贾晓东
1 , 许梦洋
1 , 莫正海
1 , 2 , 宣继萍
1 , 2 , 翟敏
1 , 2 , 郭忠仁
, 1 , 2 , * 1 江苏省中国科学院植物研究所, 南京 2100142 江苏省农业种质资源保护与利用平台, 南京 210014Recent Advances in Phenolic Metabolites in Pecan Xiaodong Jia
1 , Mengyang Xu
1 , Zhenghai Mo
1 , 2 , Jiping Xuan
1 , 2 , Min Zhai
1 , 2 , Zhongren Guo
, 1 , 2 , * 1 Institute of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210014, China 2 The Jiangsu Provincial Platform for Conservation and Utilization of Agricultural Germplasm, Nanjing 210014, China 通讯作者: *E-mail: zhongrenguo@cnbg.net 责任编辑: 白羽红
收稿日期: 2019-01-11
接受日期: 2019-06-18
网络出版日期: 2020-01-01
基金资助: 国家自然科学基金 (31200502 )林业三新工程重大集成示范项目 (LYSX201644 )
Corresponding authors: *E-mail: zhongrenguo@cnbg.net Received: 2019-01-11
Accepted: 2019-06-18
Online: 2020-01-01
摘要 薄壳山核桃(Carya illinoensis )富含酚类代谢物, 具有显著的抗氧化活性。近年来, 我国薄壳山核桃产业快速发展, 种植面积迅速扩大。明确薄壳山核桃中的酚类代谢物组成及保健功效对于促进健康产业发展具有重要意义。迄今为止, 从薄壳山核桃中已检测出酚类代谢物67个, 其中包括单宁36个、类黄酮22个、酚酸9个, 水解后检测出酚类代谢物苷元34个。该文主要对薄壳山核桃酚类代谢物的组成、提取方法、含量、药理活性及与采后贮藏特性的关系进行综述, 以期为今后深入研究薄壳山核桃酚类代谢物与其生理活性的关系及挖掘薄壳山核桃酚类代谢物的保健价值提供依据。 关键词： 薄壳山核桃 ;
酚类 ;
代谢物 ;
研究进展 Abstract Pecan (Carya illinoensis ) is enriched in phenolic metabolites, which have significant antioxidant activity. In recent years, the pecan industry has developed rapidly in China, with drastic increase of planting area. It is of great significance to clarify the composition and health benefits of phenolic metabolites in pecan for promoting the healthy development of the industry. So far, a total of 67 phenolic metabolites have been detected from pecan, including 36 tannins, 22 flavonoids, and 9 phenolic acids. And 34 phenolic metabolite aglycones have been detected after hydrolysis. This paper summarizes the recent progresses in the composition, extraction method, content, pharmacological activity, and relationship with postharvest of phenolic metabolites in pecan. These data are of great significance to further study the relationship between the phenolic metabolites and their physiological activities, and explore the health benefits of the phenolic metabolites in pecan. Keywords： Carya illinoensis ;
phenolic ;
metabolite ;
advances PDF (1199KB) 摘要页面 多维度评价 相关文章 导出 EndNote |
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Bibtex 收藏本文 引用本文 贾晓东, 许梦洋, 莫正海, 宣继萍, 翟敏, 郭忠仁 . 薄壳山核桃酚类代谢物研究进展. 植物学报, 2020,
55 (1): 106-119 doi:10.11983/CBB19008
Jia Xiaodong, Xu Mengyang, Mo Zhenghai, Xuan Jiping, Zhai Min, Guo Zhongren .
Recent Advances in Phenolic Metabolites in Pecan .
Chinese Bulletin of Botany , 2020,
55 (1): 106-119 doi:10.11983/CBB19008
薄壳山核桃(
Carya illinoensis )为胡桃科(Juglandaceae)山核桃属(
Carya )植物, 又名美国山核桃、长山核桃, 其种子可食用, 在我国又称为碧根果。山核桃属约有15种, 主要分布在北美洲, 亚洲东部产4种, 我国有4种和引种栽培1种(
柳鎏和孙醉君, 1986 )。山核桃属原产我国的4种分别为山核桃(
C. cathayensis )、湖南山核桃(
C. hunanensis )、贵州山核桃(
C. kweichowensis )和越南山核桃(
C. tonkinensis ), 引种栽培的为薄壳山核桃(
C. illinoensis ) (
裴东和鲁新政, 2011 )。薄壳山核桃原产于北美洲, 早期是印第安人的主要食物来源之一, 经过近百年的选育, 目前流通的品种果实壳薄易剥, 种仁甜而无涩味。薄壳山核桃引入我国已逾百年, 近年来引起广泛关注。薄壳山核桃适合在我国长江流域及其以南地区栽培, 且经济效益显著, 因此栽培面积快速扩大, 未来有望形成新的产业。了解薄壳山核桃中的营养成分及保健功效对于产业发展具有重要意义。
薄壳山核桃含有丰富的营养成分, 具有良好的保健功效。最早引起人们关注的是其所含有的丰富油脂, 该类油脂以单不饱和脂肪酸为主, 比例之高可媲美橄榄油, 对心脑血管具有良好的保健作用(
Morgan and Clayshulte, 2000 ;
Rajaram et al., 2001 )。除油脂外, 薄壳山核桃果实中还含有另一类重要的营养物质——酚类(phenolics)。酚类是苯环上含有酚羟基的一大类物质的统称。其中, 人们关注较多的活性物质有酚酸(phenolic acids)、类黄酮(flavonoids)、香豆素(coumarins)、木质素(lignans)和单宁(tannins) (
Alasalvar and Shahidi, 2009 )。其中, 类黄酮又包含黄酮醇(flavonols)、黄烷-3-醇(flavan-3-ols)和二氢黄酮醇(dihydroflavonols)及其糖苷(
李珊珊等, 2014 )。单宁包含水解单宁(hydrolysable tannins)和缩合单宁(condensed tannins)两大类(
孙达旺, 1992 )。水解单宁在酸碱条件下不稳定, 易于水解, 根据水解后产生酚酸的不同分为棓单宁(gallotannins)和鞣花单宁(ellagitannins)。缩合单宁一般衍生于黄烷类化合物, 又被称为原花青素或原花色素(proanthocyanidins) (
石碧和狄莹, 2000 )。酚类为植物次生代谢产物, 在植物中含量虽低但功效显著。人们最早注意到薄壳山核桃中的酚类代谢物是由于发现其可能与采后种皮变色及油脂氧化有关(
Senter et al., 1978 ,
1980 ;
Polles et al., 1981 )。后来, 科学家发现薄壳山核桃具有较强的抗氧化性(
Wu et al., 2004 ;
Gu et al., 2004 ), 进而发现这种抗氧化性的物质基础是其中所含有的酚类代谢物(
Villarreal-Lozoya et al., 2007 )。采用不同的分析手段可测定薄壳山核桃种仁及壳中的总酚、缩合单宁及总黄酮的含量, 检测抗氧化性并对酚类代谢物进行鉴定。随着液相色谱及质谱等现代化分析技术的应用, 薄壳山核桃中的酚类代谢物已逐渐被阐明。目前, 对薄壳山核桃的种质资源(
Grauke et al., 2003 )、育苗技术(
Zhang et al., 2015 )及栽培措施(
Mo et al., 2017 )已有许多研究报道, 但对薄壳山核桃中的酚类代谢物尚未见系统总结。本文综述薄壳山核桃酚类代谢物相关研究进展, 以期为今后的科学研究和产业发展提供参考。
1 薄壳山核桃不同部位酚类代谢物的组成 目前, 对薄壳山核桃酚类代谢物的研究以种仁最多, 对壳、叶片和树皮也有部分研究。根据提取手段的不同酚类代谢物分为2类, 分别是植物中原有的代谢物和水解后的苷元。目前已从薄壳山核桃中鉴定酚类代谢物67个, 包括单宁36个、类黄酮22个和酚酸9个(
表1 ;
图1 )。36个单宁包括7个缩合单宁和29个水解单宁。缩合单宁包括5个单体黄烷及其衍生物和2个原花青素; 水解单宁包括17个鞣花单宁、5个棓单宁及7个鞣花单宁和棓单宁的复合体。已鉴定出的代谢物中, 以鞣花酸为结构单元的水解单宁数量最多, 其次是以没食子酸为结构单元的水解单宁。鉴定出的类黄酮代谢物包含4种母核, 分别是槲皮素、山核桃黄素、杜鹃黄素和山奈酚。而水解后, 从薄壳山核桃中鉴定酚类代谢物苷元34个, 其中包含12个类黄酮苷元和1个香豆素(
表2 )。
Table 1 表1 表1 已鉴定的薄壳山核桃酚类代谢物
Table 1
Phenolic metabolites identified in pecan 编号 名称 母核 取代基 部位 参考文献 R1 R2 R3 R4 R5 R6 单宁-水解单宁-鞣花单宁 1 鞣花酸 A H H - H - - 种仁, 叶 Villarreal-Lozoya et al., 2007 2 鞣花酸六碳糖 A hexose, H, H, H - - 种仁 Robbins et al., 2014 3 鞣花酸五碳糖 A pentose, H, H, H - - 种仁 Robbins et al., 2014 4 鞣花酸鼠李糖 A rhamnose, H, H, H - - 种仁 de la Rosa et al., 2011 5 鞣花酸芸香糖 A rutinose, H, H, H - - 种仁 Jia et al., 2018 6 鞣花酰基鞣花酸葡萄糖 A HHDP, glucose, H, H - - 种仁 Robbins et al., 2014 7 乙酰基鞣花酸六碳糖 A CH3 CO, hexose, H, H - - 种仁 Gong and Pegg, 2017 8 甲基鞣花酸 A CH3 , H, H, H - - 种仁 de la Rosa et al., 2011 9 甲基鞣花酸六碳糖 A CH3 , hexose, H, H - - 种仁 Robbins et al., 2014 10 甲基鞣花酸五碳糖 A CH3 , pentose, H, H - - 种仁 Robbins et al., 2014 11 二甲基鞣花酸 A CH3 , CH3 , H, H - - 种仁, 叶 Gad et al., 2007 12 二甲基鞣花酸六碳糖 A CH3 , CH3 , hexose, H - - 种仁 Robbins et al., 2014 13 二甲基鞣花酸五碳糖 A CH3 , CH3 , pentose, H - - 种仁 Robbins et al., 2014 编号 名称 母核 取代基 部位 参考文献 R1 R2 R3 R4 R5 R6 14 鞣花酰基葡萄糖 B OH R2-R3/R4-R5=(S)-HHDP H H - 种仁 Robbins et al., 2014 15 橡椀酰基葡萄糖 B OH R2-R3/R4-R5=(S)-valoneoyl H H - 种仁 Jia et al., 2018 16 二鞣花酰基葡萄糖 B OH R2-R3=(S)-HHDP R4-R5=(S)-HHDP - - Jia et al., 2018 17 鞣花酰基橡椀酰基葡萄糖 B OH R2-R3=(S)-HHDP/(S)-valoneoyl R4-R5=(S)-valoneoyl/(S)-HHDP - - Jia et al., 2018 单宁-水解单宁-棓单宁 18 没食子酸 C OH OH OH - - - 种仁, 叶 Malik et al., 2009 19 没食子酸六碳糖 C Ohexose, OH, OH - - - 种仁 de la Rosa et al., 2011 20 甲基没食子酸 C OCH3 , OH, OH - - - 种仁, 叶 Jia et al., 2018 21 乙基没食子酸 C OCH3 CH2 , OH, OH - - - 种仁 Robbins et al., 2014 22 2, 3-双没食子酰基葡萄糖 B OH G G H H - 种仁, 叶 Gong and Pegg, 2017 单宁-水解单宁-鞣花单宁和棓单宁混合结构 23 双没食子酰基鞣花酸 A G, G, H, H - - 种仁 Robbins et al., 2014 24 没食子酰基鞣花酸五碳糖 A G, pentose, H, H - - 种仁 Robbins et al., 2015 25 没食子酰基甲基鞣花酸五碳糖 A G, pentose, CH3 , H - - 种仁 Robbins et al., 2014 26 没食子酰基鞣花酰基葡萄糖 B OH R2-R3/R4-R5=(S)-HHDP G, H - 种仁 Gong and Pegg, 2017 27 双没食子酰基鞣花酰基葡萄糖 B OH R2-R3/R4-R5=(S)-HHDP G G - 种仁 Gong and Pegg, 2017 28 戊烯酸双内酯 - - - - - - - 种仁 Robbins et al., 2015 29 戊烯酸双内酯水合物 - - - - - - - 种仁 Robbins et al., 2014 单宁-缩合单宁-单体黄烷及其衍生物 30 (表)儿茶素 D H H H H H H 种仁 Robbins et al., 2014 31 儿茶素六碳糖 D hexose, H, H, H, H H 种仁 Gong and Pegg, 2017 32 (表)儿茶素没食子酸酯 D G H H H H H 种仁 Robbins et al., 2014 33 (表)没食子儿茶素 D H H H H H OH 种仁 de la Rosa et al., 2011 34 (表)没食子酸儿茶素没食子酸酯 D G H H H H OH 种仁, 叶 Gad et al., 2007 单宁-缩合单宁-原花青素 35 原花青素的A型二聚体 - - - - - - - 种仁 Robbins et al., 2014 36 原花青素的B型二聚体 - - - - - - - 种仁 Robbins et al., 2014 类黄酮 37 杜鹃黄素 E OH OCH3 OH OH OH - 树皮 Abdallah et al., 2011 38 杜鹃黄素-3-葡萄糖苷 E OGlu OCH3 OH OH OH - 树枝 Ishak et al., 1980 39 杜鹃黄素-3-鼠李糖苷 E ORha OCH3 OH OH OH - 树枝 Ishak et al., 1980 40 杜鹃黄素-3-阿拉伯糖苷 E OAra OCH3 OH OH OH - 树枝 Ishak et al., 1980 41 杜鹃黄素-3-双葡萄糖苷 E OGluGlu OCH3 OH OH OH - 树枝 Ishak et al., 1980 42 杜鹃黄素-3-芸香糖苷 E ORut OCH3 OH OH OH - 树枝 Ishak et al., 1980 43 槲皮素 E OH OH OH OH OH - 叶, 树皮 Abdallah et al., 2011 44 槲皮素-3-葡萄糖苷(异槲皮苷) E OGlu OH OH OH OH - 叶 Gad et al., 2007 编号 名称 母核 取代基 部位 参考文献 R1 R2 R3 R4 R5 R6 45 槲皮素-3-鼠李糖苷 E ORha OH OH OH OH - 叶 Gad et al., 2007 46 槲皮素-3-阿拉伯糖苷 E OAra OH OH OH OH - 叶 Ishak et al., 1980 47 槲皮素-3-半乳糖苷 E OGal OH OH OH OH - 叶 Ishak et al., 1980 48 槲皮素-3-(6''-没食子酰基)半乳糖苷 E OGal-6''-G OH OH OH OH - 叶 Gad et al., 2007 49 山核桃黄素 E OCH3 OCH3 OH OH OH - 树皮 Abdallah et al., 2011 50 山核桃黄素-3'-/4'-葡萄糖苷 E OCH3 OCH3 OH OGlu/OH OH/OGlu - 树皮 Abdallah et al., 2011 51 山核桃黄素-3'-/4'-鼠李糖苷 E OCH3 OCH3 OH ORha/OH OH/ORha - 树枝 Ishak et al., 1980 52 山核桃黄素-3'-硫酸盐 E OCH3 OCH3 OH OSO3 H OH - 树皮 Abdallah et al., 2011 53 3'-甲氧基山核桃黄素 E OCH3 OCH3 OH OCH3 OH - 树皮 Abdallah et al., 2011 54 3'-甲氧基山核桃黄素- 7-葡萄糖苷 E OCH3 OCH3 OGlu OCH3 OH - 树皮 Abdallah et al., 2011 55 山奈酚 E OH OH OH H OH - 叶 Gad et al., 2007 56 3-甲氧基山奈酚 E OCH3 OH OH H OH - 叶 Ishak et al., 1980 57 山奈酚-3-半乳糖苷(三叶豆苷) E OGal OH OH H OH - 叶 Gad et al., 2007 58 山奈酚-3-(6''-没食子酰基)半乳糖苷 E OGal-6''-G OH OH H OH - 叶 Gad et al., 2007 酚酸类 59 对香豆酸 F H OH - - - - 种仁 Senter et al., 1980 60 咖啡酸 F OH OH - - - - 种仁 Malik et al., 2009 61 咖啡酸六碳糖 F OH/Ohexose Ohexose/ OH - - - - 种仁 Malik et al., 2009 62 原儿茶酸六碳糖 C OH/Ohexose Ohexose/ OH H - - - 种仁, Gong and Pegg, 2017 63 对羟基苯甲酸 C H OH H - - - 种仁, 叶 Gad et al., 2007 64 儿茶酚 - - - - - - - 种仁 Malik et al., 2009 65 原儿茶醛 - - - - - - - 种仁 de la Rosa et al., 2011 66 绿原酸 - - - - - - - 种仁 Malik et al., 2009 67 短叶苏木酚酸 - - - - - - - 种仁 Robbins et al., 2015
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生成PPT 图1薄壳山核桃中酚类代谢物的主要结构类型 Figure 1The main structure schemes of phenolic metabolites in pecan Table 2 表2 表2 薄壳山核桃中已鉴定的酚类代谢物苷元
Table 2
Phenolic metabolite aglucons identified in pecan 名称 结构类型 部位 参考文献 (表)没食子儿茶素 黄烷醇 种仁, 壳 da la Rosa et al., 2011; Hilbig et al., 2018a (表)儿茶素 黄烷醇 壳 Hilbig et al., 2018a 表儿茶素没食子酸酯 缩合单宁 壳 Hilbig et al., 2018a 黄颜木素 黄烷酮 壳 Hilbig et al., 2018a 紫杉叶素 黄烷酮 壳 Hilbig et al., 2018a 槲皮素 黄酮醇 壳 Hilbig et al., 2018a 杨梅黄酮 黄酮醇 壳 Hilbig et al., 2018a 香树素 黄酮醇 壳 Hilbig et al., 2018a 圣草酚 黄烷酮 壳 Hilbig et al., 2018a 柚皮素 黄烷酮 壳 Hilbig et al., 2018a 芹菜素 黄酮 壳 Hilbig et al., 2018a 高良姜素 黄酮醇 壳 Hilbig et al., 2018a 羟甲香豆素 香豆素 壳 Hilbig et al., 2018a 没食子酸 酚酸 种仁, 壳 Senter et al., 1980; da la Rosa et al., 2011; 龙胆酸 酚酸 种仁 Senter et al., 1980 香草酸 酚酸 种仁 Senter et al., 1980 原儿茶酸 酚酸 种仁, 壳 Senter et al., 1980; Hilbig et al., 2018a 原儿茶醛 酚酸 种仁 Senter et al., 1980; da la Rosa et al., 2011 对羟基苯甲酸 酚酸 种仁 Senter et al., 1980; da la Rosa et al., 2011 对羟基苯乙酸 酚酸 种仁 Senter et al., 1980 香豆酸 酚酸 种仁, 壳 Senter et al., 1980; Hilbig et al., 2018a 丁香酸 酚酸 种仁, 壳 Senter et al., 1980; Hilbig et al., 2018a 苦杏仁酸 酚酸 壳 Hilbig et al., 2018a 绿原酸 酚酸 壳 Hilbig et al., 2018a 香兰素 酚酸 壳 Hilbig et al., 2018a 阿魏酸 酚酸 壳 Hilbig et al., 2018a 迷迭香酸 酚酸 壳 Hilbig et al., 2018a 水杨酸 酚酸 壳 Hilbig et al., 2018a 白藜芦醇 酚酸 壳 Hilbig et al., 2018a 对茴香酸 酚酸 壳 Hilbig et al., 2018a 芥子醛 酚酸 壳 Hilbig et al., 2018a 鞣花酸 酚酸 壳 da la Rosa et al., 2011; Hilbig et al., 2018a 甲基鞣花酸 酚酸 种仁 da la Rosa et al., 2011 戊烯酸双内酯 酚酸 种仁 da la Rosa et al., 2011
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下载CSV Senter等(1978) 最早通过薄层层析和纸层析方法初步认为薄壳山核桃的种仁中含有无色花色素(leucoanthocyanidin), 但由于方法的局限性, 仅能判断结构类型, 不能确定代谢物。之后,
Senter等(1980) 采用气相色谱法从斯图尔特(Stuart)脱脂种仁的酸水解液中检测到8个酚酸, 分别是没食子酸、龙胆酸、香草酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯乙酸、香豆酸和丁香酸。采用酸或碱水解可使酯键断裂, 得到相应的苷元, 从而简化代谢物结构, 有利于结构分析, 但由于破坏了原本代谢物的结构, 因此仅能明确代谢物苷元。2004年, 有2项抗氧化性评价研究均表明薄壳山核桃含有丰富的酚类代谢物, 抗氧化活性高于许多已知的富含酚类的水果及浆果(
Wu et al., 2004 ;
Gu et al., 2004 )。这两项研究再次引起了人们对薄壳山核桃抗氧化活性的关注, 科学家们开始寻找这种强抗氧化性的物质基础。
Villarreal-Lozoya等(2007) 采用液相色谱法从堪萨(Kanza)脱脂种仁的碱水解液中检测到4个酚酸, 分别是没食子酸、儿茶素、表儿茶素和鞣花酸。
Malik等(2009) 最早尝试不水解, 直接用液相色谱法分析薄壳山核桃中的酚类代谢物, 从脱脂种仁中检测到8个酚酸, 其中新检测到的有儿茶酚、香豆酸、绿原酸和咖啡酸。
de la Rosa等(2011) 采用液相色谱法分别从直接提取液和酸水解液中检测到6个酚类代谢物和8个酚类代谢物苷元。
Robbins等(2014) 首次采用液质联用法分析和鉴定薄壳山核桃中的酚类代谢物, 至此从薄壳山核桃中检测到的酚类代谢物数量跃上了一个新的台阶。该研究团队从美国产8个高抗氧化性品种种仁的混样中鉴定出27个酚类代谢物, 其中新鉴定了13个酚酸及其糖苷、2个棓单宁、1个鞣花单宁和2个缩合单宁。
Robbins等(2015) 同样采用液质联用法从美国产薄壳山核桃种仁中新鉴定了1个酚酸和1个棓单宁。
Gong和Pegg (2017) 采用高效液相色谱联用飞行时间质谱从美国产薄壳山核桃种仁中鉴定出38个酚类代谢物, 其中新鉴定4个单宁。
Jia等(2018) 采用超高效液相色谱联用高分辨飞行时间质谱从中国产薄壳山核桃种仁动态混样中鉴定酚类代谢物35个, 其中新鉴定酚酸4个, 鞣花单宁3个。
尽管对壳的抗氧化性和酚类代谢物总量已有许多研究, 但对壳中所含的酚类代谢物结构的研究较少。
Hilbig等(2018a) 采用液质联用法检测了薄壳山核桃壳水解液中的酚类代谢物苷元, 鉴定出29个酚类代谢物苷元, 其中24个为首次从薄壳山核桃中鉴定, 鉴定的29个酚类代谢物中包含12个类黄酮和1个香豆素。12个类黄酮包含9种黄酮母核, 而目前从非水解液中仅鉴定出4种黄酮母核, 说明薄壳山核桃中可能仍有大量其它类黄酮代谢物。
最早报道从薄壳山核桃树皮中分离到的类黄酮是杜鹃黄素和山核桃黄素。
Ishak等(1980) 从薄壳山核桃的树枝中分离到5个以杜鹃黄素为母核的黄酮醇苷和2个以山核桃黄素为母核的黄酮苷并对代谢物的结构进行了鉴定。之后,
Abdallah等(2011) 从薄壳山核桃树皮中分离到7个酚类代谢物, 其中2个为具有抗糖尿病活性的新化合物, 即山核桃黄素-3'-硫酸盐和3'-甲氧基山核桃黄素-7-葡萄糖苷。
Ishak等(1980) 通过柱层析方法从薄壳山核桃的叶片中分离得到5个类黄酮代谢物, 即槲皮素-3-葡萄糖苷(异槲皮苷)、槲皮素-3-鼠李糖苷、槲皮素-3-阿拉伯糖苷、槲皮素-3-半乳糖苷和3-甲氧基山奈酚。
Gad等(2007) 又从叶片中分离得到15个酚类代谢物, 包括1个对羟基苯甲酸、5个槲皮素糖苷、3个山奈酚糖苷、5个水解单宁和1个缩合单宁。从树皮及树叶中分离得到的酚类代谢物均为分离得到单体后经核磁鉴定结构。
2 酚类代谢物提取及检测方法 酚类代谢物通常采用甲醇、乙醇或丙酮提取, 由于酚类显弱酸性, 提取液中一般会添加少量的酸。薄壳山核桃酚类代谢物常见的提取方法见
表3 。从种仁样品中提取酚类代谢物前需先进行干燥和脱脂。以分离单体代谢物为目的的提取往往采用加热回流法, 回收率高, 但杂质也较多(
Ishak et al., 1980 ;
Gad et al., 2007 ;
Abdallah et al., 2011 )。而以分析为主要目的的提取一般采用匀浆或超声方法, 获得的提取液杂质较少, 有利于分析目标代谢物(
Malik et al., 2009 ;
de la Rosa et al., 2011 ;
Robbins et al., 2014 ,
2015 ;
Gong and Pegg, 2017 ;
Jia et al., 2018 ;
Hilbig et al., 2018a )。提取后可采用凝胶柱除杂或分段, 以减少色谱峰间的重叠, 使结果更准确。而采用超高效液相色谱可进一步提高分离度, 不分段直接进行鉴定。采用高分辨质谱分析代谢物, 荷质比精度可至小数点后4位, 通过计算与理论值之间的偏差(mass measurement errors, ∆m)进一步确保结果的准确性。对原花青素的检测采用亲水作用色谱(hydrophilic interaction chromatography, HILIC)取得了较好的结果(
Gong and Pegg, 2017 )。
Table 3 表3 表3 薄壳山核桃酚类代谢物的常用提取与检测方法
Table 3
Extraction and examination methods of phenolic metabolites in pecan 部位 溶剂 提取方法 检测方法 组分 参考文献 种仁 含0.1% HCl的甲醇 冷浸3小时 纸层析显色 初步认为含无色花色素 Senter et al., 1978 种仁 含0.1% HCl的甲醇 回流提取2小时2次, 合并浓缩后用1 mol·L-1 HCl回流水解2小时, 乙酸乙酯萃取, 甲酯化 GC-MS 8个酚酸 Senter et al., 1980 树枝, 叶 70%乙醇 回流提取, 浓缩后聚酰胺柱反复柱层 H1 -NMR, C13 - NMR 从树枝中分离出4个类黄酮; 从叶中分离出5个类黄酮、 Ishak et al., 1980 叶 水 回流提取, 烘干, 再用乙醇提取, Sephadex LH-20柱反复柱层析分离 H1 -NMR, C13 - NMR 1个酚酸、8个类黄酮和6个单宁 Gad et al., 2007 种仁 70%丙酮 正己烷脱脂, 匀浆, 5°C摇床振摇过夜。分别用6 mol·L-1 HCl和8 mol·L-1 NaOH进行酸和碱水解 HPLC-DAD 4个酚类代谢物 Villarreal-Lozoya et al., 2007 种仁 80%甲醇 正己烷脱脂, 匀浆机提取30秒, 2次, 再用Sephadex LH-20小柱除杂 HPLC-DAD 8个酚酸 Malik et al., 2009 种仁 80%丙酮 正己烷脱脂, 50°C匀浆提取30分钟, HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS 5个酚酸、2个类黄酮、5个鞣花单宁和1个棓单宁 de la Rosa et al., 2011 树皮 70%乙醇 70°C回流提取, 硅胶柱及Sephadex LH-20柱反复柱层析 H1 -NMR, C13 - NMR 6个类黄酮和1个酚酸 Abdallah et al., 2011 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干, Sephadex LH-20柱分段 HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS/MS 27个酚类代谢物, 其中包含2个鞣花单宁、2个棓单宁和2个缩合单宁 Robbins et al., 2014 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) (v/v/v) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干。分别用-1 HCl和2 mol·L-1 NaOH进行酸和碱水解 HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS/MS 水解前13个酚类代谢物, 碱水解后8个, 酸水解后9个 Robbins et al., 2015 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) (v/v/v) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干, Sephadex LH-20柱分段 HPLC-DAD, HPLC-ESI-Q/TOF-MS 38个酚类代谢物, 其中包含15个鞣花单宁、3个棓单宁和13个原花青素 Gong et al., 2017 种仁 80%丙酮 正己烷脱脂, 提取液冷浸过夜, 室温超声提取2小时, 2次, 50°C氮吹仪吹干, 冻干 HPLC-DAD, UPLC-ESI-Q/TOF-MS 35个酚类代谢物, 其中包含18个鞣花单宁、2个棓单宁和2个原花青素 Jia et al., 2017 壳 20%乙醇 80°C超声提取1小时, 减压回收溶剂 HPLC-ESI-MS/MS 29个酚酸苷元, 其中包含12个类黄酮和1个香豆素 Hilbig et al., 2018a
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下载CSV 根据分离目的不同, 鉴定方法各有不同。采用1D、2D氢和碳核磁共振法可准确鉴定代谢物的结构, 但要求对代谢物进行分离, 一般纯度需达到95%以上才能准确鉴定。质谱法可以一次性同时鉴定大量代谢物, 根据国际化学分析工作组(Chemical Analysis Working Group, CAWG)代谢组学标准委员会(Metabolomics Standards Initiative, MSI)的规定, 鉴定的代谢物分为4个等级, 即可用标准品准确鉴定、无标准品但分子量和裂解规律与已知代谢物一致、无标准品通过裂解规律等推定为某一类型代谢物及未知代谢物(
Sumner et al., 2007 )。定量测定的要求较低时则可采用紫外分光法进行检测。
