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接受日期:2017-11-7接受日期:2018-02-5网络出版日期:2018-11-1
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2018《植物学报》编辑部
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欧洲百合(Lilium martagon)又名头巾百合, 是百合科百合属多年生草本植物, 广泛分布于欧洲, 生于山毛榉森林、木材的边缘及牧场的边界, 生长海拔高达2 300 m。欧洲百合观赏价值高, 具有花色丰富、花瓣斑点及花蕾绒毛数量多变等特点(Feldmaier and McRae, 1982), 对环境适应性强, 在阳光或半阴环境及多种土壤中均可生长(Synge, 1980), 是重要的观赏花卉。目前, 欧洲百合作为园艺植物广泛栽培于欧洲, 而在国内栽培相对较少, 但其应用前景十分广阔。此外, 由于过度采集, 野生欧洲百合在许多地区已变得稀有甚至濒临灭绝(Kedra and Bach, 2005)。因此, 对其进行严格保护、合理开采以及高效繁育至关重要。欧洲百合在自然条件下主要依靠种子繁殖, 周期较长, 而鳞片扦插又难以在短时间内获得大量植株。研究表明, 用百合愈伤组织可达到快速繁殖的目的(李雪艳等, 2016), 胚性愈伤组织又是良好的基因转化受体材料, 其体细胞胚再生系统具有繁殖率大、转化率高、嵌合体少及无性系变异小等优点(翟彦等, 2011)。因此, 建立离体再生体系对欧洲百合种质保存、繁殖和育种均具有重要意义。
高效地诱导愈伤组织是建立植物离体再生体系的关键, 该过程受到植物体基因型、外植体生长发育状况、培养基和培养条件等多种因素的影响(张艺萍等, 2008)。目前, 欧洲百合诱导愈伤组织的研究相对较少。Kedra和Bach (2005)探究了PIC和6-BA对欧洲百合不同外植体愈伤组织诱导及其形态发生的影响, 结果表明, 诱导愈伤组织的最适外植体为鳞片和幼苗鳞茎, 最适培养基为添加PIC和6-BA组合。该研究为进一步筛选更为高效的愈伤组织诱导培养基提供了借鉴。然而, 目前尚未见建立完整的植株再生体系的报道, 即缺少对后续愈伤组织增殖及再生等方面的探索, 并且仅开展了PIC和6-BA单独或组合使用, 并未见进行其它激素种类的比较研究。本研究以欧洲百合鳞片为外植体, 通过讨论不同植物激素组合及光照条件对愈伤组织诱导、增殖和再生不定芽的影响, 进而建立高效再生体系, 为欧洲百合种质资源保存、基因工程育种及在国内推广奠定基础。
1 植物材料供试材料为欧洲百合(Lilium martagon L.)鳞茎, 采集于中国科学院植物研究所北京植物园。
2 培养基成分与培养条件2.1 外植体消毒及无菌苗的获得剥去鳞茎最外层鳞片, 用洗涤剂漂洗10分钟, 流水冲洗2.5小时。放置在超净工作台上, 先用75%乙醇灭菌30秒, 无菌水冲洗2遍, 再用0.2%升汞灭菌10分钟, 无菌水冲洗5遍。将外植体接种于MS+1.0 mg?L-1 6- BA+0.1 mg?L-1 NAA培养基上进行初代诱导, 将诱导的不定芽接种于MS+0.1 mg?L-1 NAA+6%蔗糖培养基上促进鳞茎膨大和生根。以MS为基本培养基, 添加3%蔗糖(仅生根培养中添加6%)和0.7%琼脂, pH值为5.8-5.9。培养室温度为(25±1)°C; 光培养时光照强度为50-60 μmol·m-2·s-1, 每天光照16小时; 暗培养用锡箔纸包裹, 全天黑暗。
2.2 愈伤组织的诱导和优化将上述无菌苗鳞片接种于1-8号培养基(表1), 置于暗培养条件下诱导愈伤组织。以MS作为对照, 筛选最佳激素组合, 并将无菌苗鳞片接种于添加该激素组合的培养基上, 置于光培养条件下进行愈伤组织诱导。每瓶接种6个外植体, 设5次重复。40天后统计愈伤组织诱导率和芽诱导系数。
表 1
Table 1
表 1
表 1 欧洲百合愈伤组织诱导和增殖的培养基设计 Table 1 Media design for callus induction and proliferation of Lilium martagon| No. | Concentrations of plant growth regulator (mg·L-1) | |||
|---|---|---|---|---|
| TDZ | PIC | NAA | 6-BA | |
| CK | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| 1 | 0.20 | 0.01 | 0.00 | 0.00 |
| 2 | 0.60 | 0.01 | 0.00 | 0.00 |
| 3 | 0.20 | 0.10 | 0.00 | 0.00 |
| 4 | 0.60 | 0.10 | 0.00 | 0.00 |
| 5 | 0.20 | 0.00 | 0.50 | 0.00 |
| 6 | 0.60 | 0.00 | 0.50 | 0.00 |
| 7 | 0.20 | 0.00 | 1.00 | 0.00 |
| 8 | 0.60 | 0.00 | 1.00 | 0.00 |
| 9 | 0.00 | 0.00 | 0.10 | 0.10 |
| 10 | 0.00 | 0.00 | 0.10 | 0.50 |
| 11 | 0.00 | 0.00 | 0.10 | 1.00 |
表 1
欧洲百合愈伤组织诱导和增殖的培养基设计
Table 1
Media design for callus induction and proliferation of Lilium martagon
2.3 愈伤组织增殖将生长状态一致的愈伤组织分割成1 cm×1 cm小块, 转接至初代诱导培养基上, 分别置于光培养和暗培养条件下进行增殖培养。将在适宜培养条件下增殖的愈伤组织接种于6-BA和NAA不同浓度组合的培养基上(表1), 于相同的培养条件下进行增殖培养。每瓶接种5个外植体, 设6次重复。2个月后统计愈伤组织增殖指数及芽再生系数。在扫描电镜下观察愈伤组织, 方法参照吴耿等(2011), 并稍作修改。
2.4 再生不定芽将愈伤组织接种于MS培养基, 分别置于光培养和暗培养条件下进行2个月的分化培养。每瓶接种5个外植体, 设6次重复。从培养20天开始, 每隔10天统计不定芽再生率及再生系数。
2.5 生根培养和炼苗移栽将获得的不定芽接种于MS+0.1 mg?L-1 NAA+6%蔗糖培养基上, 置于光培养条件下进行生根培养, 2个月后统计生根率。生根后置于室温条件下, 炼苗3-5天, 然后取出无菌苗, 用自来水洗去基部的培养基残留, 种植于河砂与草碳(1:2, v/v)的混合基质中, 在温室内进行培养, 2个月后统计成活率及长势。
2.6 数据统计分析愈伤组织诱导率=(产生愈伤组织的鳞片外植体数/接种的鳞片外植体总数)×100%;
愈伤组织增殖指数=愈伤组织分割块数/起始接种的愈伤组织块数;
愈伤组织再生率=(产生不定芽的愈伤组织块数/接种的愈伤组织总块数)×100%;
芽诱导系数=产生的不定芽总数/接种的鳞片外植体总数;
芽再生系数=产生的不定芽总数/接种的愈伤组织总块数。
