李莉, 杜鑫, 张丽娜, 杨柳, 高晓庆, 唐东雪, 赵海源, 蒋晓梅, 张天舒, 李金祥. 重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株培养条件的优化[J]. 中国农业科学, 2018, 51(17): 3415-3426 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2018.17.016
LI Li, DU XIN, ZHANG LiNa, YANG Liu, GAO XiaoQing, TANG DongXue, ZHAO HaiYuan, JIANG XiaoMei, ZHANG TianShu, LI JinXiang. Optimization of Cultivation Conditions for Reassortant Avian Influenza Virus H7N9 H7-Re1 Strain[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2018, 51(17): 3415-3426 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2018.17.016

0 引言

【研究意义】禽流感（avian influenza,AI）是由A型流感病毒引起的以主要感染家禽、野禽、水禽的一种急性高度接触性传染病,国际卫生组织将其列为必须上报的动物疫病,我国将其列为一类疫病,禽流感不仅感染禽,也感染哺乳动物和人^[1],根据禽流感病毒的致病性可分为高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza,HPAI）和低致病性禽流感（low pathogenic avian influenza,LPAI）,在16个亚型中并不是每一个亚型的流感病毒均表现为对禽的高致病性^[2],历史上每次HPAI的暴发均由H5或 H7亚型病毒引起,当然并不是所有的H5或H7亚型流感病毒均为高致病力毒株,自从1959年HPAI首次报道以来,每次HPAI的暴发都给养禽业造成了巨大的经济损失^[3,4]。近年来,我国暴发了多起严重的H5亚型和H7亚型高致病性禽流感疫情,各日龄及各品种禽群均可感染发病,家禽感染后死亡率非常高,接近100%^[5]。【前人研究进展】现阶段疫苗接种仍是我国控制禽流感的主要措施之一^[6],目前市场上大部分疫苗仍用鸡胚制备,需要大量的易感鸡胚,且产量低,不同批次间病毒含量一致性差,鸡胚残体不宜处理,不利于应对大规模的禽流感疫情暴发,在禽流感疫苗的需求不断增加的情形下,曾一度造成禽流感疫苗供应量不足的紧张局面^[7,8],且病毒在鸡胚中连续传代可引起HA基因发生突变、外源病毒污染等问题,因此,建立稳定的有连续生产能力的病毒培养体系尤为重要。【本研究切入点】MDCK细胞被广泛作为病毒的增殖基质而应用,可用于呼肠孤病毒、腺病毒、犬细小病毒及禽流感病毒等^[9,10,11,12]。MDCK细胞与病毒亲和性高、增殖速度快且不易发生突变,是培养禽流感病毒的敏感细胞之一^[13]。利用连续细胞培养系统生产流感疫苗具有操作简单、规模易放大,易于质量控制,纯度高,稳定性好的特点^[14],可弥补鸡胚苗产量低,批间差异大等不足,完全可应对禽流感大规模流行^[15]。【拟解决的关键问题】在禽流感疫苗生产过程中, 所用抗原的病毒含量与疫苗的效力密切相关,所以本试验将重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株在MDCK细胞上培养,并对其培养条件进行优化,筛选出了最佳的培养体系,进行连续传代培养,并对不同代次毒种进行病毒含量的比较, 筛选出了最稳定、免疫原性最好的毒种,为生产高效价禽流感疫苗奠定基础。

1 材料与方法

试验于2017年6—12月,在吉林冠界生物技术有限公司实验室进行。

1.1 细胞和病毒

MDCK细胞（犬肾细胞）系购自ATCC公司（美国模式培养物集存库）;悬浮MDCK细胞（犬肾细胞）为本公司自行驯化,重组禽流感病毒H7亚型H7-Re1株购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。

1.2 主要试剂及耗材

胎牛血清购自兰州民海生物工程有限公司,DMEM培养基购自Hyclone公司;MDCK无血清培养基选用培养基为国产无血清全悬浮细胞培养基;TPCK-胰酶购自Sigma公司;PBS、PBS-EDTA、1%鸡红细胞悬液由本公司质检部自行制备;0.25%胰酶-EDTA购自Gibco公司;检验用SPF鸡胚购自北京梅里亚公司。

