,1, 刘钢,1,2Research advances on molecular regulation of filamentous fungal secondary metabolism in China
Yuanyuan Pan,1, Gang Liu,1,2通讯作者:
编委: 何群
收稿日期:2018-06-22修回日期:2018-08-23网络出版日期:2018-10-20
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Received:2018-06-22Revised:2018-08-23Online:2018-10-20
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潘园园,助理研究员,研究方向：丝状真菌次级代谢的分子调控E-mail:
摘要
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潘园园, 刘钢. 中国丝状真菌次级代谢分子调控研究进展[J]. 遗传, 2018, 40(10): 874-887 doi:10.16288/j.yczz.18-169
Yuanyuan Pan, Gang Liu.
来源于丝状真菌—产黄青霉(Penicillium chrysogenum)的青霉素是第一例被人们发现并在临床上使用的抗生素。然而由于丝状真菌具有相对复杂的生命过程,研究相对困难,人们将更多的目光投向了丝状细菌—链霉菌(Streptomyces),并随之迎来了抗生素发现的黄金时代。近年来,从以链霉菌为代表的土壤细菌中发掘新骨架代谢物的难度越来越大,复筛率逐年提高。同时,由于抗生素滥用等导致超级致病菌的不断出现和爆发,严重危害了人类的生命和健康。科学家把目光重新聚焦到丝状真菌次级代谢物的发掘和研究上。同放线菌相比,丝状真菌基因组含有更多的次级代谢物生物合成基因簇,具备产生更多活性代谢物的潜能。丝状真菌来源的次级代谢物在人类健康和疾病防控中已然担当了许多重要的角色,如临床上主要的抗感染药物青霉素和头孢菌素、免疫抑制剂环孢菌素A、降血脂药物洛伐他汀以及抗真菌药物棘白霉素等。丝状真菌次级代谢的分子调控是在转录、转录后、翻译以及表观遗传等不同水平上,由大量蛋白参与的复杂过程,用于保证丝状真菌应对不同的环境刺激,并形成具有高度组织性和精密性的调控网络。本文对近40年来我国科研工作者在丝状真菌次级代谢分子调控领域的研究进展进行了总结,以期让大家更好地了解目前我国在本领域的研究状况,同时对未来研究提出展望。由于综述了近40年的工作兼之本文篇幅有限,难免会挂一漏万。如有纰漏,亦敬请读者谅解。
1 丝状真菌次级代谢的转录调控
1.1 丝状真菌次级代谢的全局性调控
全局性调控是指由全局性调控因子参与并对多个次级代谢物生物合成以及形态分化进行的调控。在诱导丝状真菌产生次级代谢物时,外界环境刺激是一个很重要的因素,而全局性调控因子在其中起着关键作用。LaeA是近年来发现的一种丝状真菌全局性调控因子。2004年,美国威斯康星大学Keller研究组首次在构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中分离到laeA基因,生物信息分析表明LaeA含有一个保守的参与组蛋白甲基化的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)结合结构域[1],同时发现laeA的启动子区含有途径特异性调控蛋白AflR的结合位点。随后laeA在烟曲霉(A. funigatus)、黄曲霉(A. flavus)、米曲霉(A. oryzae)、黑曲霉(A. niger)、产黄青霉、草酸青霉(P. oxalicum)、橘青霉(P. citrinum)、里氏木霉(Trichodermareesei)、深绿木霉(T. atroviride)、丛毛红曲霉(Monascuspilosus)、红色红曲霉(M. ruber)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、藤仓镰孢菌(Gibberella fujikuroi)、轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioide)、禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus)和玉米小斑病菌(Helminthosporium maydis)中被相继报道[2]。研究发现laeA能够正调控包括抗生素和真菌毒素在内的大量次级代谢物的生物合成,同时影响真菌的形态分化和发育过程[3]。LaeA还能够通过刺激沉默基因的表达激活隐性代谢物的产生[4]。西南大学胡昌华课题组发现laeA能够通过促进橘青霉中途径特异性调控基因mlcR和结构基因mlcB的转录正调控美伐他汀的合成,因此可以通过高表达laeA来提高美伐他汀的产量[5]。他们还发现laeA负调控橘青霉孢子的形成,并鉴定了3种与LaeA互作的蛋白。其中Sey-1可能参与调控G蛋白信号通路,DST1-like蛋白可能参与次级代谢的调控,胱硫醚-β-合成酶可能与LaeA组蛋白的甲基修饰相关[6]。山东大学曲音波课题组发现laeA在发酵前期负调控草酸青霉中纤维素酶的合成,在中后期则正调控纤维素酶的合成,而且是发酵后期其他转录调控因子调控纤维素酶基因表达所必需的[7]。华中农业大学陈福生课题组发现laeA除了调控红曲霉的菌落直径、孢子萌发和分生孢子形成外,还能正调控包括色素和橘霉素在内的6种已知次级代谢物的生物合成[8]。华南理工大学潘力课题组通过转录组分析,发现laeA在转录水平正调控黑曲霉次级代谢生物合成基因簇中大约27%的基因表达,证明laeA普遍影响丝状真菌次级代谢[9, 10]。北京师范大学朱旭东课题组发现laeA正调控球毛壳中pestalotiollide B的合成[11]。中国医学科学院药用植物研究所邹忠梅课题组发现过表达laeA能够激活球毛壳菌新化合物Chaetoglobosin Z的产生[4],为隐性次级代谢物的激活提供了新的策略。然而,laeA调控次级代谢的作用机制至今尚不清楚。目前,推测有以下3种可能的作用机制：(1) LaeA作为甲基转移酶修饰组蛋白和其他蛋白的甲基化水平,通过影响染色体的状态而改变次级代谢物的合成[12];(2) LaeA通过与途径特异性调控因子作用从而共同调控次级代谢物的合成[1];(3) LaeA通过G蛋白信号转导途径将次级代谢和形态分化联系起来[1]。
Velvet蛋白家族是一类真菌特有的、含有Velvet 结构域的蛋白,包括VeA、VelB、VosA和VelC。其中VeA是在构巢曲霉中首次发现的Velvet类光敏蛋白,其N端含有一个保守的核定位信号,C端含有一个PEST区域[13]。Velvet蛋白家族在丝状真菌中的主要功能是调控形态分化和次级代谢, 并且受到光、温度等环境因素影响[14]。VeA除了影响丝状真菌的形态分化和次级代谢外,还正调控有性生殖和负调控无性生殖[15]。此外,VeA还能激活隐性基因簇[16]。VeA通过与VelB和LaeA形成蛋白复合体,共同调控丝状真菌形态分化和次级代谢[17]。我国****也在此领域开展了相关的研究,发现橘青霉中VeA能够抑制菌体的无性发育,并通过促进美伐他汀簇内结构基因和调控基因的转录提高美伐他汀的产量;VeA能够增强菌体对离子和氧化胁迫的耐受性[18, 19]。与大多数VeA抑制无性生殖和激活次级代谢物合成不同,球毛壳中VeA正调控分生孢子的产生和菌丝的生长,但负调控pestalotiollide B的合成,这暗示着球毛壳中VeA对次级代谢和形态分化的作用机制具有特殊性[11]。浙江大学马忠华课题组发现禾谷镰刀菌中FgVeA正调控脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的产生,并参与细胞内脂滴的合成。他们通过酵母双杂交获得了6个与FgVeA互作的蛋白,分析发现均含有甲基转移酶结构域。而这些Velvet复合体蛋白与构巢曲霉中相对应的蛋白作用完全不同,暗示着禾谷镰刀菌中Velvet蛋白复合体可能具有新的作用机制[20]。FgVelB的破坏增加了禾谷镰刀菌对渗透压的抗性,阻碍了气生菌丝的生长,减弱了菌丝的疏水性,增加了分生孢子量;另外FgVelB还正调控DON的产生,最终导致FgVelB突变株对开花麦穗致病性的减弱[21]。球毛壳菌VelB在正调控pestalotiollide B合成的同时,也调控了菌体的形态分化以及菌体对渗透压的敏感性[11]。中国科学院微生物研究所李少杰课题组发现,轮枝镰刀菌中Velvet相关蛋白FvVE1、FvVelB和FvVelC能够形成复合物而发挥功能,FvVE1或FvVelB的敲除阻碍了小分生孢子的产生,但激活了大分生孢子的形成,同时发现二者均正调控烟曲霉毒素的产生。FvVE1和FvVelB参与调控菌体对氧化胁迫的耐受性,但FvVelC并不参与形态分化和次级代谢这两个重要的生物学过 程[22]。而我国****对VosA和VelC的研究较少,仅发现VosA参与禾旋孢腔菌分生孢子产生和毒力过程[23],目前尚未见关于其参与次级代谢的报道。
