水至要求的体积。阴性对照无菌ddH2O为模板。PCR扩增条件为94 ℃ 5 min；92 ℃ 1 min，57 ℃ 1 min，68 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。
1.3 克隆与测序 从1.5%凝胶上切取约850 bp大小的PCR产物，用QIAquick胶回收试剂盒进行胶纯化，目的DNA片段连接至pMD18-T质粒(TaKaRa，大连)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。大约每个转化平板中选出50个白色克隆，再用psbA-F/psbA-R引物进行菌体PCR扩增，循环数降至26。选阳性克隆的培养过夜菌液，递交测序公司(华大基因，深圳)测序。
1.4 系统进化分析 克隆的核苷酸序列采用欧洲生物信息研究所网站(http://www.ebi.ac.uk/) EMBOSS Transeq程序翻译成推导的氨基酸序列。psbA阳性克隆最近的亲缘序列经NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上在氨基酸水平BLAST比对获得。本文获得的psbA基因序列亲缘关系分析，首先与日本稻田土壤和水体中获得的噬藻体源的psbA序列分析，然后再与已发表的的分离噬藻体psbA基因序列和环境克隆序列，以及非噬藻体的psbA基因序列进行分析。为了评估中国东北稻田水体中psbA集合体与日本稻田水体psbA集合体是否相同，采用UniFrac (http://bmf.colorado.edu/unifrac/)分析方法进行不加权(Unweighted) P值检测。
1.5 提交序列 本研究的序列已提交至NCBI网站，其序列号为：KX443367-KX443383。
2 结果和分析 2.1 稻田水体病毒DNA提取、PCR扩增、胶回收及克隆筛选 稻田水体过0.22 μm的滤膜后，将病毒收集到0.03 μm滤膜上，提取DNA (图 1-A)后，PCR扩增psbA基因于850 bp位置有明显亮带(图 1-B)，经胶回收获取850 bp目的基因(图 1-C)，每个样品的克隆筛选阳性克隆的位置也在850 bp的位置(图 1-D)，将阳性克隆送测序公司测序，获得17条不同的psbA基因，其中12、4、1个阳性克隆分别来自于阎家岗、大安和建三江稻田水体。扩增出的psbA基因长度是相同的，均为795 bp (不含引物部分长度)，可翻译成264个氨基酸残基。
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| 图 1. 东北稻田水样中病毒DNA提取(A)、psbA基因的PCR扩增(B)、胶纯化(C)及阳性克隆克隆检测(D) Figure 1. Profiles of viral DNA extraction, PCR amplification, gel purification and positive clone of psbA gene from cyanophage in paddy floodwater in Northeast China. MK, +, CK, YJG, JSJ, SH, DA indicate DNA marker, positive clone, control, Yanjiagang (阎家岗), Jiansanjiang (建三江), and Daan (大安) samples, respectively. |
| 图选项 |
2.2 psbA基因的最近亲缘序列分析 如表 1所示，在NCBI网站上，基于氨基酸水平的BLAST比对结果显示，本研究中获得的13条psbA基因与日本稻田克隆具有最高的相似性，相似率在94%-99%之间；有3条psbA基因与罗德岛海岸水体中噬藻体S-SIM17具有最高的相似性，相似率在97%-99%之间；仅有1个克隆与中国东海的psbA克隆PN04-004具有最高的相似性(96%)。本研究中也获得了一些非噬藻体源的psbA基因序列，但经BLAST比对后，这些序列已被剔除，未进行分析。
表 1. 东北稻田水体psbA基因与NCBI数据库在氨基酸水平的同源性比较 Table 1. Closest relatives of sequenced psbA clones from different paddy floodwater at the amino acid level
| Clone name | Closest relative | Accession No. | Identities/% | Alignmen | Remark |
| PFW-YJG-1 | NoF10 | BAH23190 | 99 | 261/264 | Wang et al., 2009 |
| PFW-YJG-2 | S-RIM17 | ACY42497 | 98 | 258/263 | Marston and Amrich, 2009 |
| PFW-YJG-3 | CF (-N)1 | BAH23191 | 98 | 247/251 | Wang et al., 2009 |
| PFW-YJG-4 | NoF9 | BAH23189 | 99 | 261/264 | Wang et al., 2009 |
| PFW-YJG-5 | CF (-N)1 | BAH23191 | 98 | 259/264 | Wang et al., 2009 |