1.3 主要设备

倒置显微镜购自Olympus 公司,CO₂培养箱购自Themeo fisher公司,生物安全柜购自Thermo fisher公司。

1.4 MDCK细胞培养H7N9 H7-Re1株方法

1.4.1 MDCK细胞培养 以（3—4）×10⁴个／cm²密度接种MDCK细胞,置37℃、5% CO₂培养箱中培养,逐日观察,待长满单层后用于病毒增殖。
1.4.2 病毒在MDCK细胞上增殖预试验 鸡胚毒按病毒感染复数MOI为10^-3接种MDCK细胞,MOI为感染病毒数/细胞数,接种3组,同时设1组不接毒的细胞作为空白对照。置37℃、5% CO₂培养箱中培养,每隔8 h取样,测定各组各时间段病毒含量（HA效价、TCID₅₀以及EID₅₀）,将病毒含量最高的毒样作为第一代种毒。
1.4.3 MDCK细胞上病毒培养条件优化
1.4.3.1 MDCK细胞上最佳接毒剂量（MOI或百分比） 取细胞毒按按MOI为（10^-5、10^-4、10^-3、10^-2、10^-1）或DMEM维持液量的（0.0008%、0.008%、0.08%、0.8%、8%）接种到MDCK细胞,每个剂量接种3组,同时设1组不接毒的细胞作为空白对照,置37℃、5% CO₂培养箱中培养,逐日观察细胞病变,直至75%以上细胞病变,测定各组收毒时的病毒含量（HA效价、TCID₅₀以及EID₅₀）。
1.4.3.2 MDCK细胞上最佳收毒时间的确定 取细胞毒按MOI为10^-4接种MDCK细胞,接种3组,同时设1组不接毒的细胞作为空白对照,置37℃、5% CO₂培养箱中培养,逐日观察细胞病变,从接毒后的24 h开始,每隔8 h取样,直至收毒,测定其病毒含量（HA效价、TCID₅₀以及EID₅₀）。
1.4.3.3 MDCK细胞上最佳TPCK-胰酶的确定 取细胞毒按MOI为10^-4接种MDCK细胞,使TPCK-胰酶浓度分别为1、2、4、6、8 μg mL^-1,每个TPCK-胰酶浓度接种3组,同时设1组不接毒的细胞作为空白对照,置37℃、5% CO₂培养箱中培养,逐日观察细胞病变,64 h收获,测定各组病毒含量（HA效价、TCID₅₀以及EID₅₀）。
1.4.3.4 MDCK细胞上最佳接种方法的确定 取细胞毒按MOI为10^-4接种MDCK细胞,分别采用吸附法（作用1 h后,倒掉种毒稀释液）与不吸附法,加入DMEM维持液（含TPCK-胰酶）,各接种3组,同时设1组不接毒的细胞作为空白对照,置37℃、5% CO₂培养箱中培养,逐日观察细胞病变,64 h收获测定各组病毒含量（HA效价、TCID₅₀以及EID₅₀）。
1.4.4 MDCK细胞上最佳病毒代次的确定 取鸡胚毒按MOI为10^-4接种MDCK细胞,胰酶终浓度为2 μg·mL^-1置37℃、5% CO₂培养箱中培养,逐日观察细胞病变,培养时间为64 h按此方法,在MDCK细胞上连传13代,每代各接种3组,同时设1组不接毒的细胞对照,测定各组病毒含量（HA效价、TCID₅₀以及EID₅₀）。

1.5 悬浮MDCK细胞培养H7N9 H7-Re1株

1.5.1 悬浮MDCK细胞培养 将悬浮MDCK细胞,以（1.0—2.0）×10⁶ cells/mL的起始密度,置37℃,5%CO₂培养箱,120—140 r/min进行培养扩繁。待细胞密度达到（8.0—10.0）×10⁶cells/mL左右时可用于接毒培养。补加病毒培养液使细胞悬液：病毒培养液=1.5﹕1—1﹕1。
1.5.2 悬浮MDCK细胞上增殖预试验 将鸡胚毒按病毒感染复数MOI为10^-1、10^-2、10^-3接种悬浮MDCK细胞,同时设1组不接毒的细胞作为空白对照。置37℃、5% CO₂培养箱中,120—140 r/min进行培养,逐日观察细胞病变,从接毒后的24 h开始,每隔12 h取样,直至75%以上细胞发生病变。测定各组病毒含量（HA效价、TCID₅₀以及EID₅₀）,将病毒含量最高的毒样作为第一代种毒。
1.5.3 悬浮MDCK细胞上最佳接毒剂量（MOI） 将上述悬浮细胞毒按MOI为（10^-4、10^-3、10^-2、10^-1）接种悬浮MDCK细胞中,每个剂量接种3组,同时设1组不接毒的细胞作为空白对照,置37℃、5% CO₂培养箱中,120—140 r/min进行培养,逐日观察细胞病变,直至75%以上细胞病变,收毒取样,测定各组病毒含量（HA效价、TCID₅₀以及EID₅₀）。
1.5.4 悬浮MDCK细胞上最佳收毒时间的确定 取悬浮种毒按MOI为10^-2接种悬浮MDCK细胞,接种3组,每组接种3瓶,同时设1组不接毒的细胞对照,作为空白对照,置37℃、5% CO₂培养箱中培养,逐日观察细胞病变,从接毒后的24 h开始,每隔12 h取样,将每组样混匀后测其病毒含量（HA效价、TCID₅₀以及EID₅₀）直至收毒,将每组样混匀后测其病毒含量（HA效价、TCID₅₀以及EID₅₀）。
1.5.5 悬浮MDCK细胞上最佳TPCK-胰酶含量的确定
将预试验制备的第一代种毒10倍系列稀释后接种悬浮MDCK细胞,分别加入TPCK-胰酶（分别含有2、4、8、12 μg·mL^-1 TPCK-胰酶）,每个不同剂量的TPCK-胰酶接种3组,每组接种3瓶,同时设1组不接毒的细胞对照,作为空白对照,置37℃、5% CO₂培养箱中培养,逐日观察细胞病变,将每组样混匀后测其病毒含量（HA效价、TCID₅₀以及EID₅₀）。