Hilbig等(2018a) 采用响应面法优化设计, 得到从薄壳山核桃壳中提取总酚的最佳工艺是用20%乙醇, 料液比为1 g:30 mL, 80°C超声提取1小时, 减压回收溶剂, 此时得到的总酚含量最高, 为394.39 mg没食子酸等价物·g
-1 。
3 酚类代谢物含量 对薄壳山核桃中酚类代谢物的定量研究目前主要集中在种仁和种壳上。定量酚类代谢物最常用的方法是通过福林酚试剂显色, 然后紫外比色测定总酚含量。
Wu等(2004) 对市售薄壳山核桃种仁总酚含量的测定结果为2 016 mg没食子酸等价物·g
-1 鲜种仁, 而
Kornsteiner等(2006) 测得为1 284 mg没食子酸等价物·g
-1 鲜种仁。
Villarreal-Lozoya等(2007) 测定美国产6种薄壳山核桃种仁中的总酚含量为62-106 mg绿原酸等价物·g
-1 脱脂种仁, 且品种间差异显著。
de la Rosa等(2011) 对墨西哥产薄壳山核桃仁的测定结果为11.7-12.5 mg没食子酸等价物·g
-1 鲜种仁, 而壳的总酚含量为65.3-92.5 mg没食子酸等价物·g
-1 鲜种仁。
Robbins等(2015) 用鞣花酸作为标准品, 测得总酚含量为1.82-2.62 g鞣花酸等价物·(100 g)
-1 种仁。不同研究对于总酚含量的表征可以为每克鲜种仁、每克干种仁或每克脱脂种仁, 标准品为没食子酸、绿原酸和鞣花酸(
罗会婷等, 2017 )。不同的标准品和含量单位给比较带来了一定的困难。据文献报道, 绿原酸等价物与没食子酸等价物的转换因子为0.6 (
Chun and Kim, 2004 ), 而脱脂种仁与未脱脂种仁比较时需考虑70%的油脂含量并进行转换(
Rudolph et al., 1992 )。
薄壳山核桃种仁中含有大量原花青素, 即缩合单宁(
Polles et al., 1981 )。缩合单宁具有抗氧化和抗诱变的活性, 且受交联度、结构单元和结构单元间化学键类型的影响(
Grimmer et al., 1992 )。
Gu等(2002) 报道薄壳山核桃中原花青素二聚体间的化学键为B型(C
4 -C
8 和C
4 -C
6 ), 之后又测定了薄壳山核桃种仁中缩合单宁的含量为494.1 mg·(100 g)
-1 鲜种仁, 同时还测定了不同交联度单宁的含量, 单体、二聚体、三聚体、四到六聚体、七到十聚体和十聚体以上的单宁含量分别为17.2、42.1、26、101、84和223 mg·(100 g)
-1 鲜种仁(
Gu et al., 2004 )。而
Robbins等(2014) 测得薄壳山核桃种仁中单体、二聚体、三聚体和四到六聚体的单宁含量分别为0.3、47.3、21.1和14.8 mg·g
-1 单宁部位。
Gong和Pegg (2017) 测得薄壳山核桃种仁中二至七聚体的单宁含量分别为31.42、18.34、7.08、5.53、1.62和0.41 mg·g
-1 粗提物。尽管各研究所得数值的单位略有不同, 但可看出薄壳山核桃种仁中二聚体及三聚体原花青素的含量最高。原花青素是由2分子或3分子的(表)儿茶素连接在一起形成, 3个及以上连接在一起形成寡聚原花青素(oligomeric proanthocyanidins) (
Holton and Cornish, 1995 )。薄壳山核桃种仁含有大量原花青素及寡聚原花青素, 这些原花青素对薄壳山核桃的抗氧化性起主要作用。
Villarreal- Lozoya等(2007) 测得美国产薄壳山核桃种仁中的缩合单宁含量为23-47 mg儿茶素等价物·g
-1 脱脂种仁。
Robbins等(2015) 测得原花青素含量为420-655 mg PD2B等价物·(100 g)
-1 种仁。薄壳山核桃中缩合单宁含量通常与总酚含量接近, 说明缩合单宁是薄壳山核桃中最主要的酚类代谢物。
此外, 研究者还对薄壳山核桃种仁的总黄酮含量进行了探索。
Wu等(2004) 比较了9种坚果的总黄酮含量, 其中薄壳山核桃的总黄酮含量最高, 为34.01 mg·(100 g)
-1 。
de la Rosa等(2011) 对墨西哥产薄壳山核桃种仁的总黄酮含量进行测定, 结果为5.8-6.4 mg儿茶素等价物·g
-1 鲜种仁。
Jia等(2018) 对中国产薄壳山核桃的总酚、缩合单宁和总黄酮含量随果实发育的动态变化进行详细分析, 结果表明总黄酮含量一般低于总酚含量。
对单个酚类代谢物进行定量一般采用气相或液相色谱法, 后者更为常用。
Senter等(1980) 对脱脂后的斯图尔特种仁进行酸水解, 通过气相色谱法测得没食子酸含量为132.8 µg·g
-1 脱脂种仁。
Villarreal-Lozoya等(2007) 研究表明, 薄壳山核桃果仁中含量最高的酚酸是鞣花酸, 其次是没食子酸, 二者含量分别为2.5-4.7和0.6-1.3 mg·g
-1 脱脂种仁。
Malik等(2009) 测定了薄壳山核桃品种德西拉布(Desirable)、威奇塔(Wichita)和切尼(Cheyenne)的单体酚酸含量, 结果显示含量最高的酚酸为儿茶素, 其次为鞣花酸和没食子酸, 三者的含量分别为32.54-90.00、20.96-86.21和15.90-21.31 g·kg
-1 。
Jia等(2018) 发现薄壳山核桃种仁在果实发育中期富含儿茶素及表儿茶素, 之后其含量随果实发育快速下降。
Robbins等(2015) 采用质谱进行定量分析, 发现鞣花酸含量最高, 为132 μg·g
-1 丙酮粗提物, 而酸或碱水解后戊烯酸双内酯的含量最高, 分别为262.4和190.2 μg·g
-1 丙酮粗提物。戊烯酸双内酯为鞣花酸和没食子酸的缩合物, 说明薄壳山核桃种仁中含有大量鞣花单宁和棓单宁的复合物。
除种仁外, 对薄壳山核桃种壳中酚类代谢物的含量也有一些研究。在巴西南部, 薄壳山核桃壳切片后被用来泡茶, 当地人认为种壳具有利尿、促消化、保肝和降血糖等功效(
do Prado et al., 2013 ;
Ribeiro et al., 2017 ;
Hilbig et al., 2018b )。
de la Rosa等(2011) 测得墨西哥产薄壳山核桃壳的总黄酮含量为26.3- 36.1 mg儿茶素等价物·g
-1 鲜种仁, 原花青素含量为316.1-464.4 mg儿茶素等价物·g
-1 鲜种仁, 而种仁的原花青素含量仅为20.3-26.7 mg儿茶素等价物·g
-1 鲜种仁, 说明薄壳山核桃壳中原花青素含量远高于种仁。
de la Rosa等(2011) 通过比较表明种壳的总酚含量大约是种仁的3倍。
Hilbig等(2018a) 测定了巴西薄壳山核桃品种巴顿(Barton)壳中的总酚含量为581.9 mg没食子酸等价物·g
-1 种仁, 缩合单宁含量为71.08 mg儿茶素等价物·g
-1 种仁, 之后采用液质联用法测定水解液中酚类代谢物苷元的含量, 其中儿茶素、没食子酸和鞣花酸的含量分别为352、138和36 mg·g
-1 干种仁, 再次证明壳中含有大量原花青素。
Do Prado等(2013 ,
2014) 测定了巴西薄壳山核桃壳的总酚及缩合单宁含量, 分析表明壳中酚类代谢物含量可能会影响油中不饱和脂肪酸的氧化程度。
4 酚类代谢物的药理活性 由于活性酚羟基的存在, 酚类物质一般具有良好的抗氧化性, 且其活性与酚羟基的数量及位置有关。薄壳山核桃含有丰富的酚类物质, 目前已有大量薄壳山核桃抗氧化性的评价研究(
表4 )。从评价方法来看, 采用DPPH和ABTS方法最多。其中,
de la Rosa等(2011) 测得的数值较高, 与其它研究结果偏离较远。
Jia等(2018) 的实验对象是果实发育期的动态样品, 其余研究为成熟样品。剔除
de la Rosa等(2011) 偏离的数据,
Jia等(2018) 的数据仅比较成熟样品结果, 可发现不同报道的数值总体接近。由于产地、品种和提取方法等的不同, 不同研究结果间存在一定差异, 但总体来看壳的抗氧化性高于种仁, 约为种仁的5-7倍。
Table 4 表4 表4 薄壳山核桃抗氧化性比较
Table 4
Comparison of antioxidant capacities of pecan 部位 抗氧化性平均值(范围) 参考文献 DPPH -1 ) ABTS -1 ) ORAC -1 ) FRAP 2+ eq∙(100 g)-1 ) 种仁 - - 179.4 - Wu et al., 2004 种仁 - - - 8.33 (6.32-11.05) Blomhoff et al., 2006 种仁 388 (324-540) - 583 (373-817) - Villarreal-Lozoya et al., 2007 种仁 102.6-108.7 75.9-83.4 227-261.5 - de la Rosa et al., 2011 种仁 2110 3360 - - de la Rosa et al., 2014 种仁 - - 135-255 14.0-20.7 Robbins et al., 2015 种仁 548.84 - - - Flores-Córdova et al., 2017 种仁 37.24-461.80 6.74-201.49 - - Jia et al., 2018 壳80%丙酮提取液 537.8-720.3 518.4-644.2 680.3-1350.3 - de la Rosa et al., 2011 壳水提液 1386.28 1333.1 - - Prado et al., 2013 壳80%丙酮提取液 4800 8240 - - de la Rosa et al., 2014 壳水提液 2448.96 1809.01 - - Prado et al., 2014 壳水提液 1268.03 2574.32 - - Hilbig et al., 2018a
DPPH: 2, 2-二苯基-1-三硝基苯肼自由基清除实验; ABTS: 2, 2'-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐自由基清除实验; ORAC: 氧化自由基吸收能力; FRAP: 铁离子还原能力 DPPH: 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl free radical scavenging assay; ABTS: 2, 2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) diammonium salt free radical scavenging assay; ORAC: Oxygen radical absorbance capacity; FRAP: Ferric ion reducing antioxidant power 新窗口打开 |
下载CSV 已有实验证明活性氧过量累积会导致炎症, 许多慢性疾病的发生与炎症密切相关。抗氧化物质对人体最重要的作用就是保护机体免受活性氧伤害。食用薄壳山核桃可降低血液的过氧化程度, 从而抑制或延缓许多慢性疾病的发生。
Domínguez-Avila等(2015) 通过小鼠(
Mus musculus )体内实验分析薄壳山核桃油脂及多酚对血液的影响。结果显示, 喂饲高脂肪食物加薄壳山核桃油脂可降低小鼠血液中的甘油三酯含量, 喂饲高脂肪食物加薄壳山核桃多酚可刺激肝脏X受体mRNA在肝脏中的表达, 而喂饲高脂肪食物加薄壳山核桃干果可降低血液脂质的过氧化程度, 上调载脂蛋白B和LDL受体mRNA在肝脏中的表达, 说明薄壳山核桃具有降血脂和抗氧化的功效。
Robbins等(2016) 通过小鼠体内实验评价了薄壳山核桃种仁的抗炎作用。实验结果表明, 薄壳山核桃中的酚类物质粗提物可抑制小鼠RAW 264.7巨噬细胞释放NO和过氧化。其中, 通过凝胶富集的小分子量部位具有显著的活性, 而大分子量部位无显著活性, 进一步的液相分析发现小分子量部位含有鞣花酸、儿茶素及二聚、三聚和寡聚原花青素。
薄壳山核桃中富含的抗氧化酚类代谢物还有利于缓解其它疾病。例如, 缓解过量摄入烟草(
Nicotiana tabacum )和乙醇导致的过氧化症状, 保护大脑、血液和肝部健康。
Reckziegel等(2011) 对小鼠的研究显示, 薄壳山核桃壳水提液对于戒烟导致的焦虑症状具有缓解作用, 同时可抑制吸烟导致的脑及红细胞脂质过氧化、降低红细胞内过氧化酶活性, 维持血浆中抗坏血酸水平。
Müller等(2013) 通过体内及体外实验, 发现薄壳山核桃壳水提液可减少脂质过氧化、谷胱甘肽和超氧化物歧化酶的消耗, 对乙醇导致的肝损伤具有保护作用, 未来可能是治疗乙醇性肝损伤的一种经济药物。同样,
Gad等(2007) 发现薄壳山核桃叶片提取物也具有保肝作用, 并从叶片中分离鉴定了15个酚类代谢物。
薄壳山核桃壳富含的酚类物质及其高抗氧化性还可用于抑制油脂过氧化。叔丁基羟基甲苯(BHT)是人工合成的抗氧化剂, 目前被广泛添加于食品中, 但有研究表明BHT具有致癌性。迷迭香酸提取物是一种新型抗氧化剂, 来源于天然植物迷迭香(
Rosmarinus officinalis ), 目前已被欧盟批准使用。
Ribeiro等(2017) 在人造奶油中添加薄壳山核桃壳水提液、迷迭香提取物和BHT, 比较三者对奶油过氧化的保护作用。结果显示, 薄壳山核桃壳水提液与其它2种抗氧化剂的效果无显著差异, 显示出薄壳山核桃壳作为新型天然抗氧化剂应用于食品工业的潜力。
Yang等(2009) 测定了9种美国消费者最常食用的干果提取物的抗增殖能力, 发现干果提取物对HepG
2 和Caco-2细胞增殖均具有一定的抑制作用, 且活性与剂量呈显著正相关, 其中核桃和薄壳山核桃的活性最强。
de la Rosa等(2014) 评价了墨西哥产薄壳山核桃种仁和壳的抗增殖活性, 发现种仁和壳的提取物对HTB4和LLC-PK1细胞增殖均具有抑制作用。
Hilbig等(2018b) 报道了薄壳山核桃壳水提液对乳腺癌MCF-7细胞系的细胞毒作用、凋亡诱导的细胞死亡及对细胞周期的阻滞作用。艾氏腹水瘤小鼠存活时间延长了67%, 并认为壳提取物抗肿瘤作用的机制可能与激活凋亡细胞死亡的关键蛋白(Bcl-XL、Bax和p53)以及细胞周期调控(cyclin A、cyclin B和CDK2)有关。这种效果归因于提取物中的酚类代谢物, 如没食子酸、4-羟基苯甲酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸和鞣花酸, 以及儿茶素、表儿茶素和没食子酸表儿茶素。研究表明, 薄壳山核桃壳提取物对肿瘤细胞生长有抑制作用, 可作为肿瘤治疗的替代物。
Abdallah等(2011) 评价了薄壳山核桃树皮的抗糖尿病活性, 从树皮的正丁醇萃取部位分离鉴定了7个类黄酮代谢物, 评价每个单体化合物对于由链脲霉素诱导的糖尿病小鼠的抗病活性, 并与辉瑞制药生产的抗糖尿病药物格列本脲(glibenlamide)活性进行比较, 结果显示其中2个类黄酮的活性高于阳性对照, 具有开发成为替代药物的潜力。
Lei等(2018) 比较了薄壳山核桃疮痂病抗性品种和易感品种中的酚类物质组成, 发现疮痂病抗性品种和易感品种中酚类物质的含量差异显著, 推测一些仅能在抗性品种中检测到或含量更高的酚类代谢物可能与疮痂病抗性有关。
5 酚类代谢物与贮藏特性 在薄壳山核桃的采收及贮藏方面, 已有的研究主要包括采后质地(
Anzaldúa-Morales et al., 1999 )、脂肪酸(
Rudolph et al., 1992 )、V
E (
Yao et al., 1992 )和颜色(
Grauke et al., 1998 )等, 而对酚类代谢物与贮藏的关系研究较少。在国外, 薄壳山核桃主要是低温带壳或脱壳贮藏, 远距离运输一般为常温进行。采后随贮存时间的延长, 薄壳山核桃种仁会逐渐氧化、酸败、失水变干、种皮褐变、风味丧失, 其中种皮褐变与酚类物质有关。酚类物质还在防止脂肪酸氧化过程中发挥一定作用。
Senter等(1978) 通过紫外分光法测定了斯图尔特和舒莱(Schley)的种仁在32°C、50%的相对湿度下避光贮藏16周过程中总酚及总黄酮含量的变化趋势。结果显示, 2个品种的总酚和总黄酮含量有较大差异, 但变化速率类似, 其中斯图尔特总酚含量更高, 也更耐贮存, 表明总酚含量与耐贮性有关。通过薄层和纸层析初步分析显示薄壳山核桃的种皮中含有无色花色素(leucoanthocyanidin), 并在贮藏过程中逐渐转变为鞣酐(phlobaphene)、矢车菊素(cyanidin)和飞燕草素(delphinidin)。
Senter等(1980) 发现, 脱壳的斯图尔特种仁在21°C、65%的相对湿度下避光贮藏12周, 酚酸含量呈逐渐下降趋势。
采后不同的加工方法会影响种皮颜色。
Nelson等(1985) 比较了不同加热方法对薄壳山核桃品质的影响。蒸汽加热导致种皮变色, 而介质加热则不会导致变色。低温贮藏可延缓种皮褐变, 且温度越低保存时间越长。研究表明, 20°C条件下薄壳山核桃仅可保存数月便丧失商品价值(
Woodroof and Heaton, 1953 ); 在5°C货架期可延长至半年左右(
Bonner and Karrfalt, 2008 ); 而在-15°C则至少可保存2年(
Anzaldúa- Morales et al., 1999 )。采后贮藏过程中, 种仁含水量会影响种皮颜色, 采收时薄壳山核桃种仁含水量为25%-30%, 应尽快干燥至4%, 隔绝氧气以抑制酚类氧化, 从而延缓褐变(
Kays, 1979 )。
Senter和Forbus (1979) 研究表明, 通过涂布乙酰化单甘脂(acetylated monoglyceride)并不能对种皮褐变产生显著抑制作用。
Dull和Kays (1988) 用聚偏二氯乙烯(polyvinylidenechloride)涂层玻璃纸真空包装种仁, 在24°C、65%的相对湿度下保存6个月颜色基本不变, 并可有效防止机械损伤, 但口味稍差。
Heaton和Shewfelt (1976) 考察了不同含水量、不同透光度软袋中的薄壳山核桃在23°C下贮藏24周其种仁颜色和脂肪酸变化, 结果显示, 光强、含水量和贮藏时间均对颜色和脂肪酸含量有显著影响, 但这3项因素的重要性次于温度。
6 问题与展望 薄壳山核桃是近年来种植面积迅速扩大的经济林, 尤其在江苏、安徽及江西等省, 每年新增面积可达数千公顷。围绕这一引进品种仍有许多问题亟待解决, 尤其关于果实品质及营养物质的研究还比较薄弱。目前, 对薄壳山核桃中酚类代谢物的组成已有研究, 其中对种仁的研究相对较透彻, 对于其它器官的研究相对较少。壳、外果皮、树枝和雄花序等是果实榨油、收获、修剪、疏雄时的副产物, 未来应进一步采用液质联用方法探究不同器官中的酚类代谢物组成, 为今后的废弃物综合利用奠定理论基础。薄壳山核桃中的酚类代谢物具有诸多保健功效, 且品种间含量差异较大, 未来应针对不同品种及育种材料开展酚类代谢物评价, 为选育酚类含量高的薄壳山核桃新品种奠定基础。近年来, 薄壳山核桃种植产业在我国发展势头迅猛, 未来将有大量国产坚果上市。目前国内消费者对薄壳山核桃缺乏了解, 因此对薄壳山核桃果实品质的研究应加大宣传力度, 让消费者更深入了解薄壳山核桃的有益效用, 从而产生购买意愿, 进而促进产业健康发展。对薄壳山核桃营养成分及保健效果的深入研究, 也是指导消费者正确选用坚果的科学依据。
薄壳山核桃中的酚类代谢物与采后种皮褐变、组培褐化及嫁接等密切相关。核桃种皮的颜色与售价直接相关。据报道, 我国出口的核桃售价比欧美同品种的售价低10%, 主要原因就是种皮颜色深和有涩味, 二者均与酚类代谢物有关。目前, 尽管薄壳山核桃种仁中的酚类代谢物组成已较为明确, 但它们在采后种皮褐变过程中如何变化及所起作用尚不清楚。明确采后种皮中酚类代谢物变化及影响因素, 获得颜色较浅、涩味较淡的核桃干果是未来的研究方向, 对于薄壳山核桃的提质增效具有重要意义。此外, 薄壳山核桃组培极易因愈伤组织褐化而失败, 嫁接时接穗及截口易于褐化变黑且影响成活率, 这些现象均与酚类代谢物密切相关。未来可通过对薄壳山核桃中的酚类代谢物研究寻找突破口, 在明确酚类代谢物组分的基础上, 探寻其在愈伤组织褐化和嫁接组织变黑中的变化及其发挥的作用, 进而采取有效措施。对薄壳山核桃中酚类代谢物的研究可为解决其生产及研究中的科学问题提供理论指导。同时, 由于同科同属植物所含的化学成分通常类似, 因此对薄壳山核桃的研究对于同科同属的核桃研究也有借鉴意义。
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1
2014
... 薄壳山核桃含有丰富的营养成分, 具有良好的保健功效.最早引起人们关注的是其所含有的丰富油脂, 该类油脂以单不饱和脂肪酸为主, 比例之高可媲美橄榄油, 对心脑血管具有良好的保健作用(
Morgan and Clayshulte, 2000 ;
Rajaram et al., 2001 ).除油脂外, 薄壳山核桃果实中还含有另一类重要的营养物质——酚类(phenolics).酚类是苯环上含有酚羟基的一大类物质的统称.其中, 人们关注较多的活性物质有酚酸(phenolic acids)、类黄酮(flavonoids)、香豆素(coumarins)、木质素(lignans)和单宁(tannins) (
Alasalvar and Shahidi, 2009 ).其中, 类黄酮又包含黄酮醇(flavonols)、黄烷-3-醇(flavan-3-ols)和二氢黄酮醇(dihydroflavonols)及其糖苷(
李珊珊等, 2014 ).单宁包含水解单宁(hydrolysable tannins)和缩合单宁(condensed tannins)两大类(
孙达旺, 1992 ).水解单宁在酸碱条件下不稳定, 易于水解, 根据水解后产生酚酸的不同分为棓单宁(gallotannins)和鞣花单宁(ellagitannins).缩合单宁一般衍生于黄烷类化合物, 又被称为原花青素或原花色素(proanthocyanidins) (
石碧和狄莹, 2000 ).酚类为植物次生代谢产物, 在植物中含量虽低但功效显著.人们最早注意到薄壳山核桃中的酚类代谢物是由于发现其可能与采后种皮变色及油脂氧化有关(
Senter et al., 1978 ,
1980 ;
Polles et al., 1981 ).后来, 科学家发现薄壳山核桃具有较强的抗氧化性(
Wu et al., 2004 ;
Gu et al., 2004 ), 进而发现这种抗氧化性的物质基础是其中所含有的酚类代谢物(
Villarreal-Lozoya et al., 2007 ).采用不同的分析手段可测定薄壳山核桃种仁及壳中的总酚、缩合单宁及总黄酮的含量, 检测抗氧化性并对酚类代谢物进行鉴定.随着液相色谱及质谱等现代化分析技术的应用, 薄壳山核桃中的酚类代谢物已逐渐被阐明.目前, 对薄壳山核桃的种质资源(
Grauke et al., 2003 )、育苗技术(
Zhang et al., 2015 )及栽培措施(
Mo et al., 2017 )已有许多研究报道, 但对薄壳山核桃中的酚类代谢物尚未见系统总结.本文综述薄壳山核桃酚类代谢物相关研究进展, 以期为今后的科学研究和产业发展提供参考. ...
1
1986
... 薄壳山核桃(
Carya illinoensis )为胡桃科(Juglandaceae)山核桃属(
Carya )植物, 又名美国山核桃、长山核桃, 其种子可食用, 在我国又称为碧根果.山核桃属约有15种, 主要分布在北美洲, 亚洲东部产4种, 我国有4种和引种栽培1种(
柳鎏和孙醉君, 1986 ).山核桃属原产我国的4种分别为山核桃(
C. cathayensis )、湖南山核桃(
C. hunanensis )、贵州山核桃(
C. kweichowensis )和越南山核桃(
C. tonkinensis ), 引种栽培的为薄壳山核桃(
C. illinoensis ) (
裴东和鲁新政, 2011 ).薄壳山核桃原产于北美洲, 早期是印第安人的主要食物来源之一, 经过近百年的选育, 目前流通的品种果实壳薄易剥, 种仁甜而无涩味.薄壳山核桃引入我国已逾百年, 近年来引起广泛关注.薄壳山核桃适合在我国长江流域及其以南地区栽培, 且经济效益显著, 因此栽培面积快速扩大, 未来有望形成新的产业.了解薄壳山核桃中的营养成分及保健功效对于产业发展具有重要意义. ...
薄壳山核桃营养成分的研究进展
1
2017
... 对薄壳山核桃中酚类代谢物的定量研究目前主要集中在种仁和种壳上.定量酚类代谢物最常用的方法是通过福林酚试剂显色, 然后紫外比色测定总酚含量.
Wu等(2004) 对市售薄壳山核桃种仁总酚含量的测定结果为2 016 mg没食子酸等价物·g
-1 鲜种仁, 而
Kornsteiner等(2006) 测得为1 284 mg没食子酸等价物·g
-1 鲜种仁.
Villarreal-Lozoya等(2007) 测定美国产6种薄壳山核桃种仁中的总酚含量为62-106 mg绿原酸等价物·g
-1 脱脂种仁, 且品种间差异显著.
de la Rosa等(2011) 对墨西哥产薄壳山核桃仁的测定结果为11.7-12.5 mg没食子酸等价物·g
-1 鲜种仁, 而壳的总酚含量为65.3-92.5 mg没食子酸等价物·g
-1 鲜种仁.
Robbins等(2015) 用鞣花酸作为标准品, 测得总酚含量为1.82-2.62 g鞣花酸等价物·(100 g)
-1 种仁.不同研究对于总酚含量的表征可以为每克鲜种仁、每克干种仁或每克脱脂种仁, 标准品为没食子酸、绿原酸和鞣花酸(
罗会婷等, 2017 ).不同的标准品和含量单位给比较带来了一定的困难.据文献报道, 绿原酸等价物与没食子酸等价物的转换因子为0.6 (
Chun and Kim, 2004 ), 而脱脂种仁与未脱脂种仁比较时需考虑70%的油脂含量并进行转换(
Rudolph et al., 1992 ). ...
1
2011
... 薄壳山核桃(
Carya illinoensis )为胡桃科(Juglandaceae)山核桃属(
Carya )植物, 又名美国山核桃、长山核桃, 其种子可食用, 在我国又称为碧根果.山核桃属约有15种, 主要分布在北美洲, 亚洲东部产4种, 我国有4种和引种栽培1种(
柳鎏和孙醉君, 1986 ).山核桃属原产我国的4种分别为山核桃(
C. cathayensis )、湖南山核桃(
C. hunanensis )、贵州山核桃(
C. kweichowensis )和越南山核桃(
C. tonkinensis ), 引种栽培的为薄壳山核桃(
C. illinoensis ) (
裴东和鲁新政, 2011 ).薄壳山核桃原产于北美洲, 早期是印第安人的主要食物来源之一, 经过近百年的选育, 目前流通的品种果实壳薄易剥, 种仁甜而无涩味.薄壳山核桃引入我国已逾百年, 近年来引起广泛关注.薄壳山核桃适合在我国长江流域及其以南地区栽培, 且经济效益显著, 因此栽培面积快速扩大, 未来有望形成新的产业.了解薄壳山核桃中的营养成分及保健功效对于产业发展具有重要意义. ...
1
2000
... 薄壳山核桃含有丰富的营养成分, 具有良好的保健功效.最早引起人们关注的是其所含有的丰富油脂, 该类油脂以单不饱和脂肪酸为主, 比例之高可媲美橄榄油, 对心脑血管具有良好的保健作用(
Morgan and Clayshulte, 2000 ;
Rajaram et al., 2001 ).除油脂外, 薄壳山核桃果实中还含有另一类重要的营养物质——酚类(phenolics).酚类是苯环上含有酚羟基的一大类物质的统称.其中, 人们关注较多的活性物质有酚酸(phenolic acids)、类黄酮(flavonoids)、香豆素(coumarins)、木质素(lignans)和单宁(tannins) (
Alasalvar and Shahidi, 2009 ).其中, 类黄酮又包含黄酮醇(flavonols)、黄烷-3-醇(flavan-3-ols)和二氢黄酮醇(dihydroflavonols)及其糖苷(
李珊珊等, 2014 ).单宁包含水解单宁(hydrolysable tannins)和缩合单宁(condensed tannins)两大类(
孙达旺, 1992 ).水解单宁在酸碱条件下不稳定, 易于水解, 根据水解后产生酚酸的不同分为棓单宁(gallotannins)和鞣花单宁(ellagitannins).缩合单宁一般衍生于黄烷类化合物, 又被称为原花青素或原花色素(proanthocyanidins) (
石碧和狄莹, 2000 ).酚类为植物次生代谢产物, 在植物中含量虽低但功效显著.人们最早注意到薄壳山核桃中的酚类代谢物是由于发现其可能与采后种皮变色及油脂氧化有关(
Senter et al., 1978 ,
1980 ;
Polles et al., 1981 ).后来, 科学家发现薄壳山核桃具有较强的抗氧化性(
Wu et al., 2004 ;
Gu et al., 2004 ), 进而发现这种抗氧化性的物质基础是其中所含有的酚类代谢物(
Villarreal-Lozoya et al., 2007 ).采用不同的分析手段可测定薄壳山核桃种仁及壳中的总酚、缩合单宁及总黄酮的含量, 检测抗氧化性并对酚类代谢物进行鉴定.随着液相色谱及质谱等现代化分析技术的应用, 薄壳山核桃中的酚类代谢物已逐渐被阐明.目前, 对薄壳山核桃的种质资源(
Grauke et al., 2003 )、育苗技术(
Zhang et al., 2015 )及栽培措施(
Mo et al., 2017 )已有许多研究报道, 但对薄壳山核桃中的酚类代谢物尚未见系统总结.本文综述薄壳山核桃酚类代谢物相关研究进展, 以期为今后的科学研究和产业发展提供参考. ...
1
1992
... 薄壳山核桃含有丰富的营养成分, 具有良好的保健功效.最早引起人们关注的是其所含有的丰富油脂, 该类油脂以单不饱和脂肪酸为主, 比例之高可媲美橄榄油, 对心脑血管具有良好的保健作用(
Morgan and Clayshulte, 2000 ;
Rajaram et al., 2001 ).除油脂外, 薄壳山核桃果实中还含有另一类重要的营养物质——酚类(phenolics).酚类是苯环上含有酚羟基的一大类物质的统称.其中, 人们关注较多的活性物质有酚酸(phenolic acids)、类黄酮(flavonoids)、香豆素(coumarins)、木质素(lignans)和单宁(tannins) (
Alasalvar and Shahidi, 2009 ).其中, 类黄酮又包含黄酮醇(flavonols)、黄烷-3-醇(flavan-3-ols)和二氢黄酮醇(dihydroflavonols)及其糖苷(
李珊珊等, 2014 ).单宁包含水解单宁(hydrolysable tannins)和缩合单宁(condensed tannins)两大类(
孙达旺, 1992 ).水解单宁在酸碱条件下不稳定, 易于水解, 根据水解后产生酚酸的不同分为棓单宁(gallotannins)和鞣花单宁(ellagitannins).缩合单宁一般衍生于黄烷类化合物, 又被称为原花青素或原花色素(proanthocyanidins) (
石碧和狄莹, 2000 ).酚类为植物次生代谢产物, 在植物中含量虽低但功效显著.人们最早注意到薄壳山核桃中的酚类代谢物是由于发现其可能与采后种皮变色及油脂氧化有关(
Senter et al., 1978 ,
1980 ;
Polles et al., 1981 ).后来, 科学家发现薄壳山核桃具有较强的抗氧化性(
Wu et al., 2004 ;
Gu et al., 2004 ), 进而发现这种抗氧化性的物质基础是其中所含有的酚类代谢物(
Villarreal-Lozoya et al., 2007 ).采用不同的分析手段可测定薄壳山核桃种仁及壳中的总酚、缩合单宁及总黄酮的含量, 检测抗氧化性并对酚类代谢物进行鉴定.随着液相色谱及质谱等现代化分析技术的应用, 薄壳山核桃中的酚类代谢物已逐渐被阐明.目前, 对薄壳山核桃的种质资源(
Grauke et al., 2003 )、育苗技术(
Zhang et al., 2015 )及栽培措施(
Mo et al., 2017 )已有许多研究报道, 但对薄壳山核桃中的酚类代谢物尚未见系统总结.本文综述薄壳山核桃酚类代谢物相关研究进展, 以期为今后的科学研究和产业发展提供参考. ...
Antidiabetic activity of phenolic compounds from pecan bark in streptozotocin-induced diabetic rats
4
2011
... 最早报道从薄壳山核桃树皮中分离到的类黄酮是杜鹃黄素和山核桃黄素.
Ishak等(1980) 从薄壳山核桃的树枝中分离到5个以杜鹃黄素为母核的黄酮醇苷和2个以山核桃黄素为母核的黄酮苷并对代谢物的结构进行了鉴定.之后,
Abdallah等(2011) 从薄壳山核桃树皮中分离到7个酚类代谢物, 其中2个为具有抗糖尿病活性的新化合物, 即山核桃黄素-3'-硫酸盐和3'-甲氧基山核桃黄素-7-葡萄糖苷. ...
... 酚类代谢物通常采用甲醇、乙醇或丙酮提取, 由于酚类显弱酸性, 提取液中一般会添加少量的酸.薄壳山核桃酚类代谢物常见的提取方法见
表3 .从种仁样品中提取酚类代谢物前需先进行干燥和脱脂.以分离单体代谢物为目的的提取往往采用加热回流法, 回收率高, 但杂质也较多(
Ishak et al., 1980 ;
Gad et al., 2007 ;
Abdallah et al., 2011 ).而以分析为主要目的的提取一般采用匀浆或超声方法, 获得的提取液杂质较少, 有利于分析目标代谢物(
Malik et al., 2009 ;
de la Rosa et al., 2011 ;
Robbins et al., 2014 ,
2015 ;
Gong and Pegg, 2017 ;
Jia et al., 2018 ;
Hilbig et al., 2018a ).提取后可采用凝胶柱除杂或分段, 以减少色谱峰间的重叠, 使结果更准确.而采用超高效液相色谱可进一步提高分离度, 不分段直接进行鉴定.采用高分辨质谱分析代谢物, 荷质比精度可至小数点后4位, 通过计算与理论值之间的偏差(mass measurement errors, ∆m)进一步确保结果的准确性.对原花青素的检测采用亲水作用色谱(hydrophilic interaction chromatography, HILIC)取得了较好的结果(
Gong and Pegg, 2017 ). ...
