张倩倩, 商璇, 林宛颖, 徐湘民^,南方医科大学基础医学院医学遗传学教研室,广州 510800

Effect of genetic modifiers on the clinical severity of β-thalassemia

Qianqian Zhang, Xuan Shang, Wanying Lin, Xiangmin Xu^,Department of Medical Genetics, Southern Medical University, Guangzhou 510800, China

通讯作者: 徐湘民,硕士,教授,研究方向：遗传性血液病的分子机制及病理基础。E-mail: xixm@smu.edu.cn

编委: 杨昭庆
收稿日期:2019-05-13修回日期:2019-07-29网络出版日期:2019-08-20

基金资助:

国家重点研发计划.2018YFA0507803 国家自然科学基金项目资助.81870148

Received:2019-05-13Revised:2019-07-29Online:2019-08-20

Fund supported:

Supported by the National Key Research and Development Program of China.2018YFA0507803 The National Natural Science Foundation of China.81870148

作者简介 About authors
张倩倩,博士研究生,专业方向：遗传学E-mail:zqq.smu@foxmail.com。






摘要
β-地中海贫血(β-地贫)是一种可致死、致残的遗传性血液病,临床上具有较宽泛的表型变异谱,在致病基因型相同或类似的情况下,患者的临床表型严重程度有很大的差异。探索影响β-地贫表型的遗传修饰因素是当前血液病及遗传病领域的研究热点和重点。本文从α-珠蛋白基因型和胎儿血红蛋白(Hb F)数量性状位点两个方面阐述了可加重或缓解β-地贫表型的遗传修饰因素,并着重介绍了调控γ-珠蛋白基因重激活的转录因子变异,以及β-珠蛋白基因簇顺式元件变异。最后,本文举例介绍了β-地贫遗传修饰的临床应用以及未来发展前景。
关键词： β-地中海贫血;胎儿血红蛋白;遗传修饰作用;基因编辑

Abstract
β-thalassemia (β-thal) is a fatal and disabling inherited blood disorder with diverse phenotypes. The same or similar genotype of β-thal can manifest variable clinical severities. It is the hotspot and emphasis in the field of hematopathy and genetic diseases to explore genetic modifiers that influence the phenotype of β-thal. This review illustrates the deteriorating and amelioratig modifiers from two aspects: genotypes of α-globin and quantitative trait locus of fetal hemoglobin (Hb F). Variations of transcription factors which reactive the γ-globin gene expression and β-globin cluster cis-acting elements were introduced emphatically. Finally, clinical applications and future development prospects of β-thal genetic modifiers are introduced by examples.
Keywords：β-thalassemia;fetal hemoglobin;genetic modifier effects;gene editing


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张倩倩, 商璇, 林宛颖, 徐湘民. 影响β-地中海贫血表型的遗传修饰作用[J]. 遗传, 2019, 41(8): 669-676 doi:10.16288/j.yczz.19-131
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β-地中海贫血(β-地贫,OMIM#613985)是世界上最常见的单基因遗传病之一,全球约有8000~9000万携带者。在我国,该疾病主要高发于长江以南地区,因高发区域人口基数庞大且该病致死、致残率高,严重影响当地出生人口质量,故被列为国家重点关注的出生缺陷筛查项目^[1,2]。β-地贫根据贫血严重程度和临床症状一般分为轻型、中间型和重型三种：轻型地贫临床无明显症状;中间型患者偶尔或无需输血,一般可维持正常生长发育,随着年龄的增长,会出现骨质疏松、血栓、腿部溃疡等并发症;重型地贫需接受规律性输血和去铁治疗,由于长期的慢性溶血和铁过载,患者常伴随有特殊面容、生长发育迟缓、肝脾肿大、继发性血色病、髓外造血、骨骼畸形等症状^[3,4]。