2 结果

2.1 病毒在MDCK细胞上病毒增殖试验

2.1.1 MDCK细胞病变观察 对细胞接毒前后细胞状态进行了观察,发现细胞接毒前细胞界限清晰,饱满,接毒后32 h开始出现轻微病变,40—48 h圆缩聚集的细胞增多,56—64 h开始出现大量典型病变灶,细胞拉丝,崩解,至72 h细胞全部脱落（图1、2）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT
图1接毒前正常MDCK细胞
-->Fig. 1Normal MDCK cell before infection (200×)
-->

显示原图|下载原图ZIP|生成PPT
图2接毒后64h的MDCK细胞
-->Fig. 2MDCK cell on 64h post-infection (200×)
-->

2.1.2 MDCK细胞预试验病毒含量 预试验结果表明,在64 h时,病毒含量可达最高,每1 mL病毒含量10^6.5—10^7.0TCID₅₀,每0.1 mL病毒含量10^6.5— 10^7.17EID₅₀,HA效价为1﹕32—1﹕64,空白对照结果HA<1﹕2,TCID₅₀、EID₅₀均为0（表1）。
Table 1
表1
表1病毒含量比较（HA、TCID₅₀/mL、EID₅₀/0.1 mL）
Table 1Comparison of virus titer (HA, TCID₅₀/mL, EID₅₀/0.1 mL)

时间 Time (h)	1组 Group 1			2组 Group 2			3组 Group 3			对照组 Control group
	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50
24	1:2	102.5	102.375	1:2	102.33	102.375	1:2	102.5	102.375	<1:2	0	0
32	1:2	103.33	103.17	1:2	103.0	102.83	1:2	103.0	103.17	<1:2	0	0
40	1:8	105.0	105.375	1:4	104.5	104.375	1:8	104.67	104.375	<1:2	0	0
48	1:16	106.5	106.5	1:16	105.67	105.83	1:16	105.5	105.5	<1:2	0	0
56	1:32	106.67	106.625	1:16	106.33	106.5	1:32	106.0	106.17	<1:2	0	0
64	1:64	107.0	107.17	1:64	106.67	106.83	1:32	106.5	106.5	<1:2	0	0
72	1:64	106.67	106.625	1:32	106.5	106.5	1:64	106.5	106.375	<1:2	0	0

新窗口打开
2.1.3 MDCK细胞上培养条件优化
2.1.3.1 最佳接毒剂量（MOI）筛选 MOI为10^-4,病毒含量可达最高,每1 mL病毒含量10^7.33— 10^7.5TCID₅₀,每0.1 mL病毒含量10^7.375— 10^7.5EID₅₀,HA效价为1﹕64—1﹕128,空白对照结果HA<1﹕2,TCID₅₀、EID₅₀均为0（表2）。接毒百分比为0.008%,病毒含量可达最高,每1 mL病毒含量10^7.33— 10^7.5TCID₅₀,每0.1 mL病毒含量10^7.375—10^7.5EID₅₀,HA为1﹕64—1﹕128,空白对照结果HA<1﹕2,TCID₅₀、EID₅₀均为0（表3）。
Table 2
表2
表2不同MOI病毒含量比较（HA、TCID₅₀/mL、EID₅₀/0.1mL）
Table 2Comparison of virus titer for different MOI (HA, TCID₅₀/mL, EID₅₀/0.1mL)