使用Excel和SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。采用邓肯多重比较法进行差异显著性检验。
3 结果与讨论3.1 不同激素组合对愈伤组织诱导的影响将无菌苗鳞片接种于不同激素组合(表1)的培养基上, 暗培养40天后, 对照组在鳞片基部形成不定芽, 在添加激素的培养基中, 鳞片基部和尖端均产生乳白至淡黄色的愈伤组织(图1A-C)和不定芽。
图 1
Figure 1
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图 1
欧洲百合愈伤组织的诱导和增殖
(A), (B) 在暗培养条件下, 添加TDZ和PIC的培养基中诱导的愈伤组织(Bar=5 mm); (C) 在暗培养条件下, 添加TDZ和NAA的培养基中诱导的愈伤组织(Bar=5 mm); (D) 在光培养条件(光周期为16小时光照/8小时黑暗)下, 添加TDZ和NAA的培养基中诱导的愈伤组织(Bar=5 mm); (E), (G) 在光培养条件(光周期为16小时光照/8小时黑暗)下增殖的愈伤组织((E) Bar=5 mm; (G) Bar=100 μm); (F), (H) 在暗培养条件下增殖的愈伤组织((F) Bar=5 mm; (H) Bar=200 μm)
Figure 1
The callus induction and proliferation of Lilium martagon
(A), (B) Callus induction in MS medium containing TDZ and PIC in the dark (Bar=5 mm); (C) Callus induction in MS medium containing TDZ and NAA in the dark (Bar=5 mm); (D) Callus induction in MS medium containing TDZ and NAA under 16/8 h light/dark photoperiod (Bar=5 mm); (E), (G) Callus proliferation under 16/8 h light/dark photoperiod ((E) Bar=5 mm; (G) Bar=100 μm); (F), (H) Callus proliferation in the dark ((F) Bar=5 mm; (H) Bar=200 μm)
在TDZ和PIC不同浓度组合的培养基中, 鳞片再生状况见表2。当PIC浓度为0.1 mg?L-1时, 3号和4号培养基的愈伤组织诱导率分别仅为34.44%和54.45%。PIC浓度为0.01 mg?L-1的1号和2号培养基, 其愈伤组织诱导率显著高于添加0.1 mg?L-1 PIC的培养基, 诱导率分别可达63.34%和66.67%。此外, 当PIC浓度为0.01 mg?L-1时, 在TDZ浓度为0.6 mg?L-1的2号培养基中形成的愈伤量最多, 且芽诱导系数显著低于其它培养基。由此可见, 2号培养基(即MS+0.6 mg?L-1 TDZ+0.01 mg?L-1 PIC)最有利于愈伤组织的诱导。
表 2
Table 2
表 2
表 2 不同激素组合对欧洲百合愈伤组织诱导的影响(暗培养) Table 2 Effects of different plant growth regulators combi- nation on the callus induction of Lilium martagon (in the dark)| No. | Rate of callus induced (%) | Number of buds/explant |
|---|---|---|
| CK | 0.00 Dc | 1.09±0.25 Bc |
| 1 | 63.34±7.46 AB | 1.13±0.33 AB |
| 2 | 66.67±7.86 A | 0.69±0.24 C |
| 3 | 34.44±12.67 C | 1.49±0.29 A |
| 4 | 54.45±8.24 B | 1.16±0.23 AB |
| 5 | 77.14±7.82 a | 1.46±0.28 bc |
| 6 | 48.57±7.82 b | 1.57±0.29 b |
| 7 | 45.72±6.39 b | 1.74±0.26 ab |
| 8 | 68.57±15.65 a | 2.00±0.35 a |
表 2
不同激素组合对欧洲百合愈伤组织诱导的影响(暗培养)
Table 2
Effects of different plant growth regulators combi- nation on the callus induction of Lilium martagon (in the dark)
在TDZ和NAA不同浓度组合的培养基中, 鳞片再生状况见表2。TDZ和NAA浓度同时最低或最高的5号和8号培养基, 其愈伤组织诱导率显著高于其它培养基, 诱导率分别为77.14%和68.57%。其中, 5号培养基形成的愈伤量最多, 芽诱导系数显著低于8号培养基。而其它培养基中愈伤组织诱导率较低, 愈伤量较少, 且芽诱导系数显著高于对照。可见, 5号培养基(即MS+0.2 mg?L-1 TDZ+0.5 mg?L-1 NAA)最有利于愈伤组织的诱导。
以上结果表明, 添加激素的培养基显著提高了愈伤组织的诱导率, 而芽诱导系数的增加不利于愈伤量的积累。另外, 虽然显著性检验结果显示, 2号与5号培养基的愈伤组织诱导率差异不显著, 但由于2号培养基诱导的部分愈伤组织存在畸形现象(图1B), 因此, 本实验诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+0.2 mg?L-1 TDZ+0.5 mg?L-1 NAA。
3.2 光暗培养条件对愈伤组织诱导、增殖和再生不定芽的影响光暗培养条件对不同种类百合离体再生的影响并不一致, 并且在不同的生长发育阶段也会产生不同程度的效应。为获得满足欧洲百合离体再生不同阶段需求的培养条件, 我们对其愈伤组织诱导、增殖和分化阶段分别进行光暗处理。
3.2.1 光暗培养条件对愈伤组织诱导的影响
光培养条件下, MS培养基中的鳞片仅产生不定芽, 而在添加TDZ和NAA不同浓度组合的培养基中, 鳞片诱导产生黄色愈伤组织(图1D)和不定芽; 其中, 5号和8号培养基的愈伤组织诱导率显著高于其它培养基, 分别为32.86%和20.00% (表3)。暗培养条件下, 各处理愈伤组织诱导率均明显高于光培养各处理(表2, 表3)。因此, 暗培养条件更有利于欧洲百合愈伤组织的诱导。
表 3
Table 3
表 3
表 3 不同浓度TDZ和NAA对欧洲百合愈伤组织诱导的影响(光周期为16小时光照/8小时黑暗) Table 3 Effects of TDZ and NAA on the callus induction of Lilium martagon (under 16/8 h light/dark photoperiod)| No. | Rate of callus induced (%) | Number of buds/explant |
|---|---|---|