除了LaeA和Velvet之外,其他全局性调控因子与次级代谢之间的关系也有报道。例如,朱旭东课题组发现小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsis microspora)中磷脂甲基转移酶基因choA和choC的缺失使得菌体呈现出异常的形态分化,而choA和choC在次级代谢中的作用则完全不同[24]。华东理工大学张元兴课题组发现海洋来源的灰绿曲霉调控蛋白Agseb1与酿酒酵母中的调控蛋白Msn2/4具有较高的同源性,Agseb1除了能够应对胁迫和调节菌体的形态分化之外,Agseb1缺失株中aspergiolide A的产量降低了43%[25]。西南大学范艳华课题组发现球孢白僵菌(Beauveria bassiana)中产生的卵孢素通过抑制死亡虫体上细菌的大量增殖来保障真菌获得营养物质,最终完成菌丝生长和产孢过程。而球孢白僵菌中全局性调控因子BbSmr1通过负调控生物合成基因簇中转录因子OpS3的表达负调控卵孢素的合成[26]。该项工作第一次向人们阐述了卵孢素如何帮助白僵菌在与细菌争夺死亡虫体营养的过程中获得优势。淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)产生的具有杀线虫活性的白灰制菌素在生物防治上具有重要的应用价值。华中农业大学肖炎农课题组发现淡紫拟青霉中RolP的缺失导致白灰制菌素不再产生,高表达rolP则可以提高白灰制菌素的产量,同时发现rolP与对线虫的毒性呈正相关[27]。本课题组在研究头孢菌素生物合成的调控过程中,发现影响菌丝分隔的AcsepH基因和发育调控基因AcstuA的缺失都会导致顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)抗生素产量急剧下降[28, 29],而一个Myb家族转录因子编码基因AcmybA的缺失则显著增加了分生孢子和头孢菌素的产生[30],说明次级代谢与形态分化的紧密联系在丝状真菌中是普遍存在的。
1.2 丝状真菌次级代谢的途径特异性调控
丝状真菌次级代谢除了受到全局性调控之外,还受到途径特异性调控。途径特异性调控是指参与调控的基因位于次级代谢物生物合成基因簇内,其编码产物直接调控基因簇内基因的转录。研究发现,60%的真菌次级代谢物合成基因簇内含有途径特异性调控基因[31]。在丝状真菌中发现的大多数途径特异性调控基因均正调控次级代谢物的生物合成。近年来的研究表明,途径特异性调控因子不仅可以调控所在基因簇中基因的转录,也可以调控基因簇外基因的转录[32],同时,不同的途径特异性调控因子之间可以进行交互调控。途径特异性调控相对简单和直接。中国农业科学院蔬菜花卉研究所谢丙炎课题组与中国科学院微生物研究所尹文兵课题组通过基因组分析、基因敲除等首次鉴定了白灰制菌素生物合成基因簇,并对其中途径特异性调控基因lcsF开展了研究,高表达lcsF使白灰制菌素产量增加了1.5倍[33]。Verticillins是由罗杰斯无性穗霉(Clonostachys rogersoniana)产生的多硫代二酮哌嗪(ETP)类化合物,具有较强的细胞毒活性和成药前景。本课题组与中国人民解放军军事医学科学院车永胜课题组合作,克隆并通过实验确证了verticillin生物合成基因簇[34]。该基因簇中存在一个途径特异性调控基因verZ,其编码产物通过直接与结构基因启动子区结合正调控verticillin的生物合成[35]。Verticillin生物合成基因簇的克隆及其调控机制的阐明,为该化合物的定向改造及利用奠定了理论基础。西北农林科技大学许金荣课题组发现禾谷镰刀菌途径特异性调控基因Tri6和Tri10正调控DON的合成,而加入外源cAMP能够部分回补Tri10突变株中DON的产生,但对Tri6突变引起的DON缺失没有回补作用,暗示Tri6在参与cAMP- PKA途径介导的DON合成过程中起到至关重要的作用[36],这也是首次证明外源cAMP通过Tri10调控真菌毒素DON的合成。
2 丝状真菌次级代谢的表观遗传调控
2.1 表观遗传相关基因参与的丝状真菌次级代谢调控
丝状真菌次级代谢与其基因簇所处的表观遗传状态有着密切的关系。通过表观遗传操作能大范围改变代谢物谱,以及激活隐性次级代谢物的产生[37]。表观遗传调控是一种基于核酸修饰的调控方式,主要包括DNA甲基化、组蛋白甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等。其中,组蛋白甲基化是最稳定的修饰方式,因此最适合作为稳定的表观遗传信息。而乙酰化修饰则具有较高的动态性,同时磷酸化和泛素化修饰相对不太稳定,因此它们更为灵活地影响染色质的结构和功能。组蛋白遗传修饰之间相互关联并共同控制着基因的表达,从而最终影响丝状真菌次级代谢物的合成。其中,组蛋白甲基化和乙酰化研究的最为透彻。LaeA作为组蛋白甲基转移酶,通过调控组蛋白和改变染色体结构来调控次级代谢产物的合成。通常组蛋白甲基转移酶和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)能够阻遏次级代谢物的合成。浙江大学毛旭明、中国医学科学院药物研究所胡友财课题组以及美国加州大学唐奕课题组合作研究发现,敲除齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula)中组蛋白去乙酰化酶使得菌体中超过75%的次级代谢基因簇表达水平上升,从该突变株中分离的10种化合物中4种具有新结构[38],该工作提示可以通过表观遗传的改变快速同时激活多个隐性基因簇,为基因组挖掘提供了强大的工具。朱旭东课题组发现小孢拟盘多毛孢组蛋白乙酰转移酶基因hat1正调控次级代谢和分生孢子的形成,同时也控制细胞壁的完整性[39]。中国农业科学院植物保护研究所冯洁课题组发现敲除组蛋白乙酰转移酶基因FgSAS3和FgGCN5增加了禾谷镰刀菌对渗透压和活性氧(ROS)的敏感性,FgSAS3敲除株中分生孢子的量和子囊壳的形成减少,而FgGCN5敲除株则完全不能形成分生孢子和子囊壳。同时发现FgSAS3和FgGCN5是禾谷镰刀菌感染小麦穗和番茄果实的重要致病因子。FgSAS3和FgGCN敲除株不再产生DON,这一结果与敲除株中参与DON合成的关键基因的转录明显下降相一致[40]。福建农林大学汪世华课题组发现黄曲霉中组蛋白乙酰转移酶基因AflgcnE的缺失抑制了黄曲霉的生长,降低了细胞表面的疏水性,同时使得菌体不能产生无性孢子和菌核,并导致黄曲霉毒素合成相关基因表达量急剧下降,黄曲霉毒素不再产生[41]。尹文兵课题组发现敲除无花果拟盘多毛孢(Pestalotiopsis fici)中组蛋白甲基转移酶基因PfcclA和组蛋白去乙酰化酶基因PfhdaA激活了15种新的聚酮化合物的产生,同时提高了11种大环内酯类抗生素的产量[42]。另外罗氏绿僵菌(Metarhizium robertsii)中hat1的敲除激活了孤儿次级代谢物生物合成基因的表达,在该敲除株中分离得到了11种新化合物[43]。近年来的研究发现,细菌和真菌中还普遍存在组蛋白赖氨酸的琥珀酰化修饰,并且已经证明其在细胞分化、中心代谢等重要生命活动中发挥着重要作用,尤其是西南大学谢建平课题组对结核分枝杆菌琥珀酰化与其致病性关系进行了详细的蛋白组学研究,为结核病的诊断和防治提供了科学依据[44]。然而,截至目前为止还没有在丝状真菌中发现琥珀酰化与次级代谢产物合成之间关系的报道。总之,上述研究证明表观遗传调控是发掘新化合物便捷和有效的策略之一。2.2 化学表观遗传试剂对丝状真菌次级代谢的调控
通过直接阻断或高表达表观遗传相关基因能够提高抗生素产量和发现新型次级代谢物。然而,由于很多丝状真菌缺乏有效的遗传操作体系,无法采用遗传手段来研究表观遗传与次级代谢的关系。近年来,一系列特异地抑制表观遗传修饰酶活性的化学试剂被发现,通过这些化学试剂来调控次级代谢,最终形成了一门新的学科,即化学表观遗传学。中山大学贺竹梅课题组利用DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮胞苷(5-AC)处理黄曲霉,发现5-AC阻遏了黄曲霉的形态分化和黄曲霉毒素的生物合成,随后RNA-seq结果表明VeA的表达受到5-AC的强烈抑制,推测5-AC抑制了VelB-VeA-LaeA复合物的形成以及羧肽酶的活性,从而降低了黄曲霉毒素的产量[45]。重庆大学杨小龙课题组发现,5-AC能够诱 导小孢拟盘多毛孢产生新化合物4′-formamidophenyl-5-methoxybenzoate和7种已知聚酮化合物[46]。绳状青霉菌(P. funiculosum)经过5-AC处理诱导后产生两种新的prenyleudesmane二萜类化合物[47]。在P. crassiuscula中加入5-AC,导致该菌产生了包括coumarin在内的4种新化合物[48]。上述证据表明,5-AC作为DNA甲基转移酶抑制剂能够激活隐性基因簇并获得新型代谢物。通过化学试剂抑制组蛋白的去乙酰化,有可能提高组蛋白乙酰化水平,促进基因的表达。深圳大学王力彦课题组用组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA和5-AC共同处理两株深海来源的曲霉,其中一株产生了1种新型的二苯醚-O-糖苷和7种已知化合物[49],另外一株产生了3种新的倍半萜类化合物和1种已知化合物[50]。中国海洋大学王长云课题组利用5-AC和组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理Cochliobolus lunatus,激活了包括cochphthesters A-G在内的9种新型化合物[51, 52]。他们在Curvularia lunata中加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠后,激活了4种化合物的产生[53]。宁波大学何山课题组利用SAHA处理杂色曲霉,激活了新的联苯类化合物versiperol A以及已知化合物2,4-dimethoxyphenol和diorcino的产生[54]。3 环境信号参与的丝状真菌次级代谢调控
