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应用SELEX技术检测水稻RFL转录因子的DNA结合位点

本站小编 Free考研考试/2022-01-01
丁承强, 常忠原, 王琰, 王绍华, 丁艳锋*,
南京农业大学农学院, 南京 210095
Ding Chengqiang, Chang Zhongyuan, Wang Yan, Wang Shaohua, Ding Yanfeng*,
College of Agronomy, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
引用本文
丁承强, 常忠原, 王琰, 王绍华, 丁艳锋. 应用SELEX技术检测水稻RFL转录因子的DNA结合位点. , 2017, 52(1): 70-76

贡献者
* 通讯作者。E-mail: dingyf@njau.edu.cn
基金资助
国家自然科学基金(No.31401324);
接受日期:2016-06-13接受日期:2016-10-13网络出版日期:2017-01-15
-->Copyright
20172010 《植物学报》编辑部

History
Received:Accepted:Online:




摘要:FLORICAULA/LEAFY是植物特有的转录因子, 其可以通过调控下游基因的表达对植物的发育起到调控作用。水稻(Oryza sativa)中的同源基因RFL (Rice FLORICAULA/LEAFY)能够调控多个发育过程, 包括开花、叶间期以及枝梗和颖花分化。指数富集配体的系统进化(SELEX)技术已经被广泛应用于体外筛选转录因子的DNA结合位点。应用SELEX技术检测水稻RFL的DNA结合序列, 经过7次PCR循环富集过程获得结合特异序列, 通过测序和MEME分析, 鉴定到RFL的DNA结合序列为(C/A)(C/T)NN(T/C/A)G(G/T)。实验结果为进一步阐明RFL分子功能奠定了基础。
 关键词: 水稻 ; 转录因子 ; SELEX ; DNA结合位点

Abstract: FLORICAULA/LEAFY encodes an evolutionarily conserved land plant-specific transcription factor. It functions by regulating the expression of downstream genes. RFL, the FLORICAULA/LEAFY homolog in rice, controls several important developments in rice: flowering time, plastochron and panicle branching. In this study, we detected the binding specificity of RFL by using the method systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX). After seven SELEX processes and sequencing, the binding site of RFL was identified as (C/A)(C/T)NN(T/C/A)G(G/T). The result contributes to clarifying the molecular function of RFL.
Key words:rice ; transcription factor ; SELEX ; DNA binding site


LFY (LEAFY)是拟南芥(Arabidopsis thaliana)花原基形成的必需基因, 该基因能够整合外部环境信号与内部开花信号来精确调控拟南芥的开花时间(Blaz- quez and Weigel, 2000)。Kyozuka等(1998)克隆了拟南芥LFY在水稻(Oryza sativa)中的同源基因RFL, 并利用原位杂交技术检测了RFL的表达情况。在一次枝梗和二次枝梗分化期, 该基因不在原基位置表达, 而是在原基周围区域表达。当小穗原基分化起始后, RFL基因就不在花序中的任何位置表达了, 这表明RFL与穗分化过程中分生特性的维持与转换密切相关(Kyozuka et al., 1998; Prasad et al., 2003)。

通过对RFL:RNAi植株和突变体的研究表明, 基因功能丧失后水稻穗部枝梗数减少甚至没有分枝, 说明RFL在幼穗分化中发挥非常重要的作用(Rao et al., 2008; Ikeda-Kawakatsu et al., 2012)。在RFL敲减实验中发现RFL能够通过调控CUC (CUP SHAPED COTELYDON)和LAX1 (LAX PANICLE 1)的表达量影响分蘖的发生(Deshpande et al., 2015)。在RFL基因控制下, 花序分生组织中的小穗分生组织的数量减少, 并表现出异常的花器官。在野生型的花序中, 穗轴分生组织通常形成10-12个一次枝梗后停止发育。然而, 在rfl突变体中, 枝梗分生组织在产生少量枝梗后就提前转化为小穗分生组织原基, 说明RFL基因的突变加

快了花序分生组织分生特性的转化(Rao et al., 2008; Ikeda-Kawakatsu et al., 2012)。此外, RFL基因的突变使水稻的出叶速率加快, 并延长了营养生长时间(Ikeda-Kawakatsu et al., 2012)。

RFL作为特异性转录因子, 其功能的行使主要依赖于调控下游基因的表达。鉴定转录因子的DNA结合序列是研究转录因子基因调控功能的重要一步。指数富集配体的系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)是20世纪90年代发展起来的一项组合化学技术, 可以用于鉴定转录因子的DNA结合序列(Klug and Famulok, 1994)。SELEX技术是一个从人工合成的大容量寡核苷酸库中, 结合PCR扩增、指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸, 经过几轮或数十轮筛选, 获得高亲和力、高特异性的核苷酸配基, 即适体(Klug and Famulok, 1994)。该技术已经成为一种重要的研究手段和工具, 可以从随机核酸序列库中筛选到与转录因子特异性结合的DNA序列, 即确认转录因子的DNA结合位点。如Sayou等(2014)利用该技术鉴定了多种陆生植物中LFY同源基因的DNA结合序列, 发现在陆生植物中, LFY同源基因的结合序列可以分为3类, 其中被子植物、裸子植物、蕨类植物和苔藓植物都划归为第1类。本研究利用SELEX技术鉴定了水稻RFL的DNA结合

