刘佳1, 朱涛1, 王鹏飞2, 孔令新1, 王松梅1, 刘运添2, 谢昌贤2, 邓子新1, 由德林1,2
1.上海交通大学生命科学技术学院, 微生物代谢国家重点实验室, 上海 200240;
2.金河生物科技股份有限公司, 内蒙古 呼和浩特 010200
收稿日期：2015-12-14；修回日期：2016-01-13；网络出版日期：2016-01-20
基金项目：国家自然科学基金(31470183，31400029)；国家“973计划”(2012CB721004)
*通信作者：由德林,Tel:+86-21-62932943;E-mail:dlyou@sjtu.edu.cn
摘要： [目的]研究金霉素产生菌中SARP家族转录调控基因ctcB的作用。[方法]利用大肠杆菌、链霉菌的属间接合转移和同源重组双交换的方法，构建ctcB基因缺失突变株。通过cDNA在相邻同转录方向的基因间隔进行PCR验证，确定金霉素生物合成基因簇中的转录单元。利用荧光定量RT-PCR方法进行突变株金霉素生物合成基因簇的转录水平检测。随后，生物信息学预测分析了金霉素生物合成基因簇内CtcB与DNA的结合位点。[结果]获得了ctcB基因缺失的双交换突变株。发酵结果显示，该突变株失去产生金霉素与四环素的能力。金霉素生物合成基因簇内有6个共转录单元，其中4个共转录单元在ctcB基因缺失突变株中转录水平明显下降。软件分析预测到一致性较高的CtcB结合重复序列。[结论]ctcB正调控金霉素生物合成结构基因ctcG-D、ctcH-K、ctcN-P、ctcW-T 4个转录单元和ctcQ，为进一步研究ctcB调控机制奠定了基础。
关键词： 金霉素 SARP家族转录调控基因 基因敲除 生物合成
Function of Streptomyces antibiotic regulatory proteins family transcriptional regulator ctcB in the biosynthetic cluster of chlortetracycline
Jia Liu1, Tao Zhu1, Pengfei Wang2, Lingxin Kong1, Songmei Wang1, Yuntian Liu2, Changxian Xie2, Zixin Deng1, Delin You1,2
1.State Key Laboratory of Microbial Metabolism, School of Life Sciences & Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China;
2.Jinhe Biotechnology Co., Ltd., Hohhot 010200, Inner Mongolia Autonomous Region, China
Received 14 December 2015; Revised 13 January 2016; Published online 20 January 2016
*Corresponding author: Delin You,Tel:+86-21-62932943;E-mail:dlyou@sjtu.edu.cn
Support by the National Natural Science Foundation of China (31470183, 31400029) and by the Key Project of China National Programs for Fundamental Research and Development (2012CB721004)
Abstract: [Objective]In order to understand the regulatory mechanisms of chlortetracycline biosynthesis in an industrial strain, function of an Streptomyces antibiotic regulatory proteins (SARP) family transcriptional regulator ctcB in the biosynthetic gene cluster of chlortetracycline was studied.[Methods]By double crossover recombination, we constructed Streptomyces aureofaciens F3 with disrupted SARP family transcriptional regulator ctcB gene. The amplicons of RT-PCR were designed to cover the adjacent genes for verification of the operons in chlortetracycline biosynthetic cluster. Transcriptional level was analyzed in the chlortetracycline biosynthetic gene cluster in the wild type strain and the ctcB gene disrupted mutant LJIA02 by quantitative real-time RT-PCR.[Results]The disruption mutant LJIA02 abolished tetracycline and chlortetracycline production. In RT-PCR six operons were confirmed in chlortetracycline biosynthetic cluster. Quantitative real-time RT-PCR indicated that ctcB directly activated five promoters from ctcG-D, ctcH-K, ctcN-P, ctcW-T and ctcQ.[Conclusion]CtcB is an essential activator as an SARP family transcriptional regulator in the chlortetracycline biosynthetic gene cluster.
