0 引言
【研究意义】在气候变暖成为全球性气象问题的背景下,极端天气事件的发生频率仍呈现增加趋势[1-2],局部地区的农业气象灾害事件多发[3],低温冷害成为全国性农业灾害,在玉米北方产区发生得尤为严重和频繁[4]。玉米属于喜温作物,低温对其生长发育影响较大,我国北方玉米产区每3—4年就会发生一次低温冷害[5],导致减产20%—30%[6],成为限制玉米产量提高的一个重要因素[7]。生育后期的低温威胁导致玉米灌浆过程不能顺利完成,进而造成减产[8],因此研究灌浆期低温对玉米籽粒生长发育过程的影响,能够为生产中抗御低温冷害提供理论依据。【前人研究进展】研究发现,低温胁迫下玉米的光合性能受到限制,群体产量明显降低[9-12],这一过程是玉米在逆境胁迫下,各组织器官生长发育变化的综合结果。籽粒作为玉米最终形成产量的重要库器官,对温度胁迫较为敏感[13-14],低温对玉米籽粒发育及内部的生理机制影响显著[15]。前人研究发现低温胁迫扰乱了作物内源激素平衡[16-18],降低了植株体内淀粉和蛋白质等大分子物质的含量,增加了可溶性糖和游离氨基酸等小分子物质含量[19]。淀粉是玉米籽粒主要成分,而籽粒发育过程中,与淀粉积累合成代谢密切相关的可溶性酸性转化酶（soluble acid invertase,SAI,EC 3.2.1.26）,蔗糖合酶（sucrose synthase,SS,EC 2.4.1.13）,可溶性淀粉合成酶（soluble starch synthase,SSS,EC 2.4.1.21）和腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP- glucose pyrophosphorylase,APGase,EC 2.7.7.21）的活性对外界环境条件的变化十分敏感[20],籽粒灌浆期间环境条件的改变将直接影响籽粒中贮存物质的合成[21-22]。玉米籽粒发育过程中,受内源激素及淀粉积累相关酶影响,不同粒位的籽粒发育差异较大,逆境胁迫下弱势粒易产生败育[23-24]。【本研究切入点】在逆境胁迫下,玉米果穗不同粒位籽粒因库活性的差异,强、弱势粒生长发育存在明显差异,直接关系到玉米粒重和产量的高低。目前低温胁迫对灌浆期玉米不同粒位籽粒生长发育影响的研究较少,进一步揭示低温胁迫下玉米强、弱势粒的物质积累和库活性的变化有重要意义。【拟解决的关键问题】本文通过玉米籽粒离体培养的方式,利用人工气候箱创建低温环境,研究低温对玉米灌浆过程中强、弱势粒干物质和淀粉的积累,以及内源激素含量和淀粉积累相关酶活性变化的影响。揭示低温胁迫下玉米籽粒灌浆过程中籽粒物质积累及内源激素、淀粉积累相关酶的变化规律,为生产上采取有效措施防控低温冷害提供依据。1 材料与方法
1.1 试验材料
本试验选用郑单958为试验材料,2015年6月15日播种于中国农业大学北京上庄实验站（40°08′ 25″N,116°10′ 39″E,海拔49 m）。试验地为粉砂质潮土,土壤地力中等,基础养分为有机质1.47%,全氮含量0.86 g·kg-1,有效磷22.76 mg·kg-1,速效钾63.06 mg·kg-1。试验田无前茬作物,玉米季外未种植其他作物,常规田间管理。于玉米开花吐丝前,选择生长均匀一致健壮的植株进行雌穗套袋,开花后统一人工授粉。籽粒离体培养试验参考陈素省等[25]的方法,在中国农业大学农业部农作制度重点实验室进行,于3 DAP（day after pollination,DAP）取雌穗回实验室进行籽粒离体培养,离体籽粒取样参考张凤路等[14]的方法。离体籽粒在无菌条件下切穗取样,弱势粒取样部位为雌穗顶部向下1—5 cm,强势粒取样部位为雌穗基部向上第18至20粒位区间,取样后籽粒在无菌操作条件下接种到灭菌培养基。接种后的籽粒在25℃恒温下暗培养1 d,5 DAP开始温度处理。设置4个处理,分别为LTS（低温处理强势粒）、LTI（低温处理弱势粒）,NTS（常温处理强势粒）、NTI（常温处理弱势粒）,每个处理4次重复,每个重复至少包含30颗籽粒;培养条件由人工气候箱（BIC-300型,上海博讯）实现,低温处理设置14℃至19℃的梯度温度,平均温度为16℃,对照处理设置22℃至27℃的梯度温度,平均温度为25℃;人工气候箱不设光照,培养过程在黑暗条件下进行,培养环境湿度为85%。