序列, 为进一步阐明RFL的分子功能并鉴定直接的下游调控基因奠定了基础。

1 材料与方法1.1 实验材料供试水稻材料为粳稻品种日本晴(Oryza sativa L. subsp. japonica var. Nipponbare)。

1.2 实验方法1.2.1 水稻的种植
将日本晴播种于营养土中, 种植在宁波江南人工气候箱内(RXZ-358)。光照周期为8小时光照/16小时黑暗。光照时培养温度为28°C; 黑暗时培养温度为22°C。相对湿度为80%。穗分化开始后取幼穗样品, 立即用液氮冷冻, 于-80°C保存备用。
1.2.2 总RNA提取
使用OMEGA公司试剂盒(Cat No. R6834-01)提取冷冻幼穗的总RNA, 琼脂糖凝胶电泳检测rRNA 28S: 18S大于1.8 (ChemiDoc Touch, BIO-RAD)。在260 nm和280 nm下测定吸光度, 将OD值介于1.8-2.2之间的样本RNA视为合格。使用PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis反转录试剂盒(Takara, Cat No. 6210A)反转录成cDNA, 用于后续RFL基因的克隆。
1.2.3 RFL基因的克隆与蛋白质表达
使用引物5'-CATATGCAGGAGGACGAGATG-3' (加NdeI酶切位点)和5′-GAATTCTTAGAACAAGGGC GGC-3′ (加EcoRI酶切位点)扩增RFL DNA结合结构域(蛋白质的189-389位), 将扩增后的产物连接到pGEM®-T Easy载体上(Promega, Cat. No. A1360)。经测序验证正确后使用内切酶NdeI和EcoRI (Takara)酶切载体, 胶回收双酶切后的产物。使用DNA Ligation Kit (Takara)将胶回收产物与线性化的pCold- GST 载体(Takara, Cat No. 3372)连接。连接后的载体转化大肠杆菌BL21感受态(Takara)。GST-RFL在大肠杆菌BL21中诱导表达(Takara, Cat No. 9126)。诱导方法参考Takara pCold™ Vector Set (Takara, Cat No. 3360)说明书进行。
1.2.4 SELEX循环富集实验
首先合成74个碱基长的单链DNA, 两端为固定序列, 其中N为随机核苷酸, 在每个位置上的A、G、C、T出现概率相同(InvitrogenTM Thermo Fisher Scientific)。全长序列如下: 5′-AGCATCACTGATTCAAGA- GCATAGN(26)TTCACCTTCAGAACTGATGTACTC- 3′。使用反向引物5′-GAGTACATCAGTTCTGAAGG- TGAA-3′和DNA聚合酶PrimeSTAR® HS DNA Polymerase (Takara)合成互补链。PCR反应程序: 98°C变性5分钟, 50°C退化10秒, 72°C延伸5秒。使用苯酚纯化PCR产物, 加入100 ng随机DNA序列和GST-RFL融合蛋白质。按照pCold™ Vector Set说明书中的标准培养条件, 将从6 mL大肠杆菌中提取的蛋白质结合到200 μL Glutathione Sepharose 4B琼脂糖凝胶微球(GE Healthcare)上, 结合后的蛋白质可供进行3次SELEX循环富集实验(约2 μg融合蛋白)。经过结合及3次洗脱, 将与蛋白结合的序列再进行PCR扩增, 对结合序列进行富集。结合缓冲液组成如下: 15 mmol∙L-1 4-羟乙基哌嗪乙磺酸, 75 mmol∙L-1 KCl, 6%甘油, 2 mmol∙L-1 DTT, 0.5 μg∙μL-1 Poly[d(I-C)]和0.1% TritonX-100。洗脱缓冲液组成如下: 15 mmol∙L-1 4-羟乙基哌嗪乙磺酸, 75 mmol∙L-1 KCl, 6%甘油, 0.25 mmol∙L-1 EDTA和0.1% TritonX-100。PCR反应程序: 94°C预变性2分钟; 94°C变性10秒, 60°C退化10秒, 72°C延伸10秒, 25个循环; 72°C延伸10秒。PCR反应前引物为5′-AGCATCACTGATTCAAGAGCATAG-3′, 反应后引物为5′-GAGTACATCAGTTCTGAAGGTG- AA-3′。使用3%琼脂糖凝胶检测PCR扩增产物。使用10 ng PCR产物进行下一个SELEX循环。最后的PCR产物使用苯酚/氯仿混合液进行纯化(25:24:1, Life Technologies)。将纯化后的产物克隆到pGEM®-T Easy载体中(Promega)。将载体转入大肠杆菌, 选取单菌落测序, 确认并分析插入序列。去掉两端的固定序列后, 使用MEME软件(http://meme-suite.org/tools/meme)进行序列分析, 计算参数设置为默认值。

2 结果与讨论2.1 RFL蛋白质的原核表达RFL蛋白质有2个主要结构域(图1A), 分别位于C端和N端。其中N端保守结构域是RFL蛋白形成同源复合体所必需的; C端为DNA结合结构域(Ikeda-Kawakatsu et al., 2012; Siriwardana and Lamb, 2012)。首先, 我们克隆了RFL全长基因进行原核表达。但经过反复优化, 难以得到可溶表达的蛋白全长。其原因可能是由于编码序列较长, 蛋白难以在原核表达系统中进行完整翻译。根据RFL蛋白结构域, 只克隆DNA结合结构域进行原核表达, 可提高蛋白质的原核表达效率。本研究克隆了RFL蛋白的第189-389位氨基酸, 通过改变诱导温度、时间以及IPTG浓度, 探索各种条件对蛋白表达的影响。结果表明, IPTG浓度为0.5 mmol·L-1时诱导表达效果最好, 在诱导后20小时蛋白质就已经大量表达, 且均为可溶表达(图1B)。
图1https://www.chinbullbotany.com/article/2017/1674-3466/1674-3466-52-1-70/img_1.png<b>图1</b> RFL蛋白质序列分析(A)与原核表达(B)<br/><b>Figure 1</b> Sequence analysis of RFL protein (A) and prokaryotic expression (B)
Figure 1https://www.chinbullbotany.com/article/2017/1674-3466/1674-3466-52-1-70/img_1.png<b>图1</b> RFL蛋白质序列分析(A)与原核表达(B)<br/><b>Figure 1</b> Sequence analysis of RFL protein (A) and prokaryotic expression (B)


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图1
RFL蛋白质序列分析(A)与原核表达(B)
Figure 1
Sequence analysis of RFL protein (A) and prokaryotic expression (B)


使用筛选出的培养条件诱导蛋白表达后收集菌液, 提取蛋白质并进行纯化。纯化后的蛋白质经过SDS-PAGE电泳分析, 得到与目标蛋白大小(51.1 kDa)相同的融合表达蛋白(图1B)。通过电泳图可知, 除目标蛋白外, 还有多条较小的蛋白条带, 这可能是融合基因在大肠杆菌翻译过程中产生的不完整蛋 白质。使用GST纯化后的蛋白进行下一步SELEX实 验。

2.2 SELEX序列分析本研究通过7次SELEX循环富集, 得到最终的富集产物(图2)。将富集后的DNA序列克隆到pGEM®-T Easy载体, 转化大肠杆菌后挑取单克隆进行测序。对阳性克隆测序后, 分析插入序列并去除两端的固定序列。通过以上操作可得到富集的DNA序列。本研究共测序得到结合序列81条(表1)。
图2https://www.chinbullbotany.com/article/2017/1674-3466/1674-3466-52-1-70/img_2.png<b>图2</b> SELEX实验过程中结合序列的PCR电泳富集结果^M: DNA分子量标准; 1: 1 μL PCR液; 2: 5 μL PCR液<br/><b>Figure 2</b> PCR analysis of the binding sequences in SELEX^M: DNA marker; 1: 1 μL PCR solution; 2: 5 μL PCR solution
Figure 2https://www.chinbullbotany.com/article/2017/1674-3466/1674-3466-52-1-70/img_2.png<b>图2</b> SELEX实验过程中结合序列的PCR电泳富集结果^M: DNA分子量标准; 1: 1 μL PCR液; 2: 5 μL PCR液<br/><b>Figure 2</b> PCR analysis of the binding sequences in SELEX^M: DNA marker; 1: 1 μL PCR solution; 2: 5 μL PCR solution


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图2
SELEX实验过程中结合序列的PCR电泳富集结果^M: DNA分子量标准; 1: 1 μL PCR液; 2: 5 μL PCR液
Figure 2
PCR analysis of the binding sequences in SELEX^M: DNA marker; 1: 1 μL PCR solution; 2: 5 μL PCR solution


