吕秀立^1,2,3†, 张群^1†, 陈香波¹, 李圃锦¹, 吴伟⁴, 关媛^5,6,*
1上海市园林科学规划研究院, 上海 200232
²上海城市困难立地绿化工程技术研究中心, 上海 200232
³国家林业种质资源平台上海子平台, 上海 200232
⁴上海植物园, 上海 200232
⁵上海市农业科学研究院林木果树研究所, 上海 201403
⁶上海市农业科学研究院, 上海市设施园艺技术重点实验室, 上海 201403
Lü Xiuli^1,2,3†, Zhang Qun^1†, Chen Xiangbo¹, Li Pujin¹, Wu Wei⁴, Guan Yuan^5,6,*
1Shanghai Academy of Landscape Architecture Science and Planning, Shanghai 200232, China
²Shanghai Engineering Research Center of Landscaping on Challenging Urban Sites, Shanghai 200232, China
³National Forest Genetic Resources Platform-Shanghai Sub-platform, Shanghai 200232, China
⁴Shanghai Botanical Garden, Shanghai 200232, China
⁵Forestry and Fruit Tree Research Institute, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201403, China
⁶Shanghai Key Laboratory of Protected Horticultural Technology, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201403, China
引用本文
吕秀立, 张群, 陈香波, 李圃锦, 吴伟, 关媛. 岩白菜属植物规模化繁殖及遗传稳定性. 植物学报, 2018, 53(5): 643-652

贡献者
* 通讯作者。E-mail: guanyuan@sibs.ac.cn
† 共同第一作者。
基金资助
上海市种业发展项目(沪农科种字(2015)第8号);
接受日期:2017-09-10接受日期:2018-03-13网络出版日期:2018-09-10
-->Copyright
2018《植物学报》编辑部

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Contributors
* Author for correspondence. E-mail: guanyuan@sibs.ac.cn
† These authors contributed equally to this paper
History
Received:Accepted:Online:

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摘要:根据市场需求和野生资源现存状况, 筛选厚叶岩白菜(Bergenia crassifolia)、秦岭岩白菜(B. scopulosa)和岩白菜(B. purpurascens)进行规模化繁殖, 并利用ISSR分子标记对组培苗进行遗传稳定性分析。以顶芽为外植体, 筛选出MS+0.5 mg·L^-1 6-BA+0.01 mg·L^-1 NAA+2.0 mg·L^-1 V_C为最佳增殖培养基, 3种岩白菜属植物增殖系数分别为3.10、2.50和2.10; 在1/2MS+1.0 mg·L^-1 IBA+2.0 mg·L^-1 V_C培养基上, 3种岩白菜属植物生根率分别为85%、80%和75%; 在腐殖土:黄沙:珍珠岩=2:1:1 (v/v/v)的混合基质中, 移栽成活率分别为90%、85%和80%。规模化繁殖厚叶岩白菜20万株, 秦岭岩白菜2万株, 岩白菜1万株, 目前还在持续生产中。ISSR分子标记结果表明, 岩白菜后代遗传变异较大, 秦岭岩白菜后代遗传变异较小, 3个种在继代至第20代时出现了遗传变异; 岩白菜和秦岭岩白菜的平均遗传变异率随继代次数的增加而增加, 厚叶岩白菜的平均遗传变异率随继代次数的增加呈现不规律变化。
关键词: 厚叶岩白菜 ; 秦岭岩白菜 ; 岩白菜 ; 遗传稳定性 ; 规模化繁殖

Abstract: According to commercial use, market demand and survival of wild resources, Bergenia crassifolia, B. scopulosa, B. purpurascens were selected for tissue culture in vitro and standardized propagation. ISSR markers were used to analyze the genetic stability of tissue culture plantlets. The optimal multiplication medium was MS medium supplemented with 0.01 mg·L^-1 NAA, 0.5 mg·L^-1 6-BA, and 2.0 mg·L^-1 Vc with shoot tips used as explants. The multiplication coefficients were 3.10, 2.50 and 2.10 for the three species, respectively. The suitable rooting culture medium was 1/2MS medium with 1.0 mg·L^-1 IBA and 2.0 mg·L^-1 Vc, and the rooting rates for the three Bergenia species were 85%, 80%, and 75%, respectively. The rooted plants were transplanted in a mixed medium of humus, yellow sand, and perlite with volume ratio 2:1:1; the survival rates of transplanted plantlets were 90%, 85% and 80%, respectively. Using this method of rapid propagation, three Bergenia species propagated 200 000, 20 000, and 10 000 plantlets, respectively. ISSR molecular marker detection results showed that genetic variation was greater for regenerated plantlets of B. purpurascens than the mother plant and was lower for regenerated plantlets of B. scopulosa than the mother plant. After 20 generations of regeneration, the plantlets of the 3 Bergenia species showed genetic variation. The average genetic variation rate of B. scopulosa and B. purpurascens increased with increasing subculture times, but the average genetic variation rate of B. crassifolia after the increase in number of generations changed irregularly.

Key words:Bergenia crassifolia ; B. scopulosa ; B. purpurascens ; genetic stability ; mass propagation


岩白菜属(Bergenia)为虎耳草科多年生常绿草本植物, 该属植物共有10余种, 主要生长于东亚、南亚北部和中南亚, 其花叶俱美, 适应性强, 为良好的丛生地被植物(李文春等, 2006)。国内外植物界对该属植物在分类、栽培、生物学特性、化学成分及药理作用等方面有较深入的研究(王碧霞等, 2012)。该属植物是重要的药材, 主要药用成分为岩白菜素和熊果苷, 岩白菜素是治疗呼吸系统疾病的特效药(董成梅等, 2012; 田憬若等, 2014); 熊果苷是人黑色素细胞中酪氨酸酶的抑制剂, 可以减少黑色素的生成(刘锋等, 2004)。随着雾霾天气的频发, 与呼吸系统有关的疾病日益增多, 对岩白菜种苗的需求量每年至少为 2 000万株(吕秀立等, 2017)。由于长期人为过度采挖和对其生境的破坏, 野生岩白菜属植物资源已濒临枯竭, 播种萌发率低, 根茎分株育苗速度慢(杨丽云等, 2010), 实施人工繁殖和栽培已迫在眉睫(赵桂茹等, 2013)。通过对国内岩白菜属植物资源的调查及市场调研, 根据岩白菜素含量、株型、花期、花色及叶色, 综合市场需求及野生资源现存数量(吕秀立等, 2017), 我们筛选引自新疆的厚叶岩白菜(B. crassifolia)、引自陕西的秦岭岩白菜(B. scopulosa)和引自西藏的岩白菜(B. purpurascens)进行离体培养及规模化繁殖。厚叶岩白菜愈伤组织发生途径(刘敏等, 2009; 吕秀立等, 2016)及离体快繁研究(朱军等, 2012)已有报道, 但尚未实现规模化育苗, 未见秦岭岩白菜和岩白菜的离体培养及组培后代遗传稳定性的检测报道。

笔者自2012年开展厚叶岩白菜的规模化生产(吕秀立等, 2013a)以来, 近几年进一步优化各培养阶段并应用于秦岭岩白菜与岩白菜的生产上, 在培养条件、激素及基质等方面趋于一致, 便于在生产实践中统一管理。ISSR是一种显性分子标记, 具有操作简单、快速灵敏、多态性高、所需DNA量少及无需预知研究对象的基因组序列等优点, 同时也具有SSR的稳定性, 已被广泛应用于遗传多样性分析和亲缘关系鉴定等研究(Zietkiewicz et al., 1994; 赵谦等, 2007; 康建坂等, 2010; 刘思泱等, 2010)。本研究应用ISSR分子标记对岩白菜组培苗后代进行遗传稳定性分析, 旨在为繁殖体系的稳定性提供理论依据, 并对保障岩白菜产业的发展具有指导意义。

1 材料与方法1.1 材料选取生长健壮且无病虫害的厚叶岩白菜(Bergenia crassifolia (L.) Fritsch)、秦岭岩白菜(B. scopulosa T P Wang)和岩白菜(B. purpurascens (Hook. f. et Thoms.) Engl.)植株为取样母株, 取母株顶芽和基部分株苗顶芽为外植体。用自来水冲洗干净, 去掉叶片, 将外植体切成直径0.3 cm、高0.3 cm的圆柱状, 茎尖生长点位于中央, 留2片极短的叶柄基部保护生长点, 以减弱消毒液对生长点的伤害。取母株及不同继代次数组培苗的叶片100 mg, 用于DNA提取。