MOI	1组Group 1			2组Group 2			3组Group 3			对照组 Control group
	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50
10-5	1:32	105.5	105.375	1:32	105.33	105.17	1:32	105.5	105.5	<1:2	0	0
10-4	1:128	107.5	107.5	1:64	107.33	107.375	1:128	107.5	107.375	<1:2	0	0
10-3	1:64	107.0	107.17	1:32	106.67	106.83	1:64	106.67	106.5	<1:2	0	0
10-2	1:32	106.0	106.17	1:32	106.33	106.17	1:32	106.0	106.17	<1:2	0	0
10-1	1:32	105.5	105.83	1:32	105.67	105.5	1:32	105.5	105.83	<1:2	0	0

新窗口打开
Table 3
表3
表3不同接毒百分比病毒含量比较（HA、TCID₅₀/mL、EID₅₀/0.1mL）
Table 3Comparison of virus titer for different Take poison percentage (HA, TCID₅₀/mL, EID₅₀/0.1mL)

百分比 Percent (%)	1组Group 1			2组Group 2			3组Group 3			对照组 Control group
	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50
0.0008	1:32	105.33	105.375	1:32	105.5	105.375	1:32	105.67	105.83	<1:2	0	0
0.008	1:128	107.33	107.5	1:64	107.33	107.5	1:128	107.5	107.375	<1:2	0	0
0.08	1:64	107.0	107.375	1:32	106.5	106.83	1:64	106.67	106.5	<1:2	0	0
0.8	1:32	106.33	106.375	1:32	106.33	106.17	1:32	106.0	106.17	<1:2	0	0
8	1:32	105.5	105.83	1:32	105.67	105.5	1:32	105.5	105.83	<1:2	0	0

新窗口打开
2.1.3.2 最佳收毒时间筛选 在64h时,病毒含量可达最高,每1 mL病毒含量10^7.33—10^7.5TCID₅₀,每0.1 mL病毒含量10^7.375—10^7.5EID₅₀,HA效价为1﹕64—1﹕128,空白对照结果HA<1﹕2,TCID₅₀、EID₅₀均为0（表4）。
Table 4
表4
表4不同收毒时间病毒含量比较（HA、TCID₅₀/mL、EID₅₀/0.1mL）
Table 4Comparison of virus titer in different times (HA, TCID₅₀/mL, EID₅₀/0.1mL)

时间 Time (h)	1组Group 1			2组Group 2			3组Group 3			对照组 Control group
	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50
24	1:2	102.67	102.375	1:2	103.0	103.375	1:2	103.33	103.17	<1:2	0	0
32	1:2	104.0	104.17	1:2	104.5	104.83	1:2	104.33	104.5	<1:2	0	0
40	1:8	105.5	105.375	1:4	105.83	105.5	1:8	105.5	105.83	<1:2	0	0
48	1:16	106.67	106.5	1:16	106.5	106.375	1:16	106.67	106.5	<1:2	0	0
56	1:32	107.33	107.17	1:16	107.0	107.375	1:32	107.0	107.17	<1:2	0	0
64	1:128	107.33	107.5	1:64	107.5	107.5	1:128	107.5	107.375	<1:2	0	0
72	1:64	107.0	107.17	1:32	107.33	107.17	1:64	107.0	107.375	<1:2	0	0

新窗口打开
2.1.3.3 最佳TPCK-胰酶含量筛选 在TPCK-胰酶浓度为2—4 μg mL^-1,病毒含量可达最高,每1 mL病毒含量10^7.33—10^7.5TCID₅₀,每0.1 mL病毒含量10^7.375—10^7.5EID₅₀,HA效价为1﹕64—1﹕128,空白对照结果HA<1﹕2,TCID₅₀、EID₅₀均为0（表5）。节约成本考虑,TPCK-胰酶浓度选为2 μg mL^-1。
Table 5
表5
表5不同TPCK-胰酶浓度病毒含量比较（HA、TCID₅₀/mL、EID₅₀/0.1mL）
Table 5Comparison of virus titer in different TPCK-treated Trypsin concentrations (HA, TCID₅₀/mL, EID₅₀/0.1mL)

TPCK-胰酶 TPCK-treated Trypsin	1组Group 1			2组Group 2			3组Group 3			对照组 Control group
	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50
8 μg	1:2	102.67	102.375	1:2	102.67	102.375	1:2	102.5	102.375	<1:2	0	0
6 μg	1:2	102.67	102.375	1:2	102.5	102.5	1:2	102.5	102.17	<1:2	0	0
4 μg	1:128	107.5	107.5	1:128	107.33	107.5	1:64	107.33	107.5	<1:2	0	0
2 μg	1:128	107.5	107.375	1:128	107.33	107.5	1:64	107.33	107.5	<1:2	0	0
1 μg	1:32	106.67	106.67	1:32	106.5	107.33	1:32	106.67	106.83	<1:2	0	0