表1
Table 1
表1
表1 SELEX富集到的结合序列 Table 1 The binding sequences in SELEX
NumberSequences (5'-3')NumberSequences (5'-3')
1TGTGACCGCGGGATAAACGAGCTGTC42CGACCCGGGGATCGCGTTTGTACTC
2CCCGGTGGGCAGAATCCGATCGGACC43CCCCCCAAGGGTAATAACATGGGCGG
3TGTAACCGGGTTTACCCATAGGTTAC44CCGGCACCCCGGACATACCCAATGGT
4CAAACCCTGTGTGTAATAACCGC45GACCGGGTATTCCCGACAAACCAGTA
5GGCCACGGGGTTTACTCGGCAGCATG46AGACCGGTGGCCGGCGCCTAGAAACC
6CGTTATACTAGATGTCCAGCGGGTAC47GTTCAGGCGGCCGTGTAATGTCCGCT
7CGGACTCGGGTTAATACGGTGGGTCC48CCCTGAGACGAGGTGTTTTGAGGTCC
8GGTGTCGAGTGGTATTCCACCGGTCC49CGGACCCATGTAATACCCGCGTAATG
9GCCCTTTGGGTTTTGTCCCCCGTATA50CAACCACCAATGGTCCATACGGGCGG
10TGAGACTACAGCGGGTAATAGCCTTA51TCCAAAGGTCAGTCACCGGGTCTGCG
11GGTCCTGCCTGCTAACCCCGTGGTCC52GTGCATGGACCGACTGTCAACGGAAA
12GGGTCCACAGGCAGGTCGTTGTACAT53GAGACTTTTGCCTCAAGTGTGGTCC
13AGACGGTCCGGTAGCTGCTTTCTTGC54AAAGTCCAAAGCGGGGGGGCAGACCG
14GTGTGGGGCGGGTTCTGGGCGGACAA55CCGAAACCCCTCCGGTCACAATCCC
15CGCCGTACACTAAGGACCGCTGGCTA56CGGTACCGGGTATTGACCGAAGGTGC
16CGGTAATTGTTGAACGATCCGGGCTG57TCCGTAGGTGGTATCCCCAGTGTGTA
17GCGACCGGTTGCTCGGTTGTGGTCCC58GACGCCAGGGGTTATTACCTGTGCCG
18GTTTAGGGTTTAGTACCCGTCGGTCC59TCCTATATCCTAATGGTGGAGGACCG
19TGGCTAATGTCCCCGTGGCTCCCCGC60TTACCCAAACGGTAATAGCACGGACC
20CATGATAGGTTTTAGCTGAGGGGCCA61CAACTATACCCAACGAGCATAACCCG
21ACCGTTGGTTCCTCGCTTTTCTTAGC62TGACTACTCGGCAAGTCTTTACCCTG
22TTCGAACGCGTGCAAGGACCGGTGGA63CCAGAAGTACTTATCCAGGGTAATAA
23GGAGCTGGACTTTACCCTTGCTTTGC64CCTGGGCTTTGCATTTCGGTCCTGGA
24GAGTTAAATGATTATCCCGTGGTCCC65GACCTGGACTATAACACTGGACCGTA
25TGACCGATGGGGTGCAAGCTGAGGGA66GCGTGGACCGGTCCGTTACTCCGTCC
26GGGTGCTACCACCGGCTGGGTTCGGG67CGAGGTAGCGACACGACTGGTGGTCC
27CGGGATGAGCGAGTACGAGTGGGCCC68CCGAAAGGACCGTAACCCAACGGTTA
28TCCCTCAGGGTATTACCCCTATGGCC69CGACTACAACGACCCCACGGGTAAAG
29TGGGCATTACCTTGAACCACCTGGTT70GAGGCCGCGAGGCCCAGACCAATGGA
30CACCAATGGGTATTGTCTGTAGCCC71TGTGCTTTTGTCGCTTCGCCCCACGG
31CCCGCCGGGTAATTGTTGTCGTAACG72ACCGATGGACCGCCGTGGGGTTGTCG
32GTCTTTTGGTCCGTGTCTTGGCGGGG73ACCTCCTGGCTATTGTACTCCGGTTA
33CGGGTAAAGGGGCTTGGTCCCCCAGC74CCCGTCGGTATTTAGCTGGTAGTCG
34TGTGAGGACGTGGTTGGACCGGTCTG75ACTGGTTCACTGCCGGTATACGGTCA
35ACCGACCGTTGGGCTTAATCCTCTTG76GAAACCTGCATTTGTCCACTGGTCTA
36CTCCAAATGCACCCAAGCGGGTTCCA77CACCGAGCGATAAAACCGTTGGTCTA
37CCCAAAACCCACCGGTCGTTGCCCCG78AGTGGTGGTTATTGCCCAATGTGCCC
38AGGGCTTAACCTCTTTATGGACCCCG79GGACATTAACCGGCCAACTCCGCGGA
39GGACCACAGGGTAAGGCTCATCGCTA80GATCCGCTGGGTAACCCAGGAAGGGT
40GCGACCAGGCAAAGACTCCTGTACGC81ACCGTCGGTTGCAGGTCCTTGGTCCG
41AGTCATACGCGGCTATTACCTTCCGG


表1
SELEX富集到的结合序列
Table 1
The binding sequences in SELEX


将81条序列提交至MEME在线分析系统, 经过统计得到RFL的DNA结合位点, 可信度达7.5e-25 (图3)。由图3可知, 水稻RFL转录因子具有典型的7 bp的CCNNNGG结合位点。根据研究结果可以将水稻RFL位点概括为(C/A)(C/T)NN(T/C/A)G(G/T)。
在这几个位点中, 第6个位点最为保守, 为鸟嘌呤核苷酸(图3中的第14位)。在7 bp的核心结合位点中, 第3和4位保守性最低(分别对应图3中的第11和12位)。本研究使用RFL全长蛋白的第189-389位的片段进行SELEX分析。在Sayou等(2014)的研究中使用2种RFL不完全蛋白进行SELEX实验, 分别是第41-389位和第219-389位。我们使用的蛋白长度介于上述2种蛋白之间, 得到的结合序列也略有不同。
图3https://www.chinbullbotany.com/article/2017/1674-3466/1674-3466-52-1-70/img_3.png<b>图3</b> RFL蛋白的结合位点<br/><b>Figure 4</b> The binding sites of RFL protein
Figure 4https://www.chinbullbotany.com/article/2017/1674-3466/1674-3466-52-1-70/img_3.png<b>图3</b> RFL蛋白的结合位点<br/><b>Figure 4</b> The binding sites of RFL protein


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图3
RFL蛋白的结合位点
Figure 4
The binding sites of RFL protein