丝状真菌的培养环境对其次级代谢产物的合成有很大的影响,这些环境信号主要包括活性氧(ROS)、氮源、碳源、pH值、温度、光照以及不同微生物间的刺激等。丝状真菌中氧化胁迫往往与其次级代谢息息相关,而谷胱甘肽和硫氧还蛋白还原酶系统是丝状真菌应对外来氧化胁迫的重要方式。本课题组发现敲除顶头孢霉谷胱甘肽还原酶基因glrA或硫氧还蛋白还原酶基因ActrxR1都能延迟孢子萌发和菌丝生长;与ActrxR1不同,glrA的缺失还增加了菌体对过氧化氢的敏感度;glrA的缺失完全阻断了头孢菌素的合成,但这种缺陷可以被外源添加甲硫氨酸所弥补,而在ActrxR1突变株中头孢菌素的产量不但没有减少,反而增加了一倍[55, 56]。在维持体内氧化还原平衡方面,glrA和ActrxR1的作用也完全不同(图1)。推测AcTrxR1用于消除体内低浓度的ROS,而低浓度的ROS可以刺激次级代谢物的合成;相反,高浓度的ROS则对细胞有毒,甚至可以导致细胞死亡,同时也不利于次级代谢物的产生,而GlrA则用于应对体内产生的高浓度ROS。bZIP类调控因子在丝状真菌中保守存在,它在响应环境信号过程中发挥着重要作用。某些bZIP转录因子在调控ROS产生的同时,也调控了次级代谢物的合成。尹文兵课题组发现bZIP类调控因子编码基因PfbzipA的缺失增强了无花果拟盘多毛孢对叔丁基过氧化氢、偶氮二甲苯、甲基萘醌亚硫酸氢钠的耐性,但对过氧化氢却更加敏感。同时PfbzipA的敲除也改变了菌体产生次级代谢物的能力[57]。
图1
新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT图1顶头孢霉中谷胱甘肽和硫氧还蛋白还原酶系统
A：谷胱甘肽还原系统。谷胱甘肽还原酶将氧化型谷胱甘肽还原成还原型谷胱甘肽,同时,还原型谷胱甘肽在谷胱甘肽氧化酶的作用下被氧化成氧化型谷胱甘肽,还原型谷胱甘肽是参与氧化应激的重要分子。B：在不含或含有0.01%甲硫氨酸(met)的MMC平板上分别接种顶头孢霉孢子(spores)和菌丝体(hypha),培养3天,观察真菌生长情况。WT：顶头孢霉野生株;ΔglrA：谷胱甘肽还原酶基因glrA敲除株;cglrA：回补株;T1：含有空载体的顶头孢霉对照菌株。C：硫氧还蛋白还原系统。硫氧还蛋白还原酶将氧化型硫氧还蛋白还原成还原型硫氧还蛋白,同时,还原型硫氧还蛋白在一系列氧化酶的作用下被氧化成氧化型硫氧还蛋白,还原型硫氧还蛋白是参与氧化应激的重要分子。D：头孢菌素的生物活性检测。WT：顶头孢霉野生株;DM：硫氧还蛋白还原酶基因ActrxR1敲除株;CM：回补株。以芽胞杆菌为检测菌株,以青霉素G(PenG)为阳性对照。
Fig. 1Glutathione reductase and thioredoxin reductase systems in A. chrysogenum
丝状真菌次级代谢还受到氮源的调控。AREA是含有锌指结构域的GATA类调控蛋白,通过与氮源利用相关基因启动子区的结合参与丝状真菌氮源调控。AREA还能直接调控次级代谢物生物合成基因的转录。本课题组发现顶头孢霉中氮源调控基因AcareA和AcareB除了调控氮源代谢,还能够调控头孢菌素的生物合成。AcAREA通过与头孢菌素生物合成关键基因pcbAB-pcbC双向启动子区的结合直接调控pcbAB和pcbC的转录,间接促进cefD2、cefEF和cefG的转录[58]。而AcAREB则通过与pcbAB- pcbC、cefD1-cefD2以及cefEF-cefG的双向启动子区结合直接正调控头孢菌素的产生[59]。
应答调控pH变化的转录因子PacC也与次级代谢紧密相关。南京农业大学赵明文课题组发现赤芝(Ganoderma lucidum)中GlPacC负调控灵芝酸的合成[60]。汪世华课题组发现敲除碳代谢阻遏基因creA导致黄曲霉生长缺陷,分生孢子量减少,黄曲霉毒素产量明显降低[61],这是碳源对次级代谢物生物合成调控的典型特征。中国科学科院华南植物园蒋跃明课题组发现橘青霉中Zn(II)2Cys6类转录因子、LaeA以及PacC在以葡萄糖为碳源的培养基中的表达量均高于以蔗糖为碳源的培养基,而GATA类转录因子的表达在这两种培养基中的表现正好相反[62]。温度对次级代谢物的生物合成也有重要的影响,天津科技大学王昌禄课题组研究发现,红曲霉菌在变温培养(30~25℃)时较恒温培养(30℃)时monacolin K的产量提高了16倍。蛋白质组学结果表明：变温培养增加了次级代谢物生物合成途径相关基因的表达,同时却阻遏了与菌丝生长相关的基因表达[63]。此外,VeA作为参与光照调控的重要调控因子也是连接VelB和LaeA形成复合体的重要桥梁。多种微生物共培养可以刺激产生新的次级代谢物。华南农业大学李春远课题组研究发现,两株红树林真菌Phomopsis sp. K38和Alternariasp. E33共培养后刺激了环肽化合物[64]、二酰亚胺化合物[65]和四肽化合物[66]的产生。同时海洋真菌Emericella sp.与放线菌Salinispora arenicola共培养刺激了emericellamides的大量产生[67]。类似的现象还很多,这些次级代谢产物在微生物间的通讯中也扮演着重要的角色。因此,多种微生物的共培养为隐形次级代谢物的激活提供了新的策略。
4 丝状真菌初级代谢和次级代谢调控关系
次级代谢与初级代谢息息相关,初级代谢为次级代谢物的合成提供前体和辅因子。次级代谢的前体可以是中心碳代谢的中间体,也可以是参与合成代谢反应的细胞组成元件。通常认为次级代谢从中心碳代谢获取代谢物的能力依赖于代谢物在细胞内的浓度以及次级代谢途径第一个反应酶的活力。通向中心碳代谢的代谢流通常比通向次级代谢合成的代谢流高很多,当通向次级代谢物合成的代谢流增加时,会显著地影响到中心碳代谢代谢物的浓度和次级代谢途径第一个酶转化前体的能力,此时可以通过提高次级代谢物生物合成基因的表达而提高次级代谢物的产量。然而,当前体是细胞组成元件时,将不能通过增加生物合成基因或者调控基因的表达而改变次级代谢流。初级代谢除了为次级代谢提供合成前体外,还可以为其提供辅因子,例如在青霉素和头孢菌素等β-内酰胺类抗生素合成过程中需要大量的NADPH作为还原力。为了满足青霉素合成对NADPH的需求,可以增加戊糖磷酸途径中的代谢流。通过比对分析青霉素高产菌株和低产菌株中心碳代谢流发现,高产菌株通过戊糖磷酸途径的代谢流高于低产菌株,这一结果与青霉素合成需要大量NADPH恰恰一致[68]。推测丝状真菌对前体和辅因子需求量的增加也是限制抗生素产量提高的重要因素,因此可以通过改造丝状真菌初级代谢途径来增加次级代谢物的产量。丝状真菌次级代谢物什么时间产生是一个重要的科学问题,普遍认为它产生于生命周期特定的时间点和特定的环境条件下。次级代谢物合成的开启也被认为是初级代谢过程的结束。初级代谢向次级代谢的转换往往与营养耗尽、光照缺少、生殖结构发育、pH变化等密切相关。研究表明构巢曲霉和黄曲霉中次级代谢物合成的开启与有性子实体的形成和菌核的产生有很强的关联性,分生孢子的产生与参与孢子色素合成相关基因的表达也有很强的相关性[69]。初级代谢向次级代谢转换的过程中往往伴随着信号分子的产生,而信号分子对次级代谢物的产生具有诱导作用。如群感效应分子在链霉菌次级代谢物合成的开启中起到决定性的作用一样,群感效应分子与丝状真菌的形态分化和次级代谢物的产生也具有相关性。如构巢曲霉和黄曲霉中的群感效应分子氧脂素不仅在调节有性孢子和无性孢子的比例中起关键作用,同时还影响柄曲霉素和黄曲霉毒素的产生[70]。除了信号分子诱导之外,环境压力胁迫也是次级代谢产物开启的重要因素,例如委内瑞拉链霉菌中杰多霉素B的产生需要噬菌体的入侵或者乙醇的诱导[71]。丝状真菌中也存在类似的现象,如黄曲霉中活性氧的产生或者体外添加氧化物能够诱导黄曲霉毒素的产生[72]。然而关于群感效应分子和胁迫诱导丝状真菌次级代谢物产生的作用机制尚不清楚,这也是未来丝状真菌次级代谢研究需要加强的地方。
5 翻译后水平对丝状真菌次级代谢的 调控
自噬是真核细胞中普遍存在且高度保守的细胞降解和营养再利用过程。而丝状真菌自噬与次级代谢间的关系还鲜有报道。本课题组发现顶头孢霉自噬基因Acatg1、Acatg8和Acatg11均参与孢子的产生和头孢菌素的合成[73, 74]。Acatg1和Acatg8正调控分生孢子的产生,但负调控头孢菌素的合成。敲除Acatg1和Acatg8能够通过增强发酵后期头孢菌素合成蛋白的稳定性提高抗生素产量。而Acatg11则负调控分生孢子的产生,但正调控头孢菌素的合成。这说明不同的自噬基因在次级代谢中发挥的功能不同。CsnE/Csn5是泛素-蛋白酶体的重要组成部分,并被证明参与丝状真菌形态分化和次级代谢。尹文兵课题组发现敲除PfcsnE导致无花果拟盘多毛孢不再产生分生孢子,同时次级代谢物的合成也受到了影响。PfcsnE突变株中产生了更多的氯代二苯酮,但是ficiolide A的产量却有所下降,同时PfcsnE的敲除还激活了7种化合物的产生[75]。转录组分析表明,PfcsnE的存在分别上调了9个以及下调了3个生物合成基因簇的表达[76]。浙江大学李红叶课题组敲除Aacsn5导致链格孢(Alternaria alternata)菌丝生长和分生孢子产生都受到了影响,转录组数据表明,Aacsn5调控与分生孢子产生和侵染相关的次级代谢物的合成[77]。