Key words: chlortetracycline Streptomyces antibiotic regulatory proteins (SARP) family transcriptional regulator gene disruption biosynthesis
金霉素(Chlortetracycline,CTC)作为第1个被发现的四环素家族成员，于1948年由Duggar从土壤微生物金黄色链霉菌(Streptomyces aureofacines)中分离得到[1]。金霉素同四环素(Tetracycline,TC)、土霉素属第一代四环素类抗生素，它们是由微生物发酵产生天然产物，而第二、三代四环素类抗生素如强力霉素和替加环素属半合成类四环素[2-3]。金霉素属于广谱抗生素，通过与细菌核糖体30S亚基的氨酰-tRNA特异性结合，阻止肽链的延伸，抑制细菌蛋白质的合成，从而发挥抗菌作用[4]，金霉素对多种革兰氏阳性和阴性致病菌有明显抑菌活性，对立克次氏体、支原体、衣原体和阿米巴原虫亦有作用。由于金霉素在临床和畜牧水产业的广泛应用[5]，因此，从50年代就开展了金霉素产生菌随机诱变[6-7]、同位素喂养[8]等生物合成方面的研究，1995年Dairi通过抗性筛选与回补突变株方法确定了含氯代酶基因的片段序列[9]。2013年上海交通大学以氯代酶基因序列为探针，从高产金霉素的金黄色链霉菌工业菌株F3中，成功地克隆了完整的金霉素生物合成基因簇，揭示了金霉素是由II型聚酮合酶合成并经多酶催化形成的生物合成途径[10]。生物信息分析发现，金霉素生物合成基因中ctcA、ctcB和ctcS分别与大器环素生物合成基因簇内dacT3、dacT1[11]和土霉素生物合成基因簇内oxyTA1[12]同源，然而它们在金霉素生物合成中可能的调控作用目前尚不清楚。本研究在前期金霉素生物合成研究的基础上，利用体内基因置换，获得了敲除金霉素生物合成基因簇内SARP家族调控基因ctcB的菌株，通过确认生物合成基因簇内转录单元，并测试其结构基因转录水平，研究该基因的调控作用，为解析金霉素生物合成机制奠定了基础。
1 材料和方法 1.1 实验材料
1.1.1 菌株与质粒 本实验使用的金霉素产生菌金黄色链霉菌Streptomyces aureofaciens F3 [10]、大肠杆菌DH10b、ET12567/pUZ8002和质粒pIJ778、fosmid 11D1均由上海交通大学微生物代谢国家重点实验室保藏。调控基因ctcB缺失的双交换突变株LJIA-2为本研究构建。
1.1.2 主要试剂和仪器 PCR反应使用TaKaRa Taq试剂盒，1 kb Plus DNA ladder购自Invitrogen公司，RNA提取所用Total RNA Isolation Kit购自北京赛百盛基因技术有限公司，限制性内切酶EcoR I、Hind III、反转录PCR反应所用RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit和荧光实时定量(q-Real-time)PCR反应所用MaximaTM SYBR Green/ROX qPCR Maxter Mix(2×)均购自Fermentas公司。四环素、金霉素标准品购自上海生工生物工程有限公司。OM培养基(燕麦34 g/L，MgSO4 0.05 mg/L，KH2PO4 0.1 mg/L，(NH4)2HPO4 0.15 mg/L，琼脂粉16 g/L) 用于产生孢子(30 ℃，7 d)以及接合转移。金霉素发酵培养基[玉米淀粉80 g/L，黄豆饼粉40 g/L，Difco酵母提取物1 g/L，Difco胰蛋白胨14 g/L，玉米浆8 g/L，碳酸钙7 g/L；(NH4)2SO4 3.5 g/L，NaCl 2.5 g/L，MgSO4 0.25 g/L，大豆油15 mL/L]用于液体发酵。q-Real-time PCR使用Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System，高效液相色谱(HPLC)使用Agilent 1200 Series，液质联用[LC-MS(n)]分析使用Agilent 1100 series LC/MSD Trap System，色谱柱均采用Agilent TC C18反向柱(5.0 μm，4.6 mm×250 mm)。 1.2 ctcB基因敲除突变株的构建 提取质粒pIJ778，用限制性内切酶EcoR I和Hind III进行酶切，琼脂糖凝胶电泳回收1425 bp片段(包含壮观霉素抗性基因aadA以及接合转移使用的oriT)。