2.3 讨论LFY基因是调控陆生植物开花和细胞分裂的关键基因, 在植物中通常只有1个拷贝(Sayou et al., 2014)。Sayou等(2014)系统研究了LFY作为转录因子在几种陆生植物中的DNA结合位点, 发现LFY通过改变结合位点的特异性使其在进化过程中保持单拷贝。目前关于拟南芥LFY的DNA结合位点研究得最为清楚(Bus- ch et al., 1999; Winter et al., 2011; Sayou et al., 2014)。Busch等(1999)在拟南芥AP1和AG1基因的启动子上发现了LFY的DNA结合位点, 序列分别为CC- AGTGG和CCAATG(G/T)。进一步研究确认了该特异性的结合位点可以表示为CC(A/G)N(T/C)GG (Win- ter et al., 2011)。而关于水稻中RFL的DNA结合位点的研究尚未见报道。本研究利用原核表达系统表达RFL蛋白质, 利用重组蛋白进行蛋白质的功能研究。原核表达系统具有表达周期短、易于培养且成本低廉等特点, 已被广泛应用于外源蛋白质的重组表达。本研究使用原核表达蛋白RFL, 利用SELEX技术, 体外筛选鉴定到81条与之特异结合的DNA序列, 通过生物信息学分析鉴定到其特异结合位点。该结合位点与拟南芥中LFY略微不同, 首先在第3位上, RFL没有特异性要求, 而LFY更加偏向于A或者G; 在第6位上, RFL对碱基的要求更加特异, 只能是G。由于进行SELEX分析时使用的蛋白长度不同可能引起DNA结合结构域的构象发生变化, 从而影响序列结合的特异性。此外, 水稻RFL与拟南芥LFY蛋白中DNA结合结构域中氨基酸的不同可能也直接影响了特异性。Sayou等(2014)在研究中使用了2种不同长度的RFL蛋白进行SELEX分析, 发现水稻RFL结合位点, 其研究结果与 Winter等(2011)对于拟南芥LFY结合位点的研究类似。这似乎意味着表达蛋白的长度对于特异性分析更为重要。我们的研究表明, RFL蛋白对于结合序列中的第3位没有特异性要求, 这与Sayou等(2014)的研究结果不同。但由于所有的研究都使用不完全的RFL蛋白进行分析, 所以下一步的研究需要改进原核表达的方法, 使用全长蛋白进行SELEX分析, 进一步验证该蛋白DNA结合序列的特异性。
SELEX分析所使用的RFL原核表达蛋白是只具有DNA结合结构域的体外表达蛋白质。由于没有成功得到可溶性表达的RFL全长蛋白质, 无法利用全长蛋白进行SELEX分析。另一个保守结构域是否会影响蛋白与DNA结合的特异性尚不清楚。另外, 原核表达蛋白会丢失一些蛋白的修饰, 且RFL的DNA结合能力也会受到其它因子的影响, 因此本研究得到的结果尚需通过水稻体内研究加以确认, 如ChIP-seq技术等。
RFL的突变使一次枝梗和二次枝梗数量急剧减少, 大大降低了水稻单产。研究RFL基因的功能有助于揭示水稻幼穗的分化过程。RFL作为一个转录因子, 其功能的行使主要依赖于对下游基因的调控。在拟南芥中已经鉴定得到了几个直接的下游基因, 如LMI1 (LATE MERISTEM IDENTITY1) (Saddic et al., 2006)、CAL (CAULIFLOWER) (William et al., 2004)、LMI2 (AtMYB17/LATE MERISTEM IDENTITY2) (Pastore et al., 2011)、APETALA1、AG (AGAMOUS) (Busch et al., 1999)和AP1 (APETALA1) (Wagner et al., 1999; Pastore et al., 2011)。除此之外, 利用ChIP-seq技术还鉴定到多个潜在的直接下游基因(Hames et al., 2008; Winter et al., 2011), 但结果仍需通过遗传学及分子生物学技术进行验证。值得注意的是, 拟南芥LFY突变后植株不能正常形成花原基, 而水稻中幼穗各个发育进程似乎加快了, 促进了花原基的形成。研究表明尽管该基因在物种之间蛋白质序列相对保守, 但在进化过程中, 其功能发生了分化(马月萍等, 2005)。目前水稻RFL的直接下游基因尚未被鉴定得到, 其转录调控功能需进一步研究。本研究鉴定了该基因的DNA结合位点, 为下一步确定直接下游调控基因奠定了重要基础。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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[本文引用: 3]

植物LEAFY同源基因的研究进展
1
2005

... RFL的突变使一次枝梗和二次枝梗数量急剧减少, 大大降低了水稻单产.研究RFL基因的功能有助于揭示水稻幼穗的分化过程.RFL作为一个转录因子, 其功能的行使主要依赖于对下游基因的调控.在拟南芥中已经鉴定得到了几个直接的下游基因, 如LMI1 (LATE MERISTEM IDENTITY1) (Saddic et al., 2006)、CAL (CAULIFLOWER) (William et al., 2004)、LMI2 (AtMYB17/LATE MERISTEM IDENTITY2) (Pastore et al., 2011)、APETALA1、AG (AGAMOUS) (Busch et al., 1999)和AP1 (APETALA1) (Wagner et al., 1999; Pastore et al., 2011).除此之外, 利用ChIP-seq技术还鉴定到多个潜在的直接下游基因(Hames et al., 2008; Winter et al., 2011), 但结果仍需通过遗传学及分子生物学技术进行验证.值得注意的是, 拟南芥LFY突变后植株不能正常形成花原基, 而水稻中幼穗各个发育进程似乎加快了, 促进了花原基的形成.研究表明尽管该基因在物种之间蛋白质序列相对保守, 但在进化过程中, 其功能发生了分化(马月萍等, 2005).目前水稻RFL的直接下游基因尚未被鉴定得到, 其转录调控功能需进一步研究.本研究鉴定了该基因的DNA结合位点, 为下一步确定直接下游调控基因奠定了重要基础. ...

1
2000

... LFY (LEAFY)是拟南芥(Arabidopsis thaliana)花原基形成的必需基因, 该基因能够整合外部环境信号与内部开花信号来精确调控拟南芥的开花时间(Blaz- quez and Weigel, 2000).Kyozuka等(1998)克隆了拟南芥LFY在水稻(Oryza sativa)中的同源基因RFL, 并利用原位杂交技术检测了RFL的表达情况.在一次枝梗和二次枝梗分化期, 该基因不在原基位置表达, 而是在原基周围区域表达.当小穗原基分化起始后, RFL基因就不在花序中的任何位置表达了, 这表明RFL与穗分化过程中分生特性的维持与转换密切相关(Kyozuka et al., 1998; Prasad et al., 2003). ...