1.2 方法1.2.1 离体培养
先进行外植体消毒, 用72%乙醇溶液浸40秒, 再用0.2% (m·v^-1)氯化汞(加数滴吐温-80)浸15分钟, 无菌水冲洗5次, 接种到初代诱导培养基上。72%乙醇溶液与氯化汞消毒液中都添加L-抗坏血酸(vitamin C, V_C), 浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0、6.0和8.0 mg·L^-1共9种浓度。
初代培养以MS为基础培养基, 6-BA设0.01、0.02、0.05和0.1 mg·L^-1 4个浓度梯度, NAA设0.01、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2和0.5 mg·L^-1 7个浓度梯度。
增殖培养以MS为基础培养基, 6-BA设0.1、0.25、0.5、0.75和1.0 mg·L^-1 5个浓度梯度, 添加0.01 mg·L^-1 NAA。
壮苗培养以MS为基础培养基, 6-BA设0.01、0.02、0.03、0.04和0.05 mg·L^-1 5个浓度梯度, IBA设0.01、0.02、0.05、0.1和0.2 mg·L^-1 5个浓度梯度。
生根培养以1/2MS为基础培养基, NAA和IBA分别设0.1、0.5、1.0和2.0 mg·L^-1 4个浓度梯度。将试管苗基部切除干净, 使切口平整, 保留2-3对叶片。
除特别说明外, 各培养阶段培养周期均为30天, 所有培养基中都添加2.0 mg·L^-1 V_C、3%蔗糖和0.7%琼脂, pH值为5.8, 分装后在高压灭菌锅中121°C保持18分钟, 灭菌备用。试管苗在光照条件下培养, 光照强度为40 μmol·m^-2·s^-1, 每天12小时光照, 温度为(23±2)°C。
1.2.2 DNA提取及ISSR标记分析
采用CTAB法(Allen et al., 2006)提取岩白菜属植物的基因组DNA。改良的CTAB溶液配方为2% CTAB, 100 mmol∙L^-1 Tris-HCl (pH8.0), 20 mmol∙L^-1 EDTA, 1.4 mmol∙L^-1 NaCl, 2% PVP, 1% β-巯基乙醇。具体步骤参照文献(Allen et al., 2006)。提取的DNA加入50 μL包含RNAase的灭菌去离子水(990 μL去离子水加10 μL RNAase)溶液溶解。用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性, 并用紫外分光光度计检测样品DNA的OD值, 以评价DNA的纯度和浓度。样品置于-20°C冰箱中保存备用。
ISSR-PCR反应体系为: 基因组DNA 50 ng, 1 μmol∙L^-1引物, 200 μmol∙L^-1 dNTPs, 2 mmol∙L^-1 MgCl₂, 2 μL Taq buffer, 1U Taq DNA聚合酶。总反应体系为20 μL。PCR反应程序为: 95°C预变性5分钟; 94°C变性1分钟, 退火1分钟, 72°C延伸2分钟, 38个循环; 72°C延伸10分钟。4°C保存扩增产物。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测, 用天能2500全自动凝胶成像系统成像并保存图片。实验中用到的ISSR引物序列参照加拿大British Columbia大学公布的序列(https://web.archive.org/web/2006/002050553/http: //www.michaelsmith.ubc.ca/services/NAPS/Primer_ Sets/Primers.pdf)设计, 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。从100个引物中选取5个扩增条带信号强、重复性好的引物用于PCR扩增。引物序列见表1。
表1
Table 1
表1
表1 ISSR分析所用的引物序列 Table 1 The sequence of ISSR primers

Name of primers	Sequence of primers (5'-3')	Annealing temperature (°C)
UBC815	CTCTCTCTCTCTCTCTG	50.6
UBC845	CTCTCTCTCTCTCTCTRG	51.8
UBC852	TCTCTCTCTCTCTCTCRA	51.6
UBC853	TCTCTCTCTCTCTCTCRT	50.9
UBC854	TCTCTCTCTCTCTCTCRG	53.4

表1
ISSR分析所用的引物序列
Table 1
The sequence of ISSR primers



1.3 数据统计每种处理调查20个组培苗, 重复3次, 统计诱导率、增殖系数、苗增加平均高度、生根率及平均遗传变异率。采用Excel 2007和SPSS 18.0软件对数据进行统计分析。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)以及Duncan法进行多重比较(α=0.05)。
诱导率=出芽外植体数/接种数;
增殖系数=增殖芽数/接种数;
苗增加平均高度=培养后苗平均高度-培养前苗平均高度;
生根率=生根数/接种数;
平均遗传变异率=(5个引物检测到的变异个体总和/取样个数/5)×100%。

2 结果与讨论2.1 离体培养2.1.1 无菌苗的获得
本研究表明, 外植体消毒时, 在消毒液中添加0.5- 5.0 mg·L^-1 V_C有助于获得无菌外植体; 而不添加V_C的消毒液, 外植体在初代培养7天内就褐变死亡; 添加浓度超过5.0 mg·L^-1 V_C的消毒液, 无菌外植体存活率下降甚至死亡。我们最终筛选出2.0 mg·L^-1为添加V_C的最适浓度, 无菌苗获得率可达75%, 与其它处理相比差异显著(表2)。因此在后续各培养阶段的培养基中添加2.0 mg·L^-1 V_C。
表2
Table 2
表2
表2 不同浓度V_C对无菌苗获得的影响 Table 2 Effects of different concentrations of V_C on the ste- rile seedlings

VC (mg·L-1)	Aseptic seedling (individual)	Sterile seedling rate (%)	Browning condition
0.1	0±0 e	0±0 e	Browning
0.2	0±0 e	0±0 e	Browning
0.5	8±2 c	40±10 c	No browning
1.0	13±1 b	65±5 b	No browning
2.0	15±0 a	75±0 a	No browning
4.0	14±1 ab	70±5 ab	No browning
5.0	13±0 b	65±0 b	No browning
6.0	4±0 d	20±0 d	No browning
8.0	0±0 e	0±0 e	Death

The data described as means±SE (n=3). Different lowercase letters behind the data in the same column indicate significant differences at P<0.05.
数据为平均值±标准误(n=3)。同列数字后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。


表2
不同浓度V_C对无菌苗获得的影响
Table 2
Effects of different concentrations of V_C on the ste- rile seedlings


取样时, 外植体有2种, 一是野生母株顶芽, 二是温室里培养一段时间分株苗的顶芽。外植体修切方式和消毒方法完全相同, 无菌苗获得率却不同(表3)。母株顶芽无菌苗获得率仅为13.33%; 而分株苗顶芽无菌苗获得率高达83.33%, 二者差异显著。其原因是温室中空气较干净, 分株苗感染各种外源微生物、细菌、霉菌和灰尘较少, 植株本身比较洁净。
表3
Table 3
表3
表3 不同外植体对无菌苗获得的影响 Table 3 Effects of different explants on the sterile seedlings

Explant	Inoculation No. (individual)	Septic seedling No. (individual)	Sterile seedling rate (%)
Top bud of mother plant	30	4±1 a	13.33±0.03 a
Shoot apical bud of ramet	30	25±2 b	83.33±0.07 b

The data described as means±SE (n=3). Different lowercase letters behind the data in the same column indicate significant differences at P<0.05.
数据为平均值±标准误(n=3)。同列数字后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。


表3
不同外植体对无菌苗获得的影响
Table 3
Effects of different explants on the sterile seedlings


2.1.2 初代培养
无菌外植体接种到初代培养基上, 1个试管接种1个,以避免交叉污染。初期采用黑暗培养可减少褐变。首次接种7天后将外植体转移至新鲜培养基也可减少褐变。待外植体萌发形成绿色芽点, 再转入光培养; 芽点长至2 cm时, 可转入增殖培养基。
初代培养过程中, 当NAA浓度为0.02 mg·L^-1时, 外植体生长发育正常; 当NAA浓度超过0.02 mg·L^-1时, 外植体易形成愈伤组织。我们最终筛选0.02 mg·L^-1为初代培养NAA最适浓度。当6-BA浓度为0.02 mg·L^-1时, 外植体培养30天后, 可以长至2 cm, 但没有出现腋芽分化; 当6-BA浓度超过0.02 mg·L^-1时, 外植体在伸长生长的同时, 出现腋芽分化。为了保证下一步增殖实验的准确性, 我们选择0.02 mg·L^-1为初代培养6-BA最适浓度。综合外植体愈伤与分化情况, 确定MS+0.02 mg·L^-1 6-BA+0.02 mg·L^-1 NAA+2.0 mg·L^-1 V_C为最适初代培养基(表4)。
表4
Table 4
表4
表4 不同激素及不同激素水平对3种岩白菜属植物外植体萌发的影响 Table 4 The effects of different hormone and hormone concentrations on the germination of bud of 3 Bergenia species

Concentration (mg·L-1)		No. of germination (individual)	Germination rate (%)	Other condition
6-BA	NAA
0.01	0.01	5±0 d	25±0 d	No callus, undifferentiated
0.01	0.02	12±1 b	60±5 b	No callus, undifferentiated
0.01	0.04	10±0 c	50±0 c	Callus, undifferentiated
0.01	0.08	10±1 c	50±5 c	Callus, undifferentiated
0.01	0.1	10±0 c	50±0 c	Callus, undifferentiated
0.01	0.2	10±1 c	50±5 c	Callus, undifferentiated
0.01	0.5	10±2 c	50±10 c	Callus, undifferentiated
0.02	0.02	15±1 a	75±5 a	No callus, undifferentiated
0.05	0.02	15±2 a	75±10 a	No callus, undifferentiated
0.1	0.02	15±0 a	75±0 a	No callus, undifferentiated

All medium contain 2.0 mg·L^-1 V_C. The data described as means±SE (n=3). Different lowercase letters behind the data in the same column indicate significant differences at P<0.05.
培养基中添加2.0 mg·L^-1 V_C。数据为平均值±标准误(n=3)。同列数字后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。