... Extraction and examination methods of phenolic metabolites in pecan
Table 3 部位 溶剂 提取方法 检测方法 组分 参考文献 种仁 含0.1% HCl的甲醇 冷浸3小时 纸层析显色 初步认为含无色花色素 Senter et al., 1978 种仁 含0.1% HCl的甲醇 回流提取2小时2次, 合并浓缩后用1 mol·L-1 HCl回流水解2小时, 乙酸乙酯萃取, 甲酯化 GC-MS 8个酚酸 Senter et al., 1980 树枝, 叶 70%乙醇 回流提取, 浓缩后聚酰胺柱反复柱层 H1 -NMR, C13 - NMR 从树枝中分离出4个类黄酮; 从叶中分离出5个类黄酮、 Ishak et al., 1980 叶 水 回流提取, 烘干, 再用乙醇提取, Sephadex LH-20柱反复柱层析分离 H1 -NMR, C13 - NMR 1个酚酸、8个类黄酮和6个单宁 Gad et al., 2007 种仁 70%丙酮 正己烷脱脂, 匀浆, 5°C摇床振摇过夜.分别用6 mol·L-1 HCl和8 mol·L-1 NaOH进行酸和碱水解 HPLC-DAD 4个酚类代谢物 Villarreal-Lozoya et al., 2007 种仁 80%甲醇 正己烷脱脂, 匀浆机提取30秒, 2次, 再用Sephadex LH-20小柱除杂 HPLC-DAD 8个酚酸 Malik et al., 2009 种仁 80%丙酮 正己烷脱脂, 50°C匀浆提取30分钟, HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS 5个酚酸、2个类黄酮、5个鞣花单宁和1个棓单宁 de la Rosa et al., 2011 树皮 70%乙醇 70°C回流提取, 硅胶柱及Sephadex LH-20柱反复柱层析 H1 -NMR, C13 - NMR 6个类黄酮和1个酚酸 Abdallah et al., 2011 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干, Sephadex LH-20柱分段 HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS/MS 27个酚类代谢物, 其中包含2个鞣花单宁、2个棓单宁和2个缩合单宁 Robbins et al., 2014 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) (v/v/v) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干.分别用-1 HCl和2 mol·L-1 NaOH进行酸和碱水解 HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS/MS 水解前13个酚类代谢物, 碱水解后8个, 酸水解后9个 Robbins et al., 2015 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) (v/v/v) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干, Sephadex LH-20柱分段 HPLC-DAD, HPLC-ESI-Q/TOF-MS 38个酚类代谢物, 其中包含15个鞣花单宁、3个棓单宁和13个原花青素 Gong et al., 2017 种仁 80%丙酮 正己烷脱脂, 提取液冷浸过夜, 室温超声提取2小时, 2次, 50°C氮吹仪吹干, 冻干 HPLC-DAD, UPLC-ESI-Q/TOF-MS 35个酚类代谢物, 其中包含18个鞣花单宁、2个棓单宁和2个原花青素 Jia et al., 2017 壳 20%乙醇 80°C超声提取1小时, 减压回收溶剂 HPLC-ESI-MS/MS 29个酚酸苷元, 其中包含12个类黄酮和1个香豆素 Hilbig et al., 2018a
根据分离目的不同, 鉴定方法各有不同.采用1D、2D氢和碳核磁共振法可准确鉴定代谢物的结构, 但要求对代谢物进行分离, 一般纯度需达到95%以上才能准确鉴定.质谱法可以一次性同时鉴定大量代谢物, 根据国际化学分析工作组(Chemical Analysis Working Group, CAWG)代谢组学标准委员会(Metabolomics Standards Initiative, MSI)的规定, 鉴定的代谢物分为4个等级, 即可用标准品准确鉴定、无标准品但分子量和裂解规律与已知代谢物一致、无标准品通过裂解规律等推定为某一类型代谢物及未知代谢物(
Sumner et al., 2007 ).定量测定的要求较低时则可采用紫外分光法进行检测. ...
...
Abdallah等(2011) 评价了薄壳山核桃树皮的抗糖尿病活性, 从树皮的正丁醇萃取部位分离鉴定了7个类黄酮代谢物, 评价每个单体化合物对于由链脲霉素诱导的糖尿病小鼠的抗病活性, 并与辉瑞制药生产的抗糖尿病药物格列本脲(glibenlamide)活性进行比较, 结果显示其中2个类黄酮的活性高于阳性对照, 具有开发成为替代药物的潜力.
Lei等(2018) 比较了薄壳山核桃疮痂病抗性品种和易感品种中的酚类物质组成, 发现疮痂病抗性品种和易感品种中酚类物质的含量差异显著, 推测一些仅能在抗性品种中检测到或含量更高的酚类代谢物可能与疮痂病抗性有关. ...
Natural antioxidants in tree nuts
1
2009
... 薄壳山核桃含有丰富的营养成分, 具有良好的保健功效.最早引起人们关注的是其所含有的丰富油脂, 该类油脂以单不饱和脂肪酸为主, 比例之高可媲美橄榄油, 对心脑血管具有良好的保健作用(
Morgan and Clayshulte, 2000 ;
Rajaram et al., 2001 ).除油脂外, 薄壳山核桃果实中还含有另一类重要的营养物质——酚类(phenolics).酚类是苯环上含有酚羟基的一大类物质的统称.其中, 人们关注较多的活性物质有酚酸(phenolic acids)、类黄酮(flavonoids)、香豆素(coumarins)、木质素(lignans)和单宁(tannins) (
Alasalvar and Shahidi, 2009 ).其中, 类黄酮又包含黄酮醇(flavonols)、黄烷-3-醇(flavan-3-ols)和二氢黄酮醇(dihydroflavonols)及其糖苷(
李珊珊等, 2014 ).单宁包含水解单宁(hydrolysable tannins)和缩合单宁(condensed tannins)两大类(
孙达旺, 1992 ).水解单宁在酸碱条件下不稳定, 易于水解, 根据水解后产生酚酸的不同分为棓单宁(gallotannins)和鞣花单宁(ellagitannins).缩合单宁一般衍生于黄烷类化合物, 又被称为原花青素或原花色素(proanthocyanidins) (
石碧和狄莹, 2000 ).酚类为植物次生代谢产物, 在植物中含量虽低但功效显著.人们最早注意到薄壳山核桃中的酚类代谢物是由于发现其可能与采后种皮变色及油脂氧化有关(
Senter et al., 1978 ,
1980 ;
Polles et al., 1981 ).后来, 科学家发现薄壳山核桃具有较强的抗氧化性(
Wu et al., 2004 ;
Gu et al., 2004 ), 进而发现这种抗氧化性的物质基础是其中所含有的酚类代谢物(
Villarreal-Lozoya et al., 2007 ).采用不同的分析手段可测定薄壳山核桃种仁及壳中的总酚、缩合单宁及总黄酮的含量, 检测抗氧化性并对酚类代谢物进行鉴定.随着液相色谱及质谱等现代化分析技术的应用, 薄壳山核桃中的酚类代谢物已逐渐被阐明.目前, 对薄壳山核桃的种质资源(
Grauke et al., 2003 )、育苗技术(
Zhang et al., 2015 )及栽培措施(
Mo et al., 2017 )已有许多研究报道, 但对薄壳山核桃中的酚类代谢物尚未见系统总结.本文综述薄壳山核桃酚类代谢物相关研究进展, 以期为今后的科学研究和产业发展提供参考. ...
Pecan texture as affected by freezing rates, storage temperature, and thawing rates
2
1999
... 在薄壳山核桃的采收及贮藏方面, 已有的研究主要包括采后质地(
Anzaldúa-Morales et al., 1999 )、脂肪酸(
Rudolph et al., 1992 )、V
E (
Yao et al., 1992 )和颜色(
Grauke et al., 1998 )等, 而对酚类代谢物与贮藏的关系研究较少.在国外, 薄壳山核桃主要是低温带壳或脱壳贮藏, 远距离运输一般为常温进行.采后随贮存时间的延长, 薄壳山核桃种仁会逐渐氧化、酸败、失水变干、种皮褐变、风味丧失, 其中种皮褐变与酚类物质有关.酚类物质还在防止脂肪酸氧化过程中发挥一定作用.
Senter等(1978) 通过紫外分光法测定了斯图尔特和舒莱(Schley)的种仁在32°C、50%的相对湿度下避光贮藏16周过程中总酚及总黄酮含量的变化趋势.结果显示, 2个品种的总酚和总黄酮含量有较大差异, 但变化速率类似, 其中斯图尔特总酚含量更高, 也更耐贮存, 表明总酚含量与耐贮性有关.通过薄层和纸层析初步分析显示薄壳山核桃的种皮中含有无色花色素(leucoanthocyanidin), 并在贮藏过程中逐渐转变为鞣酐(phlobaphene)、矢车菊素(cyanidin)和飞燕草素(delphinidin).
Senter等(1980) 发现, 脱壳的斯图尔特种仁在21°C、65%的相对湿度下避光贮藏12周, 酚酸含量呈逐渐下降趋势. ...
... 采后不同的加工方法会影响种皮颜色.
Nelson等(1985) 比较了不同加热方法对薄壳山核桃品质的影响.蒸汽加热导致种皮变色, 而介质加热则不会导致变色.低温贮藏可延缓种皮褐变, 且温度越低保存时间越长.研究表明, 20°C条件下薄壳山核桃仅可保存数月便丧失商品价值(
Woodroof and Heaton, 1953 ); 在5°C货架期可延长至半年左右(
Bonner and Karrfalt, 2008 ); 而在-15°C则至少可保存2年(
Anzaldúa- Morales et al., 1999 ).采后贮藏过程中, 种仁含水量会影响种皮颜色, 采收时薄壳山核桃种仁含水量为25%-30%, 应尽快干燥至4%, 隔绝氧气以抑制酚类氧化, 从而延缓褐变(
Kays, 1979 ).
Senter和Forbus (1979) 研究表明, 通过涂布乙酰化单甘脂(acetylated monoglyceride)并不能对种皮褐变产生显著抑制作用.
Dull和Kays (1988) 用聚偏二氯乙烯(polyvinylidenechloride)涂层玻璃纸真空包装种仁, 在24°C、65%的相对湿度下保存6个月颜色基本不变, 并可有效防止机械损伤, 但口味稍差.
Heaton和Shewfelt (1976) 考察了不同含水量、不同透光度软袋中的薄壳山核桃在23°C下贮藏24周其种仁颜色和脂肪酸变化, 结果显示, 光强、含水量和贮藏时间均对颜色和脂肪酸含量有显著影响, 但这3项因素的重要性次于温度. ...
Health benefits of nuts: potential role of antioxidants
1
2006
... Comparison of antioxidant capacities of pecan
Table 4 部位 抗氧化性平均值(范围) 参考文献 DPPH -1 ) ABTS -1 ) ORAC -1 ) FRAP 2+ eq∙(100 g)-1 ) 种仁 - - 179.4 - Wu et al., 2004 种仁 - - - 8.33 (6.32-11.05) Blomhoff et al., 2006 种仁 388 (324-540) - 583 (373-817) - Villarreal-Lozoya et al., 2007 种仁 102.6-108.7 75.9-83.4 227-261.5 - de la Rosa et al., 2011 种仁 2110 3360 - - de la Rosa et al., 2014 种仁 - - 135-255 14.0-20.7 Robbins et al., 2015 种仁 548.84 - - - Flores-Córdova et al., 2017 种仁 37.24-461.80 6.74-201.49 - - Jia et al., 2018 壳80%丙酮提取液 537.8-720.3 518.4-644.2 680.3-1350.3 - de la Rosa et al., 2011 壳水提液 1386.28 1333.1 - - Prado et al., 2013 壳80%丙酮提取液 4800 8240 - - de la Rosa et al., 2014 壳水提液 2448.96 1809.01 - - Prado et al., 2014 壳水提液 1268.03 2574.32 - - Hilbig et al., 2018a
DPPH: 2, 2-二苯基-1-三硝基苯肼自由基清除实验; ABTS: 2, 2'-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐自由基清除实验; ORAC: 氧化自由基吸收能力; FRAP: 铁离子还原能力 ...Nelson等(1985) 比较了不同加热方法对薄壳山核桃品质的影响.蒸汽加热导致种皮变色, 而介质加热则不会导致变色.低温贮藏可延缓种皮褐变, 且温度越低保存时间越长.研究表明, 20°C条件下薄壳山核桃仅可保存数月便丧失商品价值(Woodroof and Heaton, 1953 ); 在5°C货架期可延长至半年左右(Bonner and Karrfalt, 2008 ); 而在-15°C则至少可保存2年(Anzaldúa- Morales et al., 1999 ).采后贮藏过程中, 种仁含水量会影响种皮颜色, 采收时薄壳山核桃种仁含水量为25%-30%, 应尽快干燥至4%, 隔绝氧气以抑制酚类氧化, 从而延缓褐变(Kays, 1979 ).Senter和Forbus (1979) 研究表明, 通过涂布乙酰化单甘脂(acetylated monoglyceride)并不能对种皮褐变产生显著抑制作用.Dull和Kays (1988) 用聚偏二氯乙烯(polyvinylidenechloride)涂层玻璃纸真空包装种仁, 在24°C、65%的相对湿度下保存6个月颜色基本不变, 并可有效防止机械损伤, 但口味稍差.Heaton和Shewfelt (1976) 考察了不同含水量、不同透光度软袋中的薄壳山核桃在23°C下贮藏24周其种仁颜色和脂肪酸变化, 结果显示, 光强、含水量和贮藏时间均对颜色和脂肪酸含量有显著影响, 但这3项因素的重要性次于温度. ...Wu等(2004) 对市售薄壳山核桃种仁总酚含量的测定结果为2 016 mg没食子酸等价物·g-1 鲜种仁, 而Kornsteiner等(2006) 测得为1 284 mg没食子酸等价物·g-1 鲜种仁.Villarreal-Lozoya等(2007) 测定美国产6种薄壳山核桃种仁中的总酚含量为62-106 mg绿原酸等价物·g-1 脱脂种仁, 且品种间差异显著.de la Rosa等(2011) 对墨西哥产薄壳山核桃仁的测定结果为11.7-12.5 mg没食子酸等价物·g-1 鲜种仁, 而壳的总酚含量为65.3-92.5 mg没食子酸等价物·g-1 鲜种仁.Robbins等(2015) 用鞣花酸作为标准品, 测得总酚含量为1.82-2.62 g鞣花酸等价物·(100 g)-1 种仁.不同研究对于总酚含量的表征可以为每克鲜种仁、每克干种仁或每克脱脂种仁, 标准品为没食子酸、绿原酸和鞣花酸(罗会婷等, 2017 ).不同的标准品和含量单位给比较带来了一定的困难.据文献报道, 绿原酸等价物与没食子酸等价物的转换因子为0.6 (Chun and Kim, 2004 ), 而脱脂种仁与未脱脂种仁比较时需考虑70%的油脂含量并进行转换(Rudolph et al., 1992 ). ...Carya illinoinensis )Villarreal-Lozoya等(2007) 采用液相色谱法从堪萨(Kanza)脱脂种仁的碱水解液中检测到4个酚酸, 分别是没食子酸、儿茶素、表儿茶素和鞣花酸.Malik等(2009) 最早尝试不水解, 直接用液相色谱法分析薄壳山核桃中的酚类代谢物, 从脱脂种仁中检测到8个酚酸, 其中新检测到的有儿茶酚、香豆酸、绿原酸和咖啡酸.de la Rosa等(2011) 采用液相色谱法分别从直接提取液和酸水解液中检测到6个酚类代谢物和8个酚类代谢物苷元.Robbins等(2014) 首次采用液质联用法分析和鉴定薄壳山核桃中的酚类代谢物, 至此从薄壳山核桃中检测到的酚类代谢物数量跃上了一个新的台阶.该研究团队从美国产8个高抗氧化性品种种仁的混样中鉴定出27个酚类代谢物, 其中新鉴定了13个酚酸及其糖苷、2个棓单宁、1个鞣花单宁和2个缩合单宁.Robbins等(2015) 同样采用液质联用法从美国产薄壳山核桃种仁中新鉴定了1个酚酸和1个棓单宁.Gong和Pegg (2017) 采用高效液相色谱联用飞行时间质谱从美国产薄壳山核桃种仁中鉴定出38个酚类代谢物, 其中新鉴定4个单宁.Jia等(2018) 采用超高效液相色谱联用高分辨飞行时间质谱从中国产薄壳山核桃种仁动态混样中鉴定酚类代谢物35个, 其中新鉴定酚酸4个, 鞣花单宁3个. ...表3 .从种仁样品中提取酚类代谢物前需先进行干燥和脱脂.以分离单体代谢物为目的的提取往往采用加热回流法, 回收率高, 但杂质也较多(Ishak et al., 1980 ; Gad et al., 2007 ; Abdallah et al., 2011 ).而以分析为主要目的的提取一般采用匀浆或超声方法, 获得的提取液杂质较少, 有利于分析目标代谢物(Malik et al., 2009 ; de la Rosa et al., 2011 ; Robbins et al., 2014 , 2015 ; Gong and Pegg, 2017 ; Jia et al., 2018 ; Hilbig et al., 2018a ).提取后可采用凝胶柱除杂或分段, 以减少色谱峰间的重叠, 使结果更准确.而采用超高效液相色谱可进一步提高分离度, 不分段直接进行鉴定.采用高分辨质谱分析代谢物, 荷质比精度可至小数点后4位, 通过计算与理论值之间的偏差(mass measurement errors, ∆m)进一步确保结果的准确性.对原花青素的检测采用亲水作用色谱(hydrophilic interaction chromatography, HILIC)取得了较好的结果(Gong and Pegg, 2017 ). ...Table 3 部位 溶剂 提取方法 检测方法 组分 参考文献 种仁 含0.1% HCl的甲醇 冷浸3小时 纸层析显色 初步认为含无色花色素 Senter et al., 1978 种仁 含0.1% HCl的甲醇 回流提取2小时2次, 合并浓缩后用1 mol·L-1 HCl回流水解2小时, 乙酸乙酯萃取, 甲酯化 GC-MS 8个酚酸 Senter et al., 1980 树枝, 叶 70%乙醇 回流提取, 浓缩后聚酰胺柱反复柱层 H1 -NMR, C13 - NMR 从树枝中分离出4个类黄酮; 从叶中分离出5个类黄酮、 Ishak et al., 1980 叶 水 回流提取, 烘干, 再用乙醇提取, Sephadex LH-20柱反复柱层析分离 H1 -NMR, C13 - NMR 1个酚酸、8个类黄酮和6个单宁 Gad et al., 2007 种仁 70%丙酮 正己烷脱脂, 匀浆, 5°C摇床振摇过夜.分别用6 mol·L-1 HCl和8 mol·L-1 NaOH进行酸和碱水解 HPLC-DAD 4个酚类代谢物 Villarreal-Lozoya et al., 2007 种仁 80%甲醇 正己烷脱脂, 匀浆机提取30秒, 2次, 再用Sephadex LH-20小柱除杂 HPLC-DAD 8个酚酸 Malik et al., 2009 种仁 80%丙酮 正己烷脱脂, 50°C匀浆提取30分钟, HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS 5个酚酸、2个类黄酮、5个鞣花单宁和1个棓单宁 de la Rosa et al., 2011 树皮 70%乙醇 70°C回流提取, 硅胶柱及Sephadex LH-20柱反复柱层析 H1 -NMR, C13 - NMR 6个类黄酮和1个酚酸 Abdallah et al., 2011 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干, Sephadex LH-20柱分段 HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS/MS 27个酚类代谢物, 其中包含2个鞣花单宁、2个棓单宁和2个缩合单宁 Robbins et al., 2014 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) (v/v/v) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干.分别用-1 HCl和2 mol·L-1 NaOH进行酸和碱水解 HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS/MS 水解前13个酚类代谢物, 碱水解后8个, 酸水解后9个 Robbins et al., 2015 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) (v/v/v) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干, Sephadex LH-20柱分段 HPLC-DAD, HPLC-ESI-Q/TOF-MS 38个酚类代谢物, 其中包含15个鞣花单宁、3个棓单宁和13个原花青素 Gong et al., 2017 种仁 80%丙酮 正己烷脱脂, 提取液冷浸过夜, 室温超声提取2小时, 2次, 50°C氮吹仪吹干, 冻干 HPLC-DAD, UPLC-ESI-Q/TOF-MS 35个酚类代谢物, 其中包含18个鞣花单宁、2个棓单宁和2个原花青素 Jia et al., 2017 壳 20%乙醇 80°C超声提取1小时, 减压回收溶剂 HPLC-ESI-MS/MS 29个酚酸苷元, 其中包含12个类黄酮和1个香豆素 Hilbig et al., 2018a
根据分离目的不同, 鉴定方法各有不同.采用1D、2D氢和碳核磁共振法可准确鉴定代谢物的结构, 但要求对代谢物进行分离, 一般纯度需达到95%以上才能准确鉴定.质谱法可以一次性同时鉴定大量代谢物, 根据国际化学分析工作组(Chemical Analysis Working Group, CAWG)代谢组学标准委员会(Metabolomics Standards Initiative, MSI)的规定, 鉴定的代谢物分为4个等级, 即可用标准品准确鉴定、无标准品但分子量和裂解规律与已知代谢物一致、无标准品通过裂解规律等推定为某一类型代谢物及未知代谢物(Sumner et al., 2007 ).定量测定的要求较低时则可采用紫外分光法进行检测. ...Wu等(2004) 对市售薄壳山核桃种仁总酚含量的测定结果为2 016 mg没食子酸等价物·g-1 鲜种仁, 而Kornsteiner等(2006) 测得为1 284 mg没食子酸等价物·g-1 鲜种仁.Villarreal-Lozoya等(2007) 测定美国产6种薄壳山核桃种仁中的总酚含量为62-106 mg绿原酸等价物·g-1 脱脂种仁, 且品种间差异显著.de la Rosa等(2011) 对墨西哥产薄壳山核桃仁的测定结果为11.7-12.5 mg没食子酸等价物·g-1 鲜种仁, 而壳的总酚含量为65.3-92.5 mg没食子酸等价物·g-1 鲜种仁.Robbins等(2015) 用鞣花酸作为标准品, 测得总酚含量为1.82-2.62 g鞣花酸等价物·(100 g)-1 种仁.不同研究对于总酚含量的表征可以为每克鲜种仁、每克干种仁或每克脱脂种仁, 标准品为没食子酸、绿原酸和鞣花酸(罗会婷等, 2017 ).不同的标准品和含量单位给比较带来了一定的困难.据文献报道, 绿原酸等价物与没食子酸等价物的转换因子为0.6 (Chun and Kim, 2004 ), 而脱脂种仁与未脱脂种仁比较时需考虑70%的油脂含量并进行转换(Rudolph et al., 1992 ). ...Wu等(2004) 比较了9种坚果的总黄酮含量, 其中薄壳山核桃的总黄酮含量最高, 为34.01 mg·(100 g)-1 .de la Rosa等(2011) 对墨西哥产薄壳山核桃种仁的总黄酮含量进行测定, 结果为5.8-6.4 mg儿茶素等价物·g-1 鲜种仁.Jia等(2018) 对中国产薄壳山核桃的总酚、缩合单宁和总黄酮含量随果实发育的动态变化进行详细分析, 结果表明总黄酮含量一般低于总酚含量. ...do Prado et al., 2013 ; Ribeiro et al., 2017 ; Hilbig et al., 2018b ).de la Rosa等(2011) 测得墨西哥产薄壳山核桃壳的总黄酮含量为26.3- 36.1 mg儿茶素等价物·g-1 鲜种仁, 原花青素含量为316.1-464.4 mg儿茶素等价物·g-1 鲜种仁, 而种仁的原花青素含量仅为20.3-26.7 mg儿茶素等价物·g-1 鲜种仁, 说明薄壳山核桃壳中原花青素含量远高于种仁.de la Rosa等(2011) 通过比较表明种壳的总酚含量大约是种仁的3倍.Hilbig等(2018a) 测定了巴西薄壳山核桃品种巴顿(Barton)壳中的总酚含量为581.9 mg没食子酸等价物·g-1 种仁, 缩合单宁含量为71.08 mg儿茶素等价物·g-1 种仁, 之后采用液质联用法测定水解液中酚类代谢物苷元的含量, 其中儿茶素、没食子酸和鞣花酸的含量分别为352、138和36 mg·g-1 干种仁, 再次证明壳中含有大量原花青素.Do Prado等(2013 , 2014) 测定了巴西薄壳山核桃壳的总酚及缩合单宁含量, 分析表明壳中酚类代谢物含量可能会影响油中不饱和脂肪酸的氧化程度. ...de la Rosa等(2011) 通过比较表明种壳的总酚含量大约是种仁的3倍.Hilbig等(2018a) 测定了巴西薄壳山核桃品种巴顿(Barton)壳中的总酚含量为581.9 mg没食子酸等价物·g-1 种仁, 缩合单宁含量为71.08 mg儿茶素等价物·g-1 种仁, 之后采用液质联用法测定水解液中酚类代谢物苷元的含量, 其中儿茶素、没食子酸和鞣花酸的含量分别为352、138和36 mg·g-1 干种仁, 再次证明壳中含有大量原花青素.Do Prado等(2013 , 2014) 测定了巴西薄壳山核桃壳的总酚及缩合单宁含量, 分析表明壳中酚类代谢物含量可能会影响油中不饱和脂肪酸的氧化程度. ...表4 ).从评价方法来看, 采用DPPH和ABTS方法最多.其中, de la Rosa等(2011) 测得的数值较高, 与其它研究结果偏离较远.Jia等(2018) 的实验对象是果实发育期的动态样品, 其余研究为成熟样品.剔除de la Rosa等(2011) 偏离的数据, Jia等(2018) 的数据仅比较成熟样品结果, 可发现不同报道的数值总体接近.由于产地、品种和提取方法等的不同, 不同研究结果间存在一定差异, 但总体来看壳的抗氧化性高于种仁, 约为种仁的5-7倍. ...de la Rosa等(2011) 偏离的数据, Jia等(2018) 的数据仅比较成熟样品结果, 可发现不同报道的数值总体接近.由于产地、品种和提取方法等的不同, 不同研究结果间存在一定差异, 但总体来看壳的抗氧化性高于种仁, 约为种仁的5-7倍. ...Table 4 部位 抗氧化性平均值(范围) 参考文献 DPPH -1 ) ABTS -1 ) ORAC -1 ) FRAP 2+ eq∙(100 g)-1 ) 种仁 - - 179.4 - Wu et al., 2004 种仁 - - - 8.33 (6.32-11.05) Blomhoff et al., 2006 种仁 388 (324-540) - 583 (373-817) - Villarreal-Lozoya et al., 2007 种仁 102.6-108.7 75.9-83.4 227-261.5 - de la Rosa et al., 2011 种仁 2110 3360 - - de la Rosa et al., 2014 种仁 - - 135-255 14.0-20.7 Robbins et al., 2015 种仁 548.84 - - - Flores-Córdova et al., 2017 种仁 37.24-461.80 6.74-201.49 - - Jia et al., 2018 壳80%丙酮提取液 537.8-720.3 518.4-644.2 680.3-1350.3 - de la Rosa et al., 2011 壳水提液 1386.28 1333.1 - - Prado et al., 2013 壳80%丙酮提取液 4800 8240 - - de la Rosa et al., 2014 壳水提液 2448.96 1809.01 - - Prado et al., 2014 壳水提液 1268.03 2574.32 - - Hilbig et al., 2018a
DPPH: 2, 2-二苯基-1-三硝基苯肼自由基清除实验; ABTS: 2, 2'-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐自由基清除实验; ORAC: 氧化自由基吸收能力; FRAP: 铁离子还原能力 ...de la Rosa et al., 2011 壳水提液 1386.28 1333.1 - - Prado et al., 2013 壳80%丙酮提取液 4800 8240 - - de la Rosa et al., 2014 壳水提液 2448.96 1809.01 - - Prado et al., 2014 壳水提液 1268.03 2574.32 - - Hilbig et al., 2018a DPPH: 2, 2-二苯基-1-三硝基苯肼自由基清除实验; ABTS: 2, 2'-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐自由基清除实验; ORAC: 氧化自由基吸收能力; FRAP: 铁离子还原能力 ...Table 4 部位 抗氧化性平均值(范围) 参考文献 DPPH -1 ) ABTS -1 ) ORAC -1 ) FRAP 2+ eq∙(100 g)-1 ) 种仁 - - 179.4 - Wu et al., 2004 种仁 - - - 8.33 (6.32-11.05) Blomhoff et al., 2006 种仁 388 (324-540) - 583 (373-817) - Villarreal-Lozoya et al., 2007 种仁 102.6-108.7 75.9-83.4 227-261.5 - de la Rosa et al., 2011 种仁 2110 3360 - - de la Rosa et al., 2014 种仁 - - 135-255 14.0-20.7 Robbins et al., 2015 种仁 548.84 - - - Flores-Córdova et al., 2017 种仁 37.24-461.80 6.74-201.49 - - Jia et al., 2018 壳80%丙酮提取液 537.8-720.3 518.4-644.2 680.3-1350.3 - de la Rosa et al., 2011 壳水提液 1386.28 1333.1 - - Prado et al., 2013 壳80%丙酮提取液 4800 8240 - - de la Rosa et al., 2014 壳水提液 2448.96 1809.01 - - Prado et al., 2014 壳水提液 1268.03 2574.32 - - Hilbig et al., 2018a
DPPH: 2, 2-二苯基-1-三硝基苯肼自由基清除实验; ABTS: 2, 2'-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐自由基清除实验; ORAC: 氧化自由基吸收能力; FRAP: 铁离子还原能力 ...de la Rosa et al., 2014 壳水提液 2448.96 1809.01 - - Prado et al., 2014 壳水提液 1268.03 2574.32 - - Hilbig et al., 2018a DPPH: 2, 2-二苯基-1-三硝基苯肼自由基清除实验; ABTS: 2, 2'-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐自由基清除实验; ORAC: 氧化自由基吸收能力; FRAP: 铁离子还原能力 ...Yang等(2009) 测定了9种美国消费者最常食用的干果提取物的抗增殖能力, 发现干果提取物对HepG2 和Caco-2细胞增殖均具有一定的抑制作用, 且活性与剂量呈显著正相关, 其中核桃和薄壳山核桃的活性最强.de la Rosa等(2014) 评价了墨西哥产薄壳山核桃种仁和壳的抗增殖活性, 发现种仁和壳的提取物对HTB4和LLC-PK1细胞增殖均具有抑制作用.Hilbig等(2018b) 报道了薄壳山核桃壳水提液对乳腺癌MCF-7细胞系的细胞毒作用、凋亡诱导的细胞死亡及对细胞周期的阻滞作用.艾氏腹水瘤小鼠存活时间延长了67%, 并认为壳提取物抗肿瘤作用的机制可能与激活凋亡细胞死亡的关键蛋白(Bcl-XL、Bax和p53)以及细胞周期调控(cyclin A、cyclin B和CDK2)有关.这种效果归因于提取物中的酚类代谢物, 如没食子酸、4-羟基苯甲酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸和鞣花酸, 以及儿茶素、表儿茶素和没食子酸表儿茶素.研究表明, 薄壳山核桃壳提取物对肿瘤细胞生长有抑制作用, 可作为肿瘤治疗的替代物. ...do Prado et al., 2013 ; Ribeiro et al., 2017 ; Hilbig et al., 2018b ).de la Rosa等(2011) 测得墨西哥产薄壳山核桃壳的总黄酮含量为26.3- 36.1 mg儿茶素等价物·g-1 鲜种仁, 原花青素含量为316.1-464.4 mg儿茶素等价物·g-1 鲜种仁, 而种仁的原花青素含量仅为20.3-26.7 mg儿茶素等价物·g-1 鲜种仁, 说明薄壳山核桃壳中原花青素含量远高于种仁.de la Rosa等(2011) 通过比较表明种壳的总酚含量大约是种仁的3倍.Hilbig等(2018a) 测定了巴西薄壳山核桃品种巴顿(Barton)壳中的总酚含量为581.9 mg没食子酸等价物·g-1 种仁, 缩合单宁含量为71.08 mg儿茶素等价物·g-1 种仁, 之后采用液质联用法测定水解液中酚类代谢物苷元的含量, 其中儿茶素、没食子酸和鞣花酸的含量分别为352、138和36 mg·g-1 干种仁, 再次证明壳中含有大量原花青素.Do Prado等(2013 , 2014) 测定了巴西薄壳山核桃壳的总酚及缩合单宁含量, 分析表明壳中酚类代谢物含量可能会影响油中不饱和脂肪酸的氧化程度. ...Table 4 部位 抗氧化性平均值(范围) 参考文献 DPPH -1 ) ABTS -1 ) ORAC -1 ) FRAP 2+ eq∙(100 g)-1 ) 种仁 - - 179.4 - Wu et al., 2004 种仁 - - - 8.33 (6.32-11.05) Blomhoff et al., 2006 种仁 388 (324-540) - 583 (373-817) - Villarreal-Lozoya et al., 2007 种仁 102.6-108.7 75.9-83.4 227-261.5 - de la Rosa et al., 2011 种仁 2110 3360 - - de la Rosa et al., 2014 种仁 - - 135-255 14.0-20.7 Robbins et al., 2015 种仁 548.84 - - - Flores-Córdova et al., 2017 种仁 37.24-461.80 6.74-201.49 - - Jia et al., 2018 壳80%丙酮提取液 537.8-720.3 518.4-644.2 680.3-1350.3 - de la Rosa et al., 2011 壳水提液 1386.28 1333.1 - - Prado et al., 2013 壳80%丙酮提取液 4800 8240 - - de la Rosa et al., 2014 壳水提液 2448.96 1809.01 - - Prado et al., 2014 壳水提液 1268.03 2574.32 - - Hilbig et al., 2018a