肌动蛋白Ⅰ抑制剂氰烯菌酯能够特异性抑制肌球蛋白Ⅰ ATP水解酶的活性。马忠华课题组发现,氰烯菌酯通过抑制肌球蛋白Ⅰ ATP水解酶的活性抑制禾谷镰刀菌毒素小体的形成,并降低DON的产生。研究表明肌动蛋白Ⅰ(FgMyo I)还与核糖体相关蛋白FgAsc1互作,调控DON生物合成关键酶Tri1的翻译。然而肌球蛋白Ⅰ与被测试的其他次级代谢物的生物合成不相关。此项研究揭示了肌球蛋白Ⅰ参与调控真菌毒素生物合成的新功能[78]。微管末端结合蛋白能够调控酵母细胞微管的动态性、细胞的极性以及染色体的稳定性,而在丝状真菌中的功能不清楚。马忠华课题组发现,微管末端结合蛋白同源基因FgEB1调控禾谷镰刀菌的细胞极性以及对杀菌剂的敏感性,FgEB1缺失显著降低DON产量[79]。该课题组还发现禾谷镰刀菌中含有8个几丁质合成酶基因,其中FgChs2、FgChs4、FgChs7和FgChs5的缺失不同程度地削弱了DON的产生,同时FgChs2与其他几丁质酶基因的双缺失进一步降低了DON产量,说明几丁质酶与真菌毒素合成之间存在很强的关联性[80]。
AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)在丝状真菌营养代谢中具有重要作用。朱旭东课题组发现AMPK的同源基因snf1参与小孢拟盘多毛孢的初级代谢、细胞壁合成以及对渗透压的感应,snf1的破坏延迟了气生菌丝的生长,降低了分生孢子数量,同时pestalotiollide B不再产生,这说明Snf1也是参与次级代谢的关键因子[81]。陈福生课题组发现G蛋白α亚基编码基因Mga1的缺失导致红曲霉中橘霉素的产量提高了9倍,其他色素的产量也增加了71%,因此Mga1除了参与信号转导途径之外还调控次级代谢物的合成[82]。G蛋白信号转导途径中的FlbA同源基因的缺失除了阻碍分生孢子萌发,还抑制了橘霉素和色素的产生[83],蛋白组学的分析也证实了这一结果[84]。
真核生物通过外界信号在细胞表面和细胞核之间的传递进行细胞通讯,其中有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)级联系统是关键因素之一。MAP3K磷酸化MAP2K,MAP2K磷酸化MAPK,而MAPK通过磷酸化细胞核内的目标蛋白从而激活特定的基因表达[85]。AnFus3是MAPK在构巢曲霉中的同源蛋白,是负责蛋白入核的重要因子。AnFus3通过与保守的核转录因子AnSte12互作从而起始性发育过程。AnFus3能与磷酸化的VeA互作,进而调控丝状真菌的形态分化和次级代谢[86]。这个级联传递系统中的所有因子都参与了粗糙脉孢菌的形态分化、无性和有性发育过程[87]。我国****对MAPK与丝状真菌形态分化和次级代谢间关系的研究较少。哈尔滨商业大学杨萍发现棘孢木霉(T. asperellum)中MAPK基因task1与菌体的形态分化、真菌寄生体的互作以及次级代谢都有很强的相关性。task1的缺失增加了6-戊基-吡喃酮产量,也增强了对病原菌生长的抑制作用[88]。河北农业大学董金皋课题组发现玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)中MAPK编码基因StPBS2参与菌体的形态分化、分生孢子产生、细胞壁发育、耐药性以及次级代谢物的合成。StPBS2受到干扰的菌株与野生株相比产生了更多红色的次级代谢物,而且基因干扰的程度与次级代谢物的量呈正相关[89]。
6 结语与展望
丝状真菌次级代谢具有多层次调控的特点,主要包括转录水平调控、表观遗传调控和翻译后水平调控等,最终形成一个具有高度组织性且十分精密的调控网络(图2)。丝状真菌次级代谢分子调控领域,我国从无到有,目前已取得了长足的进步。基于丝状真菌与宿主相互作用的理念,范艳华课题组在国际上首次揭示了卵孢素通过抑制死亡虫体上的细菌来竞争营养物质[26]。丝状真菌隐性基因簇激活和新型化合物挖掘是国际上新兴的研究领域,通过异源表达、定向遗传改造、表观遗传修饰以及物种间互作等,能够获得多种新结构代谢产物(图3)。我国科研人员也积极开展了相关工作,毛旭明和胡友财课题组通过表观遗传的改变快速同时激活齿梗孢霉多个隐性基因簇[38],尹文兵课题组先后在无花果拟盘多毛孢和罗氏绿僵菌通过隐性基因簇激活获得了多种新结构化合物[42, 43]。越来越多的研究成果极大地促进了我国在丝状真菌次级代谢调控领域的国际竞争力。图2
新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT图2丝状真菌次级代谢调控网络
Fig. 2Regulation of filamentous fungi secondary metabolism
图3
新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT图3丝状真菌隐性基因簇激活和新型化合物挖掘策略
Fig. 3Strategies of gene activation and novel compound mining in filamentous fungi
然而我国丝状真菌次级代谢调控研究在总体方面仍相对薄弱,原创性的具有突破性的科研成果仍然不多,研究也不够系统和深入。除了上述丝状真菌与宿主的相互作用以及隐性基因簇激活外,一些领域也应当给予关注。例如,丝状真菌次级代谢是否受群感效应的调控以及具体的分子机制是什么?丝状真菌自噬与次级代谢之间存在怎样的联系?丝状真菌初级代谢和次级代谢之间的关联性以及其作用的分子基础是什么?借助对丝状真菌次级代谢调控的深入研究,人们能够通过定向遗传改造提高许多重要丝状真菌次级代谢物的产量,并激活隐性次级代谢物生物合成基因簇的表达。然而这些在实验室效果良好的调控方式,在工业生产菌株中很可能无法达到预期目标。未来可以借助转录组、蛋白组和代谢组等数据分析以及基因组编辑,系统、理性地筛选出重要的目标基因,将理性改造与传统诱变相结合,更好的提高重要次级代谢物的产量和靶向激活隐性基因簇。此外,需要加强多学科的交叉,通过合成生物学手段,将化学、遗传学、分子生物学和计算生物学等学科结合起来,更加理性地设计和改造丝状真菌次级代谢途径和调控网络。
(责任编委: 何群)
参考文献 原文顺序
文献年度倒序
文中引用次数倒序
被引期刊影响因子
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URLPMID:16151250 [本文引用: 1]
Opportunistic animal and plant pathogens, well represented by the genus Aspergillus, have evolved unique mechanisms to adapt to and avoid host defenses. Aspergillus fumigatus, an increasingly serious pathogen owing to expanding numbers of immunocompromised patients, causes the majority of human infections; however, an inability to identify bona fide virulence factors has impeded therapeutic advances. We show that an A. fumigatus mutation in a developmentally expressed transcriptional regulator (Delta laeA) coordinating morphological and chemical differentiation reduces virulence in a murine model; impaired virulence is associated with decreased levels of pulmonary gliotoxin and multiple changes in conidial and hyphal susceptibility to host phagocytes ex vivo. LaeA, a conserved protein in filamentous fungi, is a developmental regulator of virulence genes and, possibly, the first antimicrobial target specific to filamentous fungi that are pathogenic to plants and animals.