2
1999

... LFY基因是调控陆生植物开花和细胞分裂的关键基因, 在植物中通常只有1个拷贝(Sayou et al., 2014).Sayou等(2014)系统研究了LFY作为转录因子在几种陆生植物中的DNA结合位点, 发现LFY通过改变结合位点的特异性使其在进化过程中保持单拷贝.目前关于拟南芥LFY的DNA结合位点研究得最为清楚(Bus- ch et al., 1999; Winter et al., 2011; Sayou et al., 2014).Busch等(1999)在拟南芥AP1和AG1基因的启动子上发现了LFY的DNA结合位点, 序列分别为CC- AGTGG和CCAATG(G/T).进一步研究确认了该特异性的结合位点可以表示为CC(A/G)N(T/C)GG (Win- ter et al., 2011).而关于水稻中RFL的DNA结合位点的研究尚未见报道.本研究利用原核表达系统表达RFL蛋白质, 利用重组蛋白进行蛋白质的功能研究.原核表达系统具有表达周期短、易于培养且成本低廉等特点, 已被广泛应用于外源蛋白质的重组表达.本研究使用原核表达蛋白RFL, 利用SELEX技术, 体外筛选鉴定到81条与之特异结合的DNA序列, 通过生物信息学分析鉴定到其特异结合位点.该结合位点与拟南芥中LFY略微不同, 首先在第3位上, RFL没有特异性要求, 而LFY更加偏向于A或者G; 在第6位上, RFL对碱基的要求更加特异, 只能是G.由于进行SELEX分析时使用的蛋白长度不同可能引起DNA结合结构域的构象发生变化, 从而影响序列结合的特异性.此外, 水稻RFL与拟南芥LFY蛋白中DNA结合结构域中氨基酸的不同可能也直接影响了特异性.Sayou等(2014)在研究中使用了2种不同长度的RFL蛋白进行SELEX分析, 发现水稻RFL结合位点, 其研究结果与 Winter等(2011)对于拟南芥LFY结合位点的研究类似.这似乎意味着表达蛋白的长度对于特异性分析更为重要.我们的研究表明, RFL蛋白对于结合序列中的第3位没有特异性要求, 这与Sayou等(2014)的研究结果不同.但由于所有的研究都使用不完全的RFL蛋白进行分析, 所以下一步的研究需要改进原核表达的方法, 使用全长蛋白进行SELEX分析, 进一步验证该蛋白DNA结合序列的特异性. ...
... RFL的突变使一次枝梗和二次枝梗数量急剧减少, 大大降低了水稻单产.研究RFL基因的功能有助于揭示水稻幼穗的分化过程.RFL作为一个转录因子, 其功能的行使主要依赖于对下游基因的调控.在拟南芥中已经鉴定得到了几个直接的下游基因, 如LMI1 (LATE MERISTEM IDENTITY1) (Saddic et al., 2006)、CAL (CAULIFLOWER) (William et al., 2004)、LMI2 (AtMYB17/LATE MERISTEM IDENTITY2) (Pastore et al., 2011)、APETALA1、AG (AGAMOUS) (Busch et al., 1999)和AP1 (APETALA1) (Wagner et al., 1999; Pastore et al., 2011).除此之外, 利用ChIP-seq技术还鉴定到多个潜在的直接下游基因(Hames et al., 2008; Winter et al., 2011), 但结果仍需通过遗传学及分子生物学技术进行验证.值得注意的是, 拟南芥LFY突变后植株不能正常形成花原基, 而水稻中幼穗各个发育进程似乎加快了, 促进了花原基的形成.研究表明尽管该基因在物种之间蛋白质序列相对保守, 但在进化过程中, 其功能发生了分化(马月萍等, 2005).目前水稻RFL的直接下游基因尚未被鉴定得到, 其转录调控功能需进一步研究.本研究鉴定了该基因的DNA结合位点, 为下一步确定直接下游调控基因奠定了重要基础. ...

1
2015

... 通过对RFL:RNAi植株和突变体的研究表明, 基因功能丧失后水稻穗部枝梗数减少甚至没有分枝, 说明RFL在幼穗分化中发挥非常重要的作用(Rao et al., 2008; Ikeda-Kawakatsu et al., 2012).在RFL敲减实验中发现RFL能够通过调控CUC (CUP SHAPED COTELYDON)和LAX1 (LAX PANICLE 1)的表达量影响分蘖的发生(Deshpande et al., 2015).在RFL基因控制下, 花序分生组织中的小穗分生组织的数量减少, 并表现出异常的花器官.在野生型的花序中, 穗轴分生组织通常形成10-12个一次枝梗后停止发育.然而, 在rfl突变体中, 枝梗分生组织在产生少量枝梗后就提前转化为小穗分生组织原基, 说明RFL基因的突变加 ...

1
2008

... RFL的突变使一次枝梗和二次枝梗数量急剧减少, 大大降低了水稻单产.研究RFL基因的功能有助于揭示水稻幼穗的分化过程.RFL作为一个转录因子, 其功能的行使主要依赖于对下游基因的调控.在拟南芥中已经鉴定得到了几个直接的下游基因, 如LMI1 (LATE MERISTEM IDENTITY1) (Saddic et al., 2006)、CAL (CAULIFLOWER) (William et al., 2004)、LMI2 (AtMYB17/LATE MERISTEM IDENTITY2) (Pastore et al., 2011)、APETALA1、AG (AGAMOUS) (Busch et al., 1999)和AP1 (APETALA1) (Wagner et al., 1999; Pastore et al., 2011).除此之外, 利用ChIP-seq技术还鉴定到多个潜在的直接下游基因(Hames et al., 2008; Winter et al., 2011), 但结果仍需通过遗传学及分子生物学技术进行验证.值得注意的是, 拟南芥LFY突变后植株不能正常形成花原基, 而水稻中幼穗各个发育进程似乎加快了, 促进了花原基的形成.研究表明尽管该基因在物种之间蛋白质序列相对保守, 但在进化过程中, 其功能发生了分化(马月萍等, 2005).目前水稻RFL的直接下游基因尚未被鉴定得到, 其转录调控功能需进一步研究.本研究鉴定了该基因的DNA结合位点, 为下一步确定直接下游调控基因奠定了重要基础. ...

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2012

... 通过对RFL:RNAi植株和突变体的研究表明, 基因功能丧失后水稻穗部枝梗数减少甚至没有分枝, 说明RFL在幼穗分化中发挥非常重要的作用(Rao et al., 2008; Ikeda-Kawakatsu et al., 2012).在RFL敲减实验中发现RFL能够通过调控CUC (CUP SHAPED COTELYDON)和LAX1 (LAX PANICLE 1)的表达量影响分蘖的发生(Deshpande et al., 2015).在RFL基因控制下, 花序分生组织中的小穗分生组织的数量减少, 并表现出异常的花器官.在野生型的花序中, 穗轴分生组织通常形成10-12个一次枝梗后停止发育.然而, 在rfl突变体中, 枝梗分生组织在产生少量枝梗后就提前转化为小穗分生组织原基, 说明RFL基因的突变加 ...
... 快了花序分生组织分生特性的转化(Rao et al., 2008; Ikeda-Kawakatsu et al., 2012).此外, RFL基因的突变使水稻的出叶速率加快, 并延长了营养生长时间(Ikeda-Kawakatsu et al., 2012). ...
... 基因的突变使水稻的出叶速率加快, 并延长了营养生长时间(Ikeda-Kawakatsu et al., 2012). ...
... RFL蛋白质有2个主要结构域(图1A), 分别位于C端和N端.其中N端保守结构域是RFL蛋白形成同源复合体所必需的; C端为DNA结合结构域(Ikeda-Kawakatsu et al., 2012; Siriwardana and Lamb, 2012).首先, 我们克隆了RFL全长基因进行原核表达.但经过反复优化, 难以得到可溶表达的蛋白全长.其原因可能是由于编码序列较长, 蛋白难以在原核表达系统中进行完整翻译.根据RFL蛋白结构域, 只克隆DNA结合结构域进行原核表达, 可提高蛋白质的原核表达效率.本研究克隆了RFL蛋白的第189-389位氨基酸, 通过改变诱导温度、时间以及IPTG浓度, 探索各种条件对蛋白表达的影响.结果表明, IPTG浓度为0.5 mmol·L-1时诱导表达效果最好, 在诱导后20小时蛋白质就已经大量表达, 且均为可溶表达(图1B). ...