表4
不同激素及不同激素水平对3种岩白菜属植物外植体萌发的影响
Table 4
The effects of different hormone and hormone concentrations on the germination of bud of 3 Bergenia species


2.1.3 增殖培养
挑选大小一致、颜色嫩绿的试管苗, 同批次转入增殖培养基中, 筛选适宜的增殖培养基。当培养基中不添加抗褐化剂V_C时, 厚叶岩白菜褐化严重, 增殖率降低; 添加V_C后, 仍有少量褐化, 但已减轻在可控范围内。培养基中不添加抗褐化剂V_C时, 秦岭岩白菜和岩白菜都没有褐化; 添加V_C后, 对试管苗的增殖没有明显影响。当6-BA浓度为0.75 mg·L^-1时, 3个种的试管苗都开始出现玻璃化现象, 导致增殖率降低。考虑生产成本和操作便利, 我们选择MS+0.5 mg·L^-1 6-BA+ 0.01 mg·L^-1 NAA+2.0 mg·L^-1 V_C为最适增殖培养基, 3个种增殖系数分别为3.10、2.50和2.10 (图1A-C), 与其它处理相比, 差异显著(表5)。
图1https://www.chinbullbotany.com/article/2018/1674-3466/1674-3466-53-5-643/img_1.png
Figure 1https://www.chinbullbotany.com/article/2018/1674-3466/1674-3466-53-5-643/img_1.png

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图1
3种岩白菜属植物组培快繁过程
(A)-(C) 厚叶岩白菜(A)、秦岭岩白菜(B)和岩白菜(C)的增殖培养; (D)-(F) 厚叶岩白菜(D)、秦岭岩白菜(E)和岩白菜(F)的生根培养; (G)-(I) 厚叶岩白菜(G)、秦岭岩白菜(H)和岩白菜(I)的植株移栽
Figure 1
Tissue culture and rapid propagation of 3 Bergenia species
(A)-(C) Multiplication culture of B. crassifolia (A), B. scopulosa (B) and B. purpurascens (C); (D)-(F) Rooting culture of B. crassifolia (D), B. scopulosa (E) and B. purpurascens (F); (G)-(I) Transplanting of B. crassifolia (G), B. scopulosa (H) and B. purpurascens (I)


表5
Table 5
表5
表5 不同激素及不同激素水平对3种岩白菜属植物增殖的影响 Table 5 The effects of different hormone and hormone concentrations on shoot multiplication of 3 Bergenia species

Concentration (mg·L-1)				No. of multiplication bud (individual)				Multiplication coefficien				Browning condition
6-BA	NAA	VC		A	B	C		A	B	C		A	B	C
0.1	0.01			24±1 g	29±2 e	23±0 de		1.20±0.03 g	1.45±0.07 e	1.15±0 de		+	-	-
0.1	0.01	2.0		33±2 f	27±1 e	22±2 e		1.65±0.07 f	1.35±0.03 e	1.10±0 e		-	-	-
0.25	0.01			31±1 f	33±2 d	25±1 d		1.55±0.03 f	1.65±0.07 d	1.25±0.03 d		+	-	-
0.25	0.01	2.0		45±2 d	36±1 c	31±2 c		2.25±0.07 d	1.80±0.03 c	1.55±0.07 c		-	-	-
0.5	0.01			48±1 c	51±2 a	41±1 a		2.40±0.03 c	2.55±0.07 a	2.05±0.03 a		+	-	-
0.5	0.01	2.0		62±1 a	50±1 a	42±2 a		3.10±0.03 a	2.50±0.03 a	2.10±0.07 a		-	-	-
0.75	0.01			52±2 b	49±3 a	43±2 a		2.60±0.07 b	2.45±0.1 a	2.15±0.07 a		+	-	-
0.75	0.01	2.0		62±2 a	50±3 a	42±2 a		3.10±0.07 a	2.50±0.1 a	2.10±0.07 a		-	-	-
1.0	0.01			37±2 e	45±4 b	37±2 b		1.85±0.07 e	2.25±0.13 b	1.85±0.07 b		+	-	-
1.0	0.01	2.0		45±2 d	43±3 b	35±2 b		2.25±0.07 d	2.15±0.1 b	1.75±0.07 b		-	-	-

A: B. crassifolia; B: B. scopulosa; C: B. purpurascens. The data described as means±SE (n=3). Different lowercase letters behind the data in the same column indicate significant differences at P<0.05.
A: 厚叶岩白菜; B: 秦岭岩白菜; C: 岩白菜。数据为平均值±标准误(n=3)。同列数字后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。


表5
不同激素及不同激素水平对3种岩白菜属植物增殖的影响
Table 5
The effects of different hormone and hormone concentrations on shoot multiplication of 3 Bergenia species


2.1.4 壮苗培养
岩白菜属植物在增殖培养基上分化出的试管苗大小有差异, 需进行壮苗培养。当6-BA浓度达0.05 mg·L^-1 时, 试管苗出现分化; 当IBA浓度达0.2 mg·L^-1时, 基部有根分化。我们选择MS+0.04 mg·L^-1 6-BA+0.1 mg·L^-1 IBA+2.0 mg·L^-1 V_C为最适壮苗培养基(表6)。培养30天, 试管苗叶片面积增大, 长势整齐一致, 高度增加2.28 cm, 有利于后期的生根培养。
表6
Table 6
表6
表6 不同激素及不同激素水平对3种岩白菜属植物壮苗的影响 Table 6 The effects of different hormone and hormone concentrations on making robust seedling of 3 Bergenia species

Concentration (mg·L-1)		Average height before culture (cm)	Average height after culture (cm)	Adding average height (cm)	Other condition
6-BA	IBA
0.01	0.01	1.1	1.9	0.8±0.1 e	Undifferentiated, no root
0.02	0.01	1.2	2.1	0.98±0 e	Undifferentiated, no root
0.03	0.01	1.1	2.0	0.98±0 e	Undifferentiated, no root
0.04	0.01	1.3	2.5	1.28±0.1 d	Undifferentiated, no root
0.05	0.01	1.2	2.1	0.98±0.1 e	Differentiated, no root
0.04	0.02	1.1	2.6	1.58±0.1 c	Undifferentiated, no root
0.04	0.05	1.2	2.3	1.18±0.1 d	Undifferentiated, no root
0.04	0.1	1.1	3.3	2.28±0.1 b	Undifferentiated, no root
0.04	0.2	1.3	4.1	2.88±0.2 a	Undifferentiated, rootage

All media contain 2.0 mg·L^-1 V_C. The data described as means±SE (n=3). Different lowercase letters behind the data in the same column indicate significant differences at P<0.05.
培养基中添加2.0 mg·L^-1 V_C。数据为平均值±标准误(n=3)。同列数字后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。


表6
不同激素及不同激素水平对3种岩白菜属植物壮苗的影响
Table 6
The effects of different hormone and hormone concentrations on making robust seedling of 3 Bergenia species


2.1.5 生根培养
生根培养时, 在培养基中添加NAA, 试管苗基部极易形成愈伤组织, 不仅阻碍生根也不利于后期移栽。当IBA浓度低于1.0 mg·L^-1时, 生根率随浓度增加而增加; IBA浓度超过1.0 mg·L^-1时, 生根率开始下降, 试管苗基部出现愈伤组织。在生根阶段不添加抗褐化剂V_C, 厚叶岩白菜试管苗仍会逐渐褐化死亡, 秦岭岩白菜和岩白菜试管苗没有出现明显褐化, 生根率也不受影响。我们选择1/2MS+1.0 mg·L^-1 IBA+2.0 mg·L^-1 V_C为最适生根培养基。在此培养基上培养15天, 试管苗基部分化出根原基, 培养30天根可长至2-4 cm, 根系微红, 叶色浓绿舒展, 形成完整的试管苗(图1D-F), 3种岩白菜生根率分别达85%、80%和75% (表7)。
表7
Table 7
表7
表7 不同激素及不同激素浓度对3种岩白菜属植物生根的影响 Table 7 The effects of different hormone and hormone concentrations on rooting of 3 Bergenia species

Concentration (mg·L-1)				No. of roots (individual)				Rooting rate (%)				Callus status
NAA	IBA	VC		A	B	C		A	B	C		A	B	C
0.1		2.0		4±1 f	5±0 d	3±1 e		20±0.05 f	25±0 d	15±0.05 e		A small amount of browning	A small amount of browning	A small amount of browning
0.5		2.0		9±2 d	9±2 c	7±1 d		45±0.1 d	45±0.1 c	35±0.05 d		A small amount of browning	A small amount of browning	A small amount of browning
1.0		2.0		11±2 c	13±2 b	10±1 c		55±0.1 c	65±0.1 b	50±0.05 c		A small amount of browning	A small amount of browning	A small amount of browning
2.0		2.0		12±2 b	11±2 c	12±2 b		55±0.1 c	60±0.1 b	60±0.1 b		Severe browning	Severe browning	Severe browning
	0.1	2.0		7±1 e	7±0 cd	7±1 d		35±0.05 e	35±0 cd	35±0.05 d		No browning	No browning	No browning
	0.5	2.0		17±2 a	18±1 a	16±2 a		85±0.1 a	90±0.05 a	80±0.1 a		No browning	No browning	No browning
	1.0	2.0		17±2 a	16±3 a	15±2 a		85±0.1 a	80±0.15 a	75±0.1 a		No browning	No browning	No browning
	2.0	2.0		16±2 b	17±3 a	15±3 a		80±0.1 b	85±0.15 a	75±0.15 a		A small amount of browning	A small amount of browning	A small amount of browning
	0.5			0±2 g	17±1 a	15±2 a		0±0.1 g	85±0.05 a	75±0.1 a		Browning death	Normal	Normal