DPPH: 2, 2-二苯基-1-三硝基苯肼自由基清除实验; ABTS: 2, 2'-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐自由基清除实验; ORAC: 氧化自由基吸收能力; FRAP: 铁离子还原能力 ...do Prado et al., 2013 ; Ribeiro et al., 2017 ; Hilbig et al., 2018b ).de la Rosa等(2011) 测得墨西哥产薄壳山核桃壳的总黄酮含量为26.3- 36.1 mg儿茶素等价物·g-1 鲜种仁, 原花青素含量为316.1-464.4 mg儿茶素等价物·g-1 鲜种仁, 而种仁的原花青素含量仅为20.3-26.7 mg儿茶素等价物·g-1 鲜种仁, 说明薄壳山核桃壳中原花青素含量远高于种仁.de la Rosa等(2011) 通过比较表明种壳的总酚含量大约是种仁的3倍.Hilbig等(2018a) 测定了巴西薄壳山核桃品种巴顿(Barton)壳中的总酚含量为581.9 mg没食子酸等价物·g-1 种仁, 缩合单宁含量为71.08 mg儿茶素等价物·g-1 种仁, 之后采用液质联用法测定水解液中酚类代谢物苷元的含量, 其中儿茶素、没食子酸和鞣花酸的含量分别为352、138和36 mg·g-1 干种仁, 再次证明壳中含有大量原花青素.Do Prado等(2013 , 2014) 测定了巴西薄壳山核桃壳的总酚及缩合单宁含量, 分析表明壳中酚类代谢物含量可能会影响油中不饱和脂肪酸的氧化程度. ...Do Prado等(2013 , 2014) 测定了巴西薄壳山核桃壳的总酚及缩合单宁含量, 分析表明壳中酚类代谢物含量可能会影响油中不饱和脂肪酸的氧化程度. ...Table 4 部位 抗氧化性平均值(范围) 参考文献 DPPH -1 ) ABTS -1 ) ORAC -1 ) FRAP 2+ eq∙(100 g)-1 ) 种仁 - - 179.4 - Wu et al., 2004 种仁 - - - 8.33 (6.32-11.05) Blomhoff et al., 2006 种仁 388 (324-540) - 583 (373-817) - Villarreal-Lozoya et al., 2007 种仁 102.6-108.7 75.9-83.4 227-261.5 - de la Rosa et al., 2011 种仁 2110 3360 - - de la Rosa et al., 2014 种仁 - - 135-255 14.0-20.7 Robbins et al., 2015 种仁 548.84 - - - Flores-Córdova et al., 2017 种仁 37.24-461.80 6.74-201.49 - - Jia et al., 2018 壳80%丙酮提取液 537.8-720.3 518.4-644.2 680.3-1350.3 - de la Rosa et al., 2011 壳水提液 1386.28 1333.1 - - Prado et al., 2013 壳80%丙酮提取液 4800 8240 - - de la Rosa et al., 2014 壳水提液 2448.96 1809.01 - - Prado et al., 2014 壳水提液 1268.03 2574.32 - - Hilbig et al., 2018a
DPPH: 2, 2-二苯基-1-三硝基苯肼自由基清除实验; ABTS: 2, 2'-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐自由基清除实验; ORAC: 氧化自由基吸收能力; FRAP: 铁离子还原能力 ...Carya illinoinensis ) and its oil and polyphenolic fractions differentially modulate lipid metabolism and the antioxidant enzyme activities in rats fed high-fat dietsDomínguez-Avila等(2015) 通过小鼠(Mus musculus )体内实验分析薄壳山核桃油脂及多酚对血液的影响.结果显示, 喂饲高脂肪食物加薄壳山核桃油脂可降低小鼠血液中的甘油三酯含量, 喂饲高脂肪食物加薄壳山核桃多酚可刺激肝脏X受体mRNA在肝脏中的表达, 而喂饲高脂肪食物加薄壳山核桃干果可降低血液脂质的过氧化程度, 上调载脂蛋白B和LDL受体mRNA在肝脏中的表达, 说明薄壳山核桃具有降血脂和抗氧化的功效.Robbins等(2016) 通过小鼠体内实验评价了薄壳山核桃种仁的抗炎作用.实验结果表明, 薄壳山核桃中的酚类物质粗提物可抑制小鼠RAW 264.7巨噬细胞释放NO和过氧化.其中, 通过凝胶富集的小分子量部位具有显著的活性, 而大分子量部位无显著活性, 进一步的液相分析发现小分子量部位含有鞣花酸、儿茶素及二聚、三聚和寡聚原花青素. ...Nelson等(1985) 比较了不同加热方法对薄壳山核桃品质的影响.蒸汽加热导致种皮变色, 而介质加热则不会导致变色.低温贮藏可延缓种皮褐变, 且温度越低保存时间越长.研究表明, 20°C条件下薄壳山核桃仅可保存数月便丧失商品价值(Woodroof and Heaton, 1953 ); 在5°C货架期可延长至半年左右(Bonner and Karrfalt, 2008 ); 而在-15°C则至少可保存2年(Anzaldúa- Morales et al., 1999 ).采后贮藏过程中, 种仁含水量会影响种皮颜色, 采收时薄壳山核桃种仁含水量为25%-30%, 应尽快干燥至4%, 隔绝氧气以抑制酚类氧化, 从而延缓褐变(Kays, 1979 ).Senter和Forbus (1979) 研究表明, 通过涂布乙酰化单甘脂(acetylated monoglyceride)并不能对种皮褐变产生显著抑制作用.Dull和Kays (1988) 用聚偏二氯乙烯(polyvinylidenechloride)涂层玻璃纸真空包装种仁, 在24°C、65%的相对湿度下保存6个月颜色基本不变, 并可有效防止机械损伤, 但口味稍差.Heaton和Shewfelt (1976) 考察了不同含水量、不同透光度软袋中的薄壳山核桃在23°C下贮藏24周其种仁颜色和脂肪酸变化, 结果显示, 光强、含水量和贮藏时间均对颜色和脂肪酸含量有显著影响, 但这3项因素的重要性次于温度. ...Table 4 部位 抗氧化性平均值(范围) 参考文献 DPPH -1 ) ABTS -1 ) ORAC -1 ) FRAP 2+ eq∙(100 g)-1 ) 种仁 - - 179.4 - Wu et al., 2004 种仁 - - - 8.33 (6.32-11.05) Blomhoff et al., 2006 种仁 388 (324-540) - 583 (373-817) - Villarreal-Lozoya et al., 2007 种仁 102.6-108.7 75.9-83.4 227-261.5 - de la Rosa et al., 2011 种仁 2110 3360 - - de la Rosa et al., 2014 种仁 - - 135-255 14.0-20.7 Robbins et al., 2015 种仁 548.84 - - - Flores-Córdova et al., 2017 种仁 37.24-461.80 6.74-201.49 - - Jia et al., 2018 壳80%丙酮提取液 537.8-720.3 518.4-644.2 680.3-1350.3 - de la Rosa et al., 2011 壳水提液 1386.28 1333.1 - - Prado et al., 2013 壳80%丙酮提取液 4800 8240 - - de la Rosa et al., 2014 壳水提液 2448.96 1809.01 - - Prado et al., 2014 壳水提液 1268.03 2574.32 - - Hilbig et al., 2018a
DPPH: 2, 2-二苯基-1-三硝基苯肼自由基清除实验; ABTS: 2, 2'-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐自由基清除实验; ORAC: 氧化自由基吸收能力; FRAP: 铁离子还原能力 ...Carya illinoinensis Ishak等(1980) 通过柱层析方法从薄壳山核桃的叶片中分离得到5个类黄酮代谢物, 即槲皮素-3-葡萄糖苷(异槲皮苷)、槲皮素-3-鼠李糖苷、槲皮素-3-阿拉伯糖苷、槲皮素-3-半乳糖苷和3-甲氧基山奈酚.Gad等(2007) 又从叶片中分离得到15个酚类代谢物, 包括1个对羟基苯甲酸、5个槲皮素糖苷、3个山奈酚糖苷、5个水解单宁和1个缩合单宁.从树皮及树叶中分离得到的酚类代谢物均为分离得到单体后经核磁鉴定结构. ...表3 .从种仁样品中提取酚类代谢物前需先进行干燥和脱脂.以分离单体代谢物为目的的提取往往采用加热回流法, 回收率高, 但杂质也较多(Ishak et al., 1980 ; Gad et al., 2007 ; Abdallah et al., 2011 ).而以分析为主要目的的提取一般采用匀浆或超声方法, 获得的提取液杂质较少, 有利于分析目标代谢物(Malik et al., 2009 ; de la Rosa et al., 2011 ; Robbins et al., 2014 , 2015 ; Gong and Pegg, 2017 ; Jia et al., 2018 ; Hilbig et al., 2018a ).提取后可采用凝胶柱除杂或分段, 以减少色谱峰间的重叠, 使结果更准确.而采用超高效液相色谱可进一步提高分离度, 不分段直接进行鉴定.采用高分辨质谱分析代谢物, 荷质比精度可至小数点后4位, 通过计算与理论值之间的偏差(mass measurement errors, ∆m)进一步确保结果的准确性.对原花青素的检测采用亲水作用色谱(hydrophilic interaction chromatography, HILIC)取得了较好的结果(Gong and Pegg, 2017 ). ...Table 3 部位 溶剂 提取方法 检测方法 组分 参考文献 种仁 含0.1% HCl的甲醇 冷浸3小时 纸层析显色 初步认为含无色花色素 Senter et al., 1978 种仁 含0.1% HCl的甲醇 回流提取2小时2次, 合并浓缩后用1 mol·L-1 HCl回流水解2小时, 乙酸乙酯萃取, 甲酯化 GC-MS 8个酚酸 Senter et al., 1980 树枝, 叶 70%乙醇 回流提取, 浓缩后聚酰胺柱反复柱层 H1 -NMR, C13 - NMR 从树枝中分离出4个类黄酮; 从叶中分离出5个类黄酮、 Ishak et al., 1980 叶 水 回流提取, 烘干, 再用乙醇提取, Sephadex LH-20柱反复柱层析分离 H1 -NMR, C13 - NMR 1个酚酸、8个类黄酮和6个单宁 Gad et al., 2007 种仁 70%丙酮 正己烷脱脂, 匀浆, 5°C摇床振摇过夜.分别用6 mol·L-1 HCl和8 mol·L-1 NaOH进行酸和碱水解 HPLC-DAD 4个酚类代谢物 Villarreal-Lozoya et al., 2007 种仁 80%甲醇 正己烷脱脂, 匀浆机提取30秒, 2次, 再用Sephadex LH-20小柱除杂 HPLC-DAD 8个酚酸 Malik et al., 2009 种仁 80%丙酮 正己烷脱脂, 50°C匀浆提取30分钟, HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS 5个酚酸、2个类黄酮、5个鞣花单宁和1个棓单宁 de la Rosa et al., 2011 树皮 70%乙醇 70°C回流提取, 硅胶柱及Sephadex LH-20柱反复柱层析 H1 -NMR, C13 - NMR 6个类黄酮和1个酚酸 Abdallah et al., 2011 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干, Sephadex LH-20柱分段 HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS/MS 27个酚类代谢物, 其中包含2个鞣花单宁、2个棓单宁和2个缩合单宁 Robbins et al., 2014 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) (v/v/v) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干.分别用-1 HCl和2 mol·L-1 NaOH进行酸和碱水解 HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS/MS 水解前13个酚类代谢物, 碱水解后8个, 酸水解后9个 Robbins et al., 2015 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) (v/v/v) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干, Sephadex LH-20柱分段 HPLC-DAD, HPLC-ESI-Q/TOF-MS 38个酚类代谢物, 其中包含15个鞣花单宁、3个棓单宁和13个原花青素 Gong et al., 2017 种仁 80%丙酮 正己烷脱脂, 提取液冷浸过夜, 室温超声提取2小时, 2次, 50°C氮吹仪吹干, 冻干 HPLC-DAD, UPLC-ESI-Q/TOF-MS 35个酚类代谢物, 其中包含18个鞣花单宁、2个棓单宁和2个原花青素 Jia et al., 2017 壳 20%乙醇 80°C超声提取1小时, 减压回收溶剂 HPLC-ESI-MS/MS 29个酚酸苷元, 其中包含12个类黄酮和1个香豆素 Hilbig et al., 2018a
根据分离目的不同, 鉴定方法各有不同.采用1D、2D氢和碳核磁共振法可准确鉴定代谢物的结构, 但要求对代谢物进行分离, 一般纯度需达到95%以上才能准确鉴定.质谱法可以一次性同时鉴定大量代谢物, 根据国际化学分析工作组(Chemical Analysis Working Group, CAWG)代谢组学标准委员会(Metabolomics Standards Initiative, MSI)的规定, 鉴定的代谢物分为4个等级, 即可用标准品准确鉴定、无标准品但分子量和裂解规律与已知代谢物一致、无标准品通过裂解规律等推定为某一类型代谢物及未知代谢物(Sumner et al., 2007 ).定量测定的要求较低时则可采用紫外分光法进行检测. ...Nicotiana tabacum )和乙醇导致的过氧化症状, 保护大脑、血液和肝部健康.Reckziegel等(2011) 对小鼠的研究显示, 薄壳山核桃壳水提液对于戒烟导致的焦虑症状具有缓解作用, 同时可抑制吸烟导致的脑及红细胞脂质过氧化、降低红细胞内过氧化酶活性, 维持血浆中抗坏血酸水平.Müller等(2013) 通过体内及体外实验, 发现薄壳山核桃壳水提液可减少脂质过氧化、谷胱甘肽和超氧化物歧化酶的消耗, 对乙醇导致的肝损伤具有保护作用, 未来可能是治疗乙醇性肝损伤的一种经济药物.同样, Gad等(2007) 发现薄壳山核桃叶片提取物也具有保肝作用, 并从叶片中分离鉴定了15个酚类代谢物. ...Villarreal-Lozoya等(2007) 采用液相色谱法从堪萨(Kanza)脱脂种仁的碱水解液中检测到4个酚酸, 分别是没食子酸、儿茶素、表儿茶素和鞣花酸.Malik等(2009) 最早尝试不水解, 直接用液相色谱法分析薄壳山核桃中的酚类代谢物, 从脱脂种仁中检测到8个酚酸, 其中新检测到的有儿茶酚、香豆酸、绿原酸和咖啡酸.de la Rosa等(2011) 采用液相色谱法分别从直接提取液和酸水解液中检测到6个酚类代谢物和8个酚类代谢物苷元.Robbins等(2014) 首次采用液质联用法分析和鉴定薄壳山核桃中的酚类代谢物, 至此从薄壳山核桃中检测到的酚类代谢物数量跃上了一个新的台阶.该研究团队从美国产8个高抗氧化性品种种仁的混样中鉴定出27个酚类代谢物, 其中新鉴定了13个酚酸及其糖苷、2个棓单宁、1个鞣花单宁和2个缩合单宁.Robbins等(2015) 同样采用液质联用法从美国产薄壳山核桃种仁中新鉴定了1个酚酸和1个棓单宁.Gong和Pegg (2017) 采用高效液相色谱联用飞行时间质谱从美国产薄壳山核桃种仁中鉴定出38个酚类代谢物, 其中新鉴定4个单宁.Jia等(2018) 采用超高效液相色谱联用高分辨飞行时间质谱从中国产薄壳山核桃种仁动态混样中鉴定酚类代谢物35个, 其中新鉴定酚酸4个, 鞣花单宁3个. ...表3 .从种仁样品中提取酚类代谢物前需先进行干燥和脱脂.以分离单体代谢物为目的的提取往往采用加热回流法, 回收率高, 但杂质也较多(Ishak et al., 1980 ; Gad et al., 2007 ; Abdallah et al., 2011 ).而以分析为主要目的的提取一般采用匀浆或超声方法, 获得的提取液杂质较少, 有利于分析目标代谢物(Malik et al., 2009 ; de la Rosa et al., 2011 ; Robbins et al., 2014 , 2015 ; Gong and Pegg, 2017 ; Jia et al., 2018 ; Hilbig et al., 2018a ).提取后可采用凝胶柱除杂或分段, 以减少色谱峰间的重叠, 使结果更准确.而采用超高效液相色谱可进一步提高分离度, 不分段直接进行鉴定.采用高分辨质谱分析代谢物, 荷质比精度可至小数点后4位, 通过计算与理论值之间的偏差(mass measurement errors, ∆m)进一步确保结果的准确性.对原花青素的检测采用亲水作用色谱(hydrophilic interaction chromatography, HILIC)取得了较好的结果(Gong and Pegg, 2017 ). ...Gong and Pegg, 2017 ). ...Table 3 部位 溶剂 提取方法 检测方法 组分 参考文献 种仁 含0.1% HCl的甲醇 冷浸3小时 纸层析显色 初步认为含无色花色素 Senter et al., 1978 种仁 含0.1% HCl的甲醇 回流提取2小时2次, 合并浓缩后用1 mol·L-1 HCl回流水解2小时, 乙酸乙酯萃取, 甲酯化 GC-MS 8个酚酸 Senter et al., 1980 树枝, 叶 70%乙醇 回流提取, 浓缩后聚酰胺柱反复柱层 H1 -NMR, C13 - NMR 从树枝中分离出4个类黄酮; 从叶中分离出5个类黄酮、 Ishak et al., 1980 叶 水 回流提取, 烘干, 再用乙醇提取, Sephadex LH-20柱反复柱层析分离 H1 -NMR, C13 - NMR 1个酚酸、8个类黄酮和6个单宁 Gad et al., 2007 种仁 70%丙酮 正己烷脱脂, 匀浆, 5°C摇床振摇过夜.分别用6 mol·L-1 HCl和8 mol·L-1 NaOH进行酸和碱水解 HPLC-DAD 4个酚类代谢物 Villarreal-Lozoya et al., 2007 种仁 80%甲醇 正己烷脱脂, 匀浆机提取30秒, 2次, 再用Sephadex LH-20小柱除杂 HPLC-DAD 8个酚酸 Malik et al., 2009 种仁 80%丙酮 正己烷脱脂, 50°C匀浆提取30分钟, HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS 5个酚酸、2个类黄酮、5个鞣花单宁和1个棓单宁 de la Rosa et al., 2011 树皮 70%乙醇 70°C回流提取, 硅胶柱及Sephadex LH-20柱反复柱层析 H1 -NMR, C13 - NMR 6个类黄酮和1个酚酸 Abdallah et al., 2011 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干, Sephadex LH-20柱分段 HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS/MS 27个酚类代谢物, 其中包含2个鞣花单宁、2个棓单宁和2个缩合单宁 Robbins et al., 2014 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) (v/v/v) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干.分别用-1 HCl和2 mol·L-1 NaOH进行酸和碱水解 HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS/MS 水解前13个酚类代谢物, 碱水解后8个, 酸水解后9个 Robbins et al., 2015 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) (v/v/v) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干, Sephadex LH-20柱分段 HPLC-DAD, HPLC-ESI-Q/TOF-MS 38个酚类代谢物, 其中包含15个鞣花单宁、3个棓单宁和13个原花青素 Gong et al., 2017 种仁 80%丙酮 正己烷脱脂, 提取液冷浸过夜, 室温超声提取2小时, 2次, 50°C氮吹仪吹干, 冻干 HPLC-DAD, UPLC-ESI-Q/TOF-MS 35个酚类代谢物, 其中包含18个鞣花单宁、2个棓单宁和2个原花青素 Jia et al., 2017 壳 20%乙醇 80°C超声提取1小时, 减压回收溶剂 HPLC-ESI-MS/MS 29个酚酸苷元, 其中包含12个类黄酮和1个香豆素 Hilbig et al., 2018a
根据分离目的不同, 鉴定方法各有不同.采用1D、2D氢和碳核磁共振法可准确鉴定代谢物的结构, 但要求对代谢物进行分离, 一般纯度需达到95%以上才能准确鉴定.质谱法可以一次性同时鉴定大量代谢物, 根据国际化学分析工作组(Chemical Analysis Working Group, CAWG)代谢组学标准委员会(Metabolomics Standards Initiative, MSI)的规定, 鉴定的代谢物分为4个等级, 即可用标准品准确鉴定、无标准品但分子量和裂解规律与已知代谢物一致、无标准品通过裂解规律等推定为某一类型代谢物及未知代谢物(Sumner et al., 2007 ).定量测定的要求较低时则可采用紫外分光法进行检测. ...Polles et al., 1981 ).缩合单宁具有抗氧化和抗诱变的活性, 且受交联度、结构单元和结构单元间化学键类型的影响(Grimmer et al., 1992 ).Gu等(2002) 报道薄壳山核桃中原花青素二聚体间的化学键为B型(C4 -C8 和C4 -C6 ), 之后又测定了薄壳山核桃种仁中缩合单宁的含量为494.1 mg·(100 g)-1 鲜种仁, 同时还测定了不同交联度单宁的含量, 单体、二聚体、三聚体、四到六聚体、七到十聚体和十聚体以上的单宁含量分别为17.2、42.1、26、101、84和223 mg·(100 g)-1 鲜种仁(Gu et al., 2004 ).而Robbins等(2014) 测得薄壳山核桃种仁中单体、二聚体、三聚体和四到六聚体的单宁含量分别为0.3、47.3、21.1和14.8 mg·g-1 单宁部位.Gong和Pegg (2017) 测得薄壳山核桃种仁中二至七聚体的单宁含量分别为31.42、18.34、7.08、5.53、1.62和0.41 mg·g-1 粗提物.尽管各研究所得数值的单位略有不同, 但可看出薄壳山核桃种仁中二聚体及三聚体原花青素的含量最高.原花青素是由2分子或3分子的(表)儿茶素连接在一起形成, 3个及以上连接在一起形成寡聚原花青素(oligomeric proanthocyanidins) (Holton and Cornish, 1995 ).薄壳山核桃种仁含有大量原花青素及寡聚原花青素, 这些原花青素对薄壳山核桃的抗氧化性起主要作用.Villarreal- Lozoya等(2007) 测得美国产薄壳山核桃种仁中的缩合单宁含量为23-47 mg儿茶素等价物·g-1 脱脂种仁.Robbins等(2015) 测得原花青素含量为420-655 mg PD2B等价物·(100 g)-1 种仁.薄壳山核桃中缩合单宁含量通常与总酚含量接近, 说明缩合单宁是薄壳山核桃中最主要的酚类代谢物. ...Morgan and Clayshulte, 2000 ; Rajaram et al., 2001 ).除油脂外, 薄壳山核桃果实中还含有另一类重要的营养物质——酚类(phenolics).酚类是苯环上含有酚羟基的一大类物质的统称.其中, 人们关注较多的活性物质有酚酸(phenolic acids)、类黄酮(flavonoids)、香豆素(coumarins)、木质素(lignans)和单宁(tannins) (Alasalvar and Shahidi, 2009 ).其中, 类黄酮又包含黄酮醇(flavonols)、黄烷-3-醇(flavan-3-ols)和二氢黄酮醇(dihydroflavonols)及其糖苷(李珊珊等, 2014 ).单宁包含水解单宁(hydrolysable tannins)和缩合单宁(condensed tannins)两大类(孙达旺, 1992 ).水解单宁在酸碱条件下不稳定, 易于水解, 根据水解后产生酚酸的不同分为棓单宁(gallotannins)和鞣花单宁(ellagitannins).缩合单宁一般衍生于黄烷类化合物, 又被称为原花青素或原花色素(proanthocyanidins) (石碧和狄莹, 2000 ).酚类为植物次生代谢产物, 在植物中含量虽低但功效显著.人们最早注意到薄壳山核桃中的酚类代谢物是由于发现其可能与采后种皮变色及油脂氧化有关(Senter et al., 1978 , 1980 ; Polles et al., 1981 ).后来, 科学家发现薄壳山核桃具有较强的抗氧化性(Wu et al., 2004 ; Gu et al., 2004 ), 进而发现这种抗氧化性的物质基础是其中所含有的酚类代谢物(Villarreal-Lozoya et al., 2007 ).采用不同的分析手段可测定薄壳山核桃种仁及壳中的总酚、缩合单宁及总黄酮的含量, 检测抗氧化性并对酚类代谢物进行鉴定.随着液相色谱及质谱等现代化分析技术的应用, 薄壳山核桃中的酚类代谢物已逐渐被阐明.目前, 对薄壳山核桃的种质资源(Grauke et al., 2003 )、育苗技术(Zhang et al., 2015 )及栽培措施(Mo et al., 2017 )已有许多研究报道, 但对薄壳山核桃中的酚类代谢物尚未见系统总结.本文综述薄壳山核桃酚类代谢物相关研究进展, 以期为今后的科学研究和产业发展提供参考. ...Anzaldúa-Morales et al., 1999 )、脂肪酸(Rudolph et al., 1992 )、VE (Yao et al., 1992 )和颜色(Grauke et al., 1998 )等, 而对酚类代谢物与贮藏的关系研究较少.在国外, 薄壳山核桃主要是低温带壳或脱壳贮藏, 远距离运输一般为常温进行.采后随贮存时间的延长, 薄壳山核桃种仁会逐渐氧化、酸败、失水变干、种皮褐变、风味丧失, 其中种皮褐变与酚类物质有关.酚类物质还在防止脂肪酸氧化过程中发挥一定作用.Senter等(1978) 通过紫外分光法测定了斯图尔特和舒莱(Schley)的种仁在32°C、50%的相对湿度下避光贮藏16周过程中总酚及总黄酮含量的变化趋势.结果显示, 2个品种的总酚和总黄酮含量有较大差异, 但变化速率类似, 其中斯图尔特总酚含量更高, 也更耐贮存, 表明总酚含量与耐贮性有关.通过薄层和纸层析初步分析显示薄壳山核桃的种皮中含有无色花色素(leucoanthocyanidin), 并在贮藏过程中逐渐转变为鞣酐(phlobaphene)、矢车菊素(cyanidin)和飞燕草素(delphinidin).Senter等(1980) 发现, 脱壳的斯图尔特种仁在21°C、65%的相对湿度下避光贮藏12周, 酚酸含量呈逐渐下降趋势. ...Polles et al., 1981 ).缩合单宁具有抗氧化和抗诱变的活性, 且受交联度、结构单元和结构单元间化学键类型的影响(Grimmer et al., 1992 ).Gu等(2002) 报道薄壳山核桃中原花青素二聚体间的化学键为B型(C4 -C8 和C4 -C6 ), 之后又测定了薄壳山核桃种仁中缩合单宁的含量为494.1 mg·(100 g)-1 鲜种仁, 同时还测定了不同交联度单宁的含量, 单体、二聚体、三聚体、四到六聚体、七到十聚体和十聚体以上的单宁含量分别为17.2、42.1、26、101、84和223 mg·(100 g)-1 鲜种仁(Gu et al., 2004 ).而Robbins等(2014) 测得薄壳山核桃种仁中单体、二聚体、三聚体和四到六聚体的单宁含量分别为0.3、47.3、21.1和14.8 mg·g-1 单宁部位.Gong和Pegg (2017) 测得薄壳山核桃种仁中二至七聚体的单宁含量分别为31.42、18.34、7.08、5.53、1.62和0.41 mg·g-1 粗提物.尽管各研究所得数值的单位略有不同, 但可看出薄壳山核桃种仁中二聚体及三聚体原花青素的含量最高.原花青素是由2分子或3分子的(表)儿茶素连接在一起形成, 3个及以上连接在一起形成寡聚原花青素(oligomeric proanthocyanidins) (Holton and Cornish, 1995 ).薄壳山核桃种仁含有大量原花青素及寡聚原花青素, 这些原花青素对薄壳山核桃的抗氧化性起主要作用.Villarreal- Lozoya等(2007) 测得美国产薄壳山核桃种仁中的缩合单宁含量为23-47 mg儿茶素等价物·g-1 脱脂种仁.Robbins等(2015) 测得原花青素含量为420-655 mg PD2B等价物·(100 g)-1 种仁.薄壳山核桃中缩合单宁含量通常与总酚含量接近, 说明缩合单宁是薄壳山核桃中最主要的酚类代谢物. ...Polles et al., 1981 ).缩合单宁具有抗氧化和抗诱变的活性, 且受交联度、结构单元和结构单元间化学键类型的影响(Grimmer et al., 1992 ).Gu等(2002) 报道薄壳山核桃中原花青素二聚体间的化学键为B型(C4 -C8 和C4 -C6 ), 之后又测定了薄壳山核桃种仁中缩合单宁的含量为494.1 mg·(100 g)-1 鲜种仁, 同时还测定了不同交联度单宁的含量, 单体、二聚体、三聚体、四到六聚体、七到十聚体和十聚体以上的单宁含量分别为17.2、42.1、26、101、84和223 mg·(100 g)-1 鲜种仁(Gu et al., 2004 ).而Robbins等(2014) 测得薄壳山核桃种仁中单体、二聚体、三聚体和四到六聚体的单宁含量分别为0.3、47.3、21.1和14.8 mg·g-1 单宁部位.Gong和Pegg (2017) 测得薄壳山核桃种仁中二至七聚体的单宁含量分别为31.42、18.34、7.08、5.53、1.62和0.41 mg·g-1 粗提物.尽管各研究所得数值的单位略有不同, 但可看出薄壳山核桃种仁中二聚体及三聚体原花青素的含量最高.原花青素是由2分子或3分子的(表)儿茶素连接在一起形成, 3个及以上连接在一起形成寡聚原花青素(oligomeric proanthocyanidins) (Holton and Cornish, 1995 ).薄壳山核桃种仁含有大量原花青素及寡聚原花青素, 这些原花青素对薄壳山核桃的抗氧化性起主要作用.Villarreal- Lozoya等(2007) 测得美国产薄壳山核桃种仁中的缩合单宁含量为23-47 mg儿茶素等价物·g-1 脱脂种仁.Robbins等(2015) 测得原花青素含量为420-655 mg PD2B等价物·(100 g)-1 种仁.薄壳山核桃中缩合单宁含量通常与总酚含量接近, 说明缩合单宁是薄壳山核桃中最主要的酚类代谢物. ...Morgan and Clayshulte, 2000 ; Rajaram et al., 2001 ).除油脂外, 薄壳山核桃果实中还含有另一类重要的营养物质——酚类(phenolics).酚类是苯环上含有酚羟基的一大类物质的统称.其中, 人们关注较多的活性物质有酚酸(phenolic acids)、类黄酮(flavonoids)、香豆素(coumarins)、木质素(lignans)和单宁(tannins) (Alasalvar and Shahidi, 2009 ).其中, 类黄酮又包含黄酮醇(flavonols)、黄烷-3-醇(flavan-3-ols)和二氢黄酮醇(dihydroflavonols)及其糖苷(李珊珊等, 2014 ).单宁包含水解单宁(hydrolysable tannins)和缩合单宁(condensed tannins)两大类(孙达旺, 1992 ).水解单宁在酸碱条件下不稳定, 易于水解, 根据水解后产生酚酸的不同分为棓单宁(gallotannins)和鞣花单宁(ellagitannins).缩合单宁一般衍生于黄烷类化合物, 又被称为原花青素或原花色素(proanthocyanidins) (石碧和狄莹, 2000 ).酚类为植物次生代谢产物, 在植物中含量虽低但功效显著.