2
1994

... RFL作为特异性转录因子, 其功能的行使主要依赖于调控下游基因的表达.鉴定转录因子的DNA结合序列是研究转录因子基因调控功能的重要一步.指数富集配体的系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)是20世纪90年代发展起来的一项组合化学技术, 可以用于鉴定转录因子的DNA结合序列(Klug and Famulok, 1994).SELEX技术是一个从人工合成的大容量寡核苷酸库中, 结合PCR扩增、指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸, 经过几轮或数十轮筛选, 获得高亲和力、高特异性的核苷酸配基, 即适体(Klug and Famulok, 1994).该技术已经成为一种重要的研究手段和工具, 可以从随机核酸序列库中筛选到与转录因子特异性结合的DNA序列, 即确认转录因子的DNA结合位点.如Sayou等(2014)利用该技术鉴定了多种陆生植物中LFY同源基因的DNA结合序列, 发现在陆生植物中, LFY同源基因的结合序列可以分为3类, 其中被子植物、裸子植物、蕨类植物和苔藓植物都划归为第1类.本研究利用SELEX技术鉴定了水稻RFL的DNA结合 ...
... ).SELEX技术是一个从人工合成的大容量寡核苷酸库中, 结合PCR扩增、指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸, 经过几轮或数十轮筛选, 获得高亲和力、高特异性的核苷酸配基, 即适体(Klug and Famulok, 1994).该技术已经成为一种重要的研究手段和工具, 可以从随机核酸序列库中筛选到与转录因子特异性结合的DNA序列, 即确认转录因子的DNA结合位点.如Sayou等(2014)利用该技术鉴定了多种陆生植物中LFY同源基因的DNA结合序列, 发现在陆生植物中, LFY同源基因的结合序列可以分为3类, 其中被子植物、裸子植物、蕨类植物和苔藓植物都划归为第1类.本研究利用SELEX技术鉴定了水稻RFL的DNA结合 ...

1
1998

... LFY (LEAFY)是拟南芥(Arabidopsis thaliana)花原基形成的必需基因, 该基因能够整合外部环境信号与内部开花信号来精确调控拟南芥的开花时间(Blaz- quez and Weigel, 2000).Kyozuka等(1998)克隆了拟南芥LFY在水稻(Oryza sativa)中的同源基因RFL, 并利用原位杂交技术检测了RFL的表达情况.在一次枝梗和二次枝梗分化期, 该基因不在原基位置表达, 而是在原基周围区域表达.当小穗原基分化起始后, RFL基因就不在花序中的任何位置表达了, 这表明RFL与穗分化过程中分生特性的维持与转换密切相关(Kyozuka et al., 1998; Prasad et al., 2003). ...

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2011

... RFL的突变使一次枝梗和二次枝梗数量急剧减少, 大大降低了水稻单产.研究RFL基因的功能有助于揭示水稻幼穗的分化过程.RFL作为一个转录因子, 其功能的行使主要依赖于对下游基因的调控.在拟南芥中已经鉴定得到了几个直接的下游基因, 如LMI1 (LATE MERISTEM IDENTITY1) (Saddic et al., 2006)、CAL (CAULIFLOWER) (William et al., 2004)、LMI2 (AtMYB17/LATE MERISTEM IDENTITY2) (Pastore et al., 2011)、APETALA1、AG (AGAMOUS) (Busch et al., 1999)和AP1 (APETALA1) (Wagner et al., 1999; Pastore et al., 2011).除此之外, 利用ChIP-seq技术还鉴定到多个潜在的直接下游基因(Hames et al., 2008; Winter et al., 2011), 但结果仍需通过遗传学及分子生物学技术进行验证.值得注意的是, 拟南芥LFY突变后植株不能正常形成花原基, 而水稻中幼穗各个发育进程似乎加快了, 促进了花原基的形成.研究表明尽管该基因在物种之间蛋白质序列相对保守, 但在进化过程中, 其功能发生了分化(马月萍等, 2005).目前水稻RFL的直接下游基因尚未被鉴定得到, 其转录调控功能需进一步研究.本研究鉴定了该基因的DNA结合位点, 为下一步确定直接下游调控基因奠定了重要基础. ...
... ; Pastore et al., 2011).除此之外, 利用ChIP-seq技术还鉴定到多个潜在的直接下游基因(Hames et al., 2008; Winter et al., 2011), 但结果仍需通过遗传学及分子生物学技术进行验证.值得注意的是, 拟南芥LFY突变后植株不能正常形成花原基, 而水稻中幼穗各个发育进程似乎加快了, 促进了花原基的形成.研究表明尽管该基因在物种之间蛋白质序列相对保守, 但在进化过程中, 其功能发生了分化(马月萍等, 2005).目前水稻RFL的直接下游基因尚未被鉴定得到, 其转录调控功能需进一步研究.本研究鉴定了该基因的DNA结合位点, 为下一步确定直接下游调控基因奠定了重要基础. ...

1
2003

... LFY (LEAFY)是拟南芥(Arabidopsis thaliana)花原基形成的必需基因, 该基因能够整合外部环境信号与内部开花信号来精确调控拟南芥的开花时间(Blaz- quez and Weigel, 2000).Kyozuka等(1998)克隆了拟南芥LFY在水稻(Oryza sativa)中的同源基因RFL, 并利用原位杂交技术检测了RFL的表达情况.在一次枝梗和二次枝梗分化期, 该基因不在原基位置表达, 而是在原基周围区域表达.当小穗原基分化起始后, RFL基因就不在花序中的任何位置表达了, 这表明RFL与穗分化过程中分生特性的维持与转换密切相关(Kyozuka et al., 1998; Prasad et al., 2003). ...

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2008

... 通过对RFL:RNAi植株和突变体的研究表明, 基因功能丧失后水稻穗部枝梗数减少甚至没有分枝, 说明RFL在幼穗分化中发挥非常重要的作用(Rao et al., 2008; Ikeda-Kawakatsu et al., 2012).在RFL敲减实验中发现RFL能够通过调控CUC (CUP SHAPED COTELYDON)和LAX1 (LAX PANICLE 1)的表达量影响分蘖的发生(Deshpande et al., 2015).在RFL基因控制下, 花序分生组织中的小穗分生组织的数量减少, 并表现出异常的花器官.在野生型的花序中, 穗轴分生组织通常形成10-12个一次枝梗后停止发育.然而, 在rfl突变体中, 枝梗分生组织在产生少量枝梗后就提前转化为小穗分生组织原基, 说明RFL基因的突变加 ...
... 快了花序分生组织分生特性的转化(Rao et al., 2008; Ikeda-Kawakatsu et al., 2012).此外, RFL基因的突变使水稻的出叶速率加快, 并延长了营养生长时间(Ikeda-Kawakatsu et al., 2012). ...

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2006

... RFL的突变使一次枝梗和二次枝梗数量急剧减少, 大大降低了水稻单产.研究RFL基因的功能有助于揭示水稻幼穗的分化过程.RFL作为一个转录因子, 其功能的行使主要依赖于对下游基因的调控.在拟南芥中已经鉴定得到了几个直接的下游基因, 如LMI1 (LATE MERISTEM IDENTITY1) (Saddic et al., 2006)、CAL (CAULIFLOWER) (William et al., 2004)、LMI2 (AtMYB17/LATE MERISTEM IDENTITY2) (Pastore et al., 2011)、APETALA1、AG (AGAMOUS) (Busch et al., 1999)和AP1 (APETALA1) (Wagner et al., 1999; Pastore et al., 2011).除此之外, 利用ChIP-seq技术还鉴定到多个潜在的直接下游基因(Hames et al., 2008; Winter et al., 2011), 但结果仍需通过遗传学及分子生物学技术进行验证.值得注意的是, 拟南芥LFY突变后植株不能正常形成花原基, 而水稻中幼穗各个发育进程似乎加快了, 促进了花原基的形成.研究表明尽管该基因在物种之间蛋白质序列相对保守, 但在进化过程中, 其功能发生了分化(马月萍等, 2005).目前水稻RFL的直接下游基因尚未被鉴定得到, 其转录调控功能需进一步研究.本研究鉴定了该基因的DNA结合位点, 为下一步确定直接下游调控基因奠定了重要基础. ...