β-地贫是遗传性血红蛋白病的一种,血红蛋白是由两条α类珠蛋白链和两条β类珠蛋白链组成的四聚体结构,在人体内行使运输氧气的功能,由于机体对氧气的需求不同,不同发育时期的血红蛋白组分存在差异。妊娠5周开始,由γ-链和α-链组成的胎儿血红蛋白(fetal hemoglobin, Hb F)开始在肝脏中表达,成为胎儿期血中的主要血红蛋白组分,在胎儿6个月时含量超过90%,出生前后Hb F迅速减少,至6个月不超过5%,2岁时不超过1%,同时β-珠蛋白开始在骨髓中表达增强,在1岁时达到高峰并维持终身,β-链和α-链构成的Hb A (adult hemoglobin)在出生后取代Hb F成为人体主要血红蛋白组分^[2]。

β-地贫是由于β-珠蛋白基因(HBB, OMIM+ 141900)突变使受累个体β-珠蛋白肽链合成严重不足(或完全缺乏)而引起α-链与β-链比例不平衡,多余的游离α-链结合于红细胞膜上,导致红细胞氧化损伤进而破裂引发溶血^[5]。目前,已报道300多个β-地贫致病突变,包括导致β-链合成完全缺失的β⁰突变,部分减少的β⁺突变,以及轻微减少的β⁺⁺突变,β-地贫突变的不同组合基因型是决定患者临床表型的最主要遗传因素,表型严重程度排序为：β⁰/β⁰> β⁰/β⁺>β⁺/β⁺。β⁰/β⁰患者一般表现为重型β-地贫,β⁰/β⁺表现为中间型,β⁺/β⁺患者表型较轻。但是患者临床表型并不完全取决于β-地贫的突变类型,部分β⁰/β⁰患者也可能表现出中间型表型,β⁰/β⁺患者也可表现出重型。因为β-地贫患者表型的严重程度和α-与β-链比例不平衡程度呈正比,除了β-基因变异外,任何改变肽链失衡程度的因素都可以作为影响表型的遗传修饰因子,换言之,任何能降低珠蛋白链不平衡比例,减少游离α-链的因素都可以缓解β-地贫临床症状,反之,增加不平衡比例的因素可加重症状^[6,7]。本文将从加重和减轻临床表型两个方面介绍β-地中海贫血诸多遗传修饰因素的研究进展,以及这些修饰因素在临床诊断和治疗方面的应用及前景。

1 加重β-地中海贫血表型的遗传修饰因素

加重β-地中海贫血表型的遗传修饰因素有两种：(1) α-珠蛋白基因(HBA1, OMIM+141800; HBA2, OMIM+141850)多拷贝：一般β-地贫杂合子个体无明显临床贫血症状,但是当合并出现α-基因超过正常拷贝数目(ααα/αα, ααα/ααα, αααα/αα)时,游离的α-珠蛋白增加,加重血红蛋白链失衡,此时个体表现为中间型地中海贫血^[8];(2)修饰基因变异：目前尚未报道有可直接加重β-地贫患者表型的修饰基因,STEAP3属于金属还原酶STEAP (six-transmembrane epithelial antigen of the prostate)家族,在机体内发挥铁离子还原酶的作用维持体内铁稳态,在巴基斯坦一个家系中鉴定出STEAP3杂合无义突变可致严重贫血^[9],由此STEAP3受到广泛关注,后来对中国南方人群队列展开STEAP3突变谱的研究,证明携带STEAP3突变并不会导致贫血表型,猜测其原因可能源于种族差异性^[10]。另外,存在一些疾病修饰变异通过诱发或加剧患者并发症加重β-地贫表型,极大地增加患者痛苦,缩短患者生存期。谷胱甘肽巯基转移酶1(glutathione S-transferase pi-1, GSTP1)是体内生物转化最重要的Ⅱ相代谢酶之一,rs1695处于该酶的活性部位,可增加细胞对自由基介导的损伤的敏感性。病例队列研究发现在β-地贫重型儿童中,rs1695携带率为77.14%,在正常对照组中为20%。该变异诱导β-地贫患者骨钙素水平升高、骨密度降低,继而造成骨质疏松症,在纯合子队列里效应更为显著^[11]。使用MRI T2*技术评估100个罹患重型β-地贫的儿童及青少年的心脏铁沉积程度,81.25%的心脏铁沉积患者携带rs4025935变异,且rs4025935对应更低的T2*值,提示该变异导致谷胱甘肽硫转移酶M1（GSTMl）活性降低,诱发心脏铁超载,增加患儿的死亡风险^[12]。