人们最早注意到薄壳山核桃中的酚类代谢物是由于发现其可能与采后种皮变色及油脂氧化有关(Senter et al., 1978 , 1980 ; Polles et al., 1981 ).后来, 科学家发现薄壳山核桃具有较强的抗氧化性(Wu et al., 2004 ; Gu et al., 2004 ), 进而发现这种抗氧化性的物质基础是其中所含有的酚类代谢物(Villarreal-Lozoya et al., 2007 ).采用不同的分析手段可测定薄壳山核桃种仁及壳中的总酚、缩合单宁及总黄酮的含量, 检测抗氧化性并对酚类代谢物进行鉴定.随着液相色谱及质谱等现代化分析技术的应用, 薄壳山核桃中的酚类代谢物已逐渐被阐明.目前, 对薄壳山核桃的种质资源(Grauke et al., 2003 )、育苗技术(Zhang et al., 2015 )及栽培措施(Mo et al., 2017 )已有许多研究报道, 但对薄壳山核桃中的酚类代谢物尚未见系统总结.本文综述薄壳山核桃酚类代谢物相关研究进展, 以期为今后的科学研究和产业发展提供参考. ...Senter等(1978) 最早通过薄层层析和纸层析方法初步认为薄壳山核桃的种仁中含有无色花色素(leucoanthocyanidin), 但由于方法的局限性, 仅能判断结构类型, 不能确定代谢物.之后, Senter等(1980) 采用气相色谱法从斯图尔特(Stuart)脱脂种仁的酸水解液中检测到8个酚酸, 分别是没食子酸、龙胆酸、香草酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯乙酸、香豆酸和丁香酸.采用酸或碱水解可使酯键断裂, 得到相应的苷元, 从而简化代谢物结构, 有利于结构分析, 但由于破坏了原本代谢物的结构, 因此仅能明确代谢物苷元.2004年, 有2项抗氧化性评价研究均表明薄壳山核桃含有丰富的酚类代谢物, 抗氧化活性高于许多已知的富含酚类的水果及浆果(Wu et al., 2004 ; Gu et al., 2004 ).这两项研究再次引起了人们对薄壳山核桃抗氧化活性的关注, 科学家们开始寻找这种强抗氧化性的物质基础. ...Polles et al., 1981 ).缩合单宁具有抗氧化和抗诱变的活性, 且受交联度、结构单元和结构单元间化学键类型的影响(Grimmer et al., 1992 ).Gu等(2002) 报道薄壳山核桃中原花青素二聚体间的化学键为B型(C4 -C8 和C4 -C6 ), 之后又测定了薄壳山核桃种仁中缩合单宁的含量为494.1 mg·(100 g)-1 鲜种仁, 同时还测定了不同交联度单宁的含量, 单体、二聚体、三聚体、四到六聚体、七到十聚体和十聚体以上的单宁含量分别为17.2、42.1、26、101、84和223 mg·(100 g)-1 鲜种仁(Gu et al., 2004 ).而Robbins等(2014) 测得薄壳山核桃种仁中单体、二聚体、三聚体和四到六聚体的单宁含量分别为0.3、47.3、21.1和14.8 mg·g-1 单宁部位.Gong和Pegg (2017) 测得薄壳山核桃种仁中二至七聚体的单宁含量分别为31.42、18.34、7.08、5.53、1.62和0.41 mg·g-1 粗提物.尽管各研究所得数值的单位略有不同, 但可看出薄壳山核桃种仁中二聚体及三聚体原花青素的含量最高.原花青素是由2分子或3分子的(表)儿茶素连接在一起形成, 3个及以上连接在一起形成寡聚原花青素(oligomeric proanthocyanidins) (Holton and Cornish, 1995 ).薄壳山核桃种仁含有大量原花青素及寡聚原花青素, 这些原花青素对薄壳山核桃的抗氧化性起主要作用.Villarreal- Lozoya等(2007) 测得美国产薄壳山核桃种仁中的缩合单宁含量为23-47 mg儿茶素等价物·g-1 脱脂种仁.Robbins等(2015) 测得原花青素含量为420-655 mg PD2B等价物·(100 g)-1 种仁.薄壳山核桃中缩合单宁含量通常与总酚含量接近, 说明缩合单宁是薄壳山核桃中最主要的酚类代谢物. ...Nelson等(1985) 比较了不同加热方法对薄壳山核桃品质的影响.蒸汽加热导致种皮变色, 而介质加热则不会导致变色.低温贮藏可延缓种皮褐变, 且温度越低保存时间越长.研究表明, 20°C条件下薄壳山核桃仅可保存数月便丧失商品价值(Woodroof and Heaton, 1953 ); 在5°C货架期可延长至半年左右(Bonner and Karrfalt, 2008 ); 而在-15°C则至少可保存2年(Anzaldúa- Morales et al., 1999 ).采后贮藏过程中, 种仁含水量会影响种皮颜色, 采收时薄壳山核桃种仁含水量为25%-30%, 应尽快干燥至4%, 隔绝氧气以抑制酚类氧化, 从而延缓褐变(Kays, 1979 ).Senter和Forbus (1979) 研究表明, 通过涂布乙酰化单甘脂(acetylated monoglyceride)并不能对种皮褐变产生显著抑制作用.Dull和Kays (1988) 用聚偏二氯乙烯(polyvinylidenechloride)涂层玻璃纸真空包装种仁, 在24°C、65%的相对湿度下保存6个月颜色基本不变, 并可有效防止机械损伤, 但口味稍差.Heaton和Shewfelt (1976) 考察了不同含水量、不同透光度软袋中的薄壳山核桃在23°C下贮藏24周其种仁颜色和脂肪酸变化, 结果显示, 光强、含水量和贮藏时间均对颜色和脂肪酸含量有显著影响, 但这3项因素的重要性次于温度. ...Hilbig等(2018a) 采用液质联用法检测了薄壳山核桃壳水解液中的酚类代谢物苷元, 鉴定出29个酚类代谢物苷元, 其中24个为首次从薄壳山核桃中鉴定, 鉴定的29个酚类代谢物中包含12个类黄酮和1个香豆素.12个类黄酮包含9种黄酮母核, 而目前从非水解液中仅鉴定出4种黄酮母核, 说明薄壳山核桃中可能仍有大量其它类黄酮代谢物. ...表3 .从种仁样品中提取酚类代谢物前需先进行干燥和脱脂.以分离单体代谢物为目的的提取往往采用加热回流法, 回收率高, 但杂质也较多(Ishak et al., 1980 ; Gad et al., 2007 ; Abdallah et al., 2011 ).而以分析为主要目的的提取一般采用匀浆或超声方法, 获得的提取液杂质较少, 有利于分析目标代谢物(Malik et al., 2009 ; de la Rosa et al., 2011 ; Robbins et al., 2014 , 2015 ; Gong and Pegg, 2017 ; Jia et al., 2018 ; Hilbig et al., 2018a ).提取后可采用凝胶柱除杂或分段, 以减少色谱峰间的重叠, 使结果更准确.而采用超高效液相色谱可进一步提高分离度, 不分段直接进行鉴定.采用高分辨质谱分析代谢物, 荷质比精度可至小数点后4位, 通过计算与理论值之间的偏差(mass measurement errors, ∆m)进一步确保结果的准确性.对原花青素的检测采用亲水作用色谱(hydrophilic interaction chromatography, HILIC)取得了较好的结果(Gong and Pegg, 2017 ). ...Table 3 部位 溶剂 提取方法 检测方法 组分 参考文献 种仁 含0.1% HCl的甲醇 冷浸3小时 纸层析显色 初步认为含无色花色素 Senter et al., 1978 种仁 含0.1% HCl的甲醇 回流提取2小时2次, 合并浓缩后用1 mol·L-1 HCl回流水解2小时, 乙酸乙酯萃取, 甲酯化 GC-MS 8个酚酸 Senter et al., 1980 树枝, 叶 70%乙醇 回流提取, 浓缩后聚酰胺柱反复柱层 H1 -NMR, C13 - NMR 从树枝中分离出4个类黄酮; 从叶中分离出5个类黄酮、 Ishak et al., 1980 叶 水 回流提取, 烘干, 再用乙醇提取, Sephadex LH-20柱反复柱层析分离 H1 -NMR, C13 - NMR 1个酚酸、8个类黄酮和6个单宁 Gad et al., 2007 种仁 70%丙酮 正己烷脱脂, 匀浆, 5°C摇床振摇过夜.分别用6 mol·L-1 HCl和8 mol·L-1 NaOH进行酸和碱水解 HPLC-DAD 4个酚类代谢物 Villarreal-Lozoya et al., 2007 种仁 80%甲醇 正己烷脱脂, 匀浆机提取30秒, 2次, 再用Sephadex LH-20小柱除杂 HPLC-DAD 8个酚酸 Malik et al., 2009 种仁 80%丙酮 正己烷脱脂, 50°C匀浆提取30分钟, HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS 5个酚酸、2个类黄酮、5个鞣花单宁和1个棓单宁 de la Rosa et al., 2011 树皮 70%乙醇 70°C回流提取, 硅胶柱及Sephadex LH-20柱反复柱层析 H1 -NMR, C13 - NMR 6个类黄酮和1个酚酸 Abdallah et al., 2011 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干, Sephadex LH-20柱分段 HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS/MS 27个酚类代谢物, 其中包含2个鞣花单宁、2个棓单宁和2个缩合单宁 Robbins et al., 2014 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) (v/v/v) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干.分别用-1 HCl和2 mol·L-1 NaOH进行酸和碱水解 HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS/MS 水解前13个酚类代谢物, 碱水解后8个, 酸水解后9个 Robbins et al., 2015 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) (v/v/v) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干, Sephadex LH-20柱分段 HPLC-DAD, HPLC-ESI-Q/TOF-MS 38个酚类代谢物, 其中包含15个鞣花单宁、3个棓单宁和13个原花青素 Gong et al., 2017 种仁 80%丙酮 正己烷脱脂, 提取液冷浸过夜, 室温超声提取2小时, 2次, 50°C氮吹仪吹干, 冻干 HPLC-DAD, UPLC-ESI-Q/TOF-MS 35个酚类代谢物, 其中包含18个鞣花单宁、2个棓单宁和2个原花青素 Jia et al., 2017 壳 20%乙醇 80°C超声提取1小时, 减压回收溶剂 HPLC-ESI-MS/MS 29个酚酸苷元, 其中包含12个类黄酮和1个香豆素 Hilbig et al., 2018a
根据分离目的不同, 鉴定方法各有不同.采用1D、2D氢和碳核磁共振法可准确鉴定代谢物的结构, 但要求对代谢物进行分离, 一般纯度需达到95%以上才能准确鉴定.质谱法可以一次性同时鉴定大量代谢物, 根据国际化学分析工作组(Chemical Analysis Working Group, CAWG)代谢组学标准委员会(Metabolomics Standards Initiative, MSI)的规定, 鉴定的代谢物分为4个等级, 即可用标准品准确鉴定、无标准品但分子量和裂解规律与已知代谢物一致、无标准品通过裂解规律等推定为某一类型代谢物及未知代谢物(Sumner et al., 2007 ).定量测定的要求较低时则可采用紫外分光法进行检测. ...Hilbig等(2018a) 采用响应面法优化设计, 得到从薄壳山核桃壳中提取总酚的最佳工艺是用20%乙醇, 料液比为1 g:30 mL, 80°C超声提取1小时, 减压回收溶剂, 此时得到的总酚含量最高, 为394.39 mg没食子酸等价物·g-1 . ...do Prado et al., 2013 ; Ribeiro et al., 2017 ; Hilbig et al., 2018b ).de la Rosa等(2011) 测得墨西哥产薄壳山核桃壳的总黄酮含量为26.3- 36.1 mg儿茶素等价物·g-1 鲜种仁, 原花青素含量为316.1-464.4 mg儿茶素等价物·g-1 鲜种仁, 而种仁的原花青素含量仅为20.3-26.7 mg儿茶素等价物·g-1 鲜种仁, 说明薄壳山核桃壳中原花青素含量远高于种仁.de la Rosa等(2011) 通过比较表明种壳的总酚含量大约是种仁的3倍.Hilbig等(2018a) 测定了巴西薄壳山核桃品种巴顿(Barton)壳中的总酚含量为581.9 mg没食子酸等价物·g-1 种仁, 缩合单宁含量为71.08 mg儿茶素等价物·g-1 种仁, 之后采用液质联用法测定水解液中酚类代谢物苷元的含量, 其中儿茶素、没食子酸和鞣花酸的含量分别为352、138和36 mg·g-1 干种仁, 再次证明壳中含有大量原花青素.Do Prado等(2013 , 2014) 测定了巴西薄壳山核桃壳的总酚及缩合单宁含量, 分析表明壳中酚类代谢物含量可能会影响油中不饱和脂肪酸的氧化程度. ...Table 4 部位 抗氧化性平均值(范围) 参考文献 DPPH -1 ) ABTS -1 ) ORAC -1 ) FRAP 2+ eq∙(100 g)-1 ) 种仁 - - 179.4 - Wu et al., 2004 种仁 - - - 8.33 (6.32-11.05) Blomhoff et al., 2006 种仁 388 (324-540) - 583 (373-817) - Villarreal-Lozoya et al., 2007 种仁 102.6-108.7 75.9-83.4 227-261.5 - de la Rosa et al., 2011 种仁 2110 3360 - - de la Rosa et al., 2014 种仁 - - 135-255 14.0-20.7 Robbins et al., 2015 种仁 548.84 - - - Flores-Córdova et al., 2017 种仁 37.24-461.80 6.74-201.49 - - Jia et al., 2018 壳80%丙酮提取液 537.8-720.3 518.4-644.2 680.3-1350.3 - de la Rosa et al., 2011 壳水提液 1386.28 1333.1 - - Prado et al., 2013 壳80%丙酮提取液 4800 8240 - - de la Rosa et al., 2014 壳水提液 2448.96 1809.01 - - Prado et al., 2014 壳水提液 1268.03 2574.32 - - Hilbig et al., 2018a
DPPH: 2, 2-二苯基-1-三硝基苯肼自由基清除实验; ABTS: 2, 2'-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐自由基清除实验; ORAC: 氧化自由基吸收能力; FRAP: 铁离子还原能力 ...do Prado et al., 2013 ; Ribeiro et al., 2017 ; Hilbig et al., 2018b ).de la Rosa等(2011) 测得墨西哥产薄壳山核桃壳的总黄酮含量为26.3- 36.1 mg儿茶素等价物·g-1 鲜种仁, 原花青素含量为316.1-464.4 mg儿茶素等价物·g-1 鲜种仁, 而种仁的原花青素含量仅为20.3-26.7 mg儿茶素等价物·g-1 鲜种仁, 说明薄壳山核桃壳中原花青素含量远高于种仁.de la Rosa等(2011) 通过比较表明种壳的总酚含量大约是种仁的3倍.Hilbig等(2018a) 测定了巴西薄壳山核桃品种巴顿(Barton)壳中的总酚含量为581.9 mg没食子酸等价物·g-1 种仁, 缩合单宁含量为71.08 mg儿茶素等价物·g-1 种仁, 之后采用液质联用法测定水解液中酚类代谢物苷元的含量, 其中儿茶素、没食子酸和鞣花酸的含量分别为352、138和36 mg·g-1 干种仁, 再次证明壳中含有大量原花青素.Do Prado等(2013 , 2014) 测定了巴西薄壳山核桃壳的总酚及缩合单宁含量, 分析表明壳中酚类代谢物含量可能会影响油中不饱和脂肪酸的氧化程度. ...Yang等(2009) 测定了9种美国消费者最常食用的干果提取物的抗增殖能力, 发现干果提取物对HepG2 和Caco-2细胞增殖均具有一定的抑制作用, 且活性与剂量呈显著正相关, 其中核桃和薄壳山核桃的活性最强.de la Rosa等(2014) 评价了墨西哥产薄壳山核桃种仁和壳的抗增殖活性, 发现种仁和壳的提取物对HTB4和LLC-PK1细胞增殖均具有抑制作用.Hilbig等(2018b) 报道了薄壳山核桃壳水提液对乳腺癌MCF-7细胞系的细胞毒作用、凋亡诱导的细胞死亡及对细胞周期的阻滞作用.艾氏腹水瘤小鼠存活时间延长了67%, 并认为壳提取物抗肿瘤作用的机制可能与激活凋亡细胞死亡的关键蛋白(Bcl-XL、Bax和p53)以及细胞周期调控(cyclin A、cyclin B和CDK2)有关.这种效果归因于提取物中的酚类代谢物, 如没食子酸、4-羟基苯甲酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸和鞣花酸, 以及儿茶素、表儿茶素和没食子酸表儿茶素.研究表明, 薄壳山核桃壳提取物对肿瘤细胞生长有抑制作用, 可作为肿瘤治疗的替代物. ...Polles et al., 1981 ).缩合单宁具有抗氧化和抗诱变的活性, 且受交联度、结构单元和结构单元间化学键类型的影响(Grimmer et al., 1992 ).Gu等(2002) 报道薄壳山核桃中原花青素二聚体间的化学键为B型(C4 -C8 和C4 -C6 ), 之后又测定了薄壳山核桃种仁中缩合单宁的含量为494.1 mg·(100 g)-1 鲜种仁, 同时还测定了不同交联度单宁的含量, 单体、二聚体、三聚体、四到六聚体、七到十聚体和十聚体以上的单宁含量分别为17.2、42.1、26、101、84和223 mg·(100 g)-1 鲜种仁(Gu et al., 2004 ).而Robbins等(2014) 测得薄壳山核桃种仁中单体、二聚体、三聚体和四到六聚体的单宁含量分别为0.3、47.3、21.1和14.8 mg·g-1 单宁部位.Gong和Pegg (2017) 测得薄壳山核桃种仁中二至七聚体的单宁含量分别为31.42、18.34、7.08、5.53、1.62和0.41 mg·g-1 粗提物.尽管各研究所得数值的单位略有不同, 但可看出薄壳山核桃种仁中二聚体及三聚体原花青素的含量最高.原花青素是由2分子或3分子的(表)儿茶素连接在一起形成, 3个及以上连接在一起形成寡聚原花青素(oligomeric proanthocyanidins) (Holton and Cornish, 1995 ).薄壳山核桃种仁含有大量原花青素及寡聚原花青素, 这些原花青素对薄壳山核桃的抗氧化性起主要作用.Villarreal- Lozoya等(2007) 测得美国产薄壳山核桃种仁中的缩合单宁含量为23-47 mg儿茶素等价物·g-1 脱脂种仁.Robbins等(2015) 测得原花青素含量为420-655 mg PD2B等价物·(100 g)-1 种仁.薄壳山核桃中缩合单宁含量通常与总酚含量接近, 说明缩合单宁是薄壳山核桃中最主要的酚类代谢物. ...Carya pecanIshak等(1980) 从薄壳山核桃的树枝中分离到5个以杜鹃黄素为母核的黄酮醇苷和2个以山核桃黄素为母核的黄酮苷并对代谢物的结构进行了鉴定.之后, Abdallah等(2011) 从薄壳山核桃树皮中分离到7个酚类代谢物, 其中2个为具有抗糖尿病活性的新化合物, 即山核桃黄素-3'-硫酸盐和3'-甲氧基山核桃黄素-7-葡萄糖苷. ...Ishak等(1980) 通过柱层析方法从薄壳山核桃的叶片中分离得到5个类黄酮代谢物, 即槲皮素-3-葡萄糖苷(异槲皮苷)、槲皮素-3-鼠李糖苷、槲皮素-3-阿拉伯糖苷、槲皮素-3-半乳糖苷和3-甲氧基山奈酚.Gad等(2007) 又从叶片中分离得到15个酚类代谢物, 包括1个对羟基苯甲酸、5个槲皮素糖苷、3个山奈酚糖苷、5个水解单宁和1个缩合单宁.从树皮及树叶中分离得到的酚类代谢物均为分离得到单体后经核磁鉴定结构. ...表3 .从种仁样品中提取酚类代谢物前需先进行干燥和脱脂.以分离单体代谢物为目的的提取往往采用加热回流法, 回收率高, 但杂质也较多(Ishak et al., 1980 ; Gad et al., 2007 ; Abdallah et al., 2011 ).而以分析为主要目的的提取一般采用匀浆或超声方法, 获得的提取液杂质较少, 有利于分析目标代谢物(Malik et al., 2009 ; de la Rosa et al., 2011 ; Robbins et al., 2014 , 2015 ; Gong and Pegg, 2017 ; Jia et al., 2018 ; Hilbig et al., 2018a ).提取后可采用凝胶柱除杂或分段, 以减少色谱峰间的重叠, 使结果更准确.而采用超高效液相色谱可进一步提高分离度, 不分段直接进行鉴定.采用高分辨质谱分析代谢物, 荷质比精度可至小数点后4位, 通过计算与理论值之间的偏差(mass measurement errors, ∆m)进一步确保结果的准确性.对原花青素的检测采用亲水作用色谱(hydrophilic interaction chromatography, HILIC)取得了较好的结果(Gong and Pegg, 2017 ). ...Table 3 部位 溶剂 提取方法 检测方法 组分 参考文献 种仁 含0.1% HCl的甲醇 冷浸3小时 纸层析显色 初步认为含无色花色素 Senter et al., 1978 种仁 含0.1% HCl的甲醇 回流提取2小时2次, 合并浓缩后用1 mol·L-1 HCl回流水解2小时, 乙酸乙酯萃取, 甲酯化 GC-MS 8个酚酸 Senter et al., 1980 树枝, 叶 70%乙醇 回流提取, 浓缩后聚酰胺柱反复柱层 H1 -NMR, C13 - NMR 从树枝中分离出4个类黄酮; 从叶中分离出5个类黄酮、 Ishak et al., 1980 叶 水 回流提取, 烘干, 再用乙醇提取, Sephadex LH-20柱反复柱层析分离 H1 -NMR, C13 - NMR 1个酚酸、8个类黄酮和6个单宁 Gad et al., 2007 种仁 70%丙酮 正己烷脱脂, 匀浆, 5°C摇床振摇过夜.分别用6 mol·L-1 HCl和8 mol·L-1 NaOH进行酸和碱水解 HPLC-DAD 4个酚类代谢物 Villarreal-Lozoya et al., 2007 种仁 80%甲醇 正己烷脱脂, 匀浆机提取30秒, 2次, 再用Sephadex LH-20小柱除杂 HPLC-DAD 8个酚酸 Malik et al., 2009 种仁 80%丙酮 正己烷脱脂, 50°C匀浆提取30分钟, HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS 5个酚酸、2个类黄酮、5个鞣花单宁和1个棓单宁 de la Rosa et al., 2011 树皮 70%乙醇 70°C回流提取, 硅胶柱及Sephadex LH-20柱反复柱层析 H1 -NMR, C13 - NMR 6个类黄酮和1个酚酸 Abdallah et al., 2011 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干, Sephadex LH-20柱分段 HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS/MS 27个酚类代谢物, 其中包含2个鞣花单宁、2个棓单宁和2个缩合单宁 Robbins et al., 2014 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) (v/v/v) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干.分别用-1 HCl和2 mol·L-1 NaOH进行酸和碱水解 HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS/MS 水解前13个酚类代谢物, 碱水解后8个, 酸水解后9个 Robbins et al., 2015 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) (v/v/v) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干, Sephadex LH-20柱分段 HPLC-DAD, HPLC-ESI-Q/TOF-MS 38个酚类代谢物, 其中包含15个鞣花单宁、3个棓单宁和13个原花青素 Gong et al., 2017 种仁 80%丙酮 正己烷脱脂, 提取液冷浸过夜, 室温超声提取2小时, 2次, 50°C氮吹仪吹干, 冻干 HPLC-DAD, UPLC-ESI-Q/TOF-MS 35个酚类代谢物, 其中包含18个鞣花单宁、2个棓单宁和2个原花青素 Jia et al., 2017 壳 20%乙醇 80°C超声提取1小时, 减压回收溶剂 HPLC-ESI-MS/MS 29个酚酸苷元, 其中包含12个类黄酮和1个香豆素 Hilbig et al., 2018a
根据分离目的不同, 鉴定方法各有不同.采用1D、2D氢和碳核磁共振法可准确鉴定代谢物的结构, 但要求对代谢物进行分离, 一般纯度需达到95%以上才能准确鉴定.质谱法可以一次性同时鉴定大量代谢物, 根据国际化学分析工作组(Chemical Analysis Working Group, CAWG)代谢组学标准委员会(Metabolomics Standards Initiative, MSI)的规定, 鉴定的代谢物分为4个等级, 即可用标准品准确鉴定、无标准品但分子量和裂解规律与已知代谢物一致、无标准品通过裂解规律等推定为某一类型代谢物及未知代谢物(Sumner et al., 2007 ).定量测定的要求较低时则可采用紫外分光法进行检测. ...Carya illinoinensis ) kernel ripening and its phenolics profilesVillarreal-Lozoya等(2007) 采用液相色谱法从堪萨(Kanza)脱脂种仁的碱水解液中检测到4个酚酸, 分别是没食子酸、儿茶素、表儿茶素和鞣花酸.Malik等(2009) 最早尝试不水解, 直接用液相色谱法分析薄壳山核桃中的酚类代谢物, 从脱脂种仁中检测到8个酚酸, 其中新检测到的有儿茶酚、香豆酸、绿原酸和咖啡酸.de la Rosa等(2011) 采用液相色谱法分别从直接提取液和酸水解液中检测到6个酚类代谢物和8个酚类代谢物苷元.Robbins等(2014) 首次采用液质联用法分析和鉴定薄壳山核桃中的酚类代谢物, 至此从薄壳山核桃中检测到的酚类代谢物数量跃上了一个新的台阶.该研究团队从美国产8个高抗氧化性品种种仁的混样中鉴定出27个酚类代谢物, 其中新鉴定了13个酚酸及其糖苷、2个棓单宁、1个鞣花单宁和2个缩合单宁.Robbins等(2015) 同样采用液质联用法从美国产薄壳山核桃种仁中新鉴定了1个酚酸和1个棓单宁.Gong和Pegg (2017) 采用高效液相色谱联用飞行时间质谱从美国产薄壳山核桃种仁中鉴定出38个酚类代谢物, 其中新鉴定4个单宁.Jia等(2018) 采用超高效液相色谱联用高分辨飞行时间质谱从中国产薄壳山核桃种仁动态混样中鉴定酚类代谢物35个, 其中新鉴定酚酸4个, 鞣花单宁3个. ...表3 .从种仁样品中提取酚类代谢物前需先进行干燥和脱脂.以分离单体代谢物为目的的提取往往采用加热回流法, 回收率高, 但杂质也较多(Ishak et al., 1980 ; Gad et al., 2007 ; Abdallah et al., 2011 ).而以分析为主要目的的提取一般采用匀浆或超声方法, 获得的提取液杂质较少, 有利于分析目标代谢物(Malik et al., 2009 ; de la Rosa et al., 2011 ; Robbins et al., 2014 , 2015 ; Gong and Pegg, 2017 ; Jia et al., 2018 ; Hilbig et al., 2018a ).提取后可采用凝胶柱除杂或分段, 以减少色谱峰间的重叠, 使结果更准确.而采用超高效液相色谱可进一步提高分离度, 不分段直接进行鉴定.采用高分辨质谱分析代谢物, 荷质比精度可至小数点后4位, 通过计算与理论值之间的偏差(mass measurement errors, ∆m)进一步确保结果的准确性.对原花青素的检测采用亲水作用色谱(hydrophilic interaction chromatography, HILIC)取得了较好的结果(Gong and Pegg, 2017 ). ...Table 3 部位 溶剂 提取方法 检测方法 组分 参考文献 种仁 含0.1% HCl的甲醇 冷浸3小时 纸层析显色 初步认为含无色花色素 Senter et al., 1978 种仁 含0.1% HCl的甲醇 回流提取2小时2次, 合并浓缩后用1 mol·L-1 HCl回流水解2小时, 乙酸乙酯萃取, 甲酯化 GC-MS 8个酚酸 Senter et al., 1980 树枝, 叶 70%乙醇 回流提取, 浓缩后聚酰胺柱反复柱层 H1 -NMR, C13 - NMR 从树枝中分离出4个类黄酮; 从叶中分离出5个类黄酮、 Ishak et al., 1980 叶 水 回流提取, 烘干, 再用乙醇提取, Sephadex LH-20柱反复柱层析分离 H1 -NMR, C13 - NMR 1个酚酸、8个类黄酮和6个单宁 Gad et al., 2007 种仁 70%丙酮 正己烷脱脂, 匀浆, 5°C摇床振摇过夜.分别用6 mol·L-1 HCl和8 mol·L-1 NaOH进行酸和碱水解 HPLC-DAD 4个酚类代谢物 Villarreal-Lozoya et al., 2007 种仁 80%甲醇 正己烷脱脂, 匀浆机提取30秒, 2次, 再用Sephadex LH-20小柱除杂 HPLC-DAD 8个酚酸 Malik et al., 2009 种仁 80%丙酮 正己烷脱脂, 50°C匀浆提取30分钟, HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS 5个酚酸、2个类黄酮、5个鞣花单宁和1个棓单宁 de la Rosa et al., 2011 树皮 70%乙醇 70°C回流提取, 硅胶柱及Sephadex LH-20柱反复柱层析 H1 -NMR, C13 - NMR 6个类黄酮和1个酚酸 Abdallah et al., 2011 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干, Sephadex LH-20柱分段 HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS/MS 27个酚类代谢物, 其中包含2个鞣花单宁、2个棓单宁和2个缩合单宁 Robbins et al., 2014 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) (v/v/v) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干.分别用-1 HCl和2 mol·L-1 NaOH进行酸和碱水解 HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS/MS 水解前13个酚类代谢物, 碱水解后8个, 酸水解后9个 Robbins et al., 2015 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) (v/v/v) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干, Sephadex LH-20柱分段 HPLC-DAD, HPLC-ESI-Q/TOF-MS 38个酚类代谢物, 其中包含15个鞣花单宁、3个棓单宁和13个原花青素 Gong et al., 2017 种仁 80%丙酮 正己烷脱脂, 提取液冷浸过夜, 室温超声提取2小时, 2次, 50°C氮吹仪吹干, 冻干 HPLC-DAD, UPLC-ESI-Q/TOF-MS 35个酚类代谢物, 其中包含18个鞣花单宁、2个棓单宁和2个原花青素 Jia et al., 2017 壳 20%乙醇 80°C超声提取1小时, 减压回收溶剂 HPLC-ESI-MS/MS 29个酚酸苷元, 其中包含12个类黄酮和1个香豆素 Hilbig et al., 2018a