以此片段为模板，设计1对引物targB-F(5′-ATTCTGGGTCCGCTGGAAGTCCTCG ACAAGGGAATTCCGATTCCGGGGATCCGTC GACC-3′)和targB-R(5′-CCGCGCGGCAAGC GCCTGGAACTCCTGCCGAGTGGGCGATGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′)，PCR扩增得到带有壮观霉素抗性基因的DNA片段，通过与携带金霉素生物合成基因的文库质粒fosmid 11D1双交换，得到敲除质粒pLJIA02，然后通过接合转移筛选得到ctcB双交换突变株LJIA02。在中断基因的两侧设计引物对突变株进行验证，确定相应基因被壮观霉素抗性基因替换，由此实现中断ctcB的目的。对于突变株LJIA02，ctcB内部684 bp在双交换后被1365 bp的oriT-aadA替代，因此以1对验证引物targBC-F(5′-GGACGGGCCTCA GGCCGAAC-3′)和targBC-R(5′-CTGGGGCCG AGGGAAATCCGAGCG-3′)进行PCR时，野生型条带为857 bp，而双交换突变株应为1538 bp (图 1-A，1-B)。
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| 图 1. ctcB基因敲除突变株的构建(A，B)和发酵产物的LC-MS检测(C，D) Figure 1. Construction and LC-MS analysis of the ctcB disruption mutant LJIA02. A: construction of the ctcB disruption mutant LJIA02. The 0.68 kb region in chromosome was replaced by 1.39 kb aadA gene. B: PCR confirmation of the ctcB disruption mutant LJIA02. M, 1 kb DNA ladder; lane 1-3, double crossover recombinant; lane 4, wild-type strain. C: HPLC analysis of the fermentation extracts of ΔctcB, wild type (Streptomyces aureofaciens F3), standard. D: validation of tetracycline and chlortetracycline from the fermentation extracts by mass spectrum analysis. |
| 图选项 |
1.3 链霉菌发酵、发酵产物的HPLC与LC-MS检测 以TSBY培养基[13]为种子培养基，将野生型菌株和突变株LJIA02接种并于30 ℃摇床培养24 h。将其转接至发酵培养基中，于30 ℃摇床培养5 d。发酵液用固体草酸酸化使pH值到1.2-1.4，然后在5000 r/min条件下离心10 min，收集的上清用0.22 μm滤膜过滤得提取液。利用高效液相色谱(HPLC)对发酵提取液进行检测，流动相A相为0.02 mol/L草酸和0.01 mol/L三乙基胺，B相为乙腈。检测程序如下：0-40 min，B相20%等度洗脱。流速：0.6 mL/min；检测波长：360 nm；柱温：25 ℃。
液质[LC-MS(n)]分析是在正离子模式下进行，喷雾器压力为30 Psi，干燥气流为10 L/min，干燥气温为325 ℃，分子量扫描范围为200至700，多级质谱断裂分析轰击电压在1.0-1.5 V之间。流动相A相为0.01 mol/L甲酸，B相为乙腈。检测程序如下：0-30 min，B相20%等度洗脱；20-50 min，B相20%-40%梯度洗脱。流速：0.3 mL/min；检测波长：360 nm，柱温：25 ℃。
1.4 链霉菌总RNA的提取与反转录PCR 将野生型菌株和突变株LJIA02的等量孢子接种于TSBY培养基并于30 ℃摇床培养24 h。选取等量菌丝体，将其转接至发酵培养基中，于30 ℃摇床培养48 h。使用Total RNA Isolation Kit进行RNA提取，再用DNase I消化残留的基因组DNA，并通过PCR验证其无残留，并用Nanodrop定量且参考OD260/OD280分析RNA质量。随后进行PCR反转录，加入模板RNA 10 ng，随机六聚体引物1 μL，加入DEPC处理的水至12 μL，充分混匀后，置于PCR仪上65 ℃反应5 min，立即置于冰浴上。随后加入1 μL RNase抑制剂，4 μL 5×Buffer，2 μL 10 mmol/L dNTPs混合物，1 μL逆转录酶，充分混匀后进行PCR，程序设置为25 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，72 ℃ 5 min。