| CK | 0.00 c | 0.90±0.15 b |
| 5 | 32.86±12.64 a | 1.17±0.37 ab |
| 6 | 16.67±11.78 b | 1.37±0.48 a |
| 7 | 13.34±7.46 bc | 1.00±0.26 ab |
| 8 | 20.00±13.94 ab | 0.46±0.22 c |
表 3
不同浓度TDZ和NAA对欧洲百合愈伤组织诱导的影响(光周期为16小时光照/8小时黑暗)
Table 3
Effects of TDZ and NAA on the callus induction of Lilium martagon (under 16/8 h light/dark photoperiod)
3.2.2 光暗培养条件对愈伤组织增殖的影响
将欧洲百合愈伤组织置于诱导愈伤组织效果较好的原诱导培养基中进行增殖时, 发现愈伤组织极易褐化, 这严重影响愈伤组织的质量及增殖指数。为了获得增殖指数较高、生长良好且稳定性较好的愈伤组织, 我们改变了增殖培养基中激素的种类, 观察并统计了愈伤组织在光暗培养条件和添加不同浓度6-BA与NAA组合的培养基中的增殖状况。结果见图1、表4和表5。
表 4
Table 4
表 4
表 4 光暗培养条件对欧洲百合愈伤组织增殖的影响 Table 4 Effects of light/dark condition on callus proliferation of Lilium martagon| Light/dark condition | Proliferation coefficient |
|---|---|
| Photoperiod | 1.39±0.21 b |
| Dark condition | 1.86±0.30 a |
表 4
光暗培养条件对欧洲百合愈伤组织增殖的影响
Table 4
Effects of light/dark condition on callus proliferation of Lilium martagon
表 5
Table 5
表 5
表 5 不同浓度6-BA和NAA对欧洲百合愈伤组织增殖的影响(暗培养) Table 5 Effects of 6-BA and NAA on callus proliferation of Lilium martagon (in the dark)| No. | Proliferation coefficient | Number of buds/callus |
|---|---|---|
| 9 | 2.24±0.17 b | 2.37±0.39 a |
| 10 | 2.93±0.51 a | 1.65±0.38 b |
| 11 | 1.86±0.30 b | 0.88±0.41 c |
表 5
不同浓度6-BA和NAA对欧洲百合愈伤组织增殖的影响(暗培养)
Table 5
Effects of 6-BA and NAA on callus proliferation of Lilium martagon (in the dark)
将愈伤组织接种于初代诱导培养基(MS+1.0 mg?L-1 6-BA+0.1 mg?L-1 NAA)上, 分别在光培养和暗培养条件下增殖2个月, 发现暗培养对欧洲百合愈伤组织增殖指数的增加(表4)及良好生长状态的维持(图1F)都有显著的促进作用。而在光培养下, 愈伤组织表面极易褐化(图1E)。此外, 光暗培养条件下增殖的愈伤组织其表面细胞状态也存在明显差异。在扫描电镜下观察, 发现光培养下愈伤组织表面细胞排列较为紧密(图1G); 而暗培养下愈伤组织表面细胞排列疏松, 表明细胞分裂较为旺盛(图1H)。上述研究结果表明, 暗培养更有利于欧洲百合愈伤组织的增殖。
为了尽可能维持欧洲百合愈伤组织的稳定性, 我们对暗培养下愈伤组织在不同培养基中的增殖和分化情况进行了研究, 结果如表5所示。随着6-BA浓度的增加, 芽再生系数逐渐降低, 愈伤组织状态越稳定。然而, 当6-BA浓度增至1 mg?L-1时, 虽然芽再生系数最低, 但愈伤组织增殖指数低于6-BA浓度为0.5 mg?L-1时。综合增殖指数和芽再生系数, 10号培养基(MS+0.5 mg?L-1 6-BA+0.1 mg?L-1 NAA)愈伤组织增殖指数最高, 芽再生系数相对较低, 且淡黄色愈伤组织生长状态良好, 可作为欧洲百合愈伤组织增殖的最佳培养基。
3.2.3 光暗培养条件对愈伤组织再生不定芽的影响
将接种于MS培养基中的愈伤组织分别置于光培养和暗培养条件下进行分化培养, 结果显示(表6), 2个月后, 暗培养下不定芽的再生系数显著高于光培养, 为5.43, 而再生率差异不显著。通过对愈伤分化过程的观察统计, 我们发现暗培养下的再生率及不定芽再生系数持续高于光培养, 但其再生率的增加速率低于光培养, 光培养下的再生率在培养50天时即可与暗培养达到同等水平(图2A, B)。
表 6
Table 6
表 6
表 6 光暗培养条件对欧洲百合愈伤组织再生不定芽的影响 Table 6 Effects of light/dark condition on the callus differen- tiation of Lilium martagon| Light/dark condition | Differentiation rate of callus (%) | Number of buds/callus |
|---|---|---|
| Photoperiod | 74.00±13.42 a | 2.86±0.88 b |
| Dark condition | 81.11±10.68 a | 5.43±1.60 a |
表 6
光暗培养条件对欧洲百合愈伤组织再生不定芽的影响
Table 6
Effects of light/dark condition on the callus differen- tiation of Lilium martagon
图 2
Figure 2
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图 2
光暗培养条件下欧洲百合愈伤组织再生不定芽的动态变化
(A) 再生率; (B) 不定芽再生系数
Figure 2
Dynamic change of callus differentiation of Lilium martagon cultured under different light/dark condition
(A) Differentiation rate of callus; (B) Number of buds/callus
此外, 光暗培养条件下不定芽的生长发育状态也存在明显差异。通过对该愈伤组织再生不定芽过程的观察, 发现胚性愈伤组织再生经历类似合子胚的球形、心形、鱼雷形和子叶期阶段, 最后发育为新个体(图3A-E)。暗培养条件下更有利于体胚的发育, 形成的芽生长状况良好。而光培养下, 愈伤组织表面及处于不同发育阶段的体胚极易褐化(图3F), 不利于芽的再生。同时, 光培养和暗培养条件下分化的不定芽均可在光培养下正常生根壮苗, 生根培养初期约15天, 光培养分化的正常不定芽在刚接种时, 其叶片已展开, 且叶片和鳞茎均呈绿色, 之后叶片面积和鳞茎直径进一步增大(图3G-I); 而暗培养分化的不定芽刚接种时鳞茎和叶片均呈白色, 且叶片尚未展开, 因此在这一阶段除鳞茎膨大外, 还伴随鳞茎和叶片的复绿及叶片的展开(图3J-L)。15天后, 2种幼苗鳞茎及叶片在颜色及大小等方面均无显著差异, 且生根状况也较一致(图3M, N)。