2 减轻β-地中海贫血表型的遗传修饰因素

目前报道可缓解β-地贫临床症状的修饰作用主要通过两条途径：(1)减少α-珠蛋白的表达,β-地贫患者同时遗传α-地中海贫血(α-地贫,OMIM#604131)突变会减轻贫血严重程度,α-地贫突变导致α-珠蛋白合成减少,珠蛋白肽链比例趋于平衡,可改善患者贫血表型;(2)重新激活Hb F表达,β-地贫患者表型多样性的一个重要原因,是Hb F含量具有明显的个体差异,一般从0%~98%不等,Hb F含量越高,患者贫血症状越轻。α-珠蛋白和γ-珠蛋白组成的Hb F是胎儿期血液中的主要血红蛋白组分,γ-珠蛋白基因(HBG1, MIM# 142200; HBG2, MIM# 142250)在出生前后关闭表达,β-珠蛋白开始表达,与α-珠蛋白形成Hb A,并维持终身。Hb F→Hb A表达转化分子机制为解释β-地贫表型变异性的遗传学基础提供了有力的科学证据,重新激活β-地贫患者的γ-珠蛋白表达,与游离α-链结合形成可正常携氧的Hb F,降低α-链和β-链不平衡程度,可有效缓解患者症 状^[13]。早在2007年,通过全基因组关联分析(genome- wide association study, GWAS)和基因组连锁分析,鉴定出Hb F的数量性状位点(quantitative trait locus, QTL)主要集中在2p15 BCL11A、6q23 HBS1L-MYB基因间区和11p15 β-珠蛋白基因簇上^[14],近年在中国人队列里还鉴定出KLF1基因变异可显著影响Hb F,减轻表型^[15]。目前,可通过调控Hb F表达缓解β-地贫表型症状的变异主要分为3类(图1)：(1)修饰基因变异,主要是指目前临床上评估和表型显著相关的修饰基因发生基因突变。这些修饰基因多数编码重要的红系转录因子,如BCL11A、LRF、KLF1和MYB等,它们均参与红系分化及生长等通路,一旦其发生基因突变将通过减少该基因的蛋白表达量来减轻其对γ-基因的抑制作用,从而达到缓解表型的结果^[16];(2)顺式作用元件变异,主要是发生在β-珠蛋白基因簇上转录因子结合序列的变异,导致反式因子的特异性结合亲和力发生改变,进而影响β-珠蛋白基因簇重要基因的正常表达转换;(3)表观遗传修饰变异,该类变异通过改变珠蛋白基因上的表观修饰状态调控珠蛋白基因表达。下文对已报道的可缓解β-地贫表型的修饰因素及变异根据其作用机制分类进行一一介绍。

图1

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图1β-地中海贫血遗传修饰变异

珠蛋白表达的关键调控因子为KLF1、LRF、MYB、BCL11A、GATA1等。β-地中海贫血修饰变异主要分为：(1)影响重要红系转录因子合成的修饰基因变异：rs483352838(KLF1)、rs9399137(HBS1L-MYB)、rs766432(BCL11A)等;(2)结合反式作用因子的顺式元件变异：γ-珠蛋白基因(HBG1,HBG2)近端启动子-196C>T、-197C>T、-198T>C等通过改变转录因子结合序列,减少LRF和KLF1富集,减轻其对γ-基因的抑制作用。-113A>G产生新的GATA1结合位点,招募GATA1结合调控γ-基因表达;(3)通过改变甲基化状态激活珠蛋白基因表达的表观遗传修饰变异：rs368698783。
Fig. 1Modifier variants of β-thalassemia

2.1 修饰基因变异

BCL11A和LRF都是C2H2锌指转录因子,在印度尼西亚血红蛋白E(hemoglobin E, Hb E)与β-地贫双重杂合的病例队列里,BCL11A内含子区域rs11886868和rs766432的多态性与Hb F表达及患者临床严重程度有较强的相关性^[17],BCL11A已被证明是γ-珠蛋白表达的抑制基因,在人造血干细胞CD34⁺及β-YAC(yeast artificial chromosomes)转基因小鼠胚胎中敲除BCL11A基因,可减轻对γ-基因的抑制作用,染色质免疫沉淀实验显示BCL11A可直接结合于β-珠蛋白基因簇上游远端调控元件LCR (locus control region)的HS3、δ-珠蛋白基因(HBD, MIM# 142000)上游3.5 kb和γ-基因启动子近端的GGCCGG序列^[18]。研究表明失活BCL11A并不能完全逆转γ-珠蛋白向β-珠蛋白转换的过程,提示人们存在其他重要调控子。