新窗口打开
2.1.3.4 最佳接毒方式筛选 无论吸附法还是直接接毒法,病毒含量均可达最高,每1 mL病毒含量10^7.33—10^7.5TCID₅₀,每0.1 mL病毒含量10^7.375—10^7.5EID₅₀,HA效价为1﹕64—1﹕128,空白对照结果HA<1﹕2,TCID₅₀ 、EID₅₀均为0（表6）。节约时间考虑,选用直接接毒法。
Table 6
表6
表6不同接毒方式病毒含量比较（HA、TCID₅₀/mL、EID₅₀/0.1mL）
Table 6Comparison of virus titer in different access poisoning (HA, TCID₅₀/mL, EID₅₀/0.1mL)

接毒方式 Virus inoculation mode	1组Group 1			2组Group 2			3组Group 3			对照组 Control group
	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50
吸附法 Adsorption method	1:128	107.5	107.5	1:128	107.5	107.5	1:64	107.33	107.375	<1:2	0	0
直接接毒法 Direct inoculation	1:128	107.5	107.375	1:128	107.5	107.5	1:128	107.33	107.5	<1:2	0	0

新窗口打开
2.1.3.5 最佳病毒代次筛选
（1）不同代次病毒的TCID₅₀比较 测定结果表明, 第1—4代、6—13代的每1 mL病毒含量在10^7.0—10^8.0TCID₅₀之间,第5代每1 mL病毒含量达到最高10^8.5TCID₅₀,空白对照TCID₅₀均为0（图3）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT
图3不同代次病毒TCID₅₀比较
-->Fig. 3Comparison of TCID₅₀ for viruses of different generations (TCID₅₀/mL)
-->

（2）不同代次病毒的EID₅₀比较 第1—4代、6—13代的每0.1 mL病毒含量均在10^7.17—10^8.375EID₅₀之间,第5代每0.1 mL病毒含量达到最高10^8.5EID₅₀,空白对照EID₅₀均为0（图4）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT
图4不同代次病毒EID₅₀比较
-->Fig. 4Comparison of EID₅₀ for viruses of different generations (EID₅₀/0.1mL)
-->

（3）不同代次病毒的HA效价比较 第1—3代、6—13代的HA效价在1﹕64—1﹕128之间,第4、5代HA效价可达最高1﹕256,空白对照结果HA<1:2（图5）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT
图5不同代次病毒HA效价比较
-->Fig. 5Comparison of HA for viruses of different generations
-->

（4）不同代次病毒含量比较 禽流感病毒在MDCK细胞上连续传代13代,第4、5代HA效价达到了1﹕256,其他代次为1﹕64—1﹕128;第4、5代病毒含量稳定在10^8.17—10^8.5EID₅₀/0.1 mL,其他代次均能达到10^7.17EID₅₀/0.1 mL,病毒含量能达到10^7.0TCID₅₀/mL,第3代以后均能保持在10^7.5TCID₅₀/mL以上。贴壁型MDCK细胞培养禽流感病毒在HA效价上没有明显优势,仅第4、5代达到鸡胚源毒种的国家标准。各代次病毒含量较为稳定,基本都高于鸡胚源国家标准（表7）。
Table 7
表7
表7不同代次病毒含量比较（HA、TCID₅₀/mL、EID₅₀/0.1mL）
Table 7Comparison of virus titer of different generations (HA, TCID₅₀/mL, EID₅₀/0.1mL)