2
2014

... LFY基因是调控陆生植物开花和细胞分裂的关键基因, 在植物中通常只有1个拷贝(Sayou et al., 2014).Sayou等(2014)系统研究了LFY作为转录因子在几种陆生植物中的DNA结合位点, 发现LFY通过改变结合位点的特异性使其在进化过程中保持单拷贝.目前关于拟南芥LFY的DNA结合位点研究得最为清楚(Bus- ch et al., 1999; Winter et al., 2011; Sayou et al., 2014).Busch等(1999)在拟南芥AP1和AG1基因的启动子上发现了LFY的DNA结合位点, 序列分别为CC- AGTGG和CCAATG(G/T).进一步研究确认了该特异性的结合位点可以表示为CC(A/G)N(T/C)GG (Win- ter et al., 2011).而关于水稻中RFL的DNA结合位点的研究尚未见报道.本研究利用原核表达系统表达RFL蛋白质, 利用重组蛋白进行蛋白质的功能研究.原核表达系统具有表达周期短、易于培养且成本低廉等特点, 已被广泛应用于外源蛋白质的重组表达.本研究使用原核表达蛋白RFL, 利用SELEX技术, 体外筛选鉴定到81条与之特异结合的DNA序列, 通过生物信息学分析鉴定到其特异结合位点.该结合位点与拟南芥中LFY略微不同, 首先在第3位上, RFL没有特异性要求, 而LFY更加偏向于A或者G; 在第6位上, RFL对碱基的要求更加特异, 只能是G.由于进行SELEX分析时使用的蛋白长度不同可能引起DNA结合结构域的构象发生变化, 从而影响序列结合的特异性.此外, 水稻RFL与拟南芥LFY蛋白中DNA结合结构域中氨基酸的不同可能也直接影响了特异性.Sayou等(2014)在研究中使用了2种不同长度的RFL蛋白进行SELEX分析, 发现水稻RFL结合位点, 其研究结果与 Winter等(2011)对于拟南芥LFY结合位点的研究类似.这似乎意味着表达蛋白的长度对于特异性分析更为重要.我们的研究表明, RFL蛋白对于结合序列中的第3位没有特异性要求, 这与Sayou等(2014)的研究结果不同.但由于所有的研究都使用不完全的RFL蛋白进行分析, 所以下一步的研究需要改进原核表达的方法, 使用全长蛋白进行SELEX分析, 进一步验证该蛋白DNA结合序列的特异性. ...
... ; Sayou et al., 2014).Busch等(1999)在拟南芥AP1和AG1基因的启动子上发现了LFY的DNA结合位点, 序列分别为CC- AGTGG和CCAATG(G/T).进一步研究确认了该特异性的结合位点可以表示为CC(A/G)N(T/C)GG (Win- ter et al., 2011).而关于水稻中RFL的DNA结合位点的研究尚未见报道.本研究利用原核表达系统表达RFL蛋白质, 利用重组蛋白进行蛋白质的功能研究.原核表达系统具有表达周期短、易于培养且成本低廉等特点, 已被广泛应用于外源蛋白质的重组表达.本研究使用原核表达蛋白RFL, 利用SELEX技术, 体外筛选鉴定到81条与之特异结合的DNA序列, 通过生物信息学分析鉴定到其特异结合位点.该结合位点与拟南芥中LFY略微不同, 首先在第3位上, RFL没有特异性要求, 而LFY更加偏向于A或者G; 在第6位上, RFL对碱基的要求更加特异, 只能是G.由于进行SELEX分析时使用的蛋白长度不同可能引起DNA结合结构域的构象发生变化, 从而影响序列结合的特异性.此外, 水稻RFL与拟南芥LFY蛋白中DNA结合结构域中氨基酸的不同可能也直接影响了特异性.Sayou等(2014)在研究中使用了2种不同长度的RFL蛋白进行SELEX分析, 发现水稻RFL结合位点, 其研究结果与 Winter等(2011)对于拟南芥LFY结合位点的研究类似.这似乎意味着表达蛋白的长度对于特异性分析更为重要.我们的研究表明, RFL蛋白对于结合序列中的第3位没有特异性要求, 这与Sayou等(2014)的研究结果不同.但由于所有的研究都使用不完全的RFL蛋白进行分析, 所以下一步的研究需要改进原核表达的方法, 使用全长蛋白进行SELEX分析, 进一步验证该蛋白DNA结合序列的特异性. ...

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2012

... RFL蛋白质有2个主要结构域(图1A), 分别位于C端和N端.其中N端保守结构域是RFL蛋白形成同源复合体所必需的; C端为DNA结合结构域(Ikeda-Kawakatsu et al., 2012; Siriwardana and Lamb, 2012).首先, 我们克隆了RFL全长基因进行原核表达.但经过反复优化, 难以得到可溶表达的蛋白全长.其原因可能是由于编码序列较长, 蛋白难以在原核表达系统中进行完整翻译.根据RFL蛋白结构域, 只克隆DNA结合结构域进行原核表达, 可提高蛋白质的原核表达效率.本研究克隆了RFL蛋白的第189-389位氨基酸, 通过改变诱导温度、时间以及IPTG浓度, 探索各种条件对蛋白表达的影响.结果表明, IPTG浓度为0.5 mmol·L-1时诱导表达效果最好, 在诱导后20小时蛋白质就已经大量表达, 且均为可溶表达(图1B). ...

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1999

... RFL的突变使一次枝梗和二次枝梗数量急剧减少, 大大降低了水稻单产.研究RFL基因的功能有助于揭示水稻幼穗的分化过程.RFL作为一个转录因子, 其功能的行使主要依赖于对下游基因的调控.在拟南芥中已经鉴定得到了几个直接的下游基因, 如LMI1 (LATE MERISTEM IDENTITY1) (Saddic et al., 2006)、CAL (CAULIFLOWER) (William et al., 2004)、LMI2 (AtMYB17/LATE MERISTEM IDENTITY2) (Pastore et al., 2011)、APETALA1、AG (AGAMOUS) (Busch et al., 1999)和AP1 (APETALA1) (Wagner et al., 1999; Pastore et al., 2011).除此之外, 利用ChIP-seq技术还鉴定到多个潜在的直接下游基因(Hames et al., 2008; Winter et al., 2011), 但结果仍需通过遗传学及分子生物学技术进行验证.值得注意的是, 拟南芥LFY突变后植株不能正常形成花原基, 而水稻中幼穗各个发育进程似乎加快了, 促进了花原基的形成.研究表明尽管该基因在物种之间蛋白质序列相对保守, 但在进化过程中, 其功能发生了分化(马月萍等, 2005).目前水稻RFL的直接下游基因尚未被鉴定得到, 其转录调控功能需进一步研究.本研究鉴定了该基因的DNA结合位点, 为下一步确定直接下游调控基因奠定了重要基础. ...