A-C see Table 5. The data described as means±SE (n=3). Different lowercase letters behind the data in the same column indicate significant differences at P<0.05.
A-C同表5。数据为平均值±标准误(n=3)。同列数字后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。


表7
不同激素及不同激素浓度对3种岩白菜属植物生根的影响
Table 7
The effects of different hormone and hormone concentrations on rooting of 3 Bergenia species


2.1.6 试管苗移栽
当试管苗根系长至3 cm时, 选健壮的无菌苗, 室内开瓶3天, 取出后洗净琼脂, 移入腐殖土:黄沙:珍珠岩= 2:1:1 (v/v/v)的混合基质中, 温室中驯化45天, 即可移栽大田。于4月或10月移栽, 厚叶岩白菜、秦岭岩白菜和岩白菜移栽成活率分别达90%、85%和80% (图1G-I)。
经过多年的探索, 在3种岩白菜属植物规模化生产中实现了以下技术指标: 自外植体取样培养的第10-50代之间, 月繁殖系数稳定在2.5-3.5之间; 组培苗生根率达75%以上; 移栽成活率达80%以上。截至目前已生产厚叶岩白菜20万株, 秦岭岩白菜2万株, 岩白菜1万株, 还将持续生产, 以供应旺盛的市场需求。

2.2 遗传稳定性分析2.2.1 组培苗外观表现
3种岩白菜属植物组培苗培养至第20代时, 增殖系数稳定, 叶色翠绿, 外观没有明显变化。至第30代, 种苗生长健壮, 颜色深绿, 外观也没有明显变化。至第40代, 增殖系数略有提高, 芽苗成团状, 色泽深绿。至第50代, 种苗生长速度变慢, 植株纤细, 色泽淡绿, 少量种苗顶端聚合在一起, 呈现畸形(图2A, B)。移栽田间后此类顶端聚合的畸形苗生长慢, 节间短, 不易拔高, 宏观统计所占比例为5/10 000, 此类种苗应及早剔除。
图2https://www.chinbullbotany.com/article/2018/1674-3466/1674-3466-53-5-643/img_2.png
Figure 2https://www.chinbullbotany.com/article/2018/1674-3466/1674-3466-53-5-643/img_2.png

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图2
3种岩白菜属植物畸形苗和地栽苗
(A), (B) 顶端畸形的种苗; (C) 移栽成活的半年生组培苗; (D) 两年生组培苗开花; (E) 两年生组培苗, 冬季叶色变红
Figure 2
The phenotype of abnormal seedlings and field grown plants of 3 Bergenia species
(A), (B) The seedlings of abnormal apex; (C) Tissue culture seedlings were transplanted for half a year; (D) Flowering phenotype of two years old tissue culture plants; (E) Phenotypic changes of leaves of two years old tissue culture plants in winter


组培苗移栽半年后植株冠幅可达10 cm, 高度可达8 cm (图2C)。于福建省宁德市海拔450 m山地种植2年后, 平均产量达2.48×10⁴ kg·hm^-2, 田间长势良好, 75%以上植株早春开花(图2D)。当冬季气温降到0°C以下时, 叶色变红, 变色率达90% (图2E); 在密林、树下栽培, 表现出极耐阴等野生种的特性。
2.2.2 遗传稳定性检测
利用5条扩增效果好的引物, 对3种岩白菜母株和不同继代次数组培苗的基因组DNA进行ISSR分析, 5条引物都扩增出了清晰可辨的谱带。3种岩白菜属植物从第20代开始, 都检测到遗传变异(图3A-D)。厚叶岩白菜随继代次数增加, 遗传变异呈现不规律变化, 平均遗传变异率为15%-40%。而秦岭岩白菜和岩白菜遗传变异率与继代次数呈正相关, 变化规律明显。其中秦岭岩白菜继代至第20代, 组培苗平均遗传变异率为2.5%, 第50代达36.67%; 岩白菜继代至第20代, 组培苗平均遗传变异率为57.5%, 至第50代高达70% (图4)。
图3https://www.chinbullbotany.com/article/2018/1674-3466/1674-3466-53-5-643/img_3.png
Figure 3https://www.chinbullbotany.com/article/2018/1674-3466/1674-3466-53-5-643/img_3.png

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图3
ISSR引物UBC854在3种岩白菜属植物中的扩增结果
(A) 厚叶岩白菜扩增结果; (B) 秦岭岩白菜扩增结果; (C) 岩白菜扩增结果; (D) 3种岩白菜第50代组培苗扩增结果。M: DNA标准样品; MP: 母本; 20 G: 第20代; 30 G: 第30代; 40 G: 第40代; 50 G: 第50代; BC: 厚叶岩白菜; BS: 秦岭岩白菜; BP: 岩白菜
Figure 3
The amplification results of UBC854 primers in 3 Bergenia species
(A) The amplification results of UBC854 primers in B. crassi- folia; (B) The amplification results of UBC854 primers in B. scopulosa; (C) The amplification results of UBC854 primers in B. purpurascens; (D) The amplification results of UBC854 primers in 50 generation seedlings of 3 Bergenia species. M: DNA marker; MP: Maternal plant; 20 G: 20 generations; 30 G: 30 generations; 40 G: 40 generations; 50 G: 50 generations; BC: B. crassifolia; BS: B. scopulosa; BP: B. purpurascens


图4https://www.chinbullbotany.com/article/2018/1674-3466/1674-3466-53-5-643/img_4.png
Figure 4https://www.chinbullbotany.com/article/2018/1674-3466/1674-3466-53-5-643/img_4.png

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图4
3种岩白菜属植物平均遗传变异率比较
Figure 4
The comparison of average genetic variation in 3 Bergenia species



2.3 讨论2.3.1 离体培养
岩白菜属植物主要含有三大类物质: 酚类、黄酮类及醌类(袁菊丽和索剑兰, 2011)。这些物质易引起离体培养中植物材料发生褐变。相关****在培养天全岩白菜(B. tianquanensis)时, 发现聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和活性炭(A_C)对天全岩白菜的褐化抑制效果较差, 而赤霉素(GA)对岩白菜的褐化抑制效果较好(彭红卫等, 2011)。本实验采用抗褐化剂V_C, 通过对比不同浓度, 筛选出V_C最佳使用浓度。在外植体消毒阶段, 消毒液中也添加了抗褐化剂, 防止植物材料切割后产生褐变。
培养厚叶岩白菜时, 所有培养基都要添加抗褐化剂V_C。培养秦岭岩白菜和岩白菜时, 只在外植体消毒和初代培养阶段添加V_C, 之后的增殖培养与生根培养阶段可不添加V_C。厚叶岩白菜是该属植物中药用成分含量最高的种类(王继良等, 2006), 其成分比较复杂, 故离体培养时, 厚叶岩白菜褐变更严重。而药用成分含量较低的秦岭岩白菜和岩白菜褐变不严重, 由此推测褐变程度与药用成分含量有一定的相关性。
2.3.2 规模化繁殖
采用以芽繁芽进行组培快繁生产出岩白菜属植物试管苗, 通过这一工艺流程, 使得这一日趋枯竭的物种得以保存和繁殖, 此繁殖方法已获得授权发明专利(吕秀立等, 2013)。岩白菜属植物作为林下经济作物, 除了开发绿地用苗, 也可为提炼岩白菜素厂家提供优良种源。目前岩白菜种苗需求量大, 市场前景好。规模化繁殖的成功, 是后续产业化开发的前提和重要环节, 可望实现经济、社会及生态效益的统一。
2.3.3 遗传稳定性
体细胞无性系变异泛指在植物细胞、组织和器官培养过程中产生的遗传变异, 变异率可达30%-40%, 有时甚至高达100%, 某一具体性状的变异率在0.2%- 3% (丰先红等, 2010)。组织培养过程中影响变异产生的因素包括植物基因型、外植体类型、激素类型及继代次数等, 无性系变异是多因素综合作用的结果(刘福平, 2010)。国内外****利用分子标记技术对多种材料如铁皮石斛(Dendrobium officinale) (刘石泉等, 2005)、木薯(Manihot esculenta) (曾霞和庄南生, 2002)和刺梨(Rosa roxburghii) (文晓鹏和邓秀新, 2003)进行了体细胞无性系变异研究。在组织培养过程中, 如何快速、准确地鉴定经过多代繁殖的组培苗是否发生变异, 对大规模扩繁具有非常重要的意义(Reisch, 1988)。
本研究利用ISSR标记对不同继代次数的岩白菜属植物组培苗进行分析, 结果显示, 3种岩白菜从第20代开始产生变异, 不同种之间的遗传变异程度不同。厚叶岩白菜繁殖后代已有20万株, 取样比例略少, 造成继代次数与遗传变异率没有表现明显的规律变化。秦岭岩白菜和岩白菜组培苗后代分别为2万株和1万株, 取样量可能比较合适, 遗传变异率与继代次数呈正相关, 变化规律明显。根据ISSR分子鉴定结果, 厚叶岩白菜和秦岭岩白菜组培继代数不宜超过20代。而岩白菜遗传变异率过高, 可进一步调整激素种类和浓度及组培代数等, 以获得丰富的变异, 为新品种筛选提供条件。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
文献选项
原文顺序
文献年度倒序
文中引用次数倒序
被引期刊影响因子