根据分离目的不同, 鉴定方法各有不同.采用1D、2D氢和碳核磁共振法可准确鉴定代谢物的结构, 但要求对代谢物进行分离, 一般纯度需达到95%以上才能准确鉴定.质谱法可以一次性同时鉴定大量代谢物, 根据国际化学分析工作组(Chemical Analysis Working Group, CAWG)代谢组学标准委员会(Metabolomics Standards Initiative, MSI)的规定, 鉴定的代谢物分为4个等级, 即可用标准品准确鉴定、无标准品但分子量和裂解规律与已知代谢物一致、无标准品通过裂解规律等推定为某一类型代谢物及未知代谢物(Sumner et al., 2007 ).定量测定的要求较低时则可采用紫外分光法进行检测. ...Wu等(2004) 比较了9种坚果的总黄酮含量, 其中薄壳山核桃的总黄酮含量最高, 为34.01 mg·(100 g)-1 .de la Rosa等(2011) 对墨西哥产薄壳山核桃种仁的总黄酮含量进行测定, 结果为5.8-6.4 mg儿茶素等价物·g-1 鲜种仁.Jia等(2018) 对中国产薄壳山核桃的总酚、缩合单宁和总黄酮含量随果实发育的动态变化进行详细分析, 结果表明总黄酮含量一般低于总酚含量. ...Senter等(1980) 对脱脂后的斯图尔特种仁进行酸水解, 通过气相色谱法测得没食子酸含量为132.8 µg·g-1 脱脂种仁.Villarreal-Lozoya等(2007) 研究表明, 薄壳山核桃果仁中含量最高的酚酸是鞣花酸, 其次是没食子酸, 二者含量分别为2.5-4.7和0.6-1.3 mg·g-1 脱脂种仁.Malik等(2009) 测定了薄壳山核桃品种德西拉布(Desirable)、威奇塔(Wichita)和切尼(Cheyenne)的单体酚酸含量, 结果显示含量最高的酚酸为儿茶素, 其次为鞣花酸和没食子酸, 三者的含量分别为32.54-90.00、20.96-86.21和15.90-21.31 g·kg-1 .Jia等(2018) 发现薄壳山核桃种仁在果实发育中期富含儿茶素及表儿茶素, 之后其含量随果实发育快速下降.Robbins等(2015) 采用质谱进行定量分析, 发现鞣花酸含量最高, 为132 μg·g-1 丙酮粗提物, 而酸或碱水解后戊烯酸双内酯的含量最高, 分别为262.4和190.2 μg·g-1 丙酮粗提物.戊烯酸双内酯为鞣花酸和没食子酸的缩合物, 说明薄壳山核桃种仁中含有大量鞣花单宁和棓单宁的复合物. ...表4 ).从评价方法来看, 采用DPPH和ABTS方法最多.其中, de la Rosa等(2011) 测得的数值较高, 与其它研究结果偏离较远.Jia等(2018) 的实验对象是果实发育期的动态样品, 其余研究为成熟样品.剔除de la Rosa等(2011) 偏离的数据, Jia等(2018) 的数据仅比较成熟样品结果, 可发现不同报道的数值总体接近.由于产地、品种和提取方法等的不同, 不同研究结果间存在一定差异, 但总体来看壳的抗氧化性高于种仁, 约为种仁的5-7倍. ...Jia等(2018) 的数据仅比较成熟样品结果, 可发现不同报道的数值总体接近.由于产地、品种和提取方法等的不同, 不同研究结果间存在一定差异, 但总体来看壳的抗氧化性高于种仁, 约为种仁的5-7倍. ...Table 4 部位 抗氧化性平均值(范围) 参考文献 DPPH -1 ) ABTS -1 ) ORAC -1 ) FRAP 2+ eq∙(100 g)-1 ) 种仁 - - 179.4 - Wu et al., 2004 种仁 - - - 8.33 (6.32-11.05) Blomhoff et al., 2006 种仁 388 (324-540) - 583 (373-817) - Villarreal-Lozoya et al., 2007 种仁 102.6-108.7 75.9-83.4 227-261.5 - de la Rosa et al., 2011 种仁 2110 3360 - - de la Rosa et al., 2014 种仁 - - 135-255 14.0-20.7 Robbins et al., 2015 种仁 548.84 - - - Flores-Córdova et al., 2017 种仁 37.24-461.80 6.74-201.49 - - Jia et al., 2018 壳80%丙酮提取液 537.8-720.3 518.4-644.2 680.3-1350.3 - de la Rosa et al., 2011 壳水提液 1386.28 1333.1 - - Prado et al., 2013 壳80%丙酮提取液 4800 8240 - - de la Rosa et al., 2014 壳水提液 2448.96 1809.01 - - Prado et al., 2014 壳水提液 1268.03 2574.32 - - Hilbig et al., 2018a
DPPH: 2, 2-二苯基-1-三硝基苯肼自由基清除实验; ABTS: 2, 2'-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐自由基清除实验; ORAC: 氧化自由基吸收能力; FRAP: 铁离子还原能力 ...Nelson等(1985) 比较了不同加热方法对薄壳山核桃品质的影响.蒸汽加热导致种皮变色, 而介质加热则不会导致变色.低温贮藏可延缓种皮褐变, 且温度越低保存时间越长.研究表明, 20°C条件下薄壳山核桃仅可保存数月便丧失商品价值(Woodroof and Heaton, 1953 ); 在5°C货架期可延长至半年左右(Bonner and Karrfalt, 2008 ); 而在-15°C则至少可保存2年(Anzaldúa- Morales et al., 1999 ).采后贮藏过程中, 种仁含水量会影响种皮颜色, 采收时薄壳山核桃种仁含水量为25%-30%, 应尽快干燥至4%, 隔绝氧气以抑制酚类氧化, 从而延缓褐变(Kays, 1979 ).Senter和Forbus (1979) 研究表明, 通过涂布乙酰化单甘脂(acetylated monoglyceride)并不能对种皮褐变产生显著抑制作用.Dull和Kays (1988) 用聚偏二氯乙烯(polyvinylidenechloride)涂层玻璃纸真空包装种仁, 在24°C、65%的相对湿度下保存6个月颜色基本不变, 并可有效防止机械损伤, 但口味稍差.Heaton和Shewfelt (1976) 考察了不同含水量、不同透光度软袋中的薄壳山核桃在23°C下贮藏24周其种仁颜色和脂肪酸变化, 结果显示, 光强、含水量和贮藏时间均对颜色和脂肪酸含量有显著影响, 但这3项因素的重要性次于温度. ...Wu等(2004) 对市售薄壳山核桃种仁总酚含量的测定结果为2 016 mg没食子酸等价物·g-1 鲜种仁, 而Kornsteiner等(2006) 测得为1 284 mg没食子酸等价物·g-1 鲜种仁.Villarreal-Lozoya等(2007) 测定美国产6种薄壳山核桃种仁中的总酚含量为62-106 mg绿原酸等价物·g-1 脱脂种仁, 且品种间差异显著.de la Rosa等(2011) 对墨西哥产薄壳山核桃仁的测定结果为11.7-12.5 mg没食子酸等价物·g-1 鲜种仁, 而壳的总酚含量为65.3-92.5 mg没食子酸等价物·g-1 鲜种仁.Robbins等(2015) 用鞣花酸作为标准品, 测得总酚含量为1.82-2.62 g鞣花酸等价物·(100 g)-1 种仁.不同研究对于总酚含量的表征可以为每克鲜种仁、每克干种仁或每克脱脂种仁, 标准品为没食子酸、绿原酸和鞣花酸(罗会婷等, 2017 ).不同的标准品和含量单位给比较带来了一定的困难.据文献报道, 绿原酸等价物与没食子酸等价物的转换因子为0.6 (Chun and Kim, 2004 ), 而脱脂种仁与未脱脂种仁比较时需考虑70%的油脂含量并进行转换(Rudolph et al., 1992 ). ...Abdallah等(2011) 评价了薄壳山核桃树皮的抗糖尿病活性, 从树皮的正丁醇萃取部位分离鉴定了7个类黄酮代谢物, 评价每个单体化合物对于由链脲霉素诱导的糖尿病小鼠的抗病活性, 并与辉瑞制药生产的抗糖尿病药物格列本脲(glibenlamide)活性进行比较, 结果显示其中2个类黄酮的活性高于阳性对照, 具有开发成为替代药物的潜力.Lei等(2018) 比较了薄壳山核桃疮痂病抗性品种和易感品种中的酚类物质组成, 发现疮痂病抗性品种和易感品种中酚类物质的含量差异显著, 推测一些仅能在抗性品种中检测到或含量更高的酚类代谢物可能与疮痂病抗性有关. ...Villarreal-Lozoya等(2007) 采用液相色谱法从堪萨(Kanza)脱脂种仁的碱水解液中检测到4个酚酸, 分别是没食子酸、儿茶素、表儿茶素和鞣花酸.Malik等(2009) 最早尝试不水解, 直接用液相色谱法分析薄壳山核桃中的酚类代谢物, 从脱脂种仁中检测到8个酚酸, 其中新检测到的有儿茶酚、香豆酸、绿原酸和咖啡酸.de la Rosa等(2011) 采用液相色谱法分别从直接提取液和酸水解液中检测到6个酚类代谢物和8个酚类代谢物苷元.Robbins等(2014) 首次采用液质联用法分析和鉴定薄壳山核桃中的酚类代谢物, 至此从薄壳山核桃中检测到的酚类代谢物数量跃上了一个新的台阶.该研究团队从美国产8个高抗氧化性品种种仁的混样中鉴定出27个酚类代谢物, 其中新鉴定了13个酚酸及其糖苷、2个棓单宁、1个鞣花单宁和2个缩合单宁.Robbins等(2015) 同样采用液质联用法从美国产薄壳山核桃种仁中新鉴定了1个酚酸和1个棓单宁.Gong和Pegg (2017) 采用高效液相色谱联用飞行时间质谱从美国产薄壳山核桃种仁中鉴定出38个酚类代谢物, 其中新鉴定4个单宁.Jia等(2018) 采用超高效液相色谱联用高分辨飞行时间质谱从中国产薄壳山核桃种仁动态混样中鉴定酚类代谢物35个, 其中新鉴定酚酸4个, 鞣花单宁3个. ...表3 .从种仁样品中提取酚类代谢物前需先进行干燥和脱脂.以分离单体代谢物为目的的提取往往采用加热回流法, 回收率高, 但杂质也较多(Ishak et al., 1980 ; Gad et al., 2007 ; Abdallah et al., 2011 ).而以分析为主要目的的提取一般采用匀浆或超声方法, 获得的提取液杂质较少, 有利于分析目标代谢物(Malik et al., 2009 ; de la Rosa et al., 2011 ; Robbins et al., 2014 , 2015 ; Gong and Pegg, 2017 ; Jia et al., 2018 ; Hilbig et al., 2018a ).提取后可采用凝胶柱除杂或分段, 以减少色谱峰间的重叠, 使结果更准确.而采用超高效液相色谱可进一步提高分离度, 不分段直接进行鉴定.采用高分辨质谱分析代谢物, 荷质比精度可至小数点后4位, 通过计算与理论值之间的偏差(mass measurement errors, ∆m)进一步确保结果的准确性.对原花青素的检测采用亲水作用色谱(hydrophilic interaction chromatography, HILIC)取得了较好的结果(Gong and Pegg, 2017 ). ...Table 3 部位 溶剂 提取方法 检测方法 组分 参考文献 种仁 含0.1% HCl的甲醇 冷浸3小时 纸层析显色 初步认为含无色花色素 Senter et al., 1978 种仁 含0.1% HCl的甲醇 回流提取2小时2次, 合并浓缩后用1 mol·L-1 HCl回流水解2小时, 乙酸乙酯萃取, 甲酯化 GC-MS 8个酚酸 Senter et al., 1980 树枝, 叶 70%乙醇 回流提取, 浓缩后聚酰胺柱反复柱层 H1 -NMR, C13 - NMR 从树枝中分离出4个类黄酮; 从叶中分离出5个类黄酮、 Ishak et al., 1980 叶 水 回流提取, 烘干, 再用乙醇提取, Sephadex LH-20柱反复柱层析分离 H1 -NMR, C13 - NMR 1个酚酸、8个类黄酮和6个单宁 Gad et al., 2007 种仁 70%丙酮 正己烷脱脂, 匀浆, 5°C摇床振摇过夜.分别用6 mol·L-1 HCl和8 mol·L-1 NaOH进行酸和碱水解 HPLC-DAD 4个酚类代谢物 Villarreal-Lozoya et al., 2007 种仁 80%甲醇 正己烷脱脂, 匀浆机提取30秒, 2次, 再用Sephadex LH-20小柱除杂 HPLC-DAD 8个酚酸 Malik et al., 2009 种仁 80%丙酮 正己烷脱脂, 50°C匀浆提取30分钟, HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS 5个酚酸、2个类黄酮、5个鞣花单宁和1个棓单宁 de la Rosa et al., 2011 树皮 70%乙醇 70°C回流提取, 硅胶柱及Sephadex LH-20柱反复柱层析 H1 -NMR, C13 - NMR 6个类黄酮和1个酚酸 Abdallah et al., 2011 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干, Sephadex LH-20柱分段 HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS/MS 27个酚类代谢物, 其中包含2个鞣花单宁、2个棓单宁和2个缩合单宁 Robbins et al., 2014 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) (v/v/v) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干.分别用-1 HCl和2 mol·L-1 NaOH进行酸和碱水解 HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS/MS 水解前13个酚类代谢物, 碱水解后8个, 酸水解后9个 Robbins et al., 2015 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) (v/v/v) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干, Sephadex LH-20柱分段 HPLC-DAD, HPLC-ESI-Q/TOF-MS 38个酚类代谢物, 其中包含15个鞣花单宁、3个棓单宁和13个原花青素 Gong et al., 2017 种仁 80%丙酮 正己烷脱脂, 提取液冷浸过夜, 室温超声提取2小时, 2次, 50°C氮吹仪吹干, 冻干 HPLC-DAD, UPLC-ESI-Q/TOF-MS 35个酚类代谢物, 其中包含18个鞣花单宁、2个棓单宁和2个原花青素 Jia et al., 2017 壳 20%乙醇 80°C超声提取1小时, 减压回收溶剂 HPLC-ESI-MS/MS 29个酚酸苷元, 其中包含12个类黄酮和1个香豆素 Hilbig et al., 2018a
根据分离目的不同, 鉴定方法各有不同.采用1D、2D氢和碳核磁共振法可准确鉴定代谢物的结构, 但要求对代谢物进行分离, 一般纯度需达到95%以上才能准确鉴定.质谱法可以一次性同时鉴定大量代谢物, 根据国际化学分析工作组(Chemical Analysis Working Group, CAWG)代谢组学标准委员会(Metabolomics Standards Initiative, MSI)的规定, 鉴定的代谢物分为4个等级, 即可用标准品准确鉴定、无标准品但分子量和裂解规律与已知代谢物一致、无标准品通过裂解规律等推定为某一类型代谢物及未知代谢物(Sumner et al., 2007 ).定量测定的要求较低时则可采用紫外分光法进行检测. ...Senter等(1980) 对脱脂后的斯图尔特种仁进行酸水解, 通过气相色谱法测得没食子酸含量为132.8 µg·g-1 脱脂种仁.Villarreal-Lozoya等(2007) 研究表明, 薄壳山核桃果仁中含量最高的酚酸是鞣花酸, 其次是没食子酸, 二者含量分别为2.5-4.7和0.6-1.3 mg·g-1 脱脂种仁.Malik等(2009) 测定了薄壳山核桃品种德西拉布(Desirable)、威奇塔(Wichita)和切尼(Cheyenne)的单体酚酸含量, 结果显示含量最高的酚酸为儿茶素, 其次为鞣花酸和没食子酸, 三者的含量分别为32.54-90.00、20.96-86.21和15.90-21.31 g·kg-1 .Jia等(2018) 发现薄壳山核桃种仁在果实发育中期富含儿茶素及表儿茶素, 之后其含量随果实发育快速下降.Robbins等(2015) 采用质谱进行定量分析, 发现鞣花酸含量最高, 为132 μg·g-1 丙酮粗提物, 而酸或碱水解后戊烯酸双内酯的含量最高, 分别为262.4和190.2 μg·g-1 丙酮粗提物.戊烯酸双内酯为鞣花酸和没食子酸的缩合物, 说明薄壳山核桃种仁中含有大量鞣花单宁和棓单宁的复合物. ...Carya illinoensis )Morgan and Clayshulte, 2000 ; Rajaram et al., 2001 ).除油脂外, 薄壳山核桃果实中还含有另一类重要的营养物质——酚类(phenolics).酚类是苯环上含有酚羟基的一大类物质的统称.其中, 人们关注较多的活性物质有酚酸(phenolic acids)、类黄酮(flavonoids)、香豆素(coumarins)、木质素(lignans)和单宁(tannins) (Alasalvar and Shahidi, 2009 ).其中, 类黄酮又包含黄酮醇(flavonols)、黄烷-3-醇(flavan-3-ols)和二氢黄酮醇(dihydroflavonols)及其糖苷(李珊珊等, 2014 ).单宁包含水解单宁(hydrolysable tannins)和缩合单宁(condensed tannins)两大类(孙达旺, 1992 ).水解单宁在酸碱条件下不稳定, 易于水解, 根据水解后产生酚酸的不同分为棓单宁(gallotannins)和鞣花单宁(ellagitannins).缩合单宁一般衍生于黄烷类化合物, 又被称为原花青素或原花色素(proanthocyanidins) (石碧和狄莹, 2000 ).酚类为植物次生代谢产物, 在植物中含量虽低但功效显著.人们最早注意到薄壳山核桃中的酚类代谢物是由于发现其可能与采后种皮变色及油脂氧化有关(Senter et al., 1978 , 1980 ; Polles et al., 1981 ).后来, 科学家发现薄壳山核桃具有较强的抗氧化性(Wu et al., 2004 ; Gu et al., 2004 ), 进而发现这种抗氧化性的物质基础是其中所含有的酚类代谢物(Villarreal-Lozoya et al., 2007 ).采用不同的分析手段可测定薄壳山核桃种仁及壳中的总酚、缩合单宁及总黄酮的含量, 检测抗氧化性并对酚类代谢物进行鉴定.随着液相色谱及质谱等现代化分析技术的应用, 薄壳山核桃中的酚类代谢物已逐渐被阐明.目前, 对薄壳山核桃的种质资源(Grauke et al., 2003 )、育苗技术(Zhang et al., 2015 )及栽培措施(Mo et al., 2017 )已有许多研究报道, 但对薄壳山核桃中的酚类代谢物尚未见系统总结.本文综述薄壳山核桃酚类代谢物相关研究进展, 以期为今后的科学研究和产业发展提供参考. ...Morgan and Clayshulte, 2000 ; Rajaram et al., 2001 ).除油脂外, 薄壳山核桃果实中还含有另一类重要的营养物质——酚类(phenolics).酚类是苯环上含有酚羟基的一大类物质的统称.其中, 人们关注较多的活性物质有酚酸(phenolic acids)、类黄酮(flavonoids)、香豆素(coumarins)、木质素(lignans)和单宁(tannins) (Alasalvar and Shahidi, 2009 ).其中, 类黄酮又包含黄酮醇(flavonols)、黄烷-3-醇(flavan-3-ols)和二氢黄酮醇(dihydroflavonols)及其糖苷(李珊珊等, 2014 ).单宁包含水解单宁(hydrolysable tannins)和缩合单宁(condensed tannins)两大类(孙达旺, 1992 ).水解单宁在酸碱条件下不稳定, 易于水解, 根据水解后产生酚酸的不同分为棓单宁(gallotannins)和鞣花单宁(ellagitannins).缩合单宁一般衍生于黄烷类化合物, 又被称为原花青素或原花色素(proanthocyanidins) (石碧和狄莹, 2000 ).酚类为植物次生代谢产物, 在植物中含量虽低但功效显著.人们最早注意到薄壳山核桃中的酚类代谢物是由于发现其可能与采后种皮变色及油脂氧化有关(Senter et al., 1978 , 1980 ; Polles et al., 1981 ).后来, 科学家发现薄壳山核桃具有较强的抗氧化性(Wu et al., 2004 ; Gu et al., 2004 ), 进而发现这种抗氧化性的物质基础是其中所含有的酚类代谢物(Villarreal-Lozoya et al., 2007 ).采用不同的分析手段可测定薄壳山核桃种仁及壳中的总酚、缩合单宁及总黄酮的含量, 检测抗氧化性并对酚类代谢物进行鉴定.随着液相色谱及质谱等现代化分析技术的应用, 薄壳山核桃中的酚类代谢物已逐渐被阐明.目前, 对薄壳山核桃的种质资源(Grauke et al., 2003 )、育苗技术(Zhang et al., 2015 )及栽培措施(Mo et al., 2017 )已有许多研究报道, 但对薄壳山核桃中的酚类代谢物尚未见系统总结.本文综述薄壳山核桃酚类代谢物相关研究进展, 以期为今后的科学研究和产业发展提供参考. ...Nicotiana tabacum )和乙醇导致的过氧化症状, 保护大脑、血液和肝部健康.Reckziegel等(2011) 对小鼠的研究显示, 薄壳山核桃壳水提液对于戒烟导致的焦虑症状具有缓解作用, 同时可抑制吸烟导致的脑及红细胞脂质过氧化、降低红细胞内过氧化酶活性, 维持血浆中抗坏血酸水平.Müller等(2013) 通过体内及体外实验, 发现薄壳山核桃壳水提液可减少脂质过氧化、谷胱甘肽和超氧化物歧化酶的消耗, 对乙醇导致的肝损伤具有保护作用, 未来可能是治疗乙醇性肝损伤的一种经济药物.同样, Gad等(2007) 发现薄壳山核桃叶片提取物也具有保肝作用, 并从叶片中分离鉴定了15个酚类代谢物. ...Nelson等(1985) 比较了不同加热方法对薄壳山核桃品质的影响.蒸汽加热导致种皮变色, 而介质加热则不会导致变色.低温贮藏可延缓种皮褐变, 且温度越低保存时间越长.研究表明, 20°C条件下薄壳山核桃仅可保存数月便丧失商品价值(Woodroof and Heaton, 1953 ); 在5°C货架期可延长至半年左右(Bonner and Karrfalt, 2008 ); 而在-15°C则至少可保存2年(Anzaldúa- Morales et al., 1999 ).采后贮藏过程中, 种仁含水量会影响种皮颜色, 采收时薄壳山核桃种仁含水量为25%-30%, 应尽快干燥至4%, 隔绝氧气以抑制酚类氧化, 从而延缓褐变(Kays, 1979 ).Senter和Forbus (1979) 研究表明, 通过涂布乙酰化单甘脂(acetylated monoglyceride)并不能对种皮褐变产生显著抑制作用.Dull和Kays (1988) 用聚偏二氯乙烯(polyvinylidenechloride)涂层玻璃纸真空包装种仁, 在24°C、65%的相对湿度下保存6个月颜色基本不变, 并可有效防止机械损伤, 但口味稍差.Heaton和Shewfelt (1976) 考察了不同含水量、不同透光度软袋中的薄壳山核桃在23°C下贮藏24周其种仁颜色和脂肪酸变化, 结果显示, 光强、含水量和贮藏时间均对颜色和脂肪酸含量有显著影响, 但这3项因素的重要性次于温度. ...Morgan and Clayshulte, 2000 ; Rajaram et al., 2001 ).除油脂外, 薄壳山核桃果实中还含有另一类重要的营养物质——酚类(phenolics).酚类是苯环上含有酚羟基的一大类物质的统称.其中, 人们关注较多的活性物质有酚酸(phenolic acids)、类黄酮(flavonoids)、香豆素(coumarins)、木质素(lignans)和单宁(tannins) (Alasalvar and Shahidi, 2009 ).其中, 类黄酮又包含黄酮醇(flavonols)、黄烷-3-醇(flavan-3-ols)和二氢黄酮醇(dihydroflavonols)及其糖苷(李珊珊等, 2014 ).单宁包含水解单宁(hydrolysable tannins)和缩合单宁(condensed tannins)两大类(孙达旺, 1992 ).水解单宁在酸碱条件下不稳定, 易于水解, 根据水解后产生酚酸的不同分为棓单宁(gallotannins)和鞣花单宁(ellagitannins).缩合单宁一般衍生于黄烷类化合物, 又被称为原花青素或原花色素(proanthocyanidins) (石碧和狄莹, 2000 ).酚类为植物次生代谢产物, 在植物中含量虽低但功效显著.人们最早注意到薄壳山核桃中的酚类代谢物是由于发现其可能与采后种皮变色及油脂氧化有关(Senter et al., 1978 , 1980 ; Polles et al., 1981 ).后来, 科学家发现薄壳山核桃具有较强的抗氧化性(Wu et al., 2004 ; Gu et al., 2004 ), 进而发现这种抗氧化性的物质基础是其中所含有的酚类代谢物(Villarreal-Lozoya et al., 2007 ).采用不同的分析手段可测定薄壳山核桃种仁及壳中的总酚、缩合单宁及总黄酮的含量, 检测抗氧化性并对酚类代谢物进行鉴定.随着液相色谱及质谱等现代化分析技术的应用, 薄壳山核桃中的酚类代谢物已逐渐被阐明.目前, 对薄壳山核桃的种质资源(Grauke et al., 2003 )、育苗技术(Zhang et al., 2015 )及栽培措施(Mo et al., 2017 )已有许多研究报道, 但对薄壳山核桃中的酚类代谢物尚未见系统总结.本文综述薄壳山核桃酚类代谢物相关研究进展, 以期为今后的科学研究和产业发展提供参考. ...Polles et al., 1981 ).缩合单宁具有抗氧化和抗诱变的活性, 且受交联度、结构单元和结构单元间化学键类型的影响(Grimmer et al., 1992 ).Gu等(2002) 报道薄壳山核桃中原花青素二聚体间的化学键为B型(C4 -C8 和C4 -C6 ), 之后又测定了薄壳山核桃种仁中缩合单宁的含量为494.1 mg·(100 g)-1 鲜种仁, 同时还测定了不同交联度单宁的含量, 单体、二聚体、三聚体、四到六聚体、七到十聚体和十聚体以上的单宁含量分别为17.2、42.1、26、101、84和223 mg·(100 g)-1 鲜种仁(Gu et al., 2004 ).而Robbins等(2014) 测得薄壳山核桃种仁中单体、二聚体、三聚体和四到六聚体的单宁含量分别为0.3、47.3、21.1和14.8 mg·g-1 单宁部位.Gong和Pegg (2017) 测得薄壳山核桃种仁中二至七聚体的单宁含量分别为31.42、18.34、7.08、5.53、1.62和0.41 mg·g-1 粗提物.尽管各研究所得数值的单位略有不同, 但可看出薄壳山核桃种仁中二聚体及三聚体原花青素的含量最高.原花青素是由2分子或3分子的(表)儿茶素连接在一起形成, 3个及以上连接在一起形成寡聚原花青素(oligomeric proanthocyanidins) (Holton and Cornish, 1995 ).薄壳山核桃种仁含有大量原花青素及寡聚原花青素, 这些原花青素对薄壳山核桃的抗氧化性起主要作用.Villarreal- Lozoya等(2007) 测得美国产薄壳山核桃种仁中的缩合单宁含量为23-47 mg儿茶素等价物·g-1 脱脂种仁.Robbins等(2015) 测得原花青素含量为420-655 mg PD2B等价物·(100 g)-1 种仁.薄壳山核桃中缩合单宁含量通常与总酚含量接近, 说明缩合单宁是薄壳山核桃中最主要的酚类代谢物. ...Morgan and Clayshulte, 2000 ; Rajaram et al., 2001 ).除油脂外, 薄壳山核桃果实中还含有另一类重要的营养物质——酚类(phenolics).酚类是苯环上含有酚羟基的一大类物质的统称.其中, 人们关注较多的活性物质有酚酸(phenolic acids)、类黄酮(flavonoids)、香豆素(coumarins)、木质素(lignans)和单宁(tannins) (Alasalvar and Shahidi, 2009 ).其中, 类黄酮又包含黄酮醇(flavonols)、黄烷-3-醇(flavan-3-ols)和二氢黄酮醇(dihydroflavonols)及其糖苷(李珊珊等, 2014 ).单宁包含水解单宁(hydrolysable tannins)和缩合单宁(condensed tannins)两大类(孙达旺, 1992 ).水解单宁在酸碱条件下不稳定, 易于水解, 根据水解后产生酚酸的不同分为棓单宁(gallotannins)和鞣花单宁(ellagitannins).缩合单宁一般衍生于黄烷类化合物, 又被称为原花青素或原花色素(proanthocyanidins) (石碧和狄莹, 2000 ).酚类为植物次生代谢产物, 在植物中含量虽低但功效显著.人们最早注意到薄壳山核桃中的酚类代谢物是由于发现其可能与采后种皮变色及油脂氧化有关(Senter et al., 1978 , 1980 ; Polles et al., 1981 ).后来, 科学家发现薄壳山核桃具有较强的抗氧化性(Wu et al., 2004 ; Gu et al., 2004 ), 进而发现这种抗氧化性的物质基础是其中所含有的酚类代谢物(Villarreal-Lozoya et al., 2007 ).采用不同的分析手段可测定薄壳山核桃种仁及壳中的总酚、缩合单宁及总黄酮的含量, 检测抗氧化性并对酚类代谢物进行鉴定.随着液相色谱及质谱等现代化分析技术的应用, 薄壳山核桃中的酚类代谢物已逐渐被阐明.目前, 对薄壳山核桃的种质资源(Grauke et al., 2003 )、育苗技术(Zhang et al., 2015 )及栽培措施(Mo et al., 2017 )已有许多研究报道, 但对薄壳山核桃中的酚类代谢物尚未见系统总结.本文综述薄壳山核桃酚类代谢物相关研究进展, 以期为今后的科学研究和产业发展提供参考. ...Nicotiana tabacum )和乙醇导致的过氧化症状, 保护大脑、血液和肝部健康.Reckziegel等(2011) 对小鼠的研究显示, 薄壳山核桃壳水提液对于戒烟导致的焦虑症状具有缓解作用, 同时可抑制吸烟导致的脑及红细胞脂质过氧化、降低红细胞内过氧化酶活性, 维持血浆中抗坏血酸水平.Müller等(2013) 通过体内及体外实验, 发现薄壳山核桃壳水提液可减少脂质过氧化、谷胱甘肽和超氧化物歧化酶的消耗, 对乙醇导致的肝损伤具有保护作用, 未来可能是治疗乙醇性肝损伤的一种经济药物.同样, Gad等(2007) 发现薄壳山核桃叶片提取物也具有保肝作用, 并从叶片中分离鉴定了15个酚类代谢物. ...do Prado et al., 2013 ; Ribeiro et al., 2017 ; Hilbig et al., 2018b ).de la Rosa等(2011) 测得墨西哥产薄壳山核桃壳的总黄酮含量为26.3- 36.1 mg儿茶素等价物·g-1 鲜种仁, 原花青素含量为316.1-464.4 mg儿茶素等价物·g-1 鲜种仁, 而种仁的原花青素含量仅为20.3-26.7 mg儿茶素等价物·g-1 鲜种仁, 说明薄壳山核桃壳中原花青素含量远高于种仁.de la Rosa等(2011) 通过比较表明种壳的总酚含量大约是种仁的3倍.Hilbig等(2018a) 测定了巴西薄壳山核桃品种巴顿(Barton)壳中的总酚含量为581.9 mg没食子酸等价物·g-1 种仁, 缩合单宁含量为71.08 mg儿茶素等价物·g-1 种仁, 之后采用液质联用法测定水解液中酚类代谢物苷元的含量, 其中儿茶素、没食子酸和鞣花酸的含量分别为352、138和36 mg·g-1 干种仁, 再次证明壳中含有大量原花青素.Do Prado等(2013 , 2014) 测定了巴西薄壳山核桃壳的总酚及缩合单宁含量, 分析表明壳中酚类代谢物含量可能会影响油中不饱和脂肪酸的氧化程度. ...Rosmarinus officinalis ), 目前已被欧盟批准使用.Ribeiro等(2017) 在人造奶油中添加薄壳山核桃壳水提液、迷迭香提取物和BHT, 比较三者对奶油过氧化的保护作用.结果显示, 薄壳山核桃壳水提液与其它2种抗氧化剂的效果无显著差异, 显示出薄壳山核桃壳作为新型天然抗氧化剂应用于食品工业的潜力. ...Villarreal-Lozoya等(2007) 采用液相色谱法从堪萨(Kanza)脱脂种仁的碱水解液中检测到4个酚酸, 分别是没食子酸、儿茶素、表儿茶素和鞣花酸.Malik等(2009) 最早尝试不水解, 直接用液相色谱法分析薄壳山核桃中的酚类代谢物, 从脱脂种仁中检测到8个酚酸, 其中新检测到的有儿茶酚、香豆酸、绿原酸和咖啡酸.de la Rosa等(2011) 采用液相色谱法分别从直接提取液和酸水解液中检测到6个酚类代谢物和8个酚类代谢物苷元.Robbins等(2014) 首次采用液质联用法分析和鉴定薄壳山核桃中的酚类代谢物, 至此从薄壳山核桃中检测到的酚类代谢物数量跃上了一个新的台阶.该研究团队从美国产8个高抗氧化性品种种仁的混样中鉴定出27个酚类代谢物, 其中新鉴定了13个酚酸及其糖苷、2个棓单宁、1个鞣花单宁和2个缩合单宁.Robbins等(2015) 同样采用液质联用法从美国产薄壳山核桃种仁中新鉴定了1个酚酸和1个棓单宁.Gong和Pegg (2017) 采用高效液相色谱联用飞行时间质谱从美国产薄壳山核桃种仁中鉴定出38个酚类代谢物, 其中新鉴定4个单宁.Jia等(2018) 采用超高效液相色谱联用高分辨飞行时间质谱从中国产薄壳山核桃种仁动态混样中鉴定酚类代谢物35个, 其中新鉴定酚酸4个, 鞣花单宁3个. ...表3 .从种仁样品中提取酚类代谢物前需先进行干燥和脱脂.以分离单体代谢物为目的的提取往往采用加热回流法, 回收率高, 但杂质也较多(Ishak et al., 1980 ; Gad et al., 2007 ; Abdallah et al., 2011 ).而以分析为主要目的的提取一般采用匀浆或超声方法, 获得的提取液杂质较少, 有利于分析目标代谢物(Malik et al., 2009 ; de la Rosa et al., 2011 ; Robbins et al., 2014 , 2015 ; Gong and Pegg, 2017 ; Jia et al., 2018 ; Hilbig et al., 2018a ).提取后可采用凝胶柱除杂或分段, 以减少色谱峰间的重叠, 使结果更准确.而采用超高效液相色谱可进一步提高分离度, 不分段直接进行鉴定.采用高分辨质谱分析代谢物, 荷质比精度可至小数点后4位, 通过计算与理论值之间的偏差(mass measurement errors, ∆m)进一步确保结果的准确性.对原花青素的检测采用亲水作用色谱(hydrophilic interaction chromatography, HILIC)取得了较好的结果(Gong and Pegg, 2017 ). ...Table 3 部位 溶剂 提取方法 检测方法 组分 参考文献 种仁 含0.1% HCl的甲醇 冷浸3小时 纸层析显色 初步认为含无色花色素 Senter et al., 1978 种仁 含0.1% HCl的甲醇 回流提取2小时2次, 合并浓缩后用1 mol·L-1 HCl回流水解2小时, 乙酸乙酯萃取, 甲酯化 GC-MS 8个酚酸 Senter et al., 1980 树枝, 叶 70%乙醇 回流提取, 浓缩后聚酰胺柱反复柱层 H1 -NMR, C13 - NMR 从树枝中分离出4个类黄酮; 从叶中分离出5个类黄酮、 Ishak et al., 1980 叶 水 回流提取, 烘干, 再用乙醇提取, Sephadex LH-20柱反复柱层析分离 H1 -NMR, C13 - NMR 1个酚酸、8个类黄酮和6个单宁 Gad et al., 2007 种仁 70%丙酮 正己烷脱脂, 匀浆, 5°C摇床振摇过夜.分别用6 mol·L-1 HCl和8 mol·L-1 NaOH进行酸和碱水解 HPLC-DAD 4个酚类代谢物 Villarreal-Lozoya et al., 2007 种仁 80%甲醇 正己烷脱脂, 匀浆机提取30秒, 2次, 再用Sephadex LH-20小柱除杂 HPLC-DAD 8个酚酸 Malik et al., 2009 种仁 80%丙酮 正己烷脱脂, 50°C匀浆提取30分钟, HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS 5个酚酸、2个类黄酮、5个鞣花单宁和1个棓单宁 de la Rosa et al., 2011 树皮 70%乙醇 70°C回流提取, 硅胶柱及Sephadex LH-20柱反复柱层析 H1 -NMR, C13 - NMR 6个类黄酮和1个酚酸 Abdallah et al., 2011 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干, Sephadex LH-20柱分段 HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS/MS 27个酚类代谢物, 其中包含2个鞣花单宁、2个棓单宁和2个缩合单宁 Robbins et al., 2014 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) (v/v/v) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干.分别用-1 HCl和2 mol·L-1 NaOH进行酸和碱水解 HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS/MS 水解前13个酚类代谢物, 碱水解后8个, 酸水解后9个 Robbins et al., 2015 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) (v/v/v) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干, Sephadex LH-20柱分段 HPLC-DAD, HPLC-ESI-Q/TOF-MS 38个酚类代谢物, 其中包含15个鞣花单宁、3个棓单宁和13个原花青素 Gong et al., 2017 种仁 80%丙酮 正己烷脱脂, 提取液冷浸过夜, 室温超声提取2小时, 2次, 50°C氮吹仪吹干, 冻干 HPLC-DAD, UPLC-ESI-Q/TOF-MS 35个酚类代谢物, 其中包含18个鞣花单宁、2个棓单宁和2个原花青素 Jia et al., 2017 壳 20%乙醇 80°C超声提取1小时, 减压回收溶剂 HPLC-ESI-MS/MS 29个酚酸苷元, 其中包含12个类黄酮和1个香豆素 Hilbig et al., 2018a