图 3
Figure 3
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图 3
欧洲百合体胚发生和生根移栽
(A)-(E) 暗培养条件下体胚的发育过程(Bar=0.5 mm); (F) 光培养条件下愈伤组织的再生(Bar=1 mm); (G)-(I) 光培养条件下分化的不定芽生根培养第1天、第5天和第15天(Bar=2 mm); (J)-(L) 暗培养条件下分化的不定芽生根培养第1天、第5天和第15天(Bar=2 mm); (M) 光培养条件下分化的不定芽生根(Bar=5 mm); (N) 暗培养条件下分化的不定芽生根(Bar=5 mm); (O) 完整植株(Bar=1 cm); (P) 移栽(Bar=2 cm)
Figure 3
Somatic embryogenesis and rooting of Lilium martagon
(A)-(E) Developmental process of somatic embryos generated from callus cultured in the dark (Bar=0.5 mm); (F) Embryo-like structures obtained from callus under 16/8 h light/dark photoperiod (Bar=1 mm); (G)-(I) Day 1, 5 and 15 of rooting buds differentiated under 16/8 h light/dark photoperiod (Bar=2 mm); (J)-(L) Day 1, 5 and 15 of rooting buds differentiated in the dark (Bar=2 mm); (M) Rooting buds differentiated under 16/8 h light/dark photoperiod (Bar=5 mm); (N) Rooting buds differentiated in the dark (Bar=5 mm); (O) Plantlets (Bar=1 cm); (P) Transplantation (Bar=2 cm)
综上所述, 暗培养条件更有利于欧洲百合愈伤组织再生不定芽, 该不定芽生根正常, 且与光培养下分化的不定芽在生根后期无显著差异。
3.3 生根培养和炼苗移栽将愈伤组织在光培养和暗培养条件下分化产生的健壮不定芽经生根壮苗培养(图3O), 生根率均可达100%。待无菌苗底根生长至2 cm, 鳞茎直径大约2 cm时, 经炼苗处理后种植于温室内, 2个月后其成活率达93.33%, 且植株生长健壮, 长势一致(图3P)。
3.4 讨论开展欧洲百合愈伤组织诱导的研究对于建立离体再生体系进而加快其繁育推广具有重要意义。其中, 激素种类和浓度是影响百合属植物组织培养的关键因素(李莺等, 2013)。目前用于百合诱导愈伤组织的激素种类和组合较多, 其作用效果也有所不同(Tang et al., 2010; Qi et al., 2014; 袁素霞等, 2015; 张翔宇等, 2016)。Kedra和Bach (2005)仅比较了6-BA和PIC对欧洲百合愈伤组织诱导及形态发生的影响, 没有对其它种类激素进行探索。人工合成的TDZ作为一种新型的植物生长调节剂, 能够诱导外植体从愈伤组织形成到体细胞胚胎发生的一系列反应(徐晓峰和黄学林, 2003)。近年来, TDZ已被广泛应用于植物形态发生研究, 常与生长素NAA (李晓艳等, 2009; 孙安妮等, 2011)或PIC (孙红梅等, 2015)组合使用。本研究进行愈伤组织诱导时, 在培养基中添加TDZ, 分别与NAA和PIC组合使用, 结果表明, MS+0.2 mg?L-1 TDZ+ 0.5 mg?L-1 NAA为欧洲百合诱导愈伤组织的最佳培养基, 诱导率可达77.14%; 培养基MS+0.6 mg?L-1 TDZ+0.01 mg?L-1 PIC也取得了较好的愈伤组织诱导效果, 诱导率为66.67%。前人研究表明, 在单独使用PIC (Mori et al., 2005; Khosravi et al., 2007)或与TDZ组合(孙红梅等, 2015)诱导愈伤组织时, 以1.0或2.0 mg?L-1 PIC效果最好。但在本研究前期的实验中, 高浓度(1.0和2.0 mg?L-1) PIC使得鳞片外植体受到毒害, 形成的愈伤组织和芽畸形, 而低浓度(0.01和0.1 mg?L-1) PIC对愈伤组织和芽的诱导质量有较大改善, 但仍存在部分畸形现象。本研究结果与前人研究结果不同, 这可能是由于百合种类或组合使用过程中TDZ的浓度差异所致。虽然在所有诱导培养基中均有不定芽产生, 但诱导系数都相对较小, 因此, 本研究结果可为其它欧洲百合变种的愈伤组织诱导提供技术依据。
在获得高效诱导愈伤组织体系的前提下, 对其进行快速增殖及胚性状态的维持成为繁育的关键。已知TDZ既可以在愈伤组织诱导阶段起作用, 也可以在体胚诱导、发育或萌发阶段起作用, 其对植物体胚发生的作用因植物种类而异, 具有促进或抑制作用(陈云凤等, 2006)。对于百合, 诱导体胚时细胞分裂素选用TDZ还是6-BA, 需综合考虑外植体来源、基因型、其它植物激素以及培养条件等因素(Bakhshaie et al., 2010)。本研究中, TDZ和NAA组合最有利于愈伤组织的诱导, 但在继代培养时愈伤组织易褐化, 导致胚性活性下降。而以6-BA与NAA组合的培养基对欧洲百合的胚性愈伤组织增殖效果较好, 筛选得到最适增殖培养基为MS+0.5 mg?L-1 6-BA+0.1 mg?L-1 NAA。
光暗培养条件对愈伤组织增殖有很大的影响。马怡迪(2015)认为巨球百合胚性愈伤组织最佳增殖方式为暗培养。王杰等(2008)发现光培养对麝香百合(L. longiflorum)胚性愈伤组织长势、体积和增殖系数有显著的促进作用。在实验中我们观察到, 欧洲百合愈伤组织在光下增殖时表面极易褐化, 增殖缓慢, 因此, 我们对愈伤组织在光培养和暗培养下的增殖进行了比较, 结果表明该愈伤组织更适宜在暗培养条件下增殖。除此之外, 暗培养条件同样也更适宜欧洲百合愈伤组织的诱导及后续愈伤组织再生不定芽。
本研究以欧洲百合鳞片作为外植体筛选得到胚性愈伤组织高效诱导及增殖的培养基, 确定了愈伤组织诱导、增殖及分化的适宜光暗培养条件, 不定芽生根顺利且移栽成活率高, 移栽苗生长健壮。据此建立的欧洲百合离体再生体系可以为其种质资源保存、基因工程育种及推广应用奠定基础。
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| [1] | URL介绍了TDZ在植物体细胞胚胎发生中的作用及其可能的作用机制的研究进展。 [本文引用: 1] |