1.2 籽粒离体培养方法
参考GENGENBACH[26]的试验方法,果穗接种块按照籽粒与穗轴比例1﹕9取样[27],在无菌操作环境下接种到培养基。培养基制备参考CULLY[28]和赵丽晓等[24]的方法,籽粒接种到培养基后,置于人工气候箱进行培养。1.3 测定项目与方法
1.3.1 籽粒干重 分别在10、20、30、40、50 DAP取样,籽粒于105℃杀青30 min,80℃烘干后测定样品干重。1.3.2 灌浆速率 玉米籽粒灌浆过程应用Logistic曲线拟合,曲线方程为W=a/(1+be-ct)。式中,籽粒干重（W）为因变量,授粉后天数（t）为自变量,b、c为常数,a为理论籽粒最大干重。对拟合曲线方程进行求导和积分后,得到籽粒灌浆速率V的方程： V=dWdt=abce-ct/(1+be-ct)2 [29]。
1.3.3 籽粒淀粉含量 测定干重后的籽粒研磨成粉,采用酸水解-DNS法[30]测定玉米籽粒淀粉含量。
1.3.4 激素含量的测定 取10、30 DAP籽粒鲜样,利用酶联免疫法[31-32]测定籽粒IAA、ZR、GA3和ABA含量,酶联免疫试剂盒由中国农业大学提供,每个样品分别重复测定3次,取平均值。IAA、ZR、GA3和ABA的回收率分别为94.3%、89.2%、90.5%和91.8%。
1.3.5 淀粉积累相关酶活性 在10、30 DAP取籽粒鲜样,按照NAKAMURA[33]和ZINSELMEIER等[34]的试验方法进行可溶性酸性转化酶（SAI）、蔗糖合酶（SS）、可溶性淀粉合成酶（SSS）和腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（APGase）4种酶的提取及活性的测定。
1.4 数据分析
采用IBM SPSS Statistics 21软件统计分析数据,采用Duncan’ s法进行显著性检验,文中图表采用Microsoft Excel 2013制作。2 结果
2.1 灌浆期低温对籽粒干物质积累的影响
2.1.1 籽粒干重变化规律 不同温度处理下,玉米强、弱势粒的干重积累变化规律相同,呈现“S”形曲线变化（图1-A）。灌浆初期,低温胁迫处理与对照处理差异不显著,从20 DAP开始,低温胁迫处理的强、弱势粒干重都显著低于对照处理,且籽粒干重增长速度也慢于对照,50 DAP低温处理强势粒干重较对照低47.58%,弱势粒干重较对照低50.95%,弱势粒干重受低温影响幅度大于强势粒。2.1.2 利用Logistic方程模拟籽粒灌浆 利用Logistics方程W=a/(1+be-ct)对籽粒物质积累的动态规律进行模拟,方程拟合后参数见表1。各处理拟合方程经统计检验,方程决定系数都在0.98以上,均达到极显著水平,方程拟合度较好。受低温影响,玉米籽粒活跃灌浆期时间延长,其中强势粒延长7.24 d,弱势粒延长5.77 d。低温胁迫下,玉米籽粒最大灌浆速率和平均灌浆速率均减小,强势粒籽粒最大灌浆速率减少58.30%,弱势粒减少58.85%,强势粒籽粒平均灌浆速率减少55.89%,弱势粒减少57.57%。
2.1.3 籽粒灌浆速率的变化规律 由图1-B可知,各处理强、弱势粒的灌浆速率都随着灌浆时间的增加而加快,峰值出现在30 DAP左右,随即呈现下降趋势,在50 DAP达最低值,强、弱势粒有相似的变化规律。在10—40 DAP,低温处理降低了籽粒灌浆速率,强、弱粒均表现为随灌浆时间延续,灌浆速率呈先增加后减小的变化规律,但峰值出现时间要晚于对照处理。在30 DAP,低温处理强势粒和弱势粒灌浆速率均低于对照处理。在50 DAP,低温处理强、弱势粒灌浆速率均高于对照处理。可见,籽粒经低温处理后,灌浆前期的灌浆速率增加缓慢,而且后期灌浆速率降低也缓慢,表现为籽粒灌浆持续时间的延长。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1玉米灌浆期低温胁迫下籽粒干重及灌浆速率的变化