根据分离目的不同, 鉴定方法各有不同.采用1D、2D氢和碳核磁共振法可准确鉴定代谢物的结构, 但要求对代谢物进行分离, 一般纯度需达到95%以上才能准确鉴定.质谱法可以一次性同时鉴定大量代谢物, 根据国际化学分析工作组(Chemical Analysis Working Group, CAWG)代谢组学标准委员会(Metabolomics Standards Initiative, MSI)的规定, 鉴定的代谢物分为4个等级, 即可用标准品准确鉴定、无标准品但分子量和裂解规律与已知代谢物一致、无标准品通过裂解规律等推定为某一类型代谢物及未知代谢物(Sumner et al., 2007 ).定量测定的要求较低时则可采用紫外分光法进行检测. ...Wu等(2004) 对市售薄壳山核桃种仁总酚含量的测定结果为2 016 mg没食子酸等价物·g-1 鲜种仁, 而Kornsteiner等(2006) 测得为1 284 mg没食子酸等价物·g-1 鲜种仁.Villarreal-Lozoya等(2007) 测定美国产6种薄壳山核桃种仁中的总酚含量为62-106 mg绿原酸等价物·g-1 脱脂种仁, 且品种间差异显著.de la Rosa等(2011) 对墨西哥产薄壳山核桃仁的测定结果为11.7-12.5 mg没食子酸等价物·g-1 鲜种仁, 而壳的总酚含量为65.3-92.5 mg没食子酸等价物·g-1 鲜种仁.Robbins等(2015) 用鞣花酸作为标准品, 测得总酚含量为1.82-2.62 g鞣花酸等价物·(100 g)-1 种仁.不同研究对于总酚含量的表征可以为每克鲜种仁、每克干种仁或每克脱脂种仁, 标准品为没食子酸、绿原酸和鞣花酸(罗会婷等, 2017 ).不同的标准品和含量单位给比较带来了一定的困难.据文献报道, 绿原酸等价物与没食子酸等价物的转换因子为0.6 (Chun and Kim, 2004 ), 而脱脂种仁与未脱脂种仁比较时需考虑70%的油脂含量并进行转换(Rudolph et al., 1992 ). ...Polles et al., 1981 ).缩合单宁具有抗氧化和抗诱变的活性, 且受交联度、结构单元和结构单元间化学键类型的影响(Grimmer et al., 1992 ).Gu等(2002) 报道薄壳山核桃中原花青素二聚体间的化学键为B型(C4 -C8 和C4 -C6 ), 之后又测定了薄壳山核桃种仁中缩合单宁的含量为494.1 mg·(100 g)-1 鲜种仁, 同时还测定了不同交联度单宁的含量, 单体、二聚体、三聚体、四到六聚体、七到十聚体和十聚体以上的单宁含量分别为17.2、42.1、26、101、84和223 mg·(100 g)-1 鲜种仁(Gu et al., 2004 ).而Robbins等(2014) 测得薄壳山核桃种仁中单体、二聚体、三聚体和四到六聚体的单宁含量分别为0.3、47.3、21.1和14.8 mg·g-1 单宁部位.Gong和Pegg (2017) 测得薄壳山核桃种仁中二至七聚体的单宁含量分别为31.42、18.34、7.08、5.53、1.62和0.41 mg·g-1 粗提物.尽管各研究所得数值的单位略有不同, 但可看出薄壳山核桃种仁中二聚体及三聚体原花青素的含量最高.原花青素是由2分子或3分子的(表)儿茶素连接在一起形成, 3个及以上连接在一起形成寡聚原花青素(oligomeric proanthocyanidins) (Holton and Cornish, 1995 ).薄壳山核桃种仁含有大量原花青素及寡聚原花青素, 这些原花青素对薄壳山核桃的抗氧化性起主要作用.Villarreal- Lozoya等(2007) 测得美国产薄壳山核桃种仁中的缩合单宁含量为23-47 mg儿茶素等价物·g-1 脱脂种仁.Robbins等(2015) 测得原花青素含量为420-655 mg PD2B等价物·(100 g)-1 种仁.薄壳山核桃中缩合单宁含量通常与总酚含量接近, 说明缩合单宁是薄壳山核桃中最主要的酚类代谢物. ...Senter等(1980) 对脱脂后的斯图尔特种仁进行酸水解, 通过气相色谱法测得没食子酸含量为132.8 µg·g-1 脱脂种仁.Villarreal-Lozoya等(2007) 研究表明, 薄壳山核桃果仁中含量最高的酚酸是鞣花酸, 其次是没食子酸, 二者含量分别为2.5-4.7和0.6-1.3 mg·g-1 脱脂种仁.Malik等(2009) 测定了薄壳山核桃品种德西拉布(Desirable)、威奇塔(Wichita)和切尼(Cheyenne)的单体酚酸含量, 结果显示含量最高的酚酸为儿茶素, 其次为鞣花酸和没食子酸, 三者的含量分别为32.54-90.00、20.96-86.21和15.90-21.31 g·kg-1 .Jia等(2018) 发现薄壳山核桃种仁在果实发育中期富含儿茶素及表儿茶素, 之后其含量随果实发育快速下降.Robbins等(2015) 采用质谱进行定量分析, 发现鞣花酸含量最高, 为132 μg·g-1 丙酮粗提物, 而酸或碱水解后戊烯酸双内酯的含量最高, 分别为262.4和190.2 μg·g-1 丙酮粗提物.戊烯酸双内酯为鞣花酸和没食子酸的缩合物, 说明薄壳山核桃种仁中含有大量鞣花单宁和棓单宁的复合物. ...Table 4 部位 抗氧化性平均值(范围) 参考文献 DPPH -1 ) ABTS -1 ) ORAC -1 ) FRAP 2+ eq∙(100 g)-1 ) 种仁 - - 179.4 - Wu et al., 2004 种仁 - - - 8.33 (6.32-11.05) Blomhoff et al., 2006 种仁 388 (324-540) - 583 (373-817) - Villarreal-Lozoya et al., 2007 种仁 102.6-108.7 75.9-83.4 227-261.5 - de la Rosa et al., 2011 种仁 2110 3360 - - de la Rosa et al., 2014 种仁 - - 135-255 14.0-20.7 Robbins et al., 2015 种仁 548.84 - - - Flores-Córdova et al., 2017 种仁 37.24-461.80 6.74-201.49 - - Jia et al., 2018 壳80%丙酮提取液 537.8-720.3 518.4-644.2 680.3-1350.3 - de la Rosa et al., 2011 壳水提液 1386.28 1333.1 - - Prado et al., 2013 壳80%丙酮提取液 4800 8240 - - de la Rosa et al., 2014 壳水提液 2448.96 1809.01 - - Prado et al., 2014 壳水提液 1268.03 2574.32 - - Hilbig et al., 2018a
DPPH: 2, 2-二苯基-1-三硝基苯肼自由基清除实验; ABTS: 2, 2'-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐自由基清除实验; ORAC: 氧化自由基吸收能力; FRAP: 铁离子还原能力 ...Domínguez-Avila等(2015) 通过小鼠(Mus musculus )体内实验分析薄壳山核桃油脂及多酚对血液的影响.结果显示, 喂饲高脂肪食物加薄壳山核桃油脂可降低小鼠血液中的甘油三酯含量, 喂饲高脂肪食物加薄壳山核桃多酚可刺激肝脏X受体mRNA在肝脏中的表达, 而喂饲高脂肪食物加薄壳山核桃干果可降低血液脂质的过氧化程度, 上调载脂蛋白B和LDL受体mRNA在肝脏中的表达, 说明薄壳山核桃具有降血脂和抗氧化的功效.Robbins等(2016) 通过小鼠体内实验评价了薄壳山核桃种仁的抗炎作用.实验结果表明, 薄壳山核桃中的酚类物质粗提物可抑制小鼠RAW 264.7巨噬细胞释放NO和过氧化.其中, 通过凝胶富集的小分子量部位具有显著的活性, 而大分子量部位无显著活性, 进一步的液相分析发现小分子量部位含有鞣花酸、儿茶素及二聚、三聚和寡聚原花青素. ...Villarreal-Lozoya等(2007) 采用液相色谱法从堪萨(Kanza)脱脂种仁的碱水解液中检测到4个酚酸, 分别是没食子酸、儿茶素、表儿茶素和鞣花酸.Malik等(2009) 最早尝试不水解, 直接用液相色谱法分析薄壳山核桃中的酚类代谢物, 从脱脂种仁中检测到8个酚酸, 其中新检测到的有儿茶酚、香豆酸、绿原酸和咖啡酸.de la Rosa等(2011) 采用液相色谱法分别从直接提取液和酸水解液中检测到6个酚类代谢物和8个酚类代谢物苷元.Robbins等(2014) 首次采用液质联用法分析和鉴定薄壳山核桃中的酚类代谢物, 至此从薄壳山核桃中检测到的酚类代谢物数量跃上了一个新的台阶.该研究团队从美国产8个高抗氧化性品种种仁的混样中鉴定出27个酚类代谢物, 其中新鉴定了13个酚酸及其糖苷、2个棓单宁、1个鞣花单宁和2个缩合单宁.Robbins等(2015) 同样采用液质联用法从美国产薄壳山核桃种仁中新鉴定了1个酚酸和1个棓单宁.Gong和Pegg (2017) 采用高效液相色谱联用飞行时间质谱从美国产薄壳山核桃种仁中鉴定出38个酚类代谢物, 其中新鉴定4个单宁.Jia等(2018) 采用超高效液相色谱联用高分辨飞行时间质谱从中国产薄壳山核桃种仁动态混样中鉴定酚类代谢物35个, 其中新鉴定酚酸4个, 鞣花单宁3个. ...表3 .从种仁样品中提取酚类代谢物前需先进行干燥和脱脂.以分离单体代谢物为目的的提取往往采用加热回流法, 回收率高, 但杂质也较多(Ishak et al., 1980 ; Gad et al., 2007 ; Abdallah et al., 2011 ).而以分析为主要目的的提取一般采用匀浆或超声方法, 获得的提取液杂质较少, 有利于分析目标代谢物(Malik et al., 2009 ; de la Rosa et al., 2011 ; Robbins et al., 2014 , 2015 ; Gong and Pegg, 2017 ; Jia et al., 2018 ; Hilbig et al., 2018a ).提取后可采用凝胶柱除杂或分段, 以减少色谱峰间的重叠, 使结果更准确.而采用超高效液相色谱可进一步提高分离度, 不分段直接进行鉴定.采用高分辨质谱分析代谢物, 荷质比精度可至小数点后4位, 通过计算与理论值之间的偏差(mass measurement errors, ∆m)进一步确保结果的准确性.对原花青素的检测采用亲水作用色谱(hydrophilic interaction chromatography, HILIC)取得了较好的结果(Gong and Pegg, 2017 ). ...Table 3 部位 溶剂 提取方法 检测方法 组分 参考文献 种仁 含0.1% HCl的甲醇 冷浸3小时 纸层析显色 初步认为含无色花色素 Senter et al., 1978 种仁 含0.1% HCl的甲醇 回流提取2小时2次, 合并浓缩后用1 mol·L-1 HCl回流水解2小时, 乙酸乙酯萃取, 甲酯化 GC-MS 8个酚酸 Senter et al., 1980 树枝, 叶 70%乙醇 回流提取, 浓缩后聚酰胺柱反复柱层 H1 -NMR, C13 - NMR 从树枝中分离出4个类黄酮; 从叶中分离出5个类黄酮、 Ishak et al., 1980 叶 水 回流提取, 烘干, 再用乙醇提取, Sephadex LH-20柱反复柱层析分离 H1 -NMR, C13 - NMR 1个酚酸、8个类黄酮和6个单宁 Gad et al., 2007 种仁 70%丙酮 正己烷脱脂, 匀浆, 5°C摇床振摇过夜.分别用6 mol·L-1 HCl和8 mol·L-1 NaOH进行酸和碱水解 HPLC-DAD 4个酚类代谢物 Villarreal-Lozoya et al., 2007 种仁 80%甲醇 正己烷脱脂, 匀浆机提取30秒, 2次, 再用Sephadex LH-20小柱除杂 HPLC-DAD 8个酚酸 Malik et al., 2009 种仁 80%丙酮 正己烷脱脂, 50°C匀浆提取30分钟, HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS 5个酚酸、2个类黄酮、5个鞣花单宁和1个棓单宁 de la Rosa et al., 2011 树皮 70%乙醇 70°C回流提取, 硅胶柱及Sephadex LH-20柱反复柱层析 H1 -NMR, C13 - NMR 6个类黄酮和1个酚酸 Abdallah et al., 2011 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干, Sephadex LH-20柱分段 HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS/MS 27个酚类代谢物, 其中包含2个鞣花单宁、2个棓单宁和2个缩合单宁 Robbins et al., 2014 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) (v/v/v) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干.分别用-1 HCl和2 mol·L-1 NaOH进行酸和碱水解 HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS/MS 水解前13个酚类代谢物, 碱水解后8个, 酸水解后9个 Robbins et al., 2015 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) (v/v/v) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干, Sephadex LH-20柱分段 HPLC-DAD, HPLC-ESI-Q/TOF-MS 38个酚类代谢物, 其中包含15个鞣花单宁、3个棓单宁和13个原花青素 Gong et al., 2017 种仁 80%丙酮 正己烷脱脂, 提取液冷浸过夜, 室温超声提取2小时, 2次, 50°C氮吹仪吹干, 冻干 HPLC-DAD, UPLC-ESI-Q/TOF-MS 35个酚类代谢物, 其中包含18个鞣花单宁、2个棓单宁和2个原花青素 Jia et al., 2017 壳 20%乙醇 80°C超声提取1小时, 减压回收溶剂 HPLC-ESI-MS/MS 29个酚酸苷元, 其中包含12个类黄酮和1个香豆素 Hilbig et al., 2018a
根据分离目的不同, 鉴定方法各有不同.采用1D、2D氢和碳核磁共振法可准确鉴定代谢物的结构, 但要求对代谢物进行分离, 一般纯度需达到95%以上才能准确鉴定.质谱法可以一次性同时鉴定大量代谢物, 根据国际化学分析工作组(Chemical Analysis Working Group, CAWG)代谢组学标准委员会(Metabolomics Standards Initiative, MSI)的规定, 鉴定的代谢物分为4个等级, 即可用标准品准确鉴定、无标准品但分子量和裂解规律与已知代谢物一致、无标准品通过裂解规律等推定为某一类型代谢物及未知代谢物(Sumner et al., 2007 ).定量测定的要求较低时则可采用紫外分光法进行检测. ...Polles et al., 1981 ).缩合单宁具有抗氧化和抗诱变的活性, 且受交联度、结构单元和结构单元间化学键类型的影响(Grimmer et al., 1992 ).Gu等(2002) 报道薄壳山核桃中原花青素二聚体间的化学键为B型(C4 -C8 和C4 -C6 ), 之后又测定了薄壳山核桃种仁中缩合单宁的含量为494.1 mg·(100 g)-1 鲜种仁, 同时还测定了不同交联度单宁的含量, 单体、二聚体、三聚体、四到六聚体、七到十聚体和十聚体以上的单宁含量分别为17.2、42.1、26、101、84和223 mg·(100 g)-1 鲜种仁(Gu et al., 2004 ).而Robbins等(2014) 测得薄壳山核桃种仁中单体、二聚体、三聚体和四到六聚体的单宁含量分别为0.3、47.3、21.1和14.8 mg·g-1 单宁部位.Gong和Pegg (2017) 测得薄壳山核桃种仁中二至七聚体的单宁含量分别为31.42、18.34、7.08、5.53、1.62和0.41 mg·g-1 粗提物.尽管各研究所得数值的单位略有不同, 但可看出薄壳山核桃种仁中二聚体及三聚体原花青素的含量最高.原花青素是由2分子或3分子的(表)儿茶素连接在一起形成, 3个及以上连接在一起形成寡聚原花青素(oligomeric proanthocyanidins) (Holton and Cornish, 1995 ).薄壳山核桃种仁含有大量原花青素及寡聚原花青素, 这些原花青素对薄壳山核桃的抗氧化性起主要作用.Villarreal- Lozoya等(2007) 测得美国产薄壳山核桃种仁中的缩合单宁含量为23-47 mg儿茶素等价物·g-1 脱脂种仁.Robbins等(2015) 测得原花青素含量为420-655 mg PD2B等价物·(100 g)-1 种仁.薄壳山核桃中缩合单宁含量通常与总酚含量接近, 说明缩合单宁是薄壳山核桃中最主要的酚类代谢物. ...Wu等(2004) 对市售薄壳山核桃种仁总酚含量的测定结果为2 016 mg没食子酸等价物·g-1 鲜种仁, 而Kornsteiner等(2006) 测得为1 284 mg没食子酸等价物·g-1 鲜种仁.Villarreal-Lozoya等(2007) 测定美国产6种薄壳山核桃种仁中的总酚含量为62-106 mg绿原酸等价物·g-1 脱脂种仁, 且品种间差异显著.de la Rosa等(2011) 对墨西哥产薄壳山核桃仁的测定结果为11.7-12.5 mg没食子酸等价物·g-1 鲜种仁, 而壳的总酚含量为65.3-92.5 mg没食子酸等价物·g-1 鲜种仁.Robbins等(2015) 用鞣花酸作为标准品, 测得总酚含量为1.82-2.62 g鞣花酸等价物·(100 g)-1 种仁.不同研究对于总酚含量的表征可以为每克鲜种仁、每克干种仁或每克脱脂种仁, 标准品为没食子酸、绿原酸和鞣花酸(罗会婷等, 2017 ).不同的标准品和含量单位给比较带来了一定的困难.据文献报道, 绿原酸等价物与没食子酸等价物的转换因子为0.6 (Chun and Kim, 2004 ), 而脱脂种仁与未脱脂种仁比较时需考虑70%的油脂含量并进行转换(Rudolph et al., 1992 ). ...Anzaldúa-Morales et al., 1999 )、脂肪酸(Rudolph et al., 1992 )、VE (Yao et al., 1992 )和颜色(Grauke et al., 1998 )等, 而对酚类代谢物与贮藏的关系研究较少.在国外, 薄壳山核桃主要是低温带壳或脱壳贮藏, 远距离运输一般为常温进行.采后随贮存时间的延长, 薄壳山核桃种仁会逐渐氧化、酸败、失水变干、种皮褐变、风味丧失, 其中种皮褐变与酚类物质有关.酚类物质还在防止脂肪酸氧化过程中发挥一定作用.Senter等(1978) 通过紫外分光法测定了斯图尔特和舒莱(Schley)的种仁在32°C、50%的相对湿度下避光贮藏16周过程中总酚及总黄酮含量的变化趋势.结果显示, 2个品种的总酚和总黄酮含量有较大差异, 但变化速率类似, 其中斯图尔特总酚含量更高, 也更耐贮存, 表明总酚含量与耐贮性有关.通过薄层和纸层析初步分析显示薄壳山核桃的种皮中含有无色花色素(leucoanthocyanidin), 并在贮藏过程中逐渐转变为鞣酐(phlobaphene)、矢车菊素(cyanidin)和飞燕草素(delphinidin).Senter等(1980) 发现, 脱壳的斯图尔特种仁在21°C、65%的相对湿度下避光贮藏12周, 酚酸含量呈逐渐下降趋势. ...Nelson等(1985) 比较了不同加热方法对薄壳山核桃品质的影响.蒸汽加热导致种皮变色, 而介质加热则不会导致变色.低温贮藏可延缓种皮褐变, 且温度越低保存时间越长.研究表明, 20°C条件下薄壳山核桃仅可保存数月便丧失商品价值(Woodroof and Heaton, 1953 ); 在5°C货架期可延长至半年左右(Bonner and Karrfalt, 2008 ); 而在-15°C则至少可保存2年(Anzaldúa- Morales et al., 1999 ).采后贮藏过程中, 种仁含水量会影响种皮颜色, 采收时薄壳山核桃种仁含水量为25%-30%, 应尽快干燥至4%, 隔绝氧气以抑制酚类氧化, 从而延缓褐变(Kays, 1979 ).Senter和Forbus (1979) 研究表明, 通过涂布乙酰化单甘脂(acetylated monoglyceride)并不能对种皮褐变产生显著抑制作用.Dull和Kays (1988) 用聚偏二氯乙烯(polyvinylidenechloride)涂层玻璃纸真空包装种仁, 在24°C、65%的相对湿度下保存6个月颜色基本不变, 并可有效防止机械损伤, 但口味稍差.Heaton和Shewfelt (1976) 考察了不同含水量、不同透光度软袋中的薄壳山核桃在23°C下贮藏24周其种仁颜色和脂肪酸变化, 结果显示, 光强、含水量和贮藏时间均对颜色和脂肪酸含量有显著影响, 但这3项因素的重要性次于温度. ...Morgan and Clayshulte, 2000 ; Rajaram et al., 2001 ).除油脂外, 薄壳山核桃果实中还含有另一类重要的营养物质——酚类(phenolics).酚类是苯环上含有酚羟基的一大类物质的统称.其中, 人们关注较多的活性物质有酚酸(phenolic acids)、类黄酮(flavonoids)、香豆素(coumarins)、木质素(lignans)和单宁(tannins) (Alasalvar and Shahidi, 2009 ).其中, 类黄酮又包含黄酮醇(flavonols)、黄烷-3-醇(flavan-3-ols)和二氢黄酮醇(dihydroflavonols)及其糖苷(李珊珊等, 2014 ).单宁包含水解单宁(hydrolysable tannins)和缩合单宁(condensed tannins)两大类(孙达旺, 1992 ).水解单宁在酸碱条件下不稳定, 易于水解, 根据水解后产生酚酸的不同分为棓单宁(gallotannins)和鞣花单宁(ellagitannins).缩合单宁一般衍生于黄烷类化合物, 又被称为原花青素或原花色素(proanthocyanidins) (石碧和狄莹, 2000 ).酚类为植物次生代谢产物, 在植物中含量虽低但功效显著.人们最早注意到薄壳山核桃中的酚类代谢物是由于发现其可能与采后种皮变色及油脂氧化有关(Senter et al., 1978 , 1980 ; Polles et al., 1981 ).后来, 科学家发现薄壳山核桃具有较强的抗氧化性(Wu et al., 2004 ; Gu et al., 2004 ), 进而发现这种抗氧化性的物质基础是其中所含有的酚类代谢物(Villarreal-Lozoya et al., 2007 ).采用不同的分析手段可测定薄壳山核桃种仁及壳中的总酚、缩合单宁及总黄酮的含量, 检测抗氧化性并对酚类代谢物进行鉴定.随着液相色谱及质谱等现代化分析技术的应用, 薄壳山核桃中的酚类代谢物已逐渐被阐明.目前, 对薄壳山核桃的种质资源(Grauke et al., 2003 )、育苗技术(Zhang et al., 2015 )及栽培措施(Mo et al., 2017 )已有许多研究报道, 但对薄壳山核桃中的酚类代谢物尚未见系统总结.本文综述薄壳山核桃酚类代谢物相关研究进展, 以期为今后的科学研究和产业发展提供参考. ...Senter等(1978) 最早通过薄层层析和纸层析方法初步认为薄壳山核桃的种仁中含有无色花色素(leucoanthocyanidin), 但由于方法的局限性, 仅能判断结构类型, 不能确定代谢物.之后, Senter等(1980) 采用气相色谱法从斯图尔特(Stuart)脱脂种仁的酸水解液中检测到8个酚酸, 分别是没食子酸、龙胆酸、香草酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯乙酸、香豆酸和丁香酸.采用酸或碱水解可使酯键断裂, 得到相应的苷元, 从而简化代谢物结构, 有利于结构分析, 但由于破坏了原本代谢物的结构, 因此仅能明确代谢物苷元.2004年, 有2项抗氧化性评价研究均表明薄壳山核桃含有丰富的酚类代谢物, 抗氧化活性高于许多已知的富含酚类的水果及浆果(Wu et al., 2004 ; Gu et al., 2004 ).这两项研究再次引起了人们对薄壳山核桃抗氧化活性的关注, 科学家们开始寻找这种强抗氧化性的物质基础. ...Table 3 部位 溶剂 提取方法 检测方法 组分 参考文献 种仁 含0.1% HCl的甲醇 冷浸3小时 纸层析显色 初步认为含无色花色素 Senter et al., 1978 种仁 含0.1% HCl的甲醇 回流提取2小时2次, 合并浓缩后用1 mol·L-1 HCl回流水解2小时, 乙酸乙酯萃取, 甲酯化 GC-MS 8个酚酸 Senter et al., 1980 树枝, 叶 70%乙醇 回流提取, 浓缩后聚酰胺柱反复柱层 H1 -NMR, C13 - NMR 从树枝中分离出4个类黄酮; 从叶中分离出5个类黄酮、 Ishak et al., 1980 叶 水 回流提取, 烘干, 再用乙醇提取, Sephadex LH-20柱反复柱层析分离 H1 -NMR, C13 - NMR 1个酚酸、8个类黄酮和6个单宁 Gad et al., 2007 种仁 70%丙酮 正己烷脱脂, 匀浆, 5°C摇床振摇过夜.分别用6 mol·L-1 HCl和8 mol·L-1 NaOH进行酸和碱水解 HPLC-DAD 4个酚类代谢物 Villarreal-Lozoya et al., 2007 种仁 80%甲醇 正己烷脱脂, 匀浆机提取30秒, 2次, 再用Sephadex LH-20小柱除杂 HPLC-DAD 8个酚酸 Malik et al., 2009 种仁 80%丙酮 正己烷脱脂, 50°C匀浆提取30分钟, HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS 5个酚酸、2个类黄酮、5个鞣花单宁和1个棓单宁 de la Rosa et al., 2011 树皮 70%乙醇 70°C回流提取, 硅胶柱及Sephadex LH-20柱反复柱层析 H1 -NMR, C13 - NMR 6个类黄酮和1个酚酸 Abdallah et al., 2011 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干, Sephadex LH-20柱分段 HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS/MS 27个酚类代谢物, 其中包含2个鞣花单宁、2个棓单宁和2个缩合单宁 Robbins et al., 2014 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) (v/v/v) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干.分别用-1 HCl和2 mol·L-1 NaOH进行酸和碱水解 HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS/MS 水解前13个酚类代谢物, 碱水解后8个, 酸水解后9个 Robbins et al., 2015 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) (v/v/v) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干, Sephadex LH-20柱分段 HPLC-DAD, HPLC-ESI-Q/TOF-MS 38个酚类代谢物, 其中包含15个鞣花单宁、3个棓单宁和13个原花青素 Gong et al., 2017 种仁 80%丙酮 正己烷脱脂, 提取液冷浸过夜, 室温超声提取2小时, 2次, 50°C氮吹仪吹干, 冻干 HPLC-DAD, UPLC-ESI-Q/TOF-MS 35个酚类代谢物, 其中包含18个鞣花单宁、2个棓单宁和2个原花青素 Jia et al., 2017 壳 20%乙醇 80°C超声提取1小时, 减压回收溶剂 HPLC-ESI-MS/MS 29个酚酸苷元, 其中包含12个类黄酮和1个香豆素 Hilbig et al., 2018a
根据分离目的不同, 鉴定方法各有不同.采用1D、2D氢和碳核磁共振法可准确鉴定代谢物的结构, 但要求对代谢物进行分离, 一般纯度需达到95%以上才能准确鉴定.质谱法可以一次性同时鉴定大量代谢物, 根据国际化学分析工作组(Chemical Analysis Working Group, CAWG)代谢组学标准委员会(Metabolomics Standards Initiative, MSI)的规定, 鉴定的代谢物分为4个等级, 即可用标准品准确鉴定、无标准品但分子量和裂解规律与已知代谢物一致、无标准品通过裂解规律等推定为某一类型代谢物及未知代谢物(Sumner et al., 2007 ).定量测定的要求较低时则可采用紫外分光法进行检测. ...Anzaldúa-Morales et al., 1999 )、脂肪酸(Rudolph et al., 1992 )、VE (Yao et al., 1992 )和颜色(Grauke et al., 1998 )等, 而对酚类代谢物与贮藏的关系研究较少.在国外, 薄壳山核桃主要是低温带壳或脱壳贮藏, 远距离运输一般为常温进行.采后随贮存时间的延长, 薄壳山核桃种仁会逐渐氧化、酸败、失水变干、种皮褐变、风味丧失, 其中种皮褐变与酚类物质有关.酚类物质还在防止脂肪酸氧化过程中发挥一定作用.Senter等(1978) 通过紫外分光法测定了斯图尔特和舒莱(Schley)的种仁在32°C、50%的相对湿度下避光贮藏16周过程中总酚及总黄酮含量的变化趋势.结果显示, 2个品种的总酚和总黄酮含量有较大差异, 但变化速率类似, 其中斯图尔特总酚含量更高, 也更耐贮存, 表明总酚含量与耐贮性有关.通过薄层和纸层析初步分析显示薄壳山核桃的种皮中含有无色花色素(leucoanthocyanidin), 并在贮藏过程中逐渐转变为鞣酐(phlobaphene)、矢车菊素(cyanidin)和飞燕草素(delphinidin).Senter等(1980) 发现, 脱壳的斯图尔特种仁在21°C、65%的相对湿度下避光贮藏12周, 酚酸含量呈逐渐下降趋势. ...Morgan and Clayshulte, 2000 ; Rajaram et al., 2001 ).除油脂外, 薄壳山核桃果实中还含有另一类重要的营养物质——酚类(phenolics).酚类是苯环上含有酚羟基的一大类物质的统称.其中, 人们关注较多的活性物质有酚酸(phenolic acids)、类黄酮(flavonoids)、香豆素(coumarins)、木质素(lignans)和单宁(tannins) (Alasalvar and Shahidi, 2009 ).其中, 类黄酮又包含黄酮醇(flavonols)、黄烷-3-醇(flavan-3-ols)和二氢黄酮醇(dihydroflavonols)及其糖苷(李珊珊等, 2014 ).单宁包含水解单宁(hydrolysable tannins)和缩合单宁(condensed tannins)两大类(孙达旺, 1992 ).水解单宁在酸碱条件下不稳定, 易于水解, 根据水解后产生酚酸的不同分为棓单宁(gallotannins)和鞣花单宁(ellagitannins).缩合单宁一般衍生于黄烷类化合物, 又被称为原花青素或原花色素(proanthocyanidins) (石碧和狄莹, 2000 ).酚类为植物次生代谢产物, 在植物中含量虽低但功效显著.人们最早注意到薄壳山核桃中的酚类代谢物是由于发现其可能与采后种皮变色及油脂氧化有关(Senter et al., 1978 , 1980 ; Polles et al., 1981 ).后来, 科学家发现薄壳山核桃具有较强的抗氧化性(Wu et al., 2004 ; Gu et al., 2004 ), 进而发现这种抗氧化性的物质基础是其中所含有的酚类代谢物(Villarreal-Lozoya et al., 2007 ).采用不同的分析手段可测定薄壳山核桃种仁及壳中的总酚、缩合单宁及总黄酮的含量, 检测抗氧化性并对酚类代谢物进行鉴定.随着液相色谱及质谱等现代化分析技术的应用, 薄壳山核桃中的酚类代谢物已逐渐被阐明.目前, 对薄壳山核桃的种质资源(Grauke et al., 2003 )、育苗技术(Zhang et al., 2015 )及栽培措施(Mo et al., 2017 )已有许多研究报道, 但对薄壳山核桃中的酚类代谢物尚未见系统总结.本文综述薄壳山核桃酚类代谢物相关研究进展, 以期为今后的科学研究和产业发展提供参考. ...Senter等(1978) 最早通过薄层层析和纸层析方法初步认为薄壳山核桃的种仁中含有无色花色素(leucoanthocyanidin), 但由于方法的局限性, 仅能判断结构类型, 不能确定代谢物.之后, Senter等(1980) 采用气相色谱法从斯图尔特(Stuart)脱脂种仁的酸水解液中检测到8个酚酸, 分别是没食子酸、龙胆酸、香草酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯乙酸、香豆酸和丁香酸.采用酸或碱水解可使酯键断裂, 得到相应的苷元, 从而简化代谢物结构, 有利于结构分析, 但由于破坏了原本代谢物的结构, 因此仅能明确代谢物苷元.2004年, 有2项抗氧化性评价研究均表明薄壳山核桃含有丰富的酚类代谢物, 抗氧化活性高于许多已知的富含酚类的水果及浆果(Wu et al., 2004 ; Gu et al., 2004 ).这两项研究再次引起了人们对薄壳山核桃抗氧化活性的关注, 科学家们开始寻找这种强抗氧化性的物质基础. ...Table 3 部位 溶剂 提取方法 检测方法 组分 参考文献 种仁 含0.1% HCl的甲醇 冷浸3小时 纸层析显色 初步认为含无色花色素 Senter et al., 1978 种仁 含0.1% HCl的甲醇 回流提取2小时2次, 合并浓缩后用1 mol·L-1 HCl回流水解2小时, 乙酸乙酯萃取, 甲酯化 GC-MS 8个酚酸 Senter et al., 1980 树枝, 叶 70%乙醇 回流提取, 浓缩后聚酰胺柱反复柱层 H1 -NMR, C13 - NMR 从树枝中分离出4个类黄酮; 从叶中分离出5个类黄酮、 Ishak et al., 1980 叶 水 回流提取, 烘干, 再用乙醇提取, Sephadex LH-20柱反复柱层析分离 H1 -NMR, C13 - NMR 1个酚酸、8个类黄酮和6个单宁 Gad et al., 2007 种仁 70%丙酮 正己烷脱脂, 匀浆, 5°C摇床振摇过夜.分别用6 mol·L-1 HCl和8 mol·L-1 NaOH进行酸和碱水解 HPLC-DAD 4个酚类代谢物 Villarreal-Lozoya et al., 2007 种仁 80%甲醇 正己烷脱脂, 匀浆机提取30秒, 2次, 再用Sephadex LH-20小柱除杂 HPLC-DAD 8个酚酸 Malik et al., 2009 种仁 80%丙酮 正己烷脱脂, 50°C匀浆提取30分钟, HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS 5个酚酸、2个类黄酮、5个鞣花单宁和1个棓单宁 de la Rosa et al., 2011 树皮 70%乙醇 70°C回流提取, 硅胶柱及Sephadex LH-20柱反复柱层析 H1 -NMR, C13 - NMR 6个类黄酮和1个酚酸 Abdallah et al., 2011 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干, Sephadex LH-20柱分段 HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS/MS 27个酚类代谢物, 其中包含2个鞣花单宁、2个棓单宁和2个缩合单宁 Robbins et al., 2014 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) (v/v/v) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干.分别用-1 HCl和2 mol·L-1 NaOH进行酸和碱水解 HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS/MS 水解前13个酚类代谢物, 碱水解后8个, 酸水解后9个 Robbins et al., 2015 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) (v/v/v) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干, Sephadex LH-20柱分段 HPLC-DAD, HPLC-ESI-Q/TOF-MS 38个酚类代谢物, 其中包含15个鞣花单宁、3个棓单宁和13个原花青素 Gong et al., 2017 种仁 80%丙酮 正己烷脱脂, 提取液冷浸过夜, 室温超声提取2小时, 2次, 50°C氮吹仪吹干, 冻干 HPLC-DAD, UPLC-ESI-Q/TOF-MS 35个酚类代谢物, 其中包含18个鞣花单宁、2个棓单宁和2个原花青素 Jia et al., 2017 壳 20%乙醇 80°C超声提取1小时, 减压回收溶剂 HPLC-ESI-MS/MS 29个酚酸苷元, 其中包含12个类黄酮和1个香豆素 Hilbig et al., 2018a