| [2] | DOI:10.3321/j.issn:1000-2421.2009.03.022URL为了建立适宜百合遗传转化的受体系统,以铁炮百合品种白天堂无菌 苗的叶片和鳞片为外植体,薄层切割后接种于添加不同植物激素的培养基上,观察其植株再生情况,并对其建立的再生体系的遗传转化前景进行了分析比较.结果表 明,叶片薄层细胞几乎没有再生能力;2,4-D和Piclofram均可诱导横向薄层鳞片细胞直接产生鳞茎芽,最适的培养基是MS+2,4-D 0.002 mg/L,在30 d内就可直接诱导出鳞茎芽,再生率达到100%,平均出芽数为2.38;MS+TDZ 0.4 mg/L+NAA 0.5 mg/L可以诱导横向薄层鳞片细胞产生愈伤.综合考虑,百合鳞片薄层培养以MS+2,4-D 0.002 mg/L诱导的直接再生体系为最佳的再生体系. [本文引用: 1] |
| [3] | DOI:10.3969/j.issn.1000-1700.2016.06.003URL为探讨东方百合新品种TigerWoods的组培快繁技术,以其花器官为外植体获得无菌试管苗,以无菌苗鳞片和叶片为次级外植体诱导不定芽形成,通过扩繁、生根获得完整植株,炼苗后移栽.结果表明：花梗与花丝诱导能力较强,其最适诱导培养基分别为MS＋6-BA2.0mg.L-1＋NAA0.3mg.L-1与MS＋6-BA1.0mg.L-1＋NAA0.3mg.L-1.无菌苗鳞片、叶片直接诱导产生不定芽的最适培养基为MS＋TDZ2.0mg.L-1＋NAA0.1mg-L-1与MS＋TDZ1.0mg.L-1＋NAA0.5mg.L-1,诱导率为100%和93.33%,诱导系数为4.48和2.88;而上述两种外植体间接诱导愈伤组织的最适培养基为MS＋PIC1.0mg.L-1＋TDZ0.5mg.L-1与MS＋PIC1.0mg.L-1＋NAA0.5mg.L-1,愈伤诱导率为93.33%和96.67%,分化系数为4.53和3.63.小鳞茎膨大最适培养基为MS＋蔗糖75g.L-1,生根最佳培养基为MS＋IBA0.5mg.L-1,移栽最佳基质为草炭：蛭石：珍珠岩=1：1：1,成活率达91.11%. [本文引用: 1] |
| [4] | DOI:10.3969/j.issn.1000-2561.2013.08.018URLFloral organs of Lilium‘Manissa’were used as the explants for callus induction and plant regeneration. The results showed that several parts of floral organs, such as filament, style, ovary, petal and anther, had different re-differentiation capabilities, and the callus induction rates of them were descending in the order as before. The filament was the optimum explants for callus induction. The optimum media for callus induction, proliferation, bud re-differentiation and plantlets rooting were MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+0.3 mg/L 2,4-D, MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA, MS+0.6 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA and MS+0.1 mg/L NAA, respectively. The percentage of callus induction was 69.56%, regeneration frequency was 100% and rooting rate was 100%. Finally, the plantlets were transplanted onto the matrix made from peat, vermiculite, perlite, garden soil and sand in proportion as 2 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1, and the survival rate was 92%. [本文引用: 1] |
| [5] | URL百合（Lilium spp.）被誉为“球根花卉之王”，是世界五大鲜切花之一。我国虽是主要的野生百合自然分布中心，但观赏百合商品化栽培起步晚，育种和繁殖相对滞后。目 前，国内百合种球仍依赖从荷兰等国进口，百合种球国产化难题是制约我国百合商品化生产的瓶颈问题。因此，研究百合高效繁育和利用遗传转化等现代育种技术改 良性状，具有重要的实践价值。-近年来发现的浙江省分布的野百合新变种----巨球百合（L.brownii var.giganteum），具有鳞茎特大，鳞片数多，花大而美丽等特点，极具研究和开发价值，也是百合育种的优良材料。-本文以百合属野生百合种质资 源为研究材... |
| [6] | DOI:10.7606/j.issn.1004-1389.2011.8.201100829URLThe objective of this paper was to preserve and propagate the wild resources and to establish a simplest and efficient method for high frequency of somatic embryogenesis and plant regeneration of Lilium leucanthum(Baker). The effects of hormone combination,different places in scales and the condition of light or dark on inducing somatic embryogenesis were studied. The results showed that the appropriate medium of the somatic embryogenesis induced from scales was MS + 0.5 mg/L TDZ + 1.0 mg/L NAA. The induction rate of somatic embryogenesis of scales at base was 90.00% which was the highest in the three parts of explants. The ability of scale parts inducing somatic embryogenesis was lower > middle > upper. The induction rate of somatic embryogenesis under the dark condition was 90.00%,which was higher than the light condition. [本文引用: 1] |