-->Fig. 1Changes of kernel dry weight and grain-filling rate under low temperature during maize grain filling period
-->
Table 1
表1
表1玉米灌浆期低温下籽粒灌浆模型与灌浆参数
Table 1The grain filling process model and grain filling parameters under low temperature stress during maize grain filling period
| 处理 Treatment | 粒位 Grain position | 拟合方程 Fitting equation | 活跃灌浆期 D (d) | 最大灌浆速率 Gmax (mg·grain-1·d-1) | 平均灌浆速率 Gmean (mg·grain-1·d-1) | 相关系数Correlation coefficient |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 常温 Normal temperature | 强势粒 Superior kernels | W=0.2226/(1+62.5279e-0.1582t) | 16.65 | 8.80 | 3.99 | 0.9970** |
| 弱势粒 Superior kernels | W=0.1832/(1+51.7854e-0.1555t) | 16.94 | 7.12 | 3.30 | 0.9954** | |
| 低温 Low temperature | 强势粒 Superior kernels | W=0.1428/(1+17.3857e-0.1079t) | 23.89 | 3.67 | 1.76 | 0.9907** |
| 弱势粒 Superior kernels | W=0.1083/(1+15.2869e-0.1162t) | 22.71 | 2.93 | 1.40 | 0.9850** |
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2.2 灌浆期低温对籽粒内源激素含量的影响
玉米籽粒内源激素的含量受低温胁迫后发生明显改变（图2）。在10DAP,低温处理后,籽粒IAA含量显著低于对照处理,且弱势粒降低幅度大于强势粒;GA3的含量均高于对照,其中强势粒差异显著,弱势粒差异不显著;ZR及ABA的含量均表现为强、弱势粒显著低于对照,且弱势粒减低幅度大于强势粒。在30 DAP,低温处理下强势粒IAA含量与对照差异不明显,而弱势粒的IAA含量显著低于对照;GA3含量受低温影响较小,强、弱势粒均与对照差异不显著;ZR含量表现为强势、弱势粒均低于对照,但强势粒差异不显著,而弱势粒差异显著;ABA含量受低温影响,强、弱势粒均高于对照处理,且处理间差异显著,其中强势粒增加幅度大于弱势粒,随着低温胁迫时间的累加,低温对玉米籽粒内源激素含量的影响依然存在,且对弱势粒的影响更加明显。可见,低温引起了籽粒内源激素含量的紊乱,严重影响了受多种激素调控的籽粒灌浆过程。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2灌浆期低温胁迫下籽粒内源激素的变化
-->Fig. 2Changes of kernel hormone content under low temperature during maize grain filling period