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背景： 丝状真菌是一类重要的微生物,具有丰富的次级代谢谱,其中不乏一些重要的活性物质,包括抗生素、抗癌物质、降胆固醇类物质以及免疫抑制剂等,可见丝状真菌是重要的天然产物宝库,对其次级代谢及生长发育即全局性调控的研究是十分重要且有必要的。但是对真菌的次级代谢及生长发育的调控较原核生物更复杂,近些年的研究表明真菌的次级代谢除了受途径特异性调控因子的调控外还受到全局性调控因子的全局调控,具有复杂的层级网络调控关系。 2004年在构巢曲霉中分离鉴定了一种全局性调控因子LaeA,其普遍存在于丝状真菌中,调控次级代谢生物合成的同时影响多项生长发育相关的途径。LaeA作为丝状真菌中十分重要的的全局性调控因子,是近些年丝状真菌中的研究热点,并有了许多重要的进展,2008年在构巢曲霉中发现了LaeA/VeA/VelB蛋白三聚体所调控的全局性调控网络,至此LaeA的研究进入一个新的层面,研究方向也更多地集中在全局网络的确定以及调控机制的阐明方面。 橘青霉是一类重要的降胆固醇类药物美伐他汀的产生菌,除此之外作为重要的丝状真菌,还具有产生许多其他生物活性物质的潜力,但是到目前为止关于其生长发育和次级代谢调控的研究还较少,所以对橘青霉内调控网络的研究具有十分重要的基础科学意义和社会应用价值。本实验室已经就橘青霉展开了一些基础工作,包括菌株培养、遗传转化体系的构建以及全局性调控因子LaeA的克隆等。LaeA作为丝状真菌中典型的全局性调控因子,已证明在丝状真菌调控网络中扮演着重要的角色。以LaeA作为出发点去研究橘青霉中次级代谢产物生物合成的调控网络具有较好的研究基础。生物合成调控网络伴随着许多关键蛋白间的相互作用,因此对橘青霉中的LaeA蛋白相互作用研究有助于阐明LaeA在橘青霉中的网络调控机制,有利于挖掘相关蛋白拓展橘青霉次级代谢产物生物合成的调控网络,从而达到提高美伐他汀产量和产生新的天然活性化合物的最终目的。 目的： 本文旨在通过体外探究橘青霉中LaeA与VeA的相互作用以及体内串联亲和与LaeA相互作用蛋白来初步推测LaeA的全局调控网络,为接下来的调控机制研究奠定基础。 方法： 1.将LaeA与VeA串联在PET-Duet-1原核表达载体上在BL21型大肠杆菌中异源共表达,利用镍亲和纯化的方法纯化出带有His标签的VeA蛋白,同时SDS-PAGE检测是否存在由于与VeA的结合而被纯化出来的LaeA以此来体外验证LaeA与VeA是否具有相互作用。 2.构建功能域S-腺苷甲硫氨酸(SAM)结合域缺失型LaeA基因即LaeA (ΔSAM),利用方法1中的异源共表达方法探究SAM Domain在LaeA蛋白相互作用中所扮演的角色。 3.过表达LaeA (ΔSAM)后研究SAM Domain对LaeA的全局调控功能的影响：利用HPLC检测美伐他汀产量；血细胞计数板计算孢子的产量。 4.构建LaeA串联亲和载体PGiHTGi-TAP-LaeA,通过农杆菌介导的橘青霉遗传转化体系转入橘青霉中并利用镍亲和和链霉亲和素两步纯化筛选与LaeA相互作用的蛋白,然后通过MALDI-TOF生物质谱鉴定蛋白,最后通过对鉴定的蛋白生物信息学分析初步推测橘青霉中LaeA的全局性调控网络。结果： 1. LaeA与VeA共表达后,经镍亲和纯化后SDS-PAGE考染结果显示LaeA与VeA同时被纯化出来,证实LaeA与VeA体外具有相互作用。 2.利用重叠PCR的方法成功获得SAM Domain缺失型LaeA基因即LaeA (ΔSAM),将LaeA (ΔSAM)与VeA共表达后,经镍亲和纯化仅有VeA被纯化出来,证实LaeA在缺失SAM Domain后失去了与VeA结合的能力。 3.利用农杆菌介导的橘青霉转化方法得到LaeA (ΔSAM)过表达型橘青霉即OE::LaeA(ΔSAM)菌株,发酵七天后HPLC检测其美伐他汀的产量相对于OE::LaeA有很明显的降低,更接近WT; OE::LaeA (ΔSAM)的孢子产量比WT低31%,而OE::LaeA的孢子产量则仅比WT低9.9%。 4.成功构建LaeA串联亲和表达载体PGiHTGi-SBP-LaeA-His,利用农杆菌介导的橘青霉遗传转化体系转入橘青霉中,经链霉亲和素结合肽和镍亲和两步纯化后经SDS-PAGE检测得到与LaeA相互作用蛋白。 5.将4中串联亲和得到的蛋白进行胶内酶解后MALDI-TOF质谱鉴定蛋白,成功鉴定到5个与LaeA相互作用蛋白,结合文献资料以及生物信息学分析推测其中3种蛋白与LaeA全局调控有关：Protein sey-1是一种GTP-binding protein可能与橘青霉内G蛋白信号通路的调控有关；DST1-like protein是一种锌指类转录调控因子,涉及到生物合成基因簇的转录；Cystathionine-β-synthase (CBS)是胱硫醚-p-合成酶,其含有典型的CBS domain,可以与许多蛋白结构结合从而使该蛋白对带有腺苷结构的配体敏感,同时其具有SAM结合位点,推测可能与LaeA的组蛋白甲基转移修饰相关。 结论： 橘青霉中的LaeA与VeA在体外具有相互作用,且LaeA的SAM Domain是其与VeA蛋白相互作用中不可或缺的结构域；SAM Domain是LaeA调控美伐他汀合成和孢子产量的重要功能域；推测LaeA可能受到G蛋白Seyl相关的信号通路的影响,并通过与锌指类转录因子DSTl-like Protein结合来调控次级代谢,另外LaeA还可能通过与CBS结合从而刺激SAM结合能力从而影响LaeA的组蛋白甲基转移修饰。这些结果有助于深入理解橘青霉中LaeA调控网络,为接下来的遗传改造奠定基础。
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背景： 丝状真菌是一类重要的微生物,具有丰富的次级代谢谱,其中不乏一些重要的活性物质,包括抗生素、抗癌物质、降胆固醇类物质以及免疫抑制剂等,可见丝状真菌是重要的天然产物宝库,对其次级代谢及生长发育即全局性调控的研究是十分重要且有必要的。但是对真菌的次级代谢及生长发育的调控较原核生物更复杂,近些年的研究表明真菌的次级代谢除了受途径特异性调控因子的调控外还受到全局性调控因子的全局调控,具有复杂的层级网络调控关系。 2004年在构巢曲霉中分离鉴定了一种全局性调控因子LaeA,其普遍存在于丝状真菌中,调控次级代谢生物合成的同时影响多项生长发育相关的途径。LaeA作为丝状真菌中十分重要的的全局性调控因子,是近些年丝状真菌中的研究热点,并有了许多重要的进展,2008年在构巢曲霉中发现了LaeA/VeA/VelB蛋白三聚体所调控的全局性调控网络,至此LaeA的研究进入一个新的层面,研究方向也更多地集中在全局网络的确定以及调控机制的阐明方面。 橘青霉是一类重要的降胆固醇类药物美伐他汀的产生菌,除此之外作为重要的丝状真菌,还具有产生许多其他生物活性物质的潜力,但是到目前为止关于其生长发育和次级代谢调控的研究还较少,所以对橘青霉内调控网络的研究具有十分重要的基础科学意义和社会应用价值。本实验室已经就橘青霉展开了一些基础工作,包括菌株培养、遗传转化体系的构建以及全局性调控因子LaeA的克隆等。LaeA作为丝状真菌中典型的全局性调控因子,已证明在丝状真菌调控网络中扮演着重要的角色。以LaeA作为出发点去研究橘青霉中次级代谢产物生物合成的调控网络具有较好的研究基础。生物合成调控网络伴随着许多关键蛋白间的相互作用,因此对橘青霉中的LaeA蛋白相互作用研究有助于阐明LaeA在橘青霉中的网络调控机制,有利于挖掘相关蛋白拓展橘青霉次级代谢产物生物合成的调控网络,从而达到提高美伐他汀产量和产生新的天然活性化合物的最终目的。 目的： 本文旨在通过体外探究橘青霉中LaeA与VeA的相互作用以及体内串联亲和与LaeA相互作用蛋白来初步推测LaeA的全局调控网络,为接下来的调控机制研究奠定基础。 方法： 1.将LaeA与VeA串联在PET-Duet-1原核表达载体上在BL21型大肠杆菌中异源共表达,利用镍亲和纯化的方法纯化出带有His标签的VeA蛋白,同时SDS-PAGE检测是否存在由于与VeA的结合而被纯化出来的LaeA以此来体外验证LaeA与VeA是否具有相互作用。 2.构建功能域S-腺苷甲硫氨酸(SAM)结合域缺失型LaeA基因即LaeA (ΔSAM),利用方法1中的异源共表达方法探究SAM Domain在LaeA蛋白相互作用中所扮演的角色。 3.过表达LaeA (ΔSAM)后研究SAM Domain对LaeA的全局调控功能的影响：利用HPLC检测美伐他汀产量；血细胞计数板计算孢子的产量。 4.构建LaeA串联亲和载体PGiHTGi-TAP-LaeA,通过农杆菌介导的橘青霉遗传转化体系转入橘青霉中并利用镍亲和和链霉亲和素两步纯化筛选与LaeA相互作用的蛋白,然后通过MALDI-TOF生物质谱鉴定蛋白,最后通过对鉴定的蛋白生物信息学分析初步推测橘青霉中LaeA的全局性调控网络。