| [7] | URL [本文引用: 2] |
| [8] | URL采用麝香百合假鳞茎诱导出的胚性愈伤组织,从氯化钴、ABA、蔗糖浓度以及光照条件等4个方面对胚性愈伤组织的状态进行调整,并进行了植株再生研究。结果表明:0.05μmol·L-1的氯化钴有利于提高体细胞胚的比例和愈伤组织的颗粒性,0.01和0.02μmol·L-1的氯化钴有利于愈伤组织体积增大和增殖系数提高;随着ABA浓度提高,对胚性愈伤组织的长势、干湿程度、增殖体积和增殖系数的抑制效果逐渐明显,但对胚性愈伤组织比例和颗粒性的抑制效果不显著;光培养条件下,90和60g·L-1蔗糖对麝香百合胚性愈伤组织的比例和颗粒性都有较好的影响,但在暗培养条件下,仅60g·L-1蔗糖的效果较好;光培养和暗培养对胚性愈伤组织的干湿程度和颗粒性都没有显著的影响;1g·L-1活性炭和基本培养基对愈伤组织的再生具有显著影响。综合以上结果,麝香百合胚性愈伤组织的最佳增殖方式为采用光培养,培养基为MS+NAA5.4μmol·L-1+TDZ0.4μmol·L-1+CoCl20.05μmol·L-1+蔗糖60g·L-1,胚性愈伤组织再生植株的适宜培养基为MS+活性炭1g·L-1+蔗糖30g·L-1。 |
| [9] | DOI:10.3724/SP.J.1259.2011.00658URLPlants have several strategies to adapt to different environments. Lonicera confusa is a typical species in karst calcium (Ca)-rich environments; to adapt to the Ca-rich environment, it excretes calcium by leaf stoma. In the present study, the calcium-excretion process of L. confusa was investigated by scanning electron microscopy and energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDX). We compared the different types of Ca crystals by self-assembly of secreted products with point and line-by-line scanning. Ca crystals are formed after Ca salt is excreted by stoma of L. confusa in the karst Ca-rich environment. Ca salt could self-assemble 3 types of crystals, prisms, ball and crystal sand. Crystals have a large amount of Ca, and sulfur (S) and other elements, which are present in certain ratio. The crystal nucleus protein is rich in S element, which is beneficial for biomineralization of Ca-related crystal and others. EDX could be effectively used for microprobe analysis of plant leaves and identifying plant-excreted products. [本文引用: 1] |
| [10] | DOI:10.3969/j.issn.1674-3466.2003.02.014URLTDZ(N-phenyl-N-1,2,3-thidiazol-5-yl-urea) is a substituted phenylurea compound and has emerged as a highly efficacious bioregulant of morphogenesis in the tissue culture of many plant species. Application of TDZ induces a diverse array of cultural responses ranging from induction of callus to formation of somatic embryos.TDZ exhibits the unique property of mimicking both auxin and cytokinin effects on growth and differentiation of cultured explants. The recent app roaches applied to study the morphogenic events initiated by TDZ are clearly beginning to reveal the details of a variety of underlying mechanisms. Various reports indicate that TDZ may act through modulation of the endogenous plant growth substances, or as a result of induced stress. The other possibilities include the modification in cell membranes, energy levels, nutrient uptake, or nutrient assimilation. In this review, several of these possibilities are presented and summarized in light of recently published studies on characterization of TDZ-induce dmorphogenic effects. [本文引用: 1] |
| [11] | URL [本文引用: 1] |
| [12] | URL以切花百合(Lilium)品种'黄天霸 '('Manissa')花器官为外植体诱导体细胞胚胎发生与植株再生.结果表明,不同花器官、不同激素配比对愈伤组织形成均具有显著影响.花丝为最佳外 植体,激素对愈伤组织诱导的影响效应为NAA＞6-BA＞2,4-D,最适培养基为MS+1.0 mg·L-1 NAA+0.2 mg·L-1 6-BA;激素诱导体细胞胚胎发生的影响效应为2,4-D＞KT＞6-BA,最佳培养基配方为MS+1.0 mg·L-1 2,4-D+0.2 mg·L-1 KT+1.0 mg·L-1 6-BA;MS培养基添加IBA可促进体细胞胚萌发成苗,体细胞胚芽成苗的最佳培养基为MS+0.2 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 IBA. [本文引用: 1] |