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岩白菜素的研究进展
1
2012

... 岩白菜属(Bergenia)为虎耳草科多年生常绿草本植物, 该属植物共有10余种, 主要生长于东亚、南亚北部和中南亚, 其花叶俱美, 适应性强, 为良好的丛生地被植物(李文春等, 2006).国内外植物界对该属植物在分类、栽培、生物学特性、化学成分及药理作用等方面有较深入的研究(王碧霞等, 2012).该属植物是重要的药材, 主要药用成分为岩白菜素和熊果苷, 岩白菜素是治疗呼吸系统疾病的特效药(董成梅等, 2012; 田憬若等, 2014); 熊果苷是人黑色素细胞中酪氨酸酶的抑制剂, 可以减少黑色素的生成(刘锋等, 2004).随着雾霾天气的频发, 与呼吸系统有关的疾病日益增多, 对岩白菜种苗的需求量每年至少为 2 000万株(吕秀立等, 2017).由于长期人为过度采挖和对其生境的破坏, 野生岩白菜属植物资源已濒临枯竭, 播种萌发率低, 根茎分株育苗速度慢(杨丽云等, 2010), 实施人工繁殖和栽培已迫在眉睫(赵桂茹等, 2013).通过对国内岩白菜属植物资源的调查及市场调研, 根据岩白菜素含量、株型、花期、花色及叶色, 综合市场需求及野生资源现存数量(吕秀立等, 2017), 我们筛选引自新疆的厚叶岩白菜(B. crassifolia)、引自陕西的秦岭岩白菜(B. scopulosa)和引自西藏的岩白菜(B. purpurascens)进行离体培养及规模化繁殖.厚叶岩白菜愈伤组织发生途径(刘敏等, 2009; 吕秀立等, 2016)及离体快繁研究(朱军等, 2012)已有报道, 但尚未实现规模化育苗, 未见秦岭岩白菜和岩白菜的离体培养及组培后代遗传稳定性的检测报道. ...

植物组织培养中体细胞无性系变异研究
1
2010

... 体细胞无性系变异泛指在植物细胞、组织和器官培养过程中产生的遗传变异, 变异率可达30%-40%, 有时甚至高达100%, 某一具体性状的变异率在0.2%- 3% (丰先红等, 2010).组织培养过程中影响变异产生的因素包括植物基因型、外植体类型、激素类型及继代次数等, 无性系变异是多因素综合作用的结果(刘福平, 2010).国内外****利用分子标记技术对多种材料如铁皮石斛(Dendrobium officinale) (刘石泉等, 2005)、木薯(Manihot esculenta) (曾霞和庄南生, 2002)和刺梨(Rosa roxburghii) (文晓鹏和邓秀新, 2003)进行了体细胞无性系变异研究.在组织培养过程中, 如何快速、准确地鉴定经过多代繁殖的组培苗是否发生变异, 对大规模扩繁具有非常重要的意义(Reisch, 1988). ...

应用ISSR技术分析苦瓜种质资源的多态性
1
2010

... 笔者自2012年开展厚叶岩白菜的规模化生产(吕秀立等, 2013a)以来, 近几年进一步优化各培养阶段并应用于秦岭岩白菜与岩白菜的生产上, 在培养条件、激素及基质等方面趋于一致, 便于在生产实践中统一管理.ISSR是一种显性分子标记, 具有操作简单、快速灵敏、多态性高、所需DNA量少及无需预知研究对象的基因组序列等优点, 同时也具有SSR的稳定性, 已被广泛应用于遗传多样性分析和亲缘关系鉴定等研究(Zietkiewicz et al., 1994; 赵谦等, 2007; 康建坂等, 2010; 刘思泱等, 2010).本研究应用ISSR分子标记对岩白菜组培苗后代进行遗传稳定性分析, 旨在为繁殖体系的稳定性提供理论依据, 并对保障岩白菜产业的发展具有指导意义. ...

岩白菜研究现状与展望
1
2006

... 岩白菜属(Bergenia)为虎耳草科多年生常绿草本植物, 该属植物共有10余种, 主要生长于东亚、南亚北部和中南亚, 其花叶俱美, 适应性强, 为良好的丛生地被植物(李文春等, 2006).国内外植物界对该属植物在分类、栽培、生物学特性、化学成分及药理作用等方面有较深入的研究(王碧霞等, 2012).该属植物是重要的药材, 主要药用成分为岩白菜素和熊果苷, 岩白菜素是治疗呼吸系统疾病的特效药(董成梅等, 2012; 田憬若等, 2014); 熊果苷是人黑色素细胞中酪氨酸酶的抑制剂, 可以减少黑色素的生成(刘锋等, 2004).随着雾霾天气的频发, 与呼吸系统有关的疾病日益增多, 对岩白菜种苗的需求量每年至少为 2 000万株(吕秀立等, 2017).由于长期人为过度采挖和对其生境的破坏, 野生岩白菜属植物资源已濒临枯竭, 播种萌发率低, 根茎分株育苗速度慢(杨丽云等, 2010), 实施人工繁殖和栽培已迫在眉睫(赵桂茹等, 2013).通过对国内岩白菜属植物资源的调查及市场调研, 根据岩白菜素含量、株型、花期、花色及叶色, 综合市场需求及野生资源现存数量(吕秀立等, 2017), 我们筛选引自新疆的厚叶岩白菜(B. crassifolia)、引自陕西的秦岭岩白菜(B. scopulosa)和引自西藏的岩白菜(B. purpurascens)进行离体培养及规模化繁殖.厚叶岩白菜愈伤组织发生途径(刘敏等, 2009; 吕秀立等, 2016)及离体快繁研究(朱军等, 2012)已有报道, 但尚未实现规模化育苗, 未见秦岭岩白菜和岩白菜的离体培养及组培后代遗传稳定性的检测报道. ...

熊果苷合成研究进展
1
2004

... 岩白菜属(Bergenia)为虎耳草科多年生常绿草本植物, 该属植物共有10余种, 主要生长于东亚、南亚北部和中南亚, 其花叶俱美, 适应性强, 为良好的丛生地被植物(李文春等, 2006).国内外植物界对该属植物在分类、栽培、生物学特性、化学成分及药理作用等方面有较深入的研究(王碧霞等, 2012).该属植物是重要的药材, 主要药用成分为岩白菜素和熊果苷, 岩白菜素是治疗呼吸系统疾病的特效药(董成梅等, 2012; 田憬若等, 2014); 熊果苷是人黑色素细胞中酪氨酸酶的抑制剂, 可以减少黑色素的生成(刘锋等, 2004).随着雾霾天气的频发, 与呼吸系统有关的疾病日益增多, 对岩白菜种苗的需求量每年至少为 2 000万株(吕秀立等, 2017).由于长期人为过度采挖和对其生境的破坏, 野生岩白菜属植物资源已濒临枯竭, 播种萌发率低, 根茎分株育苗速度慢(杨丽云等, 2010), 实施人工繁殖和栽培已迫在眉睫(赵桂茹等, 2013).通过对国内岩白菜属植物资源的调查及市场调研, 根据岩白菜素含量、株型、花期、花色及叶色, 综合市场需求及野生资源现存数量(吕秀立等, 2017), 我们筛选引自新疆的厚叶岩白菜(B. crassifolia)、引自陕西的秦岭岩白菜(B. scopulosa)和引自西藏的岩白菜(B. purpurascens)进行离体培养及规模化繁殖.厚叶岩白菜愈伤组织发生途径(刘敏等, 2009; 吕秀立等, 2016)及离体快繁研究(朱军等, 2012)已有报道, 但尚未实现规模化育苗, 未见秦岭岩白菜和岩白菜的离体培养及组培后代遗传稳定性的检测报道. ...

植物体细胞无性系变异的遗传基础及主要影响因素
1
2010

... 体细胞无性系变异泛指在植物细胞、组织和器官培养过程中产生的遗传变异, 变异率可达30%-40%, 有时甚至高达100%, 某一具体性状的变异率在0.2%- 3% (丰先红等, 2010).组织培养过程中影响变异产生的因素包括植物基因型、外植体类型、激素类型及继代次数等, 无性系变异是多因素综合作用的结果(刘福平, 2010).国内外****利用分子标记技术对多种材料如铁皮石斛(Dendrobium officinale) (刘石泉等, 2005)、木薯(Manihot esculenta) (曾霞和庄南生, 2002)和刺梨(Rosa roxburghii) (文晓鹏和邓秀新, 2003)进行了体细胞无性系变异研究.在组织培养过程中, 如何快速、准确地鉴定经过多代繁殖的组培苗是否发生变异, 对大规模扩繁具有非常重要的意义(Reisch, 1988). ...