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2004

... RFL的突变使一次枝梗和二次枝梗数量急剧减少, 大大降低了水稻单产.研究RFL基因的功能有助于揭示水稻幼穗的分化过程.RFL作为一个转录因子, 其功能的行使主要依赖于对下游基因的调控.在拟南芥中已经鉴定得到了几个直接的下游基因, 如LMI1 (LATE MERISTEM IDENTITY1) (Saddic et al., 2006)、CAL (CAULIFLOWER) (William et al., 2004)、LMI2 (AtMYB17/LATE MERISTEM IDENTITY2) (Pastore et al., 2011)、APETALA1、AG (AGAMOUS) (Busch et al., 1999)和AP1 (APETALA1) (Wagner et al., 1999; Pastore et al., 2011).除此之外, 利用ChIP-seq技术还鉴定到多个潜在的直接下游基因(Hames et al., 2008; Winter et al., 2011), 但结果仍需通过遗传学及分子生物学技术进行验证.值得注意的是, 拟南芥LFY突变后植株不能正常形成花原基, 而水稻中幼穗各个发育进程似乎加快了, 促进了花原基的形成.研究表明尽管该基因在物种之间蛋白质序列相对保守, 但在进化过程中, 其功能发生了分化(马月萍等, 2005).目前水稻RFL的直接下游基因尚未被鉴定得到, 其转录调控功能需进一步研究.本研究鉴定了该基因的DNA结合位点, 为下一步确定直接下游调控基因奠定了重要基础. ...

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2011

... LFY基因是调控陆生植物开花和细胞分裂的关键基因, 在植物中通常只有1个拷贝(Sayou et al., 2014).Sayou等(2014)系统研究了LFY作为转录因子在几种陆生植物中的DNA结合位点, 发现LFY通过改变结合位点的特异性使其在进化过程中保持单拷贝.目前关于拟南芥LFY的DNA结合位点研究得最为清楚(Bus- ch et al., 1999; Winter et al., 2011; Sayou et al., 2014).Busch等(1999)在拟南芥AP1和AG1基因的启动子上发现了LFY的DNA结合位点, 序列分别为CC- AGTGG和CCAATG(G/T).进一步研究确认了该特异性的结合位点可以表示为CC(A/G)N(T/C)GG (Win- ter et al., 2011).而关于水稻中RFL的DNA结合位点的研究尚未见报道.本研究利用原核表达系统表达RFL蛋白质, 利用重组蛋白进行蛋白质的功能研究.原核表达系统具有表达周期短、易于培养且成本低廉等特点, 已被广泛应用于外源蛋白质的重组表达.本研究使用原核表达蛋白RFL, 利用SELEX技术, 体外筛选鉴定到81条与之特异结合的DNA序列, 通过生物信息学分析鉴定到其特异结合位点.该结合位点与拟南芥中LFY略微不同, 首先在第3位上, RFL没有特异性要求, 而LFY更加偏向于A或者G; 在第6位上, RFL对碱基的要求更加特异, 只能是G.由于进行SELEX分析时使用的蛋白长度不同可能引起DNA结合结构域的构象发生变化, 从而影响序列结合的特异性.此外, 水稻RFL与拟南芥LFY蛋白中DNA结合结构域中氨基酸的不同可能也直接影响了特异性.Sayou等(2014)在研究中使用了2种不同长度的RFL蛋白进行SELEX分析, 发现水稻RFL结合位点, 其研究结果与 Winter等(2011)对于拟南芥LFY结合位点的研究类似.这似乎意味着表达蛋白的长度对于特异性分析更为重要.我们的研究表明, RFL蛋白对于结合序列中的第3位没有特异性要求, 这与Sayou等(2014)的研究结果不同.但由于所有的研究都使用不完全的RFL蛋白进行分析, 所以下一步的研究需要改进原核表达的方法, 使用全长蛋白进行SELEX分析, 进一步验证该蛋白DNA结合序列的特异性. ...
... 基因的启动子上发现了LFY的DNA结合位点, 序列分别为CC- AGTGG和CCAATG(G/T).进一步研究确认了该特异性的结合位点可以表示为CC(A/G)N(T/C)GG (Win- ter et al., 2011).而关于水稻中RFL的DNA结合位点的研究尚未见报道.本研究利用原核表达系统表达RFL蛋白质, 利用重组蛋白进行蛋白质的功能研究.原核表达系统具有表达周期短、易于培养且成本低廉等特点, 已被广泛应用于外源蛋白质的重组表达.本研究使用原核表达蛋白RFL, 利用SELEX技术, 体外筛选鉴定到81条与之特异结合的DNA序列, 通过生物信息学分析鉴定到其特异结合位点.该结合位点与拟南芥中LFY略微不同, 首先在第3位上, RFL没有特异性要求, 而LFY更加偏向于A或者G; 在第6位上, RFL对碱基的要求更加特异, 只能是G.由于进行SELEX分析时使用的蛋白长度不同可能引起DNA结合结构域的构象发生变化, 从而影响序列结合的特异性.此外, 水稻RFL与拟南芥LFY蛋白中DNA结合结构域中氨基酸的不同可能也直接影响了特异性.Sayou等(2014)在研究中使用了2种不同长度的RFL蛋白进行SELEX分析, 发现水稻RFL结合位点, 其研究结果与 Winter等(2011)对于拟南芥LFY结合位点的研究类似.这似乎意味着表达蛋白的长度对于特异性分析更为重要.我们的研究表明, RFL蛋白对于结合序列中的第3位没有特异性要求, 这与Sayou等(2014)的研究结果不同.但由于所有的研究都使用不完全的RFL蛋白进行分析, 所以下一步的研究需要改进原核表达的方法, 使用全长蛋白进行SELEX分析, 进一步验证该蛋白DNA结合序列的特异性. ...
... RFL的突变使一次枝梗和二次枝梗数量急剧减少, 大大降低了水稻单产.研究RFL基因的功能有助于揭示水稻幼穗的分化过程.RFL作为一个转录因子, 其功能的行使主要依赖于对下游基因的调控.在拟南芥中已经鉴定得到了几个直接的下游基因, 如LMI1 (LATE MERISTEM IDENTITY1) (Saddic et al., 2006)、CAL (CAULIFLOWER) (William et al., 2004)、LMI2 (AtMYB17/LATE MERISTEM IDENTITY2) (Pastore et al., 2011)、APETALA1、AG (AGAMOUS) (Busch et al., 1999)和AP1 (APETALA1) (Wagner et al., 1999; Pastore et al., 2011).除此之外, 利用ChIP-seq技术还鉴定到多个潜在的直接下游基因(Hames et al., 2008; Winter et al., 2011), 但结果仍需通过遗传学及分子生物学技术进行验证.值得注意的是, 拟南芥LFY突变后植株不能正常形成花原基, 而水稻中幼穗各个发育进程似乎加快了, 促进了花原基的形成.研究表明尽管该基因在物种之间蛋白质序列相对保守, 但在进化过程中, 其功能发生了分化(马月萍等, 2005).目前水稻RFL的直接下游基因尚未被鉴定得到, 其转录调控功能需进一步研究.本研究鉴定了该基因的DNA结合位点, 为下一步确定直接下游调控基因奠定了重要基础. ...



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