ZBTB7A基因编码的LRF是参与肿瘤形成和细胞转化的重要因子,完全敲除后小鼠会因为严重贫血而胚胎致死,成鼠期敲除会引起轻度巨红细胞性贫血。最近,LRF被鉴定为胎儿血红蛋白的重要沉默子,在成人阶段它结合到γ-基因上使染色体保持致密的核小体结构进而沉默γ-基因的表达。Martyn等^[19]采用逆向思维的研究策略,用EMSA (electrophoretic mobility shift assay)筛选结合于γ-基因启动子区上已报道可引起遗传性持续性胎儿血红蛋白症(hereditary persistence of fetal hemoglobin, HPFH)表型的变异的转录因子,结果显示BCL11A结合在γ-基因转录起始位点前115 bp的位置,而LRF主要结合于前200 bp的位置。研究表明,在人永生化红系祖细胞HUDEP-2中敲除ZBTB7A或者BCL11A任一基因,Hb F会上升至总体血红蛋白水平的50%~70%,然而同时敲除这两个基因,Hb F会超过95%。另外,在上游LCR区域也发现了LRF的结合序列^[20],但至今仍未发现ZBTB7A基因上自然发生的变异与Hb F表达相关联。

红系特异锌指结构转录因子KLF1通过C末端锌指与DNA结合促进β-珠蛋白的表达和胎儿期γ-珠蛋白到成年期β-珠蛋白的表达转换。完全敲除后小鼠会因为严重贫血而胚胎致死。研究人员发现敲降KLF1可致BCL11A表达减少,提示KLF1是BCL11A的正向转录调节因子。人群中KLF1存在多种自然突变,在正常人、β-地贫携带者和β-地贫患者研究队列中,携带罕见KLF1变异均会伴随升高的Hb F^[21]。在我国,KLF1基因非同义突变在地贫高发区域较之低发区域有更高的发生频率,提示极可能存在正向选择作用,进一步评估多种修饰因素对中国β-地贫患者临床表型的作用,候选列表为HBB基因型、HBA基因型、XmnI、BCL11A、HBS1L-MYB间区和KLF1,结果显示KLF1基因变异对中国人群β-地贫表型修饰作用最为显著^[15]。

GWAS鉴定出位于6号染色体的HBS1L-MYB基因间区上存在多个变异与Hb F表达量相关,在中国广西壮族的中间型β-地贫患者队列里研究显示rs9376090、rs9399137、rs7776054、rs9389268等9个SNPs对应较高的Hb F,但多数变异影响血液学表型的作用机制尚未完全阐明^[22]。目前最主要的猜想是部分SNPs通过降低转录因子亲和力来远端调控MYB的表达量,MYB是参与造血与红系分化过程的重要因子,敲除实验表明会引起造血干细胞的减少和红系细胞无法正常成熟,在K562细胞中过表达MYB会抑制γ-珠蛋白的表达,而在人红系祖细胞中敲降MYB会导致microRNA-15a和microRNA- 16-1表达翻倍增加,进而刺激γ-珠蛋白开放表达。除了Hb F,MYB还与红细胞平均血红蛋白量及红细胞压积等参数相关联^[23,24]。

2.2 顺式作用元件变异

位于HBG2上游158 bp的C/T变异(rs7482144,XmnI多态性)与Hb F含量及β-地贫表型严重性显著相关,在我国南方地贫高发区域此突变携带率高达13%,其多态性所引起的Hb F升高效应在极端红系压力下极为明显,在正常人中效果甚微,rs7482144不仅对β-地贫的表型修饰作用显著,对镰刀形细胞贫血患者也会有一定的改善作用,其作用效能在不同人种之间中无明显差异^[25,26]。