1.5 金霉素生物合成基因共转录单元的确认 在2个相邻同转录方向的基因间隔区域设计引物，即正向引物在上游基因终止密码子的上游200 bp内设计，反向引物在下游基因起始密码子起200 bp内设计引物。若2个基因同属一转录单元，则转录后位于同一mRNA上，可在RT-PCR反应中扩增到条带，反之则无。金霉素生物合成基因簇内部相邻同向基因存在序列交叉重叠，则判断为同一转录单元，无交叉重叠情况，设计10对引物进行PCR验证(表 1)。
表 1. 用于确定金霉素生物合成基因转录单元的PCR引物 Table 1. Primers used for RT-PCR of transcript assay of the chlortetracycline biosynthetic gene cluster
| Primers | Gene tested | Forward (5'→3') | Reverse (5'→3') |
| ctcFG-RT | ctcF-ctcG | CCCCAGCTCCTCGCGCTCGACGTG | GACCACCGAGGAGGACGTGCTCTC |
| ctcHI-RT | ctcH-ctcI | GGCCTGGTGCTCGCCAAGACCTAC | GCCTCCAGCGCGGCGTGGTCGAGC |
| ctcIJ-RT | ctcI-ctcJ | GCGGCGAGGGCGTCGACCCGGCCG | TCCCACTCGGCGGTCTCCACGTAC |
| ctcJK-RT | ctcJ-ctcK | GTACGTGGAGACCGCCGAGTGGGA | GGCCCGGGCCAGCTCGGCCGCGCC |
| ctcNO-RT | ctcN-ctcO | TCGCCGCTGGCCGCCTGGGCGGAC | AGCCGGTGCTGGACGCCCAGTTCG |
| ctcOP-RT | ctcO-ctcP | GCGACCCGGAGGTCCTGCTGCAGC | GAAGCGGGGGTGGTGGGCACCGTC |
| ctcQR-RT | ctcQ-ctcR | CAGGGGCGGGGCCTTGGAGACGCT | CCGACCCGGACGAGGCCGTGCGCC |
| ctcUV-RT | ctcU-ctcV | TGCCGCGCTCGCGCTCGATGGTGT | CGCGCTGCTCTCCCTGCGGGACGG |
| ctcZ1-RT | ctcZ-ctc1 | CAGGGCCAGCAGGGCGATCACCAG | TGCTCGGCGACCTGCTGATGGGGC |
| ctc12-RT | ctc1-ctc2 | CGACGGCGGTGAAGATGGCCTGCT | CGCGCTCTCGGTCGGCATCTCGCT |
表选项
1.6 金霉素生物合成基因转录水平检测 荧光相对定量Real-time PCR法，是指在不同样本中某目标基因相对于参照基因的数量变化。相对定量的具体计算方法是比较Ct值法，Ct值是每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。利用公式(1)计算出样品组目标基因相对变化量。
 | (1) |
表 2. 荧光定量PCR使用的引物 Table 2. Primers used for quantitative real-time PCR
| Primer | Forward (5'→3') | Reverse (5'→3') |
| ctcG-RT | ACGTCGCCCTGGTGACCGGGGCGA | GACCGTGCTCACGTCCTGCGCGGA |
| ctcH-RT | ACCACCGACGCAACGAGGAGGCCC | GGCGCCCTGCTCGATCGCCGCGCG |
| ctcM-RT | CCGCCTACCTGGCCTCGCAGCCGC | CACGATGTCGTCCACCACCAGTGA |
| ctcN-RT | CGGGAGCGGGGCCGACCGGCCTGA | GTTGCCGCCCTGCAGCACGCCCGC |
| ctcQ-RT | TGCCGCTGGACCTGGCCCCCGGCC | CAGCACCCGGCTGTCGCGGTTGAT |
| ctcW-RT | GCCGGCGCGTGGTGGTCACCGGGA | ACGGATCTGACGCTGCGTCAATCC |