代次 Generation	1组Group 1			2组Group 2			3组Group 3			对照组 Control group
	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50
1	1:64	107.0	107.17	1:64	107.0	107.17	1:64	107.0	107.17	<1:2	0	0
2	1:128	107.33	107.5	1:128	107.33	107.38	1:128	107.33	107.5	<1:2	0	0
3	1:128	107.67	107.83	1:128	107.67	107.5	1:128	107.67	107.5	<1:2	0	0
4	1:256	107.67	108.17	1:256	108.0	108.17	1:256	107.67	108.38	<1:2	0	0
5	1:256	108.33	108.5	1:256	108.33	108.5	1:256	108.33	108.5	<1:2	0	0
6	1:128	108.0	107.83	1:128	107.67	108.38	1:128	107.67	108.17	<1:2	0	0
7	1:128	107.67	107.83	1:128	107.67	108.17	1:128	107.67	107.83	<1:2	0	0
8	1:128	107.67	107.83	1:128	107.67	107.83	1:128	107.67	107.83	<1:2	0	0
9	1:128	107.67	107.83	1:128	107.67	107.83	1:128	107.67	107.5	<1:2	0	0
10	1:128	107.67	107.5	1:128	107.5	107.5	1:128	107.5	107.5	<1:2	0	0
11	1:128	107.5	107.5	1:128	107.5	107.5	1:128	107.33	107.38	<1:2	0	0
12	1:128	107.5	107.5	1:128	107.5	107.5	1:128	107.33	107.38	<1:2	0	0
13	1:128	107.5	107.5	1:128	107.33	107.5	1:128	107.33	107.38	<1:2	0	0

新窗口打开

2.2 病毒在悬浮MDCK细胞上的增殖试验

2.2.1 MDCK细胞细胞病变观察 对细胞接毒前后细胞状态进行了观察,24—72 h开始出现细胞破碎,崩
解,至72 h细胞全部脱落（图6）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT
图6接毒前后细胞病变情况
A接毒前细胞状态;B 接毒后24 h;C 接毒后36 h;D 接毒后48 h;E 接毒后60 h;F 接毒后72 h
-->Fig. 6Pathological changes of cells before and after vaccination (200×)
A: Pre-toxic cell state;B: Poisoning after 24 h;C: Poisoning after 36 h;D: Poisoning after 48 h;E: Poisoning after 60 h;F: Poisoning after 72 h
-->

2.2.2 病毒在悬浮MDCK细胞上病毒含量
2.2.2.1 预试验结果 鸡胚毒在悬浮MDCK细胞上
增殖,MOI取10^-2,在48 h时,病毒含量可达最高,每1 mL病毒含量10^7.0TCID₅₀,每0.1 mL病毒含量10^7.5EID₅₀,HA效价为1﹕512,空白对照结果HA<1﹕2,TCID₅₀、EID₅₀均为0（表8）。
Table 8
表8
表8病毒含量比较（HA、TCID₅₀/mL、EID₅₀/0.1mL）
Table 8Comparison of virus titer (HA, TCID₅₀/mL, EID₅₀/0.1mL)

时间 Time (h)	1组Group 1			2组Group 2			3组Group 3			对照组 Control group
	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50
24	1:64	105.0	105.17	1:32	105.33	105.375	1:2	103.0	103.375	<1:2	0	0
36	1:128	106.33	106.17	1:64	106.0	105.83	1:8	104.0	103.83	<1:2	0	0
48	1:128	106.0	105.375	1:512	107.0	107.5	1:64	104.67	104.375	<1:2	0	0
60	1:128	106.0	106.5	1:512	107.0	107.17	1:64	105.5	105.5	<1:2	0	0
72	1:128	105.67	105.625	1:512	106.33	106.5	1:64	105.0	104.17	<1:2	0	0

新窗口打开
2.2.2.2 悬浮MDCK细胞最佳接毒剂量 以上述试验结果为依据,进行悬浮毒传代试验,结果表明MOI取10^-2为病毒HA效价、TCID₅₀以及EID₅₀最稳定,最高（表9）。
Table 9
表9
表9不同MOI病毒含量比较（HA、TCID₅₀/mL、EID₅₀/0.1mL）
Table 9Comparison of virus titer for different MOI (HA, TCID₅₀/mL, EID₅₀/0.1mL)

MOI	1组Group 1			2组Group 2			3组Group 3			对照组 Control group
	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50
10-4	1:32	104.5	104.5	1:32	105.33	104.83	1:64	104.0	103.83	<1:2	0	0
10-3	1:64	105.5	106.0	1:32	105.67	105.5	1:64	106.0	105.83	<1:2	0	0
10-2	1:512	108.33	108.375	1:1024	108.5	108.5	1:1024	108.33	108.375	<1:2	0	0
10-1	1:256	107.5	107.17	1:256	107.0	107.17	1:128	106.67	107.17	<1:2	0	0

新窗口打开
2.2.2.3 悬浮MDCK细胞最佳收毒时间 在48 h时,病毒含量可达最高,每1 mL病毒含量10^8.33—10^8.5TCID₅₀,每0.1 mL病毒含量10^8.375—10^8.5EID₅₀,HA效价为1﹕512—1﹕1024,空白对照结果HA< 1﹕2,TCID₅₀、EID₅₀均为0（表10）。
Table 1
表1
表10 不同时间病毒含量比较（HA、TCID₅₀/mL、EID₅₀/0.1mL）
Table 10 Comparison of virus titer in different times (HA, TCID₅₀/mL, EID₅₀/0.1mL)