结果： 1. LaeA与VeA共表达后,经镍亲和纯化后SDS-PAGE考染结果显示LaeA与VeA同时被纯化出来,证实LaeA与VeA体外具有相互作用。 2.利用重叠PCR的方法成功获得SAM Domain缺失型LaeA基因即LaeA (ΔSAM),将LaeA (ΔSAM)与VeA共表达后,经镍亲和纯化仅有VeA被纯化出来,证实LaeA在缺失SAM Domain后失去了与VeA结合的能力。 3.利用农杆菌介导的橘青霉转化方法得到LaeA (ΔSAM)过表达型橘青霉即OE::LaeA(ΔSAM)菌株,发酵七天后HPLC检测其美伐他汀的产量相对于OE::LaeA有很明显的降低,更接近WT; OE::LaeA (ΔSAM)的孢子产量比WT低31%,而OE::LaeA的孢子产量则仅比WT低9.9%。 4.成功构建LaeA串联亲和表达载体PGiHTGi-SBP-LaeA-His,利用农杆菌介导的橘青霉遗传转化体系转入橘青霉中,经链霉亲和素结合肽和镍亲和两步纯化后经SDS-PAGE检测得到与LaeA相互作用蛋白。 5.将4中串联亲和得到的蛋白进行胶内酶解后MALDI-TOF质谱鉴定蛋白,成功鉴定到5个与LaeA相互作用蛋白,结合文献资料以及生物信息学分析推测其中3种蛋白与LaeA全局调控有关：Protein sey-1是一种GTP-binding protein可能与橘青霉内G蛋白信号通路的调控有关；DST1-like protein是一种锌指类转录调控因子,涉及到生物合成基因簇的转录；Cystathionine-β-synthase (CBS)是胱硫醚-p-合成酶,其含有典型的CBS domain,可以与许多蛋白结构结合从而使该蛋白对带有腺苷结构的配体敏感,同时其具有SAM结合位点,推测可能与LaeA的组蛋白甲基转移修饰相关。 结论： 橘青霉中的LaeA与VeA在体外具有相互作用,且LaeA的SAM Domain是其与VeA蛋白相互作用中不可或缺的结构域；SAM Domain是LaeA调控美伐他汀合成和孢子产量的重要功能域；推测LaeA可能受到G蛋白Seyl相关的信号通路的影响,并通过与锌指类转录因子DSTl-like Protein结合来调控次级代谢,另外LaeA还可能通过与CBS结合从而刺激SAM结合能力从而影响LaeA的组蛋白甲基转移修饰。这些结果有助于深入理解橘青霉中LaeA调控网络,为接下来的遗传改造奠定基础。
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URLPMID:18973828 [本文引用: 1]
Filamentous fungi produce a diverse array of secondary metabolites 鈥 small molecules that are not necessary for normal growth or development. Secondary metabolites have a tremendous impact on society; some are exploited for their antibiotic and pharmaceutical activities, others are involved in disease interactions with plants or animals. The availability of fungal genome sequences has led to an enhanced effort at identifying biosynthetic genes for these molecules. Genes that regulate production of secondary metabolites have been identified and a link between secondary metabolism, light and sexual/asexual reproduction established. However, the role of secondary metabolites in the fungi that produce them remains a mystery. Many of these fungi live saprophytically in the soil and such molecules may provide protection against other inhabitants in this ecological niche.
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URLPMID:18457967 [本文引用: 1]
In fungi, the velvet gene, or veA , is involved in the regulation of diverse cellular processes, including control of asexual and sexual development as well as secondary metabolism. This global regulator is conserved in numerous fungal species. Interestingly, in Aspergilli, where most of the studies on veA have been carried out, this gene has been described to mediate development in response to light. In recent years the knowledge of this important regulatory system has expanded through the use of Aspergillus nidulans as a model organism, and through the study of veA orthologs across fungal genera. This review includes information on the current understanding of veA function and its mechanism of action. The fact that veA has only been found in fungi, together with advances in the elucidation of the veA mechanism, might be useful in designing future control strategies to decrease the detrimental effects of fungi while enhancing those qualities that are beneficial.
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URLPMID:18556559 [本文引用: 1]
Abstract Differentiation and secondary metabolism are correlated processes in fungi that respond to light. In Aspergillus nidulans, light inhibits sexual reproduction as well as secondary metabolism. We identified the heterotrimeric velvet complex VelB/VeA/LaeA connecting light-responding developmental regulation and control of secondary metabolism. VeA, which is primarily expressed in the dark, physically interacts with VelB, which is expressed during sexual development. VeA bridges VelB to the nuclear master regulator of secondary metabolism, LaeA. Deletion of either velB or veA results in defects in both sexual fruiting-body formation and the production of secondary metabolites.