现发现超过20种位于γ-基因近端启动子区域可致HPFH的点突变,常见于-117、-196、-197、-198等位点,这些点突变可通过改变红系重要转录因子BCL11A、KLF1、LRF等结合序列碱基,降低结合能力,减少抑制子对γ-基因的遏制作用,使其重新开放表达^[27]。最近研究发现,除了改变既有的转录因子结合序列,这些近端启动子的点突变也可能产生新的转录因子结合位点,如-113A>G通过招募红系特异转录因子GATA1结合激活γ-珠蛋白的表达^[28]。

某些β-地中海贫血患者的β-基因无变异却无法正常表达,研究发现在其β-珠蛋白基因簇上游缺失一段很长的非编码序列,导致致密的异染色质结构延伸到整个基因区域,抑制基因转录,提示位于HBE基因上游6~20 kb的红系特异HSs (hyper-sensitive site)调控元件可能发挥重要的调控作用^[29]。在胎儿期,HSs、珠蛋白基因和红系转录因子成环形成活性染色质中心(active chromatin hub, ACH),转录因子较启动子更易结合于LCR,LCR在空间上靠近γ-基因启动子,更多的转录因子被传递到启动子区域,促使γ-基因转录。目前对于LCR上的功能性变异鉴定和机制探索的研究少之又少,Kim等^[30]成功用CRISPR/Cas9系统诱变LCR HSs上KLF1、BCL11A和GATA1等红系转录因子的结合序列,改变转录因子的结合力,从而影响珠蛋白基因表达,使人们进一步相信LCR上可能存在一些影响珠蛋白基因转换的功能性变异。

2.3 表观遗传修饰

表观遗传学调控是指在不改变核苷酸序列的前提下,通过DNA甲基化、小RNA干扰和组蛋白修饰等途径引起基因表达的可遗传变化。DNA甲基化可改变染色质结构、稳定性和构象,从而降低基因的转录活性,而去甲基化则诱导了基因的重新表达^[31]。实验表明,γ-基因转录起始位点前53 bp处CG位点的低甲基化与γ-基因的重新激活相关^[32]。胎儿出生后,LYAR蛋白与组蛋白甲基化转移酶PRMT5结合后双甲基化组蛋白H4上的精氨酸残基,进而招募DNA甲基化转移酶DNMT3A,DNMT3A甲基化γ-基因启动子上的CG位点,抑制γ-基因的表达。队列研究显示中国南方地贫患者群体中HBG1启动子上rs368698783 G/A变异的携带率高达16%,携带此变异患者Hb F值较高且表型较轻,功能实验结果显示变异使LYAR蛋白结合亲和力降低,通过LYAR、PRMT5和DNMT3A作用通路,降低γ-基因启动子附近CG位点的甲基化,从而开放γ-珠蛋白的表达,改善贫血表型^[33]。抑制性染色质标记H3K27me3是α-珠蛋白基因仅在红细胞表达的特异标志物。在非红细胞中,H3K27me3富集于α-基因启动子,抑制转录。IOX1是一种2OG氧合酶(2OG oxygenases) 的有效广谱抑制剂,体外实验可有效抑制KDM6A和KDM6B,研究报道在人造血干细胞CD34+中,IOX1通过抑制KDM酶增加α-基因启动子上H3K27me3的富集,可在不影响其他基因表达和红系分化过程的前提下,有选择性地减少α-链合成,即可通过此途径减少β-地贫珠蛋白链比例不平衡程度,缓解患者表型^[34]。SIRT1是一种NAD依赖的组蛋白去乙酰化酶,促进组蛋白和DNA甲基化,抑制基因转录,使用小分子SIRT1激活剂SRT2104和SRT1720处理K562细胞和脐带血来源CD34⁺细胞,可有效增强γ-珠蛋白 表达,提示SIRT1及其激活剂是治疗β-地贫的潜在靶点^[35]。