| [13] | DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2016.09.016URL以淡黄花百合珠芽为试验材料，采用完全试验设计方法，研究不同浓度的6－BA、NAA组合对淡黄花百合珠芽愈伤组织诱导的影响。结果表明：淡黄花百合珠芽诱导愈伤组织的最佳培养基为MS＋0．3 mg／LNAA＋1．0 mg／L 6－BA，其诱导萌发时间为11 d，萌发率为100％，愈伤组织月平均直径增长量3 cm以上。 [本文引用: 1] |
| [14] | DOI:10.3969/j.issn.1001-8581.2008.12.012URL为建立东方百合元帅、提拔、西伯利亚的高频愈伤体系,以幼叶、花 丝、生长点为外植体,进行了不同激素组合的MS固体培养基对胚性愈伤组织诱导及植株再生研究.结果发现,Picloram比2,4-D更有利于胚性愈伤组 织的诱导,幼叶、花丝更能有效诱导出胚性愈伤组织和再生植株,生长点的出愈率较低.幼叶在MS+2 mg/L Picloram培养基,花丝在MS+2 mg/L Picloram+0.1 mg/L ABA培养基,生长点在MS+2 mg/L Picloram+0.03 mg/L TDZ培养基上能高效诱导出愈伤组织,来自幼叶的胚性愈伤组织在MS+1.0 mg/L BA+ 0.1 mg/L KT+0.1 mg/L IBA培养基上能高频再生出芽,来自花丝的胚性愈伤组织在MS+1.5 mg/L BA+0.3 mg/L KT+ 0.2 mg/L IBA培养基上能高频再生出芽.愈伤组织生长呈直线生长趋势. [本文引用: 1] |
| [15] | DOI:10.1007/s11240-010-9726-4URLA somatic embryogenesis (SE) protocol was established for the regeneration of Lilium ledebourii (Baker) Boiss. whole plants using new vegetative bulblet microscales and transverse thin cell layers (tTCLs) of young bulblet roots as the explant sources. Bulblets were induced from bulb scale explants cultured for at least 3 months in the dark on Murashige and Skoog (MS) medium containing 3% sucrose, 0.8% agar, and different concentrations of α-naphthaleneacetic acid (NAA), 6-benzyladenine (BA), and thidiazuron. Embryo-like structures were obtained from tTCL explants of 3-month-old bulblets (excised from bulb scale explants) following culture on solid MS medium containing 3% sucrose and various concentrations of NAA and BA for 302months in the dark. Both the explant source and the type of plant growth regulators affected the differentiation of somatic embryos. The highest percentage (65.55%) of embryogenesis was obtained from bulblet microscale tTCLs cultured on solid MS medium containing 0.5402μM NAA and 0.4402μM BA. Plants with normal shoots and roots were obtained following a 3-month culture of embryos on growth regulator-free MS medium at 2502±021°C under a 16/8-h light/dark photoperiod (light intensity 4002μmol02m 612 02s 611 , cool-white fluorescent light). The plants were successfully acclimatized in the growth chamber. [本文引用: 1] |
| [16] | [本文引用: 1] |
| [17] | [本文引用: 1] |
| [18] | [本文引用: 1] |
| [19] | DOI:10.1079/IVP2005707URLIn researching the application of genetic transformation to lily breeding, callus formation from cultured explants and plant regeneration from induced calluses were examined in 33 Lilium genotypes, 21 species, three Asiatic hybrids, two LA hybrids, two Longiflorum hybrids, three Oriental hybrids, and two Trumpet hybrids. Seed, bulb scale, leaf, or filament explants were placed on a medium containing 4.1 碌M 4-amino-3,5,6-trichloropicolinic acid (picloram; PIC) and cultured in the dark. After 2 mo., callus formation was observed in 30 genotypes, and a formation frequency of more than 50% was obtained in 24 genotypes. Bulb scale and filament explants showed great ability to form calluses, whereas seeds had poor ability. Most of the induced calluses were yellow and had a nodular appearance. When subcultured onto the same fresh medium, twofold or more increases in callus mass were obtained