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背景：丝状真菌是一类重要的微生物,一些工业菌株能够产生抗生素、有机酸、降胆固醇物质、抗病毒物质、抗癌物质和免疫抑制剂等对人类有益的物质,也会产生一些对人类有害的次级代谢产物,如柄曲霉素、黄曲霉毒素等真菌毒素。在人类生产和生活上起着十分重要的作用。。 真菌次级代谢生物合成途径主要包括PKS和NRPS两个途径,次级代谢生物合成基因总是成簇存在的,其调控体系是一个复杂的网络。调控真菌次级代谢产物的调控因子主要包括：位于生物合成基因簇上的途径特异性调控因子、与生物合成基因簇没有直接关联的信号途径调控性因子、近些年来发现并被提出的全局性调控因子VeA和LaeA。 全局性的调控因子VeA,是E.Kfer等人于1965年第一次在构巢曲霉中发现的一个能够影响构巢曲霉有性繁殖和无性繁殖比例的调控因子,进一步研究发现,它不仅对形态发育有着一定程度的影响,同时也调控着丝状真菌有益物质以及真菌毒素等次级代谢产物的产生,是一个十分重要的丝状真菌的全局性调控因子。它对次级代谢产物生物合成基因簇的调控作用,为真菌理性遗传改造提供了一条重要的全新途径；它对未知次级代谢产物基因簇的调控作用和对沉默基因的转录激活,使基于全局性调控因子的遗传操作成为寻找新型天然产物的新思路。迄今为止,veA的同源基因已经分别在烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)被克隆得到。 他汀类药物由于其它药物所无法比拟的降胆固醇效果,是降血脂药物中的首要选择。自从1987年洛伐他汀获得FDA批准用于临床,成为第一个投入市场的他汀类药物以来,相继开发了许多半合成和全合成的他汀类药物,并且其中许多获得批准上市的药物在市场上都长期占有极大的份额。除常用的最重要的降脂功能外,他汀类药物还开拓了许多新的治疗领域。美伐他汀是最早被发现的他汀类化合物,目前主要作为转化前体受到广泛关注。因此,对其生物来源的寻求和通过菌种改良的方式来进一步提高其产量在工业上有着十分重要的意义。 目的：本实验选取一株美伐他汀产生菌M2,从M2中克隆得到veA的同源基因Pci-veA,并对其进行生物信息学分析。比较它在不同阶段的表达情况、菌体生物量的变化情况和美伐他汀的比生长率变化情况,同时观察光照及黑暗条件对其生长形态上的影响,进而推断它们之间可能存在的调控关系。 方法：本实验中根据同源基因序列设计简并引物,RT-PCR克Pci-veA隆核心序列,分别设计随机引物和嵌套引物,采用TAIL-PCR和RACE技术,克隆3’端和5’端序列,根据拼接得到的全长设计上下游引物克隆得到DNA和cDNA序列,利用生物信息学和生理指标对其特性进行初步分析。 结果：从美伐他汀产生菌橘青霉中克隆得到veA的同源基因Pci-veA,它的cDNA序列为1704个bp,DNA序列为1774bp,编码567个氨基酸,该基因与产黄青霉中发现的veA同源性为91%,和棒状曲霉中的veA相似性为61%。它编码的蛋白质分子量为62762.5道尔顿,等电点为9.10。序列比对在Pci-VeA的N-末端查找到了该基因的保守功能序列NLS区域(bipartite nuclear localization signal motif),和另外一个在构巢曲霉中也存在的pat7区域。表达情况的研究表明该基因的表达伴随橘青霉生长的整个阶段中,是一个组成型表达,而黑暗条件抑制其分生孢子的产生,光照条件上调并且提前分生孢子的产生。 结论：本文成功从美伐他汀产生菌橘青霉中克隆得到veA的同源基因Pci-veA,推断橘青霉Pci-VeA可能正调控美伐他汀的生物合成,并参与光照条件下分生孢子的形成。该基因的成功克隆以及在美伐他汀产生过程中的表达情况的初步研究,为下一步的功能研究和菌种改良提供了依据和平台。
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背景：丝状真菌是一类重要的微生物,一些工业菌株能够产生抗生素、有机酸、降胆固醇物质、抗病毒物质、抗癌物质和免疫抑制剂等对人类有益的物质,也会产生一些对人类有害的次级代谢产物,如柄曲霉素、黄曲霉毒素等真菌毒素。在人类生产和生活上起着十分重要的作用。。 真菌次级代谢生物合成途径主要包括PKS和NRPS两个途径,次级代谢生物合成基因总是成簇存在的,其调控体系是一个复杂的网络。调控真菌次级代谢产物的调控因子主要包括：位于生物合成基因簇上的途径特异性调控因子、与生物合成基因簇没有直接关联的信号途径调控性因子、近些年来发现并被提出的全局性调控因子VeA和LaeA。 全局性的调控因子VeA,是E.Kfer等人于1965年第一次在构巢曲霉中发现的一个能够影响构巢曲霉有性繁殖和无性繁殖比例的调控因子,进一步研究发现,它不仅对形态发育有着一定程度的影响,同时也调控着丝状真菌有益物质以及真菌毒素等次级代谢产物的产生,是一个十分重要的丝状真菌的全局性调控因子。它对次级代谢产物生物合成基因簇的调控作用,为真菌理性遗传改造提供了一条重要的全新途径；它对未知次级代谢产物基因簇的调控作用和对沉默基因的转录激活,使基于全局性调控因子的遗传操作成为寻找新型天然产物的新思路。迄今为止,veA的同源基因已经分别在烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)被克隆得到。 他汀类药物由于其它药物所无法比拟的降胆固醇效果,是降血脂药物中的首要选择。自从1987年洛伐他汀获得FDA批准用于临床,成为第一个投入市场的他汀类药物以来,相继开发了许多半合成和全合成的他汀类药物,并且其中许多获得批准上市的药物在市场上都长期占有极大的份额。除常用的最重要的降脂功能外,他汀类药物还开拓了许多新的治疗领域。美伐他汀是最早被发现的他汀类化合物,目前主要作为转化前体受到广泛关注。因此,对其生物来源的寻求和通过菌种改良的方式来进一步提高其产量在工业上有着十分重要的意义。 目的：本实验选取一株美伐他汀产生菌M2,从M2中克隆得到veA的同源基因Pci-veA,并对其进行生物信息学分析。比较它在不同阶段的表达情况、菌体生物量的变化情况和美伐他汀的比生长率变化情况,同时观察光照及黑暗条件对其生长形态上的影响,进而推断它们之间可能存在的调控关系。 方法：本实验中根据同源基因序列设计简并引物,RT-PCR克Pci-veA隆核心序列,分别设计随机引物和嵌套引物,采用TAIL-PCR和RACE技术,克隆3’端和5’端序列,根据拼接得到的全长设计上下游引物克隆得到DNA和cDNA序列,利用生物信息学和生理指标对其特性进行初步分析。 结果：从美伐他汀产生菌橘青霉中克隆得到veA的同源基因Pci-veA,它的cDNA序列为1704个bp,DNA序列为1774bp,编码567个氨基酸,该基因与产黄青霉中发现的veA同源性为91%,和棒状曲霉中的veA相似性为61%。它编码的蛋白质分子量为62762.5道尔顿,等电点为9.10。序列比对在Pci-VeA的N-末端查找到了该基因的保守功能序列NLS区域(bipartite nuclear localization signal motif),和另外一个在构巢曲霉中也存在的pat7区域。表达情况的研究表明该基因的表达伴随橘青霉生长的整个阶段中,是一个组成型表达,而黑暗条件抑制其分生孢子的产生,光照条件上调并且提前分生孢子的产生。 结论：本文成功从美伐他汀产生菌橘青霉中克隆得到veA的同源基因Pci-veA,推断橘青霉Pci-VeA可能正调控美伐他汀的生物合成,并参与光照条件下分生孢子的形成。该基因的成功克隆以及在美伐他汀产生过程中的表达情况的初步研究,为下一步的功能研究和菌种改良提供了依据和平台。
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URLPMID:23178386 [本文引用: 1]
Abstract Fungi produce a multitude of low-molecular-mass compounds known as secondary metabolites, which have roles in a range of cellular processes such as transcription, development and intercellular communication. In addition, many of these compounds now have important applications, for instance, as antibiotics or immunosuppressants. Genome mining efforts indicate that the capability of fungi to produce secondary metabolites has been substantially underestimated because many of the fungal secondary metabolite biosynthesis gene clusters are silent under standard cultivation conditions. In this Review, I describe our current understanding of the regulatory elements that modulate the transcription of genes involved in secondary metabolism. I also discuss how an improved knowledge of these regulatory elements will ultimately lead to a better understanding of the physiological and ecological functions of these important compounds and will pave the way for a novel avenue to drug discovery through targeted activation of silent gene clusters.