| ctcX-RT | GCGTGGTCGGCGGCGGCCCGGCCG | GTCGTGCTCGACGGCGCCGTGCGC |
| hrdB-RT | CGCTCCCGCCGGAGATCGCCGATT | CGCGGCACTGACCATCAGTGTCAC |
表选项
2 结果和分析 2.1 ctcB基因敲除突变株的构建和发酵产物分析 对金霉素生物合成基因ctcB进行同源序列比对分析，发现它编码的蛋白与3个四环素类抗生素生物合成基因簇内的调控蛋白同源性较高，包括大器环素生物合成基因簇内的DacT1(57% identity)[11]、SF2575生物合成基因簇内的SsfT1(51% identity)[14]、土霉素生物合成基因簇内的OtcR (46% identity)[15]。序列分析表明，CtcB具有N端的OmpR类型DNA结合结构域和C端的BTAD细菌转录激活结构域[16]，属于链霉菌抗生素调控蛋白家族(Streptomyces antibiotic regulatory proteins，SARP)[17]。为了确认ctcB基因的功能，利用大肠杆菌、链霉菌的属间接合转移和同源重组双交换的方法，构建了ctcB基因敲除突变株LJIA02。将野生型和获得的突变株LJIA02，用金霉素发酵培养基进行发酵培养，30 ℃培养5 d后，发酵液酸化后用于HPLC与LC-MS分析。从HPLC检测结果(图 1-C)中可以看出，野生型11.7 min处的色谱峰与四环素(TC)标准品一致，22.5 min处的峰与金霉素(CTC)标准品一致，2个色谱峰的特征吸收光谱也与标准品一致。而突变株LJIA02在11.7 min和22.5 min处均无明显色谱峰。随后，通过LC-MS进一步检测了在11.7 min和22.5 min是否有痕量四环素和金霉素产生(图 1-D)，发现野生型菌株的发酵产物与标准品在这2个出峰位置具有一致的四环素(445.4 m/z [M+H]+)和金霉素(479.6 m/z [M+H]+)质谱峰，而突变株LJIA02没有检测到相同m/z值的一级质谱峰，对应同m/z值的二级质谱碎片峰也没有检测到。这些结果确定了ctcB基因缺失菌株失去了产生四环素与金霉素的能力，暗示ctcB基因对金霉素生物合成基因簇起正调控激活作用，为金霉素生物合成必需基因。
2.2 金霉素生物合成基因共转录单元的确认 为了确定ctcB基因对金霉素生物合成的调控作用，对其生物合成基因的共转录单元进行了确认。分析金霉素生物合成基因簇，发现基因转录方向一致且首尾相连的基因共有8组(即可能的共转录单元有8个)：包括ctcG-D、ctcH-K、ctcM-L、ctcN-P、ctcR-Q、ctcT-W、ctcX-Y 和ctc2-Z (图 2-A)。其中可能形成的基因间隔有16个，但发现因为相邻2个基因交叉重叠而并不存在的间隔区有6个，这6个假间隔区前后的2个基因应该属于同一转录单元。因此，为了判断前后基因是否属于同一转录单元，需要在跨相邻基因间隔区设计引物，对剩下的10个基因间隔区进行RT-PCR反应，属于不同转录单元的基因会转录到不同的RNA链上，则无法获得扩增产物。根据前期发酵实验，发现金色链霉菌在发酵48 h时生长良好且产生了金霉素，因此选取发酵48 h的菌体提取RNA，进行cDNA合成和PCR。根据实验电泳结果(图 2-B)显示的相邻基因的共转录关系，金霉素生物合成基因簇的共转录单元共有6个(图 2-A)，分别是ctcG-D，ctcH-K，ctcM-L，ctcN-P，ctcT-W，ctcX-Y。
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| 图 2. 金霉素生物合成基因簇(A)和相邻基因共转录分析(B) Figure 2. Organization of the gene cluster for chlortetracycline biosynthesis and verification of the operons in chlortetracycline biosynthetic gene cluster. A: organization of the gene cluster for chlortetracycline biosynthesis, in which mini-PKS genes (black) and resistence genes (gray) are highlighted. The vertical solid arrows show the intervals between the adjacent genes without overlap. The horizontal dashed arrows