野生花卉厚叶岩白菜组织培养及再生体系的建立
1
2009

... 岩白菜属(Bergenia)为虎耳草科多年生常绿草本植物, 该属植物共有10余种, 主要生长于东亚、南亚北部和中南亚, 其花叶俱美, 适应性强, 为良好的丛生地被植物(李文春等, 2006).国内外植物界对该属植物在分类、栽培、生物学特性、化学成分及药理作用等方面有较深入的研究(王碧霞等, 2012).该属植物是重要的药材, 主要药用成分为岩白菜素和熊果苷, 岩白菜素是治疗呼吸系统疾病的特效药(董成梅等, 2012; 田憬若等, 2014); 熊果苷是人黑色素细胞中酪氨酸酶的抑制剂, 可以减少黑色素的生成(刘锋等, 2004).随着雾霾天气的频发, 与呼吸系统有关的疾病日益增多, 对岩白菜种苗的需求量每年至少为 2 000万株(吕秀立等, 2017).由于长期人为过度采挖和对其生境的破坏, 野生岩白菜属植物资源已濒临枯竭, 播种萌发率低, 根茎分株育苗速度慢(杨丽云等, 2010), 实施人工繁殖和栽培已迫在眉睫(赵桂茹等, 2013).通过对国内岩白菜属植物资源的调查及市场调研, 根据岩白菜素含量、株型、花期、花色及叶色, 综合市场需求及野生资源现存数量(吕秀立等, 2017), 我们筛选引自新疆的厚叶岩白菜(B. crassifolia)、引自陕西的秦岭岩白菜(B. scopulosa)和引自西藏的岩白菜(B. purpurascens)进行离体培养及规模化繁殖.厚叶岩白菜愈伤组织发生途径(刘敏等, 2009; 吕秀立等, 2016)及离体快繁研究(朱军等, 2012)已有报道, 但尚未实现规模化育苗, 未见秦岭岩白菜和岩白菜的离体培养及组培后代遗传稳定性的检测报道. ...

铁皮石斛不同繁殖代数遗传稳定性RAPD的研究
1
2005

... 体细胞无性系变异泛指在植物细胞、组织和器官培养过程中产生的遗传变异, 变异率可达30%-40%, 有时甚至高达100%, 某一具体性状的变异率在0.2%- 3% (丰先红等, 2010).组织培养过程中影响变异产生的因素包括植物基因型、外植体类型、激素类型及继代次数等, 无性系变异是多因素综合作用的结果(刘福平, 2010).国内外****利用分子标记技术对多种材料如铁皮石斛(Dendrobium officinale) (刘石泉等, 2005)、木薯(Manihot esculenta) (曾霞和庄南生, 2002)和刺梨(Rosa roxburghii) (文晓鹏和邓秀新, 2003)进行了体细胞无性系变异研究.在组织培养过程中, 如何快速、准确地鉴定经过多代繁殖的组培苗是否发生变异, 对大规模扩繁具有非常重要的意义(Reisch, 1988). ...

6个彩色马铃薯品种的ISSR分析
1
2010

... 笔者自2012年开展厚叶岩白菜的规模化生产(吕秀立等, 2013a)以来, 近几年进一步优化各培养阶段并应用于秦岭岩白菜与岩白菜的生产上, 在培养条件、激素及基质等方面趋于一致, 便于在生产实践中统一管理.ISSR是一种显性分子标记, 具有操作简单、快速灵敏、多态性高、所需DNA量少及无需预知研究对象的基因组序列等优点, 同时也具有SSR的稳定性, 已被广泛应用于遗传多样性分析和亲缘关系鉴定等研究(Zietkiewicz et al., 1994; 赵谦等, 2007; 康建坂等, 2010; 刘思泱等, 2010).本研究应用ISSR分子标记对岩白菜组培苗后代进行遗传稳定性分析, 旨在为繁殖体系的稳定性提供理论依据, 并对保障岩白菜产业的发展具有指导意义. ...

厚叶岩白菜叶片离体培养研究
1
2016

... 岩白菜属(Bergenia)为虎耳草科多年生常绿草本植物, 该属植物共有10余种, 主要生长于东亚、南亚北部和中南亚, 其花叶俱美, 适应性强, 为良好的丛生地被植物(李文春等, 2006).国内外植物界对该属植物在分类、栽培、生物学特性、化学成分及药理作用等方面有较深入的研究(王碧霞等, 2012).该属植物是重要的药材, 主要药用成分为岩白菜素和熊果苷, 岩白菜素是治疗呼吸系统疾病的特效药(董成梅等, 2012; 田憬若等, 2014); 熊果苷是人黑色素细胞中酪氨酸酶的抑制剂, 可以减少黑色素的生成(刘锋等, 2004).随着雾霾天气的频发, 与呼吸系统有关的疾病日益增多, 对岩白菜种苗的需求量每年至少为 2 000万株(吕秀立等, 2017).由于长期人为过度采挖和对其生境的破坏, 野生岩白菜属植物资源已濒临枯竭, 播种萌发率低, 根茎分株育苗速度慢(杨丽云等, 2010), 实施人工繁殖和栽培已迫在眉睫(赵桂茹等, 2013).通过对国内岩白菜属植物资源的调查及市场调研, 根据岩白菜素含量、株型、花期、花色及叶色, 综合市场需求及野生资源现存数量(吕秀立等, 2017), 我们筛选引自新疆的厚叶岩白菜(B. crassifolia)、引自陕西的秦岭岩白菜(B. scopulosa)和引自西藏的岩白菜(B. purpurascens)进行离体培养及规模化繁殖.厚叶岩白菜愈伤组织发生途径(刘敏等, 2009; 吕秀立等, 2016)及离体快繁研究(朱军等, 2012)已有报道, 但尚未实现规模化育苗, 未见秦岭岩白菜和岩白菜的离体培养及组培后代遗传稳定性的检测报道. ...

厚叶岩白菜组织培养技术
2
2013

... 笔者自2012年开展厚叶岩白菜的规模化生产(吕秀立等, 2013a)以来, 近几年进一步优化各培养阶段并应用于秦岭岩白菜与岩白菜的生产上, 在培养条件、激素及基质等方面趋于一致, 便于在生产实践中统一管理.ISSR是一种显性分子标记, 具有操作简单、快速灵敏、多态性高、所需DNA量少及无需预知研究对象的基因组序列等优点, 同时也具有SSR的稳定性, 已被广泛应用于遗传多样性分析和亲缘关系鉴定等研究(Zietkiewicz et al., 1994; 赵谦等, 2007; 康建坂等, 2010; 刘思泱等, 2010).本研究应用ISSR分子标记对岩白菜组培苗后代进行遗传稳定性分析, 旨在为繁殖体系的稳定性提供理论依据, 并对保障岩白菜产业的发展具有指导意义. ...
... 采用以芽繁芽进行组培快繁生产出岩白菜属植物试管苗, 通过这一工艺流程, 使得这一日趋枯竭的物种得以保存和繁殖, 此繁殖方法已获得授权发明专利(吕秀立等, 2013).岩白菜属植物作为林下经济作物, 除了开发绿地用苗, 也可为提炼岩白菜素厂家提供优良种源.目前岩白菜种苗需求量大, 市场前景好.规模化繁殖的成功, 是后续产业化开发的前提和重要环节, 可望实现经济、社会及生态效益的统一. ...

厚叶岩白菜离体培养和快速繁殖的方法
0
2013

岩白菜属植物需求状况及发展趋势分析
2
2017

... 岩白菜属(Bergenia)为虎耳草科多年生常绿草本植物, 该属植物共有10余种, 主要生长于东亚、南亚北部和中南亚, 其花叶俱美, 适应性强, 为良好的丛生地被植物(李文春等, 2006).国内外植物界对该属植物在分类、栽培、生物学特性、化学成分及药理作用等方面有较深入的研究(王碧霞等, 2012).该属植物是重要的药材, 主要药用成分为岩白菜素和熊果苷, 岩白菜素是治疗呼吸系统疾病的特效药(董成梅等, 2012; 田憬若等, 2014); 熊果苷是人黑色素细胞中酪氨酸酶的抑制剂, 可以减少黑色素的生成(刘锋等, 2004).随着雾霾天气的频发, 与呼吸系统有关的疾病日益增多, 对岩白菜种苗的需求量每年至少为 2 000万株(吕秀立等, 2017).由于长期人为过度采挖和对其生境的破坏, 野生岩白菜属植物资源已濒临枯竭, 播种萌发率低, 根茎分株育苗速度慢(杨丽云等, 2010), 实施人工繁殖和栽培已迫在眉睫(赵桂茹等, 2013).通过对国内岩白菜属植物资源的调查及市场调研, 根据岩白菜素含量、株型、花期、花色及叶色, 综合市场需求及野生资源现存数量(吕秀立等, 2017), 我们筛选引自新疆的厚叶岩白菜(B. crassifolia)、引自陕西的秦岭岩白菜(B. scopulosa)和引自西藏的岩白菜(B. purpurascens)进行离体培养及规模化繁殖.厚叶岩白菜愈伤组织发生途径(刘敏等, 2009; 吕秀立等, 2016)及离体快繁研究(朱军等, 2012)已有报道, 但尚未实现规模化育苗, 未见秦岭岩白菜和岩白菜的离体培养及组培后代遗传稳定性的检测报道. ...
... ).通过对国内岩白菜属植物资源的调查及市场调研, 根据岩白菜素含量、株型、花期、花色及叶色, 综合市场需求及野生资源现存数量(吕秀立等, 2017), 我们筛选引自新疆的厚叶岩白菜(B. crassifolia)、引自陕西的秦岭岩白菜(B. scopulosa)和引自西藏的岩白菜(B. purpurascens)进行离体培养及规模化繁殖.厚叶岩白菜愈伤组织发生途径(刘敏等, 2009; 吕秀立等, 2016)及离体快繁研究(朱军等, 2012)已有报道, 但尚未实现规模化育苗, 未见秦岭岩白菜和岩白菜的离体培养及组培后代遗传稳定性的检测报道. ...