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2.3 灌浆期低温对籽粒淀粉含量的影响
低温胁迫下,玉米强、弱势粒淀粉含量变化趋势基本一致（图3）。低温处理强、弱势粒淀粉含量均低于常温处理,在整个灌浆过程中其变化趋势与籽粒干重及灌浆速率表现保持一致。在10 DAP低温处理下,强、弱势粒淀粉含量与常温处理差异不显著,从20 DAP开始,低温处理下强弱势粒淀粉含量均显著低于常温处理,且20 DAP强、弱势粒淀粉含量较常温处理降低幅度最大,其中强势粒降低65.97%,弱势粒降低66.35%。随灌浆时间推进,从30 DAP开始,各处理间淀粉含量差距呈逐渐增大趋势,在50 DAP达到最大,低温胁迫下,强势粒比常温低53.27%,弱势粒比常温低56.32%,说明低温处理对籽粒最终淀粉含量的影响,弱势粒大于强势粒。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3玉米灌浆期低温胁迫下籽粒淀粉含量的变化
-->Fig. 3Changes of kernel starch content under low temperature during maize grain filling period
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2.4 灌浆期低温对籽粒积累相关酶活性的影响
从图4可知,受低温胁迫影响,玉米籽粒灌浆前期及灌浆中期的酸性蔗糖转化酶（SAI）和蔗糖合酶（SS）的活性均低于对照,灌浆期玉米籽粒淀粉合成底物转化效率因低温胁迫而受到限制。在10 DAP,低温处理强、弱势粒的SAI、SS活性均显著低于对照,强势粒的两种酶活性降低程度均大于弱势粒。在30 DAP,低温处理强势粒的SAI及SS活性显著低于对照,其中弱势粒SAI活性的降低幅度大于强势粒,而SS活性降低幅度小于的强势粒。低温胁迫下,玉米籽粒可溶性淀粉合酶（SSS）和ADPG焦磷酸化酶（APGase）活性显著低于对照处理（图4）,导致玉米籽粒淀粉的合成过程受限。在10 DAP,低温处理强、弱势粒的SSS、APGase活性与对照相比较均有大幅下降,表明在灌浆前期,低温对强、弱势粒的两种酶的影响较大。在30 DAP,低温处理强势粒的SSS、APGase活性显著低于对照处理,弱势粒SSS活性显著低于对照,而AGPase活性与对照差异不显著。在灌浆中期,低温对SSS、AGPase两种酶活性的影响表现为强势粒大于弱势粒,且对SSS活性的影响大于对APGase活性的影响。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图4玉米灌浆期低温胁迫下籽粒淀粉合成相关酶活性的变化
-->Fig. 4Change of activities of enzymes related to starch synthesis in kernel under low temperature during maize grain filling period
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2.5 灌浆期低温处理下玉米籽粒灌浆速率、籽粒内源激素含量及淀粉积累相关酶活性间的相关分析
通过灌浆速率（V）模拟方程计算10、30 DAP的强、弱势粒灌浆速率,并与10 DAP和30 DAP强、弱势粒内源激素含量及淀粉积累相关酶活性进行相关分析,结果见表2。由表可知,低温处理后,玉米籽粒灌浆速率与GA3含量呈显著负相关,与SSS、AGPase活性呈极著正相关。各激素含量之间,GA3与IAA及ZR呈显著负相关,IAA与ZR呈显著正相关。各淀粉积累相关酶活性之间,SSS与AGPase呈极显著正相关。各激素含量与淀粉合成酶活性之间,SSS、AGPase与GA3呈极显著负相关,与IAA及ZR呈显著正相关。可见,低温降低玉米的灌浆速率,可能与GA3含量的增加及SSS、AGPase活性的降低有关。Table 2