时间 Time (h)	1组Group 1			2组Group 2			3组Group 3			对照组 Control group
	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50
24	1:32	105.0	105.375	1:32	105.5	105.375	1:64	105.5	103.17	<1:2	0	0
36	1:128	106.67	107.17	1:128	107.67	107.5	1:256	107.33	107.83	<1:2	0	0
48	1:512	108.33	108.375	1:1024	108.5	108.5	1:1024	108.33	108.375	<1:2	0	0
60	1:512	107.67	108.0	1:1024	107.5	107.375	1:1024	107.67	107.5	<1:2	0	0
72	1:512	107.0	107.17	1:1024	107.33	107.17	1:1024	107.17	107.375	<1:2	0	0

新窗口打开
2.2.2.4 最佳TPCK-胰酶浓度试验 在TPCK-胰酶浓度为4—8 μg·mL^-1,每1 mL病毒含量10^8.0—10^8.5TCID₅₀,每0.1 mL病毒含量10^8.17—10^8.5EID₅₀,HA效价为1﹕512—1﹕1024,空白对照结果HA<1﹕2,TCID₅₀、EID₅₀均为0（表11）。节约成本考虑,TPCK-胰酶浓度选为4—8 μg·mL^-1。
Table 1
表1
表11 不同TPCK-胰酶浓度病毒含量比较（HA、TCID₅₀/mL、EID₅₀/0.1mL）
Table 11 Comparison of virus titer in different TPCK-treated Trypsin concentrations (HA, TCID₅₀/mL, EID₅₀/0.1mL)

TPCK-胰酶 TPCK-treated Trypsin	1组Group 1			2组Group 2			3组Group 3			对照组 Control group
	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50	HA	TCID50	EID50
2μg	1:2	104.67	104.375	1:2	103.67	102.375	1:2	103.5	103.375	<1:2	0	0
4μg	1:512	108.33	108.375	1:1024	108.5	108.5	1:1024	108.33	108.375	<1:2	0	0
8μg	1:512	108.0	108.17	1:512	108.33	108.5	1:1024	108.33	108.375	<1:2	0	0
12μg	1:512	107.67	107.5	1:128	107.17	107.33	1:64	107.17	106.83	<1:2	0	0

新窗口打开

3 讨论

以生物反应器大规模全悬浮培养动物细胞的技术,已被许多大型知名企业应用于病毒疫苗工业化生产,其生产规模已达数千升^[17,18],一些欧美国家已经批准,基于动物细胞培养生产的禽流感疫苗上市^[19,20,21],MDCK细胞最适宜生产甲型禽流感病毒和乙型禽流感病毒的三种细胞之一^[22,23]。笔者的试验认为,重组禽流感病毒在MDCK细胞上增殖的试验从以下几个方面进行。

3.1 接毒方式

病毒接毒方式分别采用了病毒吸附法和直接接毒法,两种方法病毒含量无差别,吸附法要进行多次操作,较繁琐,而直接接毒法,简化了病毒繁殖操作,不但减少了操作时间,而且最大限度的降低了污染几率,适用于规模化制备毒种。

3.2 接毒比例

一种是以MOI为接种单位,另一种以百分比为接种单位,在贴壁MDCK细胞中,以MOI为接种单位时需对细胞进行消化计数,过程比较繁琐,而采用百分比接种法较为方便,但两种方法获得的种毒的病毒含量并无差别,在病毒繁殖中都适用,可根据不同试验目的进行不同的选择。以百分比为接种单位需注意细胞传代时严格按照要求进行细胞计数与接种,以保证接毒时细胞的均一性。无论是以百分比为接毒单位,还是以MOI为接毒单位,其归根结底都是病毒数量的不同,适当的病毒数量可以更好地实现病毒的复制,从而更好的增殖^[16]。当病毒数量过多时,细胞在病毒的感染下迅速凋亡,破裂,同时还会产生大量不具有感染性的干扰缺损病毒颗粒,其基因组有缺损,故不能完成复制循环,而必须依赖于其同源的完全病毒才能复制。同时,由于基因组较其完全病毒小、复制更为迅速,在与其完全病毒共感染时更易占据优势,从而干扰其复制。当病毒数量过低时,病毒增殖速度降低,病毒大量增殖时间延长,用于产毒的大部分细胞已老化,影响产毒,最终病毒含量也不高。