3 结语与展望

意大利卡利亚里大学于2015年发布TSS (Thalassemia severity score)系统(http://tss.unica.it),结合致病基因与5个修饰位点可初步计算预测患者贫血严重程度,以期作为β-地贫筛查的预测评分和标准化严重程度量表,研发人员强调了遗传修饰因素在β-地贫诊断及筛查中的重要作用,建议将修饰作用量化用于指导临床决策^[36]。现有重型、中间型及轻型β-地贫的临床分类指南和标准,已不能满足当前包括精准人群防控和制定个体化临床管理方案在内的迫切需要。对文中所述修饰因素的充分研究及解析有助于建立整合致病变异及遗传修饰因素的β-地贫新亚型分类指南和标准,并加速研发可用于疾病的人群分子筛查、临床精准诊断和疗效评价的遗传变异检测标准及技术体系。

异基因造血干细胞移植是目前较成熟的β-地贫根治方法,近些年手术方案及技术不断发展,从同胞移植发展到非亲缘供体移植,移植成功率在逐步提升,但由于供者难寻、费用昂贵等问题,受益患者极有限。表观遗传修饰和基因编辑改变珠蛋白基因表达有望成为治愈β-地贫的新方法。DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂胞苷和地它西滨、组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠和丁酸等具有激活与增强γ-珠蛋白表达的能力,目前已用于临床治疗,但由于药物副作用较强、患者疗效不稳定等原因,尚未广泛地推广和使用^[31]。深入研究β-地贫表观遗传调控作用可为研发安全性更高、特异性更好的表观遗传学药物提供科学理论基础。Wu等^[37]以BCL11A红系增强子+58序列作为靶点对正常人与β-地贫病人来源的CD34⁺细胞进行编辑,通过优化Cas9原核表达载体和编辑系统,使编辑效率达到98%,细胞体外培养实验和免疫缺陷小鼠干细胞移植实验结果均显示,编辑后的β-地贫造血干细胞分化更加成熟,红细胞Hb F含量较高,且细胞形态和大小均趋于正常。采用重激活内源性Hb F的策略,CRISPR/Cas9基因编辑技术编辑修饰基因,有望为β-地贫患者提供全新的基于自体干细胞移植的治愈方案。

β-地中海贫血是一种常染色体隐性遗传血红蛋白病,位于11号染色体上的HBB基因发生缺失或变异,导致β-链合成不足,不同突变所致β-肽链合成量不同,对应患者贫血程度存在差异,但除了致病基因HBB外,β-地贫表型严重程度仍受多种遗传因素调控,包括α-基因拷贝数、修饰基因变异、珠蛋白基因簇顺式元件变异和表观遗传学修饰。系统分析和阐述遗传修饰作用对β-地贫表型影响将有助于临床精准诊断、制定个性化优生优育方案、研发疾病表观修饰药物、探索基于DNA编辑技术的靶向基因治疗方案,同时可为其他孟德尔遗传病研究提供借鉴作用。

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胎儿血红蛋白(HbF)是一种主要在胎儿期间大量存在的血红蛋白, 但成年后含量极少, 然而少量人群及部分镰刀型贫血和地中海贫血患者体内仍保留一定量的HbF, 其存在对缓解贫血临床并发症具有重要益处。以往研究已经确定影响HbF数量性状的基因座定位于6q23和2p15, 而最新的一系列研究表明, 定位于6q23的HBS1L-MYB和2p15的BCL11A与HbF含量关联最高。这些研究一方面有助于理解HbF表达机理, 另一方面也为镰刀型贫血的治疗提供了潜在的药物靶点。文章对HbF表达的数量性状相关基因的研究现状及潜在应用进行了综述
郭晓强 . 胎儿血红蛋白数量性状相关基因的研究进展
遗传, 2010,32(4):295-300.
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胎儿血红蛋白(HbF)是一种主要在胎儿期间大量存在的血红蛋白, 但成年后含量极少, 然而少量人群及部分镰刀型贫血和地中海贫血患者体内仍保留一定量的HbF, 其存在对缓解贫血临床并发症具有重要益处。以往研究已经确定影响HbF数量性状的基因座定位于6q23和2p15, 而最新的一系列研究表明, 定位于6q23的HBS1L-MYB和2p15的BCL11A与HbF含量关联最高。这些研究一方面有助于理解HbF表达机理, 另一方面也为镰刀型贫血的治疗提供了潜在的药物靶点。文章对HbF表达的数量性状相关基因的研究现状及潜在应用进行了综述

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