岩白菜组培中POD活性的研究
1
2011

... 岩白菜属植物主要含有三大类物质: 酚类、黄酮类及醌类(袁菊丽和索剑兰, 2011).这些物质易引起离体培养中植物材料发生褐变.相关****在培养天全岩白菜(B. tianquanensis)时, 发现聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和活性炭(A_C)对天全岩白菜的褐化抑制效果较差, 而赤霉素(GA)对岩白菜的褐化抑制效果较好(彭红卫等, 2011).本实验采用抗褐化剂V_C, 通过对比不同浓度, 筛选出V_C最佳使用浓度.在外植体消毒阶段, 消毒液中也添加了抗褐化剂, 防止植物材料切割后产生褐变. ...

岩白菜素的生物活性的研究进展
1
2014

... 岩白菜属(Bergenia)为虎耳草科多年生常绿草本植物, 该属植物共有10余种, 主要生长于东亚、南亚北部和中南亚, 其花叶俱美, 适应性强, 为良好的丛生地被植物(李文春等, 2006).国内外植物界对该属植物在分类、栽培、生物学特性、化学成分及药理作用等方面有较深入的研究(王碧霞等, 2012).该属植物是重要的药材, 主要药用成分为岩白菜素和熊果苷, 岩白菜素是治疗呼吸系统疾病的特效药(董成梅等, 2012; 田憬若等, 2014); 熊果苷是人黑色素细胞中酪氨酸酶的抑制剂, 可以减少黑色素的生成(刘锋等, 2004).随着雾霾天气的频发, 与呼吸系统有关的疾病日益增多, 对岩白菜种苗的需求量每年至少为 2 000万株(吕秀立等, 2017).由于长期人为过度采挖和对其生境的破坏, 野生岩白菜属植物资源已濒临枯竭, 播种萌发率低, 根茎分株育苗速度慢(杨丽云等, 2010), 实施人工繁殖和栽培已迫在眉睫(赵桂茹等, 2013).通过对国内岩白菜属植物资源的调查及市场调研, 根据岩白菜素含量、株型、花期、花色及叶色, 综合市场需求及野生资源现存数量(吕秀立等, 2017), 我们筛选引自新疆的厚叶岩白菜(B. crassifolia)、引自陕西的秦岭岩白菜(B. scopulosa)和引自西藏的岩白菜(B. purpurascens)进行离体培养及规模化繁殖.厚叶岩白菜愈伤组织发生途径(刘敏等, 2009; 吕秀立等, 2016)及离体快繁研究(朱军等, 2012)已有报道, 但尚未实现规模化育苗, 未见秦岭岩白菜和岩白菜的离体培养及组培后代遗传稳定性的检测报道. ...

岩白菜属植物研究的新进展
1
2012

... 岩白菜属(Bergenia)为虎耳草科多年生常绿草本植物, 该属植物共有10余种, 主要生长于东亚、南亚北部和中南亚, 其花叶俱美, 适应性强, 为良好的丛生地被植物(李文春等, 2006).国内外植物界对该属植物在分类、栽培、生物学特性、化学成分及药理作用等方面有较深入的研究(王碧霞等, 2012).该属植物是重要的药材, 主要药用成分为岩白菜素和熊果苷, 岩白菜素是治疗呼吸系统疾病的特效药(董成梅等, 2012; 田憬若等, 2014); 熊果苷是人黑色素细胞中酪氨酸酶的抑制剂, 可以减少黑色素的生成(刘锋等, 2004).随着雾霾天气的频发, 与呼吸系统有关的疾病日益增多, 对岩白菜种苗的需求量每年至少为 2 000万株(吕秀立等, 2017).由于长期人为过度采挖和对其生境的破坏, 野生岩白菜属植物资源已濒临枯竭, 播种萌发率低, 根茎分株育苗速度慢(杨丽云等, 2010), 实施人工繁殖和栽培已迫在眉睫(赵桂茹等, 2013).通过对国内岩白菜属植物资源的调查及市场调研, 根据岩白菜素含量、株型、花期、花色及叶色, 综合市场需求及野生资源现存数量(吕秀立等, 2017), 我们筛选引自新疆的厚叶岩白菜(B. crassifolia)、引自陕西的秦岭岩白菜(B. scopulosa)和引自西藏的岩白菜(B. purpurascens)进行离体培养及规模化繁殖.厚叶岩白菜愈伤组织发生途径(刘敏等, 2009; 吕秀立等, 2016)及离体快繁研究(朱军等, 2012)已有报道, 但尚未实现规模化育苗, 未见秦岭岩白菜和岩白菜的离体培养及组培后代遗传稳定性的检测报道. ...

岩白菜素的研究进展
1
2006

... 培养厚叶岩白菜时, 所有培养基都要添加抗褐化剂V_C.培养秦岭岩白菜和岩白菜时, 只在外植体消毒和初代培养阶段添加V_C, 之后的增殖培养与生根培养阶段可不添加V_C.厚叶岩白菜是该属植物中药用成分含量最高的种类(王继良等, 2006), 其成分比较复杂, 故离体培养时, 厚叶岩白菜褐变更严重.而药用成分含量较低的秦岭岩白菜和岩白菜褐变不严重, 由此推测褐变程度与药用成分含量有一定的相关性. ...

利用细胞学和分子标记检测刺梨愈伤组织的遗传稳定性
1
2003

... 体细胞无性系变异泛指在植物细胞、组织和器官培养过程中产生的遗传变异, 变异率可达30%-40%, 有时甚至高达100%, 某一具体性状的变异率在0.2%- 3% (丰先红等, 2010).组织培养过程中影响变异产生的因素包括植物基因型、外植体类型、激素类型及继代次数等, 无性系变异是多因素综合作用的结果(刘福平, 2010).国内外****利用分子标记技术对多种材料如铁皮石斛(Dendrobium officinale) (刘石泉等, 2005)、木薯(Manihot esculenta) (曾霞和庄南生, 2002)和刺梨(Rosa roxburghii) (文晓鹏和邓秀新, 2003)进行了体细胞无性系变异研究.在组织培养过程中, 如何快速、准确地鉴定经过多代繁殖的组培苗是否发生变异, 对大规模扩繁具有非常重要的意义(Reisch, 1988). ...

药用植物岩白菜种子发芽特性研究
1
2010

... 岩白菜属(Bergenia)为虎耳草科多年生常绿草本植物, 该属植物共有10余种, 主要生长于东亚、南亚北部和中南亚, 其花叶俱美, 适应性强, 为良好的丛生地被植物(李文春等, 2006).国内外植物界对该属植物在分类、栽培、生物学特性、化学成分及药理作用等方面有较深入的研究(王碧霞等, 2012).该属植物是重要的药材, 主要药用成分为岩白菜素和熊果苷, 岩白菜素是治疗呼吸系统疾病的特效药(董成梅等, 2012; 田憬若等, 2014); 熊果苷是人黑色素细胞中酪氨酸酶的抑制剂, 可以减少黑色素的生成(刘锋等, 2004).随着雾霾天气的频发, 与呼吸系统有关的疾病日益增多, 对岩白菜种苗的需求量每年至少为 2 000万株(吕秀立等, 2017).由于长期人为过度采挖和对其生境的破坏, 野生岩白菜属植物资源已濒临枯竭, 播种萌发率低, 根茎分株育苗速度慢(杨丽云等, 2010), 实施人工繁殖和栽培已迫在眉睫(赵桂茹等, 2013).通过对国内岩白菜属植物资源的调查及市场调研, 根据岩白菜素含量、株型、花期、花色及叶色, 综合市场需求及野生资源现存数量(吕秀立等, 2017), 我们筛选引自新疆的厚叶岩白菜(B. crassifolia)、引自陕西的秦岭岩白菜(B. scopulosa)和引自西藏的岩白菜(B. purpurascens)进行离体培养及规模化繁殖.厚叶岩白菜愈伤组织发生途径(刘敏等, 2009; 吕秀立等, 2016)及离体快繁研究(朱军等, 2012)已有报道, 但尚未实现规模化育苗, 未见秦岭岩白菜和岩白菜的离体培养及组培后代遗传稳定性的检测报道. ...