3.3 收毒时间

本试验对收毒时间进行了筛选,确定了最佳的收获时间,收获的过早,病毒虽大量复制但未释放,病毒含量较低,收获时间过晚,细胞已完全破裂,死亡,病毒已没有寄生的宿主,部分病毒会失去活性,影响病毒含量,当细胞未死亡具有一定活性时,此时收获病毒含量最高,可作为最佳的收获时间。

3.4 TPCK-胰酶浓度

禽流感病毒感染细胞时需要先将 HA 基因裂解为HA1 和 HA2 才能感染人或禽的细胞,这种裂解可以通过胰酶处理增加其感染性^[24]。禽流感病毒在体外培养的动物细胞,一般都需要在病毒增殖过程中添加经TPCK处理的胰蛋白酶,能够对病毒囊膜表面的HA蛋白进行正确裂解^[25,26]。YOUIL等的研究发现TPCK-胰酶的存在与否对病毒增殖有很大影响,但随着TPCK-胰酶浓度增加对病毒增殖作用并没有影响^[27]。培养优化中在确定最佳TPCK-胰酶浓度时发现,在浓度为1—2 μg·mL^-1范围内,病毒含量随TPCK-胰酶浓度的增加而上升,但2—4 μg·mL^-1范围内,病毒含量无差别,出于成本考虑,将TPCK-胰酶浓度定为2 μg·mL^-1。在TPCK-胰酶浓度为6—8 μg·mL^-1范围内,病毒含量很低,这是因为TPCK-胰酶浓度过大,除裂解病毒外,还对MDCK细胞单层产生了消化作用,致使细胞生长和代谢产生了变化,部分细胞脱落,凋亡,病毒无法在细胞上有效增殖。

3.5 病毒培养条件

本试验对不同代次的重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1的病毒含量进行了比较,病毒经过在MDCK细胞上连续传代,逐渐适应细胞,CPE明显、稳定,病毒含量趋于稳定。TCID₅₀结果表明,病毒从第1代传至第5代,TCID₅₀总体呈上升趋势,在第5代时达到最高,每1 mL病毒含量达到10^8.5TCID₅₀,且重复性较好,产毒稳定。病毒从第6代传至第13代,TCID₅₀总体呈下降趋势,但下降幅度较小,1至13代,病毒TCID₅₀先升后降,相差在1.5个滴度之内,说明各代次之间TCID₅₀相差较小。EID₅₀结果表明,病毒从第1代传至第5代,EID₅₀总体呈上升趋势,在第5代时达到最高,每0.1 mL病毒含量达到10^8.5EID₅₀,且重复性较好,产毒稳定,病毒从第6代传至第13代,EID₅₀总体呈下降趋势,但下降幅度较小,1至13代,病毒EID₅₀先升后降,相差在1.5个滴度之内,说明各代次之间TCID₅₀相差较小。HA效价结果表明,在第5代可达1﹕256,相差在2个滴度之内,各代次之间HA效价相差很小。在实际生产中我们结合了HI抗体测定及免疫攻毒的结果确定最佳生产用代次为第5代。

4 结论

4.1 重组禽流感病毒H7N9

H7-Re1株各代次均可在MDCK细胞上稳定增殖,利用MDCK细胞可大量增殖病毒,获得高效价的毒种,降低污染几率,但在MDCK细胞上随着代次的增高HA基因、NA基因序列是否有所变化,发生突变这个问题值得思考,所以本试验对病毒传代进行了筛选,筛选出了最佳、最稳定的低代次毒种,最大限度地降低了基因突变率。禽流感病毒在MDCK细胞的优化培养虽有多人对其进行了研究^[28,29,30],但对H7亚型H7-Re1株在MDCK细胞上的培养优化及病毒代次筛选未见报道,所以本试验对其进行了研究,筛选出了病毒最佳的培养条件、最佳代次,为生产制备高效价的疫苗奠定基础。

4.2

通过悬浮MDCK细胞最佳接毒剂量、最佳收毒时间、最佳TPCK-胰酶浓度试验,为反应器放大生产重组禽流感病毒灭活疫苗（细胞源）提供了基础数据。重组禽流感病毒不应在悬浮MDCK细胞上传代超过5代,故在生产种毒库的建立应注意这一问题,选择合适的种毒库建立方法。
通过此试验提供两种重组禽流感病毒在MDCK细胞上驯化的方法,为生物反应器大规模全悬浮培养禽流感灭活疫苗提供了有力的保证,两种方法均可以放大用于生产。
The authors have declared that no competing interests exist.

---

参考文献文献选项 原文顺序
文献年度倒序
文中引用次数倒序
被引期刊影响因子