| PFW-YJG-6 | S-RIM17 | ACY42497 | 99 | 260/263 | Marston and Amrich, 2009 |
| PFW-YJG-7 | CF (-N)1 | BAH23191 | 98 | 260/264 | Wang et al., 2009 |
| PFW-YJG-8 | NoF10 | BAH23190 | 98 | 260/264 | Wang et al., 2009 |
| PFW-YJG-9 | CM10 | BAH23217 | 97 | 257/264 | Wang et al., 2009 |
| PFW-YJG-10 | S-RIM17 | ACY42497 | 97 | 256/263 | Marston and Amrich, 2009 |
| PFW-YJG-11 | CM10 | BAH23217 | 97 | 256/264 | Wang et al., 2009 |
| PFW-YJG-12 | NoF10 | BAH23190 | 99 | 261/264 | Wang et al., 2009 |
| PFW-DA-1 | PN04-004 | AGL79394 | 96 | 254/264 | Zheng et al., 2014 |
| PFW-DA-2 | CF (-N)8 | BAH23198 | 97 | 253/262 | Wang et al., 2009 |
| PFW-DA-3 | NoF10 | BAH23190 | 99 | 263/264 | Wang et al., 2009 |
| PFW-DA-4 | NoF10 | BAH23190 | 98 | 258/264 | Wang et al., 2009 |
| PFW-JSJ-1 | CM6 | BAH23213 | 94 | 247/263 | Wang et al., 2009 |
| YJG: Yanjiagang (阎家岗); JSJ: Jiansanjiang (建三江); DA: Daan (大安). | |||||
表选项
2.3 psbA基因的系统进化分析 图 2为本研究获得的17条psbA基因序列与从日本稻田水体中获得的噬藻体源27条psbA基因序列在氨基酸水平上构建的系统进化树。可将其划分为5个进化簇(ClusterⅠ-Cluster Ⅴ)，本研究获得的psbA序列分布在ClusterⅠ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ中，分别含有6、2、5和3条psbA序列。Sharon等[11]利用psbA基因序列的GC含量及其氨基酸序列可变的三肽元件来区分psbA基因是否来自于噬藻体，他们认为EQE、ENE、EEV、EEE、EDV、EVE、EQV和EDE等几种病毒来更易来自于病毒D1亚基。Sullivan等[10]发现，聚球藻噬藻体的GC含量为46%-51%，而聚球藻宿主GC含量在56%-62%。
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| 图 2. 中国东北稻田水体psbA序列与日本稻田水体psbA序列在氨基酸水平的系统进化树 Figure 2. Neighbor-joining phylogenetic tree showing the relationships of psbA amino acid sequence from paddy floodwater in NE China with those from in Japan. |
| 图选项 |
在Cluster Ⅰ-Cluster Ⅴ进化簇中，psbA基因序列的GC含量和三肽元件(XXX)R/KETTXXXSQ/H不同[11]。ClusterⅠ中GC含量为45.8%-52.0% (x=48.7±1.8%)，主要含三肽元件是EEV (PFW-YJG-12为EKV)；ClusterⅡ中GC含量为47.2%-52.2% (x=51.1±1.4%)，主要含有三肽元件是ESE (CF1和CM9分别为EVE和EAE)；Cluster Ⅲ中GC含量为47.6%-47.7%(x=47.7±0.1%)，它包含序列中三肽元件是ETE；Cluster Ⅳ中GC含量为45.2%-49.7% (x=47.5±1.7%)，它包含序列中三肽元件主要是EVE和ENE (PFW-DA-1的三肽元件是ETE)；Cluster Ⅴ中GC含量为46.9%-49.3% (x=48.3±1.1%)，它包含序列中三肽元件是EEV。与Cluster Ⅴ相近的有1条psbA序列PFW-JSJ-1它的三肽元件是ETE，其GC含量为48.9%。三肽元件ETE在聚球藻菌株中也存在，但聚球藻的肌尾病毒和短尾病毒也有ETE，结合该序列的系统进化位置，作者推测PFW-DA-1、PFW-YJG-9、PFW-YJG-11和PFWJSJ-1的psbA基因来自于噬藻体。此外，本研究中克隆PFW-YJG-12的三肽元件为EKV，经GC含量及系统进化地位分析(图 2和图 3)，推测其来自于噬藻体。因此，本研究获得的17条psbA基因均来自于噬藻体。