in 1 mo. for 15 genotypes. Callus lines showing sustained growth 1 yr after the initiation of subculture were examined for their ability to produce shoots on a medium without plant growth regulators (PGRs) and a medium containing 22 M 6-benzyladenine (BA). Shoot regeneration was observed in all genotypes examined, and a regeneration frequency of over 80% was obtained in 20 genotypes. Initial explants used for callus induction and callus type (nodular or friable) had no effect on shoot regeneration. Most of the regenerated shoots developed into complete plantlets following their transfer to a PGR-free medium. [本文引用: 1] |
| [20] | [本文引用: 1] |
| [21] | [本文引用: 1] |
| [22] | [本文引用: 1] |
TDZ对植物体细胞胚胎发生的作用
1
2006
... 在获得高效诱导愈伤组织体系的前提下, 对其进行快速增殖及胚性状态的维持成为繁育的关键.已知TDZ既可以在愈伤组织诱导阶段起作用, 也可以在体胚诱导、发育或萌发阶段起作用, 其对植物体胚发生的作用因植物种类而异, 具有促进或抑制作用(
百合鳞片薄层细胞培养高效再生体系的建立
1
2009
... 开展欧洲百合愈伤组织诱导的研究对于建立离体再生体系进而加快其繁育推广具有重要意义.其中, 激素种类和浓度是影响百合属植物组织培养的关键因素(
东方百合Tiger Woods离体快繁技术体系的建立
1
2016
... 欧洲百合(Lilium martagon)又名头巾百合, 是百合科百合属多年生草本植物, 广泛分布于欧洲, 生于山毛榉森林、木材的边缘及牧场的边界, 生长海拔高达2 300 m.欧洲百合观赏价值高, 具有花色丰富、花瓣斑点及花蕾绒毛数量多变等特点(
‘黄天霸’百合花器官愈伤组织诱导及植株再生
1
2013
... 开展欧洲百合愈伤组织诱导的研究对于建立离体再生体系进而加快其繁育推广具有重要意义.其中, 激素种类和浓度是影响百合属植物组织培养的关键因素(
野生百合高效再生体系建立及愈伤组织增殖调控研究
2015
宜昌百合体细胞胚诱导及植株再生
1
2011
... 开展欧洲百合愈伤组织诱导的研究对于建立离体再生体系进而加快其繁育推广具有重要意义.其中, 激素种类和浓度是影响百合属植物组织培养的关键因素(
重瓣东方百合Double surprise离体快繁技术体系的建立
2
2015
... 开展欧洲百合愈伤组织诱导的研究对于建立离体再生体系进而加快其繁育推广具有重要意义.其中, 激素种类和浓度是影响百合属植物组织培养的关键因素(
... )或与TDZ组合(
麝香百合胚性愈伤组织状态的调整与植株再生
2008
岩溶环境下华南忍冬气孔泌钙及其生物矿化
1
2011
... 将生长状态一致的愈伤组织分割成1 cm×1 cm小块, 转接至初代诱导培养基上, 分别置于光培养和暗培养条件下进行增殖培养.将在适宜培养条件下增殖的愈伤组织接种于6-BA和NAA不同浓度组合的培养基上(
TDZ: 一种有效的植物生长调节剂
1
2003
... 开展欧洲百合愈伤组织诱导的研究对于建立离体再生体系进而加快其繁育推广具有重要意义.其中, 激素种类和浓度是影响百合属植物组织培养的关键因素(
百合未授粉子房离体培养胚胎形成及植株再生
1
2015
... 开展欧洲百合愈伤组织诱导的研究对于建立离体再生体系进而加快其繁育推广具有重要意义.其中, 激素种类和浓度是影响百合属植物组织培养的关键因素(
百合体细胞胚胎发生和植株再生
1
2011
... 欧洲百合(Lilium martagon)又名头巾百合, 是百合科百合属多年生草本植物, 广泛分布于欧洲, 生于山毛榉森林、木材的边缘及牧场的边界, 生长海拔高达2 300 m.欧洲百合观赏价值高, 具有花色丰富、花瓣斑点及花蕾绒毛数量多变等特点(
淡黄花百合珠芽诱导脱分化的研究
1
2016
... 开展欧洲百合愈伤组织诱导的研究对于建立离体再生体系进而加快其繁育推广具有重要意义.其中, 激素种类和浓度是影响百合属植物组织培养的关键因素(
东方百合胚性愈伤组织诱导和植株再生研究
1
2008
... 高效地诱导愈伤组织是建立植物离体再生体系的关键, 该过程受到植物体基因型、外植体生长发育状况、培养基和培养条件等多种因素的影响(
1
2010
... 在获得高效诱导愈伤组织体系的前提下, 对其进行快速增殖及胚性状态的维持成为繁育的关键.已知TDZ既可以在愈伤组织诱导阶段起作用, 也可以在体胚诱导、发育或萌发阶段起作用, 其对植物体胚发生的作用因植物种类而异, 具有促进或抑制作用(
1
1982
... 欧洲百合(Lilium martagon)又名头巾百合, 是百合科百合属多年生草本植物, 广泛分布于欧洲, 生于山毛榉森林、木材的边缘及牧场的边界, 生长海拔高达2 300 m.欧洲百合观赏价值高, 具有花色丰富、花瓣斑点及花蕾绒毛数量多变等特点(
1
2005
... 欧洲百合(Lilium martagon)又名头巾百合, 是百合科百合属多年生草本植物, 广泛分布于欧洲, 生于山毛榉森林、木材的边缘及牧场的边界, 生长海拔高达2 300 m.欧洲百合观赏价值高, 具有花色丰富、花瓣斑点及花蕾绒毛数量多变等特点(
1
2007
... 开展欧洲百合愈伤组织诱导的研究对于建立离体再生体系进而加快其繁育推广具有重要意义.其中, 激素种类和浓度是影响百合属植物组织培养的关键因素(
1
2005
... 开展欧洲百合愈伤组织诱导的研究对于建立离体再生体系进而加快其繁育推广具有重要意义.其中, 激素种类和浓度是影响百合属植物组织培养的关键因素(
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2014
... 开展欧洲百合愈伤组织诱导的研究对于建立离体再生体系进而加快其繁育推广具有重要意义.其中, 激素种类和浓度是影响百合属植物组织培养的关键因素(
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1980
... 欧洲百合(Lilium martagon)又名头巾百合, 是百合科百合属多年生草本植物, 广泛分布于欧洲, 生于山毛榉森林、木材的边缘及牧场的边界, 生长海拔高达2 300 m.欧洲百合观赏价值高, 具有花色丰富、花瓣斑点及花蕾绒毛数量多变等特点(
1
2010
... 开展欧洲百合愈伤组织诱导的研究对于建立离体再生体系进而加快其繁育推广具有重要意义.其中, 激素种类和浓度是影响百合属植物组织培养的关键因素(