表2
表2灌浆期低温下玉米籽粒灌浆速率与籽粒内源激素含量及淀粉积累相关酶活性变化的相关分析
Table 2Correlation coefficients between grain filling rate and change of hormone contents and activities of enzymes related to starch synthesis in kernel under low temperature during maize grain filling period
| 指标 Index | 灌浆速率 Grain-filling rate | 生长素 IAA | 赤霉素 GA3 | 玉米素 ZR | 脱落酸 ABA | 可溶性酸性转化酶 SAI | 蔗糖转化酶 SS | 可溶性淀粉合成酶 SSS | ADPG焦磷酸化酶 AGPase |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 灌浆速率 Grain-filling rate | 1.000 | ||||||||
| IAA | 0.496 | 1.000 | |||||||
| GA3 | -0.752* | -0.772* | 1.000 | ||||||
| ZR | 0.471 | 0.801* | -0.748* | 1.000 | |||||
| ABA | -0.140 | -0.129 | 0.051 | -0.267 | 1.000 | ||||
| SAI | -0.538 | -0.009 | 0.318 | 0.014 | -0.532 | 1.000 | |||
| SS | -.518 | 0.185 | 0.258 | -0.190 | 0.030 | 0.647 | 1.000 | ||
| SSS | 0.796* | 0.758* | -0.893** | 0.831* | -0.257 | -0.374 | -0.409 | 1.000 | |
| AGPase | 0.904** | 0.746* | -0.863** | 0.595 | -0.121 | -0.466 | -0.252 | 0.899** | 1.000 |
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3 讨论
灌浆过程是玉米产量形成的重要时期,也是籽粒发育和物质积累的关键时期,该阶段对环境温度要求较高,最适宜的灌浆温度为日均22℃—24℃[35]。灌浆过程对低温比较敏感[36],温度低于18℃,就会受到限制[37]。低温对灌浆前期影响最大[38],该时期是玉米产量受温度胁迫影响的敏感期[39]。研究表明,灌浆期低温降低籽粒灌浆速率,进而延缓了整个灌浆进程[40],最终导致籽粒物质积累不足,温度每降低1℃,玉米减产300 kg·hm-2[41]。本研究发现,低温能够延长玉米籽粒的活跃灌浆时间6—7 d,但同时也降低了灌浆速率,且灌浆时间的延长无法补偿灌浆速率的降低。遭遇低温后,玉米灌浆前期的籽粒灌浆速率受影响较大,授粉后0—20 d,低温处理强、弱势粒均表现出灌浆速率增长缓慢,峰值低于对照,且峰值出现时间晚于对照的现象,从而降低了籽粒干物质的积累效率,最终导致籽粒干重的显著降低,这与笔者前期研究结果一致[42]。植物内源激素对玉米籽粒的发育起着非常重要的调节作用[18],其对逆境胁迫异常敏感,低温扰乱了籽粒中内源激素平衡,干扰了籽粒正常的生长发育过程[16, 43]。前人在对玉米籽粒的灌浆速率及胚乳细胞增殖速度的研究中发现,在籽粒灌浆前期,这两项指标与籽粒中ZR、IAA及ABA的含量呈显著正相关,在活跃灌浆期与籽粒中GA3的含量呈显著负相关[44]。