indicatethe different mRNAs transcribed by specific transcription units. B: PCR confirmation of the amplicons fragments (300-400 bp) on an ethidium bromide-dyed agarose gel. The amplicons were designed to covering of the adjacent genes. M, 1 kb DNA ladder; lane 1, ctcF-ctcG; lane 2, ctcH-ctcI; lane 3, ctcI-ctcJ; lane 4, ctcJ-ctcK; lane 5, ctcN-ctcO; lane 6, ctcO-ctcP; lane 7, ctcQ-ctcR; lane 8, ctcU-ctcV; lane 9, ctcZ-ctc1; lane 10, ctc1-ctc2. RT-PCR bands indicate that most genes are transcribed from the same mRNA. |
| 图选项 |
2.3 ctcB基因缺失突变株LJIA02和野生型菌株中金霉素生物合成基因转录水平检测 在确定共转录单元基础上，选取6个转录单元中的第一个基因，以及单独转录的ctcQ作为检测对象，共设计了7对引物，分别对野生型菌株和突变株LJIA02的ctcG、ctcH、ctcM、ctcN、ctcQ、ctcW和ctcX进行荧光定量RT-PCR。内参基因选择在不同样品中有稳定转录表达量的sigma因子hrdB[18]基因。根据△△Ct计算公式，在突变株LJIA02中目标基因按照系统算法测得的数值大于2.0或者低于0.5，即判断该基因的转录被显著的增强或者抑制。荧光定量RT-PCR结果显示(图 3)，突变株内不同功能的基因转录水平受到影响不同，发现对比野生型菌株，ctcG-D、ctcH-K、ctcQ、ctcN-P和ctcT-W的转录水平下降明显，除ctcH-K约为野生型菌株的20%外，其余均降低到野生型的10%以下，最低为野生型的2%。转录水平下降基因涵盖了ctcU-W 中合成碳链骨架的mini-PKS，ctcG中负责11位酮基还原为羟基的酮还原酶，ctcD/F/H 形成四环素核心结构的环化酶/芳香化酶，ctcO负责加载C4位氨基的双甲基的甲基转移酶等[10]，而ctcM-L 和ctcX-Y 的转录水平与野生型菌株相当。金霉素生物合成基因簇内的6个共转录单元中的4个转录水平大幅度下降，表明ctcB是金霉素生物合成的正调控基因。另外，这些金霉素生物合成基因转录水平的降低也与ctcB基因缺失突变株LJIA02丧失金霉素和四环素生物合成能力具有对应关系。
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| 图 3. 金霉素生物合成基因转录水平检测 Figure 3. Transcriptional analysis of the chlortetracycline biosynthetic gene cluster in wild type and mutants LJIA02by quantitative realtime RT-PCR. The measurements of ctcG, ctcH, ctcN, ctcQ, ctcW gave values lower than 1.0 indicating that the mutants produced less mRNA than in the wild-type strain. Error bars were calculated from three independent experiments each of which was performed in duplicate. |
| 图选项 |
3 讨论 本研究构建了ctcB基因缺失突变株LJIA02，发现其丧失了四环素和金霉素的产生能力，进一步通过荧光定量RT-PCR，确定了ctcB基因作为正调控基因，调控金霉素生物合成基因的转录。同源比对分析显示CtcB、DacT1、SsfT1和OtcR是SARP家族蛋白，系统进化树分析表明这4个SARP蛋白同属于一个小的分支(图 4)。SARP家族蛋白作为转录激活因子，大多存在于链霉菌中，直接调控次级代谢产物生物合成基因的转录[16]，只有少部分存在于Mycobacterium,Nocardia,Thermobifida,Lechevalieria等放线菌中。