根据分离目的不同, 鉴定方法各有不同.采用1D、2D氢和碳核磁共振法可准确鉴定代谢物的结构, 但要求对代谢物进行分离, 一般纯度需达到95%以上才能准确鉴定.质谱法可以一次性同时鉴定大量代谢物, 根据国际化学分析工作组(Chemical Analysis Working Group, CAWG)代谢组学标准委员会(Metabolomics Standards Initiative, MSI)的规定, 鉴定的代谢物分为4个等级, 即可用标准品准确鉴定、无标准品但分子量和裂解规律与已知代谢物一致、无标准品通过裂解规律等推定为某一类型代谢物及未知代谢物(Sumner et al., 2007 ).定量测定的要求较低时则可采用紫外分光法进行检测. ...Senter等(1980) 对脱脂后的斯图尔特种仁进行酸水解, 通过气相色谱法测得没食子酸含量为132.8 µg·g-1 脱脂种仁.Villarreal-Lozoya等(2007) 研究表明, 薄壳山核桃果仁中含量最高的酚酸是鞣花酸, 其次是没食子酸, 二者含量分别为2.5-4.7和0.6-1.3 mg·g-1 脱脂种仁.Malik等(2009) 测定了薄壳山核桃品种德西拉布(Desirable)、威奇塔(Wichita)和切尼(Cheyenne)的单体酚酸含量, 结果显示含量最高的酚酸为儿茶素, 其次为鞣花酸和没食子酸, 三者的含量分别为32.54-90.00、20.96-86.21和15.90-21.31 g·kg-1 .Jia等(2018) 发现薄壳山核桃种仁在果实发育中期富含儿茶素及表儿茶素, 之后其含量随果实发育快速下降.Robbins等(2015) 采用质谱进行定量分析, 发现鞣花酸含量最高, 为132 μg·g-1 丙酮粗提物, 而酸或碱水解后戊烯酸双内酯的含量最高, 分别为262.4和190.2 μg·g-1 丙酮粗提物.戊烯酸双内酯为鞣花酸和没食子酸的缩合物, 说明薄壳山核桃种仁中含有大量鞣花单宁和棓单宁的复合物. ...Anzaldúa-Morales et al., 1999 )、脂肪酸(Rudolph et al., 1992 )、VE (Yao et al., 1992 )和颜色(Grauke et al., 1998 )等, 而对酚类代谢物与贮藏的关系研究较少.在国外, 薄壳山核桃主要是低温带壳或脱壳贮藏, 远距离运输一般为常温进行.采后随贮存时间的延长, 薄壳山核桃种仁会逐渐氧化、酸败、失水变干、种皮褐变、风味丧失, 其中种皮褐变与酚类物质有关.酚类物质还在防止脂肪酸氧化过程中发挥一定作用.Senter等(1978) 通过紫外分光法测定了斯图尔特和舒莱(Schley)的种仁在32°C、50%的相对湿度下避光贮藏16周过程中总酚及总黄酮含量的变化趋势.结果显示, 2个品种的总酚和总黄酮含量有较大差异, 但变化速率类似, 其中斯图尔特总酚含量更高, 也更耐贮存, 表明总酚含量与耐贮性有关.通过薄层和纸层析初步分析显示薄壳山核桃的种皮中含有无色花色素(leucoanthocyanidin), 并在贮藏过程中逐渐转变为鞣酐(phlobaphene)、矢车菊素(cyanidin)和飞燕草素(delphinidin).Senter等(1980) 发现, 脱壳的斯图尔特种仁在21°C、65%的相对湿度下避光贮藏12周, 酚酸含量呈逐渐下降趋势. ...Sumner et al., 2007 ).定量测定的要求较低时则可采用紫外分光法进行检测. ...Morgan and Clayshulte, 2000 ; Rajaram et al., 2001 ).除油脂外, 薄壳山核桃果实中还含有另一类重要的营养物质——酚类(phenolics).酚类是苯环上含有酚羟基的一大类物质的统称.其中, 人们关注较多的活性物质有酚酸(phenolic acids)、类黄酮(flavonoids)、香豆素(coumarins)、木质素(lignans)和单宁(tannins) (Alasalvar and Shahidi, 2009 ).其中, 类黄酮又包含黄酮醇(flavonols)、黄烷-3-醇(flavan-3-ols)和二氢黄酮醇(dihydroflavonols)及其糖苷(李珊珊等, 2014 ).单宁包含水解单宁(hydrolysable tannins)和缩合单宁(condensed tannins)两大类(孙达旺, 1992 ).水解单宁在酸碱条件下不稳定, 易于水解, 根据水解后产生酚酸的不同分为棓单宁(gallotannins)和鞣花单宁(ellagitannins).缩合单宁一般衍生于黄烷类化合物, 又被称为原花青素或原花色素(proanthocyanidins) (石碧和狄莹, 2000 ).酚类为植物次生代谢产物, 在植物中含量虽低但功效显著.人们最早注意到薄壳山核桃中的酚类代谢物是由于发现其可能与采后种皮变色及油脂氧化有关(Senter et al., 1978 , 1980 ; Polles et al., 1981 ).后来, 科学家发现薄壳山核桃具有较强的抗氧化性(Wu et al., 2004 ; Gu et al., 2004 ), 进而发现这种抗氧化性的物质基础是其中所含有的酚类代谢物(Villarreal-Lozoya et al., 2007 ).采用不同的分析手段可测定薄壳山核桃种仁及壳中的总酚、缩合单宁及总黄酮的含量, 检测抗氧化性并对酚类代谢物进行鉴定.随着液相色谱及质谱等现代化分析技术的应用, 薄壳山核桃中的酚类代谢物已逐渐被阐明.目前, 对薄壳山核桃的种质资源(Grauke et al., 2003 )、育苗技术(Zhang et al., 2015 )及栽培措施(Mo et al., 2017 )已有许多研究报道, 但对薄壳山核桃中的酚类代谢物尚未见系统总结.本文综述薄壳山核桃酚类代谢物相关研究进展, 以期为今后的科学研究和产业发展提供参考. ...Villarreal-Lozoya等(2007) 采用液相色谱法从堪萨(Kanza)脱脂种仁的碱水解液中检测到4个酚酸, 分别是没食子酸、儿茶素、表儿茶素和鞣花酸.Malik等(2009) 最早尝试不水解, 直接用液相色谱法分析薄壳山核桃中的酚类代谢物, 从脱脂种仁中检测到8个酚酸, 其中新检测到的有儿茶酚、香豆酸、绿原酸和咖啡酸.de la Rosa等(2011) 采用液相色谱法分别从直接提取液和酸水解液中检测到6个酚类代谢物和8个酚类代谢物苷元.Robbins等(2014) 首次采用液质联用法分析和鉴定薄壳山核桃中的酚类代谢物, 至此从薄壳山核桃中检测到的酚类代谢物数量跃上了一个新的台阶.该研究团队从美国产8个高抗氧化性品种种仁的混样中鉴定出27个酚类代谢物, 其中新鉴定了13个酚酸及其糖苷、2个棓单宁、1个鞣花单宁和2个缩合单宁.Robbins等(2015) 同样采用液质联用法从美国产薄壳山核桃种仁中新鉴定了1个酚酸和1个棓单宁.Gong和Pegg (2017) 采用高效液相色谱联用飞行时间质谱从美国产薄壳山核桃种仁中鉴定出38个酚类代谢物, 其中新鉴定4个单宁.Jia等(2018) 采用超高效液相色谱联用高分辨飞行时间质谱从中国产薄壳山核桃种仁动态混样中鉴定酚类代谢物35个, 其中新鉴定酚酸4个, 鞣花单宁3个. ...Table 3 部位 溶剂 提取方法 检测方法 组分 参考文献 种仁 含0.1% HCl的甲醇 冷浸3小时 纸层析显色 初步认为含无色花色素 Senter et al., 1978 种仁 含0.1% HCl的甲醇 回流提取2小时2次, 合并浓缩后用1 mol·L-1 HCl回流水解2小时, 乙酸乙酯萃取, 甲酯化 GC-MS 8个酚酸 Senter et al., 1980 树枝, 叶 70%乙醇 回流提取, 浓缩后聚酰胺柱反复柱层 H1 -NMR, C13 - NMR 从树枝中分离出4个类黄酮; 从叶中分离出5个类黄酮、 Ishak et al., 1980 叶 水 回流提取, 烘干, 再用乙醇提取, Sephadex LH-20柱反复柱层析分离 H1 -NMR, C13 - NMR 1个酚酸、8个类黄酮和6个单宁 Gad et al., 2007 种仁 70%丙酮 正己烷脱脂, 匀浆, 5°C摇床振摇过夜.分别用6 mol·L-1 HCl和8 mol·L-1 NaOH进行酸和碱水解 HPLC-DAD 4个酚类代谢物 Villarreal-Lozoya et al., 2007 种仁 80%甲醇 正己烷脱脂, 匀浆机提取30秒, 2次, 再用Sephadex LH-20小柱除杂 HPLC-DAD 8个酚酸 Malik et al., 2009 种仁 80%丙酮 正己烷脱脂, 50°C匀浆提取30分钟, HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS 5个酚酸、2个类黄酮、5个鞣花单宁和1个棓单宁 de la Rosa et al., 2011 树皮 70%乙醇 70°C回流提取, 硅胶柱及Sephadex LH-20柱反复柱层析 H1 -NMR, C13 - NMR 6个类黄酮和1个酚酸 Abdallah et al., 2011 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干, Sephadex LH-20柱分段 HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS/MS 27个酚类代谢物, 其中包含2个鞣花单宁、2个棓单宁和2个缩合单宁 Robbins et al., 2014 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) (v/v/v) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干.分别用-1 HCl和2 mol·L-1 NaOH进行酸和碱水解 HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS/MS 水解前13个酚类代谢物, 碱水解后8个, 酸水解后9个 Robbins et al., 2015 种仁 丙酮:水:乙酸(70:29.5:0.5) (v/v/v) 正己烷脱脂, 50°C摇床提取30分钟, 3次, 减压回收有机溶剂, 冻干, Sephadex LH-20柱分段 HPLC-DAD, HPLC-ESI-Q/TOF-MS 38个酚类代谢物, 其中包含15个鞣花单宁、3个棓单宁和13个原花青素 Gong et al., 2017 种仁 80%丙酮 正己烷脱脂, 提取液冷浸过夜, 室温超声提取2小时, 2次, 50°C氮吹仪吹干, 冻干 HPLC-DAD, UPLC-ESI-Q/TOF-MS 35个酚类代谢物, 其中包含18个鞣花单宁、2个棓单宁和2个原花青素 Jia et al., 2017 壳 20%乙醇 80°C超声提取1小时, 减压回收溶剂 HPLC-ESI-MS/MS 29个酚酸苷元, 其中包含12个类黄酮和1个香豆素 Hilbig et al., 2018a
根据分离目的不同, 鉴定方法各有不同.采用1D、2D氢和碳核磁共振法可准确鉴定代谢物的结构, 但要求对代谢物进行分离, 一般纯度需达到95%以上才能准确鉴定.质谱法可以一次性同时鉴定大量代谢物, 根据国际化学分析工作组(Chemical Analysis Working Group, CAWG)代谢组学标准委员会(Metabolomics Standards Initiative, MSI)的规定, 鉴定的代谢物分为4个等级, 即可用标准品准确鉴定、无标准品但分子量和裂解规律与已知代谢物一致、无标准品通过裂解规律等推定为某一类型代谢物及未知代谢物(Sumner et al., 2007 ).定量测定的要求较低时则可采用紫外分光法进行检测. ...Wu等(2004) 对市售薄壳山核桃种仁总酚含量的测定结果为2 016 mg没食子酸等价物·g-1 鲜种仁, 而Kornsteiner等(2006) 测得为1 284 mg没食子酸等价物·g-1 鲜种仁.Villarreal-Lozoya等(2007) 测定美国产6种薄壳山核桃种仁中的总酚含量为62-106 mg绿原酸等价物·g-1 脱脂种仁, 且品种间差异显著.de la Rosa等(2011) 对墨西哥产薄壳山核桃仁的测定结果为11.7-12.5 mg没食子酸等价物·g-1 鲜种仁, 而壳的总酚含量为65.3-92.5 mg没食子酸等价物·g-1 鲜种仁.Robbins等(2015) 用鞣花酸作为标准品, 测得总酚含量为1.82-2.62 g鞣花酸等价物·(100 g)-1 种仁.不同研究对于总酚含量的表征可以为每克鲜种仁、每克干种仁或每克脱脂种仁, 标准品为没食子酸、绿原酸和鞣花酸(罗会婷等, 2017 ).不同的标准品和含量单位给比较带来了一定的困难.据文献报道, 绿原酸等价物与没食子酸等价物的转换因子为0.6 (Chun and Kim, 2004 ), 而脱脂种仁与未脱脂种仁比较时需考虑70%的油脂含量并进行转换(Rudolph et al., 1992 ). ...Polles et al., 1981 ).缩合单宁具有抗氧化和抗诱变的活性, 且受交联度、结构单元和结构单元间化学键类型的影响(Grimmer et al., 1992 ).Gu等(2002) 报道薄壳山核桃中原花青素二聚体间的化学键为B型(C4 -C8 和C4 -C6 ), 之后又测定了薄壳山核桃种仁中缩合单宁的含量为494.1 mg·(100 g)-1 鲜种仁, 同时还测定了不同交联度单宁的含量, 单体、二聚体、三聚体、四到六聚体、七到十聚体和十聚体以上的单宁含量分别为17.2、42.1、26、101、84和223 mg·(100 g)-1 鲜种仁(Gu et al., 2004 ).而Robbins等(2014) 测得薄壳山核桃种仁中单体、二聚体、三聚体和四到六聚体的单宁含量分别为0.3、47.3、21.1和14.8 mg·g-1 单宁部位.Gong和Pegg (2017) 测得薄壳山核桃种仁中二至七聚体的单宁含量分别为31.42、18.34、7.08、5.53、1.62和0.41 mg·g-1 粗提物.尽管各研究所得数值的单位略有不同, 但可看出薄壳山核桃种仁中二聚体及三聚体原花青素的含量最高.原花青素是由2分子或3分子的(表)儿茶素连接在一起形成, 3个及以上连接在一起形成寡聚原花青素(oligomeric proanthocyanidins) (Holton and Cornish, 1995 ).薄壳山核桃种仁含有大量原花青素及寡聚原花青素, 这些原花青素对薄壳山核桃的抗氧化性起主要作用.Villarreal- Lozoya等(2007) 测得美国产薄壳山核桃种仁中的缩合单宁含量为23-47 mg儿茶素等价物·g-1 脱脂种仁.Robbins等(2015) 测得原花青素含量为420-655 mg PD2B等价物·(100 g)-1 种仁.薄壳山核桃中缩合单宁含量通常与总酚含量接近, 说明缩合单宁是薄壳山核桃中最主要的酚类代谢物. ...Senter等(1980) 对脱脂后的斯图尔特种仁进行酸水解, 通过气相色谱法测得没食子酸含量为132.8 µg·g-1 脱脂种仁.Villarreal-Lozoya等(2007) 研究表明, 薄壳山核桃果仁中含量最高的酚酸是鞣花酸, 其次是没食子酸, 二者含量分别为2.5-4.7和0.6-1.3 mg·g-1 脱脂种仁.Malik等(2009) 测定了薄壳山核桃品种德西拉布(Desirable)、威奇塔(Wichita)和切尼(Cheyenne)的单体酚酸含量, 结果显示含量最高的酚酸为儿茶素, 其次为鞣花酸和没食子酸, 三者的含量分别为32.54-90.00、20.96-86.21和15.90-21.31 g·kg-1 .Jia等(2018) 发现薄壳山核桃种仁在果实发育中期富含儿茶素及表儿茶素, 之后其含量随果实发育快速下降.Robbins等(2015) 采用质谱进行定量分析, 发现鞣花酸含量最高, 为132 μg·g-1 丙酮粗提物, 而酸或碱水解后戊烯酸双内酯的含量最高, 分别为262.4和190.2 μg·g-1 丙酮粗提物.戊烯酸双内酯为鞣花酸和没食子酸的缩合物, 说明薄壳山核桃种仁中含有大量鞣花单宁和棓单宁的复合物. ...Table 4 部位 抗氧化性平均值(范围) 参考文献 DPPH -1 ) ABTS -1 ) ORAC -1 ) FRAP 2+ eq∙(100 g)-1 ) 种仁 - - 179.4 - Wu et al., 2004 种仁 - - - 8.33 (6.32-11.05) Blomhoff et al., 2006 种仁 388 (324-540) - 583 (373-817) - Villarreal-Lozoya et al., 2007 种仁 102.6-108.7 75.9-83.4 227-261.5 - de la Rosa et al., 2011 种仁 2110 3360 - - de la Rosa et al., 2014 种仁 - - 135-255 14.0-20.7 Robbins et al., 2015 种仁 548.84 - - - Flores-Córdova et al., 2017 种仁 37.24-461.80 6.74-201.49 - - Jia et al., 2018 壳80%丙酮提取液 537.8-720.3 518.4-644.2 680.3-1350.3 - de la Rosa et al., 2011 壳水提液 1386.28 1333.1 - - Prado et al., 2013 壳80%丙酮提取液 4800 8240 - - de la Rosa et al., 2014 壳水提液 2448.96 1809.01 - - Prado et al., 2014 壳水提液 1268.03 2574.32 - - Hilbig et al., 2018a
DPPH: 2, 2-二苯基-1-三硝基苯肼自由基清除实验; ABTS: 2, 2'-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐自由基清除实验; ORAC: 氧化自由基吸收能力; FRAP: 铁离子还原能力 ...Nelson等(1985) 比较了不同加热方法对薄壳山核桃品质的影响.蒸汽加热导致种皮变色, 而介质加热则不会导致变色.低温贮藏可延缓种皮褐变, 且温度越低保存时间越长.研究表明, 20°C条件下薄壳山核桃仅可保存数月便丧失商品价值(Woodroof and Heaton, 1953 ); 在5°C货架期可延长至半年左右(Bonner and Karrfalt, 2008 ); 而在-15°C则至少可保存2年(Anzaldúa- Morales et al., 1999 ).采后贮藏过程中, 种仁含水量会影响种皮颜色, 采收时薄壳山核桃种仁含水量为25%-30%, 应尽快干燥至4%, 隔绝氧气以抑制酚类氧化, 从而延缓褐变(Kays, 1979 ).Senter和Forbus (1979) 研究表明, 通过涂布乙酰化单甘脂(acetylated monoglyceride)并不能对种皮褐变产生显著抑制作用.Dull和Kays (1988) 用聚偏二氯乙烯(polyvinylidenechloride)涂层玻璃纸真空包装种仁, 在24°C、65%的相对湿度下保存6个月颜色基本不变, 并可有效防止机械损伤, 但口味稍差.Heaton和Shewfelt (1976) 考察了不同含水量、不同透光度软袋中的薄壳山核桃在23°C下贮藏24周其种仁颜色和脂肪酸变化, 结果显示, 光强、含水量和贮藏时间均对颜色和脂肪酸含量有显著影响, 但这3项因素的重要性次于温度. ...Morgan and Clayshulte, 2000 ; Rajaram et al., 2001 ).除油脂外, 薄壳山核桃果实中还含有另一类重要的营养物质——酚类(phenolics).酚类是苯环上含有酚羟基的一大类物质的统称.其中, 人们关注较多的活性物质有酚酸(phenolic acids)、类黄酮(flavonoids)、香豆素(coumarins)、木质素(lignans)和单宁(tannins) (Alasalvar and Shahidi, 2009 ).其中, 类黄酮又包含黄酮醇(flavonols)、黄烷-3-醇(flavan-3-ols)和二氢黄酮醇(dihydroflavonols)及其糖苷(李珊珊等, 2014 ).单宁包含水解单宁(hydrolysable tannins)和缩合单宁(condensed tannins)两大类(孙达旺, 1992 ).水解单宁在酸碱条件下不稳定, 易于水解, 根据水解后产生酚酸的不同分为棓单宁(gallotannins)和鞣花单宁(ellagitannins).缩合单宁一般衍生于黄烷类化合物, 又被称为原花青素或原花色素(proanthocyanidins) (石碧和狄莹, 2000 ).酚类为植物次生代谢产物, 在植物中含量虽低但功效显著.人们最早注意到薄壳山核桃中的酚类代谢物是由于发现其可能与采后种皮变色及油脂氧化有关(Senter et al., 1978 , 1980 ; Polles et al., 1981 ).后来, 科学家发现薄壳山核桃具有较强的抗氧化性(Wu et al., 2004 ; Gu et al., 2004 ), 进而发现这种抗氧化性的物质基础是其中所含有的酚类代谢物(Villarreal-Lozoya et al., 2007 ).采用不同的分析手段可测定薄壳山核桃种仁及壳中的总酚、缩合单宁及总黄酮的含量, 检测抗氧化性并对酚类代谢物进行鉴定.随着液相色谱及质谱等现代化分析技术的应用, 薄壳山核桃中的酚类代谢物已逐渐被阐明.目前, 对薄壳山核桃的种质资源(Grauke et al., 2003 )、育苗技术(Zhang et al., 2015 )及栽培措施(Mo et al., 2017 )已有许多研究报道, 但对薄壳山核桃中的酚类代谢物尚未见系统总结.本文综述薄壳山核桃酚类代谢物相关研究进展, 以期为今后的科学研究和产业发展提供参考. ...Senter等(1978) 最早通过薄层层析和纸层析方法初步认为薄壳山核桃的种仁中含有无色花色素(leucoanthocyanidin), 但由于方法的局限性, 仅能判断结构类型, 不能确定代谢物.之后, Senter等(1980) 采用气相色谱法从斯图尔特(Stuart)脱脂种仁的酸水解液中检测到8个酚酸, 分别是没食子酸、龙胆酸、香草酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯乙酸、香豆酸和丁香酸.采用酸或碱水解可使酯键断裂, 得到相应的苷元, 从而简化代谢物结构, 有利于结构分析, 但由于破坏了原本代谢物的结构, 因此仅能明确代谢物苷元.2004年, 有2项抗氧化性评价研究均表明薄壳山核桃含有丰富的酚类代谢物, 抗氧化活性高于许多已知的富含酚类的水果及浆果(Wu et al., 2004 ; Gu et al., 2004 ).这两项研究再次引起了人们对薄壳山核桃抗氧化活性的关注, 科学家们开始寻找这种强抗氧化性的物质基础. ...Wu等(2004) 对市售薄壳山核桃种仁总酚含量的测定结果为2 016 mg没食子酸等价物·g-1 鲜种仁, 而Kornsteiner等(2006) 测得为1 284 mg没食子酸等价物·g-1 鲜种仁.Villarreal-Lozoya等(2007) 测定美国产6种薄壳山核桃种仁中的总酚含量为62-106 mg绿原酸等价物·g-1 脱脂种仁, 且品种间差异显著.de la Rosa等(2011) 对墨西哥产薄壳山核桃仁的测定结果为11.7-12.5 mg没食子酸等价物·g-1 鲜种仁, 而壳的总酚含量为65.3-92.5 mg没食子酸等价物·g-1 鲜种仁.Robbins等(2015) 用鞣花酸作为标准品, 测得总酚含量为1.82-2.62 g鞣花酸等价物·(100 g)-1 种仁.不同研究对于总酚含量的表征可以为每克鲜种仁、每克干种仁或每克脱脂种仁, 标准品为没食子酸、绿原酸和鞣花酸(罗会婷等, 2017 ).不同的标准品和含量单位给比较带来了一定的困难.据文献报道, 绿原酸等价物与没食子酸等价物的转换因子为0.6 (Chun and Kim, 2004 ), 而脱脂种仁与未脱脂种仁比较时需考虑70%的油脂含量并进行转换(Rudolph et al., 1992 ). ...Wu等(2004) 比较了9种坚果的总黄酮含量, 其中薄壳山核桃的总黄酮含量最高, 为34.01 mg·(100 g)-1 .de la Rosa等(2011) 对墨西哥产薄壳山核桃种仁的总黄酮含量进行测定, 结果为5.8-6.4 mg儿茶素等价物·g-1 鲜种仁.Jia等(2018) 对中国产薄壳山核桃的总酚、缩合单宁和总黄酮含量随果实发育的动态变化进行详细分析, 结果表明总黄酮含量一般低于总酚含量. ...Table 4 部位 抗氧化性平均值(范围) 参考文献 DPPH -1 ) ABTS -1 ) ORAC -1 ) FRAP 2+ eq∙(100 g)-1 ) 种仁 - - 179.4 - Wu et al., 2004 种仁 - - - 8.33 (6.32-11.05) Blomhoff et al., 2006 种仁 388 (324-540) - 583 (373-817) - Villarreal-Lozoya et al., 2007 种仁 102.6-108.7 75.9-83.4 227-261.5 - de la Rosa et al., 2011 种仁 2110 3360 - - de la Rosa et al., 2014 种仁 - - 135-255 14.0-20.7 Robbins et al., 2015 种仁 548.84 - - - Flores-Córdova et al., 2017 种仁 37.24-461.80 6.74-201.49 - - Jia et al., 2018 壳80%丙酮提取液 537.8-720.3 518.4-644.2 680.3-1350.3 - de la Rosa et al., 2011 壳水提液 1386.28 1333.1 - - Prado et al., 2013 壳80%丙酮提取液 4800 8240 - - de la Rosa et al., 2014 壳水提液 2448.96 1809.01 - - Prado et al., 2014 壳水提液 1268.03 2574.32 - - Hilbig et al., 2018a
DPPH: 2, 2-二苯基-1-三硝基苯肼自由基清除实验; ABTS: 2, 2'-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐自由基清除实验; ORAC: 氧化自由基吸收能力; FRAP: 铁离子还原能力 ...Yang等(2009) 测定了9种美国消费者最常食用的干果提取物的抗增殖能力, 发现干果提取物对HepG2 和Caco-2细胞增殖均具有一定的抑制作用, 且活性与剂量呈显著正相关, 其中核桃和薄壳山核桃的活性最强.de la Rosa等(2014) 评价了墨西哥产薄壳山核桃种仁和壳的抗增殖活性, 发现种仁和壳的提取物对HTB4和LLC-PK1细胞增殖均具有抑制作用.Hilbig等(2018b) 报道了薄壳山核桃壳水提液对乳腺癌MCF-7细胞系的细胞毒作用、凋亡诱导的细胞死亡及对细胞周期的阻滞作用.艾氏腹水瘤小鼠存活时间延长了67%, 并认为壳提取物抗肿瘤作用的机制可能与激活凋亡细胞死亡的关键蛋白(Bcl-XL、Bax和p53)以及细胞周期调控(cyclin A、cyclin B和CDK2)有关.这种效果归因于提取物中的酚类代谢物, 如没食子酸、4-羟基苯甲酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸和鞣花酸, 以及儿茶素、表儿茶素和没食子酸表儿茶素.研究表明, 薄壳山核桃壳提取物对肿瘤细胞生长有抑制作用, 可作为肿瘤治疗的替代物. ...Anzaldúa-Morales et al., 1999 )、脂肪酸(Rudolph et al., 1992 )、VE (Yao et al., 1992 )和颜色(Grauke et al., 1998 )等, 而对酚类代谢物与贮藏的关系研究较少.在国外, 薄壳山核桃主要是低温带壳或脱壳贮藏, 远距离运输一般为常温进行.采后随贮存时间的延长, 薄壳山核桃种仁会逐渐氧化、酸败、失水变干、种皮褐变、风味丧失, 其中种皮褐变与酚类物质有关.酚类物质还在防止脂肪酸氧化过程中发挥一定作用.Senter等(1978) 通过紫外分光法测定了斯图尔特和舒莱(Schley)的种仁在32°C、50%的相对湿度下避光贮藏16周过程中总酚及总黄酮含量的变化趋势.结果显示, 2个品种的总酚和总黄酮含量有较大差异, 但变化速率类似, 其中斯图尔特总酚含量更高, 也更耐贮存, 表明总酚含量与耐贮性有关.通过薄层和纸层析初步分析显示薄壳山核桃的种皮中含有无色花色素(leucoanthocyanidin), 并在贮藏过程中逐渐转变为鞣酐(phlobaphene)、矢车菊素(cyanidin)和飞燕草素(delphinidin).Senter等(1980) 发现, 脱壳的斯图尔特种仁在21°C、65%的相对湿度下避光贮藏12周, 酚酸含量呈逐渐下降趋势. ...Morgan and Clayshulte, 2000 ; Rajaram et al., 2001 ).除油脂外, 薄壳山核桃果实中还含有另一类重要的营养物质——酚类(phenolics).酚类是苯环上含有酚羟基的一大类物质的统称.其中, 人们关注较多的活性物质有酚酸(phenolic acids)、类黄酮(flavonoids)、香豆素(coumarins)、木质素(lignans)和单宁(tannins) (Alasalvar and Shahidi, 2009 ).其中, 类黄酮又包含黄酮醇(flavonols)、黄烷-3-醇(flavan-3-ols)和二氢黄酮醇(dihydroflavonols)及其糖苷(李珊珊等, 2014 ).单宁包含水解单宁(hydrolysable tannins)和缩合单宁(condensed tannins)两大类(孙达旺, 1992 ).水解单宁在酸碱条件下不稳定, 易于水解, 根据水解后产生酚酸的不同分为棓单宁(gallotannins)和鞣花单宁(ellagitannins).缩合单宁一般衍生于黄烷类化合物, 又被称为原花青素或原花色素(proanthocyanidins) (石碧和狄莹, 2000 ).酚类为植物次生代谢产物, 在植物中含量虽低但功效显著.人们最早注意到薄壳山核桃中的酚类代谢物是由于发现其可能与采后种皮变色及油脂氧化有关(Senter et al., 1978 , 1980 ; Polles et al., 1981 ).后来, 科学家发现薄壳山核桃具有较强的抗氧化性(Wu et al., 2004 ; Gu et al., 2004 ), 进而发现这种抗氧化性的物质基础是其中所含有的酚类代谢物(Villarreal-Lozoya et al., 2007 ).采用不同的分析手段可测定薄壳山核桃种仁及壳中的总酚、缩合单宁及总黄酮的含量, 检测抗氧化性并对酚类代谢物进行鉴定.随着液相色谱及质谱等现代化分析技术的应用, 薄壳山核桃中的酚类代谢物已逐渐被阐明.目前, 对薄壳山核桃的种质资源(Grauke et al., 2003 )、育苗技术(Zhang et al., 2015 )及栽培措施(Mo et al., 2017 )已有许多研究报道, 但对薄壳山核桃中的酚类代谢物尚未见系统总结.本文综述薄壳山核桃酚类代谢物相关研究进展, 以期为今后的科学研究和产业发展提供参考. ...京ICP备16067583号-21 北京玛格泰克科技发展有限公司 设计开发 
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