在本研究中,同样发现在灌浆前期,籽粒灌浆速率与GA3含量表现为显著负相关,籽粒GA3含量因低温胁迫而显著提高,其中强势粒显著提高24.7%,而弱势粒提高不显著。籽粒的IAA、ZR及ABA的含量因低温胁迫而显著降低,其中,强势粒3种激素分别降低了44.1%、39.3%、5.9%,弱势粒分别降低了56.6%、34.6%、12.1%,低温胁迫引起内源激素的变化,是导致灌浆初期籽粒灌浆速率低于对照的主要原因之一。研究表明,胚乳细胞的平均增殖速率和最大胚乳细胞数与ZR高含量呈显著正相关,玉米籽粒胚乳细胞的分裂受ZR的调控[45]。在本研究中,灌浆初期受低温影响,玉米籽粒GA3含量升高而ZR含量降低,且GA3含量与ZR含量表现为负相关,这对玉米籽粒胚乳细胞的分裂不利,进而影响玉米籽粒库容的形成,降低了籽粒同化物积累的能力。在灌浆中期,籽粒GA3含量受低温影响变化不大,ABA含量受低温的影响要高于对照处理,但此时玉米灌浆速率低于对照,说明在长时间低温胁迫下,籽粒ABA含量虽然升高,但不能增加籽粒灌浆速率,反而会抑制籽粒灌浆。在灌浆中期,低温处理下玉米强、弱势粒的IAA及ZR含量低于对照,其中强势粒IAA含量比对照低6.7%,弱势粒IAA含量比对照低38.4%,表明在灌浆中期,低温胁迫对弱势粒的影响尤为显著,导致弱势粒粒重及灌浆速率受低温影响较强势粒更大。
灌浆期低温导致籽粒干物质充实不良,这与籽粒保持最大灌浆速率时间缩短,最大灌浆速率、平均灌浆速率降低[46],淀粉含量降低关系密切[47]。本研究中,低温胁迫影响了玉米籽粒的淀粉积累,随着低温胁迫时间的延长和危害的累积,在灌浆过程中,低温处理强、弱势粒淀粉含量显著低于常温处理,导致籽粒干物质积累量明显减少。在50 DAP,强势粒重减少了47.6%,弱势粒重减少了50.9%,表明在离体培养条件下,低温对弱势粒干物质积累的影响程度略大于强势粒。
研究表明,灌浆前期是籽粒库容形成的关键时期,也是籽粒库活力最活跃的时期[48],此时玉米灌浆过程受籽粒库活性影响较大[49]。在灌浆初期,酸性蔗糖转化酶（SAI）是参与蔗糖降解的主要酶,其活性是衡量籽粒库活力的主要指标[50]。本研究中灌浆初期低温处理显著降低了玉米强、弱势粒的SAI活性,减弱了籽粒蔗糖转化能力,影响了籽粒蔗糖代谢,导致灌浆前期灌浆速率及籽粒干重增长缓慢,表现为这两项指标都显著低于对照。在灌浆期协助籽粒将同化物质有效转化为淀粉的是蔗糖合酶（SS）、淀粉合酶（SSS）和ADPG焦磷酸化酶（AGPase）等[22],灌浆期低温降低了以上淀粉积累合成关键酶的活性[51]。本研究发现,籽粒灌浆速率同SSS及AGPase的活性关系密切,呈显著正相关。灌浆前期低温显著降低了SAI及SS的活性,降低了淀粉合成底物的生成及供应能力,同时也显著降低了SS、AGPase的活性,限制了同化产物的转化积累。灌浆后期低温胁迫对SAI、SS、SSS及AGPase活性的负面影响依然存在,降低了淀粉的合成底物的转化和淀粉积累效率,制约了淀粉合成的直接供体ADPG的产生,限制了淀粉链的延长,导致淀粉积累不足,在灌浆后期强势粒SSS和AGPase活性降低程度要高于弱势粒,这可能是导致最终强势粒淀粉含量降低程度大于弱势粒的主要原因之一。
4 结论
低温处理导致玉米强、弱势粒的灌浆速率的降低,是造成籽粒干物质积累减少的重要原因。玉米籽粒受低温影响,在灌浆前期,籽粒生长素（IAA）、玉米素（ZR）、脱落酸（ABA）含量减少,可溶性酸性转化酶（SAI）活性降低,导致库活性不足,库容量减少。在灌浆中期,籽粒淀粉合成中底物的供应及淀粉的合成过程受低温限制,导致籽粒淀粉合成不足,含量降低。低温对玉米强、弱势粒的灌浆过程都造成较大的影响,且对弱势粒的影响大于强势粒。The authors have declared that no competing interests exist.