岩白菜属药用植物的研究进展
1
2011

... 岩白菜属植物主要含有三大类物质: 酚类、黄酮类及醌类(袁菊丽和索剑兰, 2011).这些物质易引起离体培养中植物材料发生褐变.相关****在培养天全岩白菜(B. tianquanensis)时, 发现聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和活性炭(A_C)对天全岩白菜的褐化抑制效果较差, 而赤霉素(GA)对岩白菜的褐化抑制效果较好(彭红卫等, 2011).本实验采用抗褐化剂V_C, 通过对比不同浓度, 筛选出V_C最佳使用浓度.在外植体消毒阶段, 消毒液中也添加了抗褐化剂, 防止植物材料切割后产生褐变. ...

木薯分子标记研究进展
1
2002

... 体细胞无性系变异泛指在植物细胞、组织和器官培养过程中产生的遗传变异, 变异率可达30%-40%, 有时甚至高达100%, 某一具体性状的变异率在0.2%- 3% (丰先红等, 2010).组织培养过程中影响变异产生的因素包括植物基因型、外植体类型、激素类型及继代次数等, 无性系变异是多因素综合作用的结果(刘福平, 2010).国内外****利用分子标记技术对多种材料如铁皮石斛(Dendrobium officinale) (刘石泉等, 2005)、木薯(Manihot esculenta) (曾霞和庄南生, 2002)和刺梨(Rosa roxburghii) (文晓鹏和邓秀新, 2003)进行了体细胞无性系变异研究.在组织培养过程中, 如何快速、准确地鉴定经过多代繁殖的组培苗是否发生变异, 对大规模扩繁具有非常重要的意义(Reisch, 1988). ...

不同光照强度对2年生岩白菜生长的影响
1
2013

... 岩白菜属(Bergenia)为虎耳草科多年生常绿草本植物, 该属植物共有10余种, 主要生长于东亚、南亚北部和中南亚, 其花叶俱美, 适应性强, 为良好的丛生地被植物(李文春等, 2006).国内外植物界对该属植物在分类、栽培、生物学特性、化学成分及药理作用等方面有较深入的研究(王碧霞等, 2012).该属植物是重要的药材, 主要药用成分为岩白菜素和熊果苷, 岩白菜素是治疗呼吸系统疾病的特效药(董成梅等, 2012; 田憬若等, 2014); 熊果苷是人黑色素细胞中酪氨酸酶的抑制剂, 可以减少黑色素的生成(刘锋等, 2004).随着雾霾天气的频发, 与呼吸系统有关的疾病日益增多, 对岩白菜种苗的需求量每年至少为 2 000万株(吕秀立等, 2017).由于长期人为过度采挖和对其生境的破坏, 野生岩白菜属植物资源已濒临枯竭, 播种萌发率低, 根茎分株育苗速度慢(杨丽云等, 2010), 实施人工繁殖和栽培已迫在眉睫(赵桂茹等, 2013).通过对国内岩白菜属植物资源的调查及市场调研, 根据岩白菜素含量、株型、花期、花色及叶色, 综合市场需求及野生资源现存数量(吕秀立等, 2017), 我们筛选引自新疆的厚叶岩白菜(B. crassifolia)、引自陕西的秦岭岩白菜(B. scopulosa)和引自西藏的岩白菜(B. purpurascens)进行离体培养及规模化繁殖.厚叶岩白菜愈伤组织发生途径(刘敏等, 2009; 吕秀立等, 2016)及离体快繁研究(朱军等, 2012)已有报道, 但尚未实现规模化育苗, 未见秦岭岩白菜和岩白菜的离体培养及组培后代遗传稳定性的检测报道. ...

ISSR分子标记及其在植物研究中的应用
1
2007

... 笔者自2012年开展厚叶岩白菜的规模化生产(吕秀立等, 2013a)以来, 近几年进一步优化各培养阶段并应用于秦岭岩白菜与岩白菜的生产上, 在培养条件、激素及基质等方面趋于一致, 便于在生产实践中统一管理.ISSR是一种显性分子标记, 具有操作简单、快速灵敏、多态性高、所需DNA量少及无需预知研究对象的基因组序列等优点, 同时也具有SSR的稳定性, 已被广泛应用于遗传多样性分析和亲缘关系鉴定等研究(Zietkiewicz et al., 1994; 赵谦等, 2007; 康建坂等, 2010; 刘思泱等, 2010).本研究应用ISSR分子标记对岩白菜组培苗后代进行遗传稳定性分析, 旨在为繁殖体系的稳定性提供理论依据, 并对保障岩白菜产业的发展具有指导意义. ...

新疆珍稀药用植物厚叶岩白菜离体快繁研究
1
2012

... 岩白菜属(Bergenia)为虎耳草科多年生常绿草本植物, 该属植物共有10余种, 主要生长于东亚、南亚北部和中南亚, 其花叶俱美, 适应性强, 为良好的丛生地被植物(李文春等, 2006).国内外植物界对该属植物在分类、栽培、生物学特性、化学成分及药理作用等方面有较深入的研究(王碧霞等, 2012).该属植物是重要的药材, 主要药用成分为岩白菜素和熊果苷, 岩白菜素是治疗呼吸系统疾病的特效药(董成梅等, 2012; 田憬若等, 2014); 熊果苷是人黑色素细胞中酪氨酸酶的抑制剂, 可以减少黑色素的生成(刘锋等, 2004).随着雾霾天气的频发, 与呼吸系统有关的疾病日益增多, 对岩白菜种苗的需求量每年至少为 2 000万株(吕秀立等, 2017).由于长期人为过度采挖和对其生境的破坏, 野生岩白菜属植物资源已濒临枯竭, 播种萌发率低, 根茎分株育苗速度慢(杨丽云等, 2010), 实施人工繁殖和栽培已迫在眉睫(赵桂茹等, 2013).通过对国内岩白菜属植物资源的调查及市场调研, 根据岩白菜素含量、株型、花期、花色及叶色, 综合市场需求及野生资源现存数量(吕秀立等, 2017), 我们筛选引自新疆的厚叶岩白菜(B. crassifolia)、引自陕西的秦岭岩白菜(B. scopulosa)和引自西藏的岩白菜(B. purpurascens)进行离体培养及规模化繁殖.厚叶岩白菜愈伤组织发生途径(刘敏等, 2009; 吕秀立等, 2016)及离体快繁研究(朱军等, 2012)已有报道, 但尚未实现规模化育苗, 未见秦岭岩白菜和岩白菜的离体培养及组培后代遗传稳定性的检测报道. ...

2
2006

... 采用CTAB法(Allen et al., 2006)提取岩白菜属植物的基因组DNA.改良的CTAB溶液配方为2% CTAB, 100 mmol∙L^-1 Tris-HCl (pH8.0), 20 mmol∙L^-1 EDTA, 1.4 mmol∙L^-1 NaCl, 2% PVP, 1% β-巯基乙醇.具体步骤参照文献(Allen et al., 2006).提取的DNA加入50 μL包含RNAase的灭菌去离子水(990 μL去离子水加10 μL RNAase)溶液溶解.用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性, 并用紫外分光光度计检测样品DNA的OD值, 以评价DNA的纯度和浓度.样品置于-20°C冰箱中保存备用. ...
... NaCl, 2% PVP, 1% β-巯基乙醇.具体步骤参照文献(Allen et al., 2006).提取的DNA加入50 μL包含RNAase的灭菌去离子水(990 μL去离子水加10 μL RNAase)溶液溶解.用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性, 并用紫外分光光度计检测样品DNA的OD值, 以评价DNA的纯度和浓度.样品置于-20°C冰箱中保存备用. ...

1
1988

... 体细胞无性系变异泛指在植物细胞、组织和器官培养过程中产生的遗传变异, 变异率可达30%-40%, 有时甚至高达100%, 某一具体性状的变异率在0.2%- 3% (丰先红等, 2010).组织培养过程中影响变异产生的因素包括植物基因型、外植体类型、激素类型及继代次数等, 无性系变异是多因素综合作用的结果(刘福平, 2010).国内外****利用分子标记技术对多种材料如铁皮石斛(Dendrobium officinale) (刘石泉等, 2005)、木薯(Manihot esculenta) (曾霞和庄南生, 2002)和刺梨(Rosa roxburghii) (文晓鹏和邓秀新, 2003)进行了体细胞无性系变异研究.在组织培养过程中, 如何快速、准确地鉴定经过多代繁殖的组培苗是否发生变异, 对大规模扩繁具有非常重要的意义(Reisch, 1988). ...

1
1994

... 笔者自2012年开展厚叶岩白菜的规模化生产(吕秀立等, 2013a)以来, 近几年进一步优化各培养阶段并应用于秦岭岩白菜与岩白菜的生产上, 在培养条件、激素及基质等方面趋于一致, 便于在生产实践中统一管理.ISSR是一种显性分子标记, 具有操作简单、快速灵敏、多态性高、所需DNA量少及无需预知研究对象的基因组序列等优点, 同时也具有SSR的稳定性, 已被广泛应用于遗传多样性分析和亲缘关系鉴定等研究(Zietkiewicz et al., 1994; 赵谦等, 2007; 康建坂等, 2010; 刘思泱等, 2010).本研究应用ISSR分子标记对岩白菜组培苗后代进行遗传稳定性分析, 旨在为繁殖体系的稳定性提供理论依据, 并对保障岩白菜产业的发展具有指导意义. ...