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URLPMID:20433937 [本文引用: 1]
Filamentous fungi produce a multitude of low molecular weight bioactive compounds. The increasing number of fungal genome sequences impressively demonstrated that their biosynthetic potential is far from being exploited. In fungi, the genes required for the biosynthesis of a secondary metabolite are clustered. Many of these bioinformatically newly discovered secondary metabolism gene clusters are silent under standard laboratory conditions. Consequently, no product can be found. This review summarizes the current strategies that have been successfully applied during the last years to activate these silent gene clusters in filamentous fungi, especially in the genus The techniques take advantage of genome mining, vary from the simple search for compounds with bioinformatically predicted physicochemical properties up to methods that exploit a probable interaction of microorganisms. Until now, the majority of successful approaches have been based on molecular biology like the generation of gene nock outs, promoter exchange, overexpression of transcription factors or other pleiotropic regulators. Moreover, strategies based on epigenetics opened a new avenue for the elucidation of the regulation of secondary metabolite formation and will certainly continue to play a significant role for the elucidation of cryptic natural products. The conditions under which a given gene cluster is naturally expressed are largely unknown. One technique is to attempt to simulate the natural habitat by co-cultivation of microorganisms from the same ecosystem. This has already led to the activation of silent gene clusters and the identification of novel compounds in Aspergillus nidulans. These simulation strategies will help discover new natural products in the future, and may also provide fundamental new insights into microbial communication.
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头孢菌素C(CPC)是治疗细菌感染的β-内酰胺类抗生素合成的主要前体,丝状真菌顶头孢霉是CPC的主要生产菌。在传统菌种选育过程中顶头孢霉经历多轮诱变和筛选使其CPC生产能力得到显著提高,但是发生在高产背后的遗传变化仍然未知。初级代谢通过向次级代谢提供前体和辅因子与其联系在一起,并且前体和辅因子是高产菌中抗生素产量的限制因素。在本研究中利用实验室建立的RNA测序数据和代谢物谱对高低产菌中的初级代谢进行比较分析,更好的理解了初级代谢和CPC生物合成之间的关系,有利于使用合理代谢工程手段提高CPC产量。首先对顶头孢霉中心碳代谢途径中基因转录水平进行分析,发现高产菌在发酵早期上调糖酵解途径中的基因转录水平快速消耗葡萄糖开始CPC合成,发酵后期对3-磷酸甘油酸(3PG)上下游基因转录水平的不同调控导致糖异生途径中的碳流导向3PG最终提高丝氨酸合成;在三羧酸循环中高产菌下调柠檬酸合酶基因转录水平迫使更多丙酮酸参与缬氨酸合成,而琥珀酸脱氢酶基因转录水平上调可能导致苹果酸合成增加,从而有更多苹果酸进入糖异生途径生成3PG;高产菌在乙醛酸循环中上调异柠檬酸裂解酶和苹果酸合酶基因转录水平,乙醛酸循环更加活跃生成更多琥珀酸;高产菌发酵早期戊糖磷酸途径中能生成NADPH的两个酶转录水平上调,而在发酵后期γ-氨基丁酸支路中琥珀酸半醛脱氢酶基因转录水平发生显著上调,这些都导致有更多NADPH参与CPC生物合成。将高低产菌中初级代谢中间产物胞内含量进行比较,发现葡萄糖、3PG、苹果酸和琥珀酸在高低产菌中差别比较大,其含量变化趋势与基因转录水平相一致。其次对CPC前体氨基酸合成途径基因转录水平进行分析,发现高产菌半胱氨酸合成途径中编码胱硫醚-γ-裂解酶、胱硫醚-β-合酶和S-腺苷甲硫氨酸合酶的基因转录水平上调;丝氨酸和缬氨酸生物合成途径基因转录水平在高产菌中均上调;高产菌赖氨酸合成途径中编码第一步反应酶基因转录水平上调,而编码最后一步反应酶基因转录水平下调。检测胞内丝氨酸、半胱氨酸、缬氨酸和α-氨基己二酸含量,发现高产菌中这些氨基酸含量都高于低产菌,与基因转录水平相一致。此外还对CPC进行体外和体内甲氧基化探索。体外实验从带棒链霉菌中克隆cmc I和cmc J基因,分别构建Cmc I和Cmc J蛋白表达载体并在体外纯化。将纯化后的Cmc I和Cmc J蛋白添加到变铅青链霉菌和顶头孢霉裂解液中对CPC进行转化。体内实验中构建了两个cmc I和cmc J基因的双表达载体,分别导入顶头孢霉中获得正确转化子并进行发酵产物LC-MS鉴定。
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头孢菌素C(CPC)是治疗细菌感染的β-内酰胺类抗生素合成的主要前体,丝状真菌顶头孢霉是CPC的主要生产菌。在传统菌种选育过程中顶头孢霉经历多轮诱变和筛选使其CPC生产能力得到显著提高,但是发生在高产背后的遗传变化仍然未知。初级代谢通过向次级代谢提供前体和辅因子与其联系在一起,并且前体和辅因子是高产菌中抗生素产量的限制因素。在本研究中利用实验室建立的RNA测序数据和代谢物谱对高低产菌中的初级代谢进行比较分析,更好的理解了初级代谢和CPC生物合成之间的关系,有利于使用合理代谢工程手段提高CPC产量。首先对顶头孢霉中心碳代谢途径中基因转录水平进行分析,发现高产菌在发酵早期上调糖酵解途径中的基因转录水平快速消耗葡萄糖开始CPC合成,发酵后期对3-磷酸甘油酸(3PG)上下游基因转录水平的不同调控导致糖异生途径中的碳流导向3PG最终提高丝氨酸合成;在三羧酸循环中高产菌下调柠檬酸合酶基因转录水平迫使更多丙酮酸参与缬氨酸合成,而琥珀酸脱氢酶基因转录水平上调可能导致苹果酸合成增加,从而有更多苹果酸进入糖异生途径生成3PG;高产菌在乙醛酸循环中上调异柠檬酸裂解酶和苹果酸合酶基因转录水平,乙醛酸循环更加活跃生成更多琥珀酸;高产菌发酵早期戊糖磷酸途径中能生成NADPH的两个酶转录水平上调,而在发酵后期γ-氨基丁酸支路中琥珀酸半醛脱氢酶基因转录水平发生显著上调,这些都导致有更多NADPH参与CPC生物合成。将高低产菌中初级代谢中间产物胞内含量进行比较,发现葡萄糖、3PG、苹果酸和琥珀酸在高低产菌中差别比较大,其含量变化趋势与基因转录水平相一致。其次对CPC前体氨基酸合成途径基因转录水平进行分析,发现高产菌半胱氨酸合成途径中编码胱硫醚-γ-裂解酶、胱硫醚-β-合酶和S-腺苷甲硫氨酸合酶的基因转录水平上调;丝氨酸和缬氨酸生物合成途径基因转录水平在高产菌中均上调;高产菌赖氨酸合成途径中编码第一步反应酶基因转录水平上调,而编码最后一步反应酶基因转录水平下调。检测胞内丝氨酸、半胱氨酸、缬氨酸和α-氨基己二酸含量,发现高产菌中这些氨基酸含量都高于低产菌,与基因转录水平相一致。此外还对CPC进行体外和体内甲氧基化探索。体外实验从带棒链霉菌中克隆cmc I和cmc J基因,分别构建Cmc I和Cmc J蛋白表达载体并在体外纯化。将纯化后的Cmc I和Cmc J蛋白添加到变铅青链霉菌和顶头孢霉裂解液中对CPC进行转化。体内实验中构建了两个cmc I和cmc J基因的双表达载体,分别导入顶头孢霉中获得正确转化子并进行发酵产物LC-MS鉴定。
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URLPMID:29357387 [本文引用: 1]
Abstract Myosin-I molecular motors are proposed to function as linkers between membranes and the actin cytoskeleton in several cellular processes, but their role in the biosynthesis of fungal secondary metabolites remain elusive. Here, we found that the myosin I of Fusarium graminearum (FgMyo1), the causal agent of Fusarium head blight, plays critical roles in mycotoxin biosynthesis. Inhibition of myosin I by the small molecule phenamacril leads to marked reduction in deoxynivalenol (DON) biosynthesis. FgMyo1 also governs translation of the DON biosynthetic enzyme Tri1 by interacting with the ribosome-associated protein FgAsc1. Disruption of the ATPase activity of FgMyo1 either by the mutation E420K, down-regulation of FgMyo1 expression or deletion of FgAsc1 results in reduced Tri1 translation. The DON biosynthetic enzymes Tri1 and Tri4 are mainly localized to subcellular structures known as toxisomes in response to mycotoxin induction and the FgMyo1-interacting protein, actin, participates in toxisome formation. The actin polymerization disruptor latrunculin A inhibits toxisome assembly. Consistent with this observation, deletion of the actin-associated proteins FgPrk1 and FgEnd3 also results in reduced toxisome formation. Unexpectedly, the FgMyo1-actin cytoskeleton is not involved in biosynthesis of another secondary metabolite tested. Taken together, this study uncovers a novel function of myosin I in regulating mycotoxin biosynthesis in filamentous fungi.
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