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| 图 3. 我国东北稻田水体与日本稻田水体、及其他环境psbA序列构建的系统进化树 Figure 3. Neighbor-joining phylogenetic tree showing the relationship of psbA amino acid sequence from paddy floodwater in NE China and Japan and those from other environments. The blank triangle, gray box, black box and blank box indicate the psbA sequences of cyanophage from this study, paddy floodwater in Japan, marine and lake, respectively. |
| 图选项 |
将本研究获得的psbA序列与具代表性的绿藻、蓝藻、噬藻体病毒株及环境中的噬藻体的psbA序列在氨基酸水平上构建系统进化树(图 3)。据系统进化树结构可将其划分为8个进化簇(Cluster A-Cluster H)。本研究获得的17条psbA序列主要分布在Cluster A、B、E中。Cluster C主要来自聚球藻的噬藻体类群；Cluster D和F主要来自于海洋的噬藻体分离株和克隆；Cluster G和H包含有来自蓝藻、绿藻、海洋聚球藻(Synechococcus)、原绿球藻(Prochlorococcus)及其噬藻体分离株的psbA序列。
Cluster A包含有来自于海洋、湖泊和稻田水体中psbA克隆，其中，大部分稻田水体psbA克隆与来自湖泊的克隆进化距离更相近些，而来自海洋水体的psbA的克隆形成一个相对独立的进化簇，在这个进化簇中，中国东北稻田与日本稻田水体中psbA基因可形成一个进化亚簇，王光华等[18]命名为PFW-2；Cluster B主要由来自稻田水体中的克隆和淡水湖泊中psbA克隆组成，其中2个来自淡水湖泊中进化亚簇，命名为FW1和FW2[16]，1个来自日本稻田水体的进化亚簇，王光华等[18]命名为PFW1；Cluster E中的克隆均来自稻田生态系统，其中本研究11条序列和日本稻田水体中17条序列分布在此进化簇中。在此进化簇中，由PFW-YJG-9、PFW-YJG-11和PFW-DA-3、PFW-DA-4形成2个进化亚簇主要来自中国东北稻田水体，日本稻田水体中也有特有的进化亚簇，此进化簇中两地域间的其他序列交叉分布。
采用不加权UniFrac分析表明，由本研究获得的17条psbA克隆序列集合体与日本稻田27条噬藻体源的psbA基因序列集合体差异显著(P < 0.01)。表明两国之间稻田含有psbA基因的噬藻体群落不同。
3 讨论 本研究采用psbA基因的引物是简并性的，具有不同核苷酸序列的psbA片段在DGGE图谱中可能具有相同的位置，所以依据DGGE图谱对多个样品psbA基因多样性的比较是不可行的[18]。因此本研究采用PCR扩增后，对目的条带进行胶纯化，用纯化后的产物进行克隆测序的方法来调查我国东北稻田水体中噬藻体psbA基因多样性。
本研究发现，某些环境样品中psbA基因PCR扩增的目的条带有的并不是很亮，推测原因可能是：(1)?由于采集的水样中病毒含相对较少，而且采集的稻田水样为自然灌溉的地下水，稻田每隔1 d需要灌溉1次，对稻田水体中病毒浓度起到稀释作用；(2)?采集的水样量较小(500 mL)，扩大稻田水样的量，增加稻田病毒浓缩的倍数，可能会改善PCR扩增psbA基因的相对浓度。
环境样品中psbA基因如何与他们的宿主基因进行区别是最迷惑的问题。Chénard和Suttle[16]提出3种方法进行区分环境样品中病毒psbA基因。(1)?样品通过0.2 μm滤膜去除宿主细胞，且病毒浓缩物在进行psbA扩增前用DNAse去除游离的DNA；(2)?基于噬藻体和他们宿主的平均GC含量进行区分(聚球藻噬藻体的GC含量由46%-51%，而聚球藻宿主GC含量在56%-62%[11]；(3)?在D1蛋白内三肽元件(motif)的分布(R/KETTXXXSQ/H)[16]。本研究也采用Chénard和Suttle[11]的处理分析方法，但是通过DNase对溶解态的DNA消化不彻底，即使是用DNase和RNase在37 ℃水浴消化5.5 h，仍然存在着蓝藻源的psbA基因，或提高酶浓度可延长酶解时间，相应的条件应进一步优化。在日本稻田获得的DNA样品中也被细菌和真核生物源的psbA基因的污染，在获得的46条序列中，26条psbA序列认为是噬藻体源[18]。稻田水体中蓝藻和病毒也存在着时间上的差异[20]，而本研究仅调查东北稻田与日本稻田地域间的噬藻体群落的差异，而未考虑时间上的变化，也未调查东北稻田与日本稻田蓝藻多样性的差异，有待深入研究探讨宿主与病毒间的互作关系。目前psbA基因仅在肌尾病毒和短尾病毒中存在，而在长尾病毒中未发现[16]，因此，采用多个分子标记来调查环境中病毒基因多样性更加精确[17]。
综上所述，我们首次以psbA基因作为分子标记，采用PCR-克隆测序技术对东北稻田水体噬藻体类群进行调查，发现东北稻田水体中存在着新的psbA基因类群，东北稻田水体噬藻体psbA基因群集组成与日本稻田水体不同，这与我们以前以编码肌尾病毒衣壳组装蛋白的g20基因作为分子标记研究结果一致[19]。稻田水体中噬藻体psbA基因、病毒基因组成明显与海洋、湖泊的生态类群不同。
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