SARP家族蛋白的DNA结合区域一般具有明显的串联重复保守序列特征，该串联重复序列与-10区距离8个碱基保证与SARP结合后，-10区位于DNA上背向SARP的一侧，留出空间使RNA聚合酶与其形成稳定的四聚体复合物；重复序列间处在相距11个核苷酸的2个区域，在DNA上处于双螺旋大沟同侧，保证了2个SARP分子结合于DNA骨架的同侧，形成稳定的双体形态[19-20]。因此，我们考察了ctcB调控的ctcG-D、ctcH-K、ctcQ、ctcN-P和ctcT-W转录单元的DNA结合区域保守性。结果显示在图 5-A，转录单元ctcG-D、ctcQ、ctcN-P和ctcT-W具有同样保守的串联重复序列。MeMe[21]软件比对分析表明一致性较好，结合区域重复序列保守性较高(图 5-B)，这与SARP家族蛋白OtcR[15]和SanG[22]的DNA结合区域串联重复保守序列具有类似的特征。ctcG-D、ctcQ、ctcN-P和ctcT-W基因前具有保守的串联重复序列，CtcB与之结合激活这些基因的转录，这与ctcB基因缺失突变株中荧光定量RT-PCR的实验结果是相吻合的。然而ctcH-K前并未找到该保守序列，而是在推测的-10区前距离8个碱基的位置上有序列GAACCCGGGGGGACAGG，可能正是该序列与保守序列之间的差异，使CtcB与之结合作用减弱，从而导致ctcH-K转录水平下降不如ctcG-D、ctcQ、ctcN-P和ctcT-W明显。以上DNA结合序列保守性分析，进一步证实了ctcB是金霉素生物合成的正调控基因。为解析金霉素生物合成的调控机制，并通过加倍该基因提高金霉素的产量提供了理论基础。
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| 图 4. CtcB与SARP同源蛋白系统进化树分析 Figure 4. Phylogenetic analysis of CtcB with other members of SARPs. The neighbor-joining phylogenetic tree was constructed by using MEGA v5.0 with 500 bootstrap replicates. The scale 0.2 is the genetic distance. Accession number in NCBI: CtcB, AEI98645.1; DacT1, AFU65883.1; SsfT1, ADE34517.1; OtcR, AJO26937.1; ActII-ORF4, AAA26692.1; FdmR1, AAQ08934.1; DnrI, AAA26736.1; TylS, AGG68810.1; NanR2, AAP42854.1; NanR1, AAP42853.1; MonRI, AAO65809.1; ChlF2, AAZ77687.1; RedD, AAA88556.1; TylT, AGG68812.1; VmsS, WP_033220281.1; AfsR, BAA14186.1; SanG, AAV31783.1; TylR, AGG68811.1. |
| 图选项 |
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| 图 5. 金霉素生物合成基因簇的SARP结合区预测比对(A)和一致性分析(B) Figure 5. The predicted SARP-binding sites of chlortetracycline biosynthetic gene cluster. A: the predicted SARP-binding consensus sequences of chlortetracycline biosynthetic gene cluster. The solid arrows mark the tandem repeat sequences identified in this study. Putative -10 regions are dashed underlined. B: analysis of the consensus SARP- binding sequences of the promoter regions from chlortetracycline biosynthetic gene cluster using MeMe. The solid arrows mark the tandem repeat sequences. |
| 图选项 |
参考文献
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