2010年以来,中国蔬菜种植面积从1.9×107 hm2增至2015年的2.2×107 hm2,蔬菜生产总量稳定增长,2015年全国蔬菜生产总量约为78 526. 7万t,比2010年增长20.6%[1]。然而,在蔬菜生长发育过程中,常常遭受非生物逆境的胁迫,严重影响蔬菜作物的产量及品质。
非生物逆境是对植物生长不利的各种环境因素的总称, 也称为环境胁迫, 如干旱、盐、极端温度、重金属等。当蔬菜作物面临非生物胁迫时,会启动一系列基因表达调控进程,诱导相关基因/转录因子的激活表达,这些逆境响应基因的表达进一步诱发植物体做出各种生理反应以抵抗和缓解逆境所致的影响。因此,研究蔬菜抗逆过程中的关键调控因子以及相应的逆境响应功能基因,成为蔬菜非生物逆境研究的热点。在中科院与汤森路透联合发布《2015研究前沿》中,植物抗逆性的研究占据了农业、植物和动物学领域研究的8个热点前沿,组成了“植物应对生物和非生物胁迫的分子机制和调控”前沿群。本文就近年来国内外蔬菜非生物逆境方面的研究进展进行综述及展望。
1 干旱胁迫
干旱胁迫影响植物的生长、发育和繁殖,是最不利于植株生长的因素之一,也是研究最多的逆境因子之一[2]。干旱胁迫对植物形态结构和生理功能的影响十分广泛。植物生物量、水分利用效率、光合作用、渗透调节能力、细胞膜稳定性、抗氧化防御系统和激素水平等指标常常被用来评价植物抗旱性的高低。经过漫长的进化过程,植物形成了一系列信号传导机制以抵御干旱胁迫,包括干旱胁迫信号的感知、第二信使的产生、信号转导和信号网络的形成[3]。信号转导的结果是相关基因的表达和蛋白质的合成,这可能会导致渗透系统和抗氧化系统的变化,最终提高植株对干旱逆境的抵抗能力[4]。耐旱性是一系列的分子、细胞和生理过程综合作用的结果,包括多种基因的诱导和抑制,各种渗透调节物质的积累,抗氧化系统的提高,蒸腾作用减弱以及植株生长抑制等。在这样的背景下,阐明控制、感知与传导逆境信号的分子机制非常重要[5]。研究者利用现代遗传学和功能基因组学的方法,如转录组学、蛋白质组学和代谢组学,深入研究了干旱胁迫响应中的关键基因。这些关键基因编码的蛋白质包括转录因子、蛋白激酶和蛋白磷酸酶,以及具有代谢和调控功能的蛋白质,如水通道蛋白（Aquaporin）、离子转运蛋白（ion transporter）、热激蛋白（heat shock protein,HSP）和LEA蛋白（late embryogenesis abundant protein）。转录因子通过调节下游响应逆境的基因在调节多种非生物胁迫中起着关键作用。转录因子通过与启动子特定区域相结合调控不同逆境相关基因的表达[6,7]。在特定的时间,这些调控基因表达的遗传修饰可以极大地影响植物的抗逆性,因为其进一步调控许多下游应激反应基因[8,9]。1.1 抗旱功能基因
水不仅是合成细胞中多种生命物质的重要底物,同时参与调节植物体内营养代谢和渗透平衡。无论是整个植物或是细胞水平,水分吸收和膜运输系统对植物的生长和发育是必需的。水通道蛋白介导植物中的水分跨膜运输,是调节水分吸收与转运的关键。近年来,它已成为植物逆境分子生物学的研究热点。水的跨膜运输主要由水通道蛋白家族实现,植物对非生物胁迫的反应,会导致植物的水分短缺,影响植物生长发育。抵御逆境胁迫在很大程度上取决于其调控能力[10]。LI等[11]筛选了在番茄根中表达量较高的3个质膜型内在蛋白（plasma membrane intrinsic proteins）基因SlPIP2;1、SlPIP2;7、SlPIP2;5,并转入拟南芥和番茄植株中,过表达植株在干旱胁迫下表现出更强的生长势;发芽率、根系导水率和存活率都显著提高。在干旱胁迫下,过表达番茄具有较高的相对含水量,而丙二醛（MDA）含量则较低。辣椒水通道蛋白（Tonoplast intrinsic proteins）基因CaTIP1-1在花、果、种子中表达高于根、茎、叶,该基因受0.15 mol∙L-1 NaCl、0.15 mol∙L-1甘露醇、5 mmol∙L-1水杨酸（SA）和100 μmol∙L-1脱落酸（ABA）诱导上调表达[12]。病毒诱导该基因沉默后,植株表现矮化[12]。超量表达CaTIP1-1增强了细胞的活力、提高了活性氧清除能力,使转基因烟草对干旱胁迫的抗性增强[12]。辣椒质膜内在蛋白CaPIP1-1定位在质膜和其他亚细胞器,该基因在果实中表达量最高,低温、盐、甘露醇、脱落酸和辣椒疫霉菌侵染处理后上调表达[12]。病毒诱导该基因沉默后,辣椒植株矮化,离体叶片对干旱胁迫的抗性降低[12]。QIAN等[13]发现当黄瓜幼苗浸泡在PEG和NaCl溶液中,根中水通道蛋白AQP的表达下降,根系导水率的下降可能是由于水通道蛋白活力的下降。CsPIP1;2和CsPIP2;4表达的下降导致叶片和叶片细胞的导水率下降。这些结果表明,黄瓜的水通道蛋白介导黄瓜幼苗的水分运输[13]。SlSlZ1（SAP and Mizl）蛋白可以调节类泛素化过程,ZHANG等[14]在番茄中扩增得到一个SlSlZ1,该基因的表达受到干旱胁迫的诱导,在烟草中过表达SlSlZ1,经过干旱处理后,转基因植株降低了ROS的积累,并提高了脯氨酸含量,表现出更强的抗旱能力。LIU等[15]在番茄中克隆得到了一个ShDHN（SK3-type dehydrin）,ShDHN是番茄中的一类脱水蛋白,表达受到不同逆境胁迫的诱导。在番茄中过表达ShDHN,转基因植株积累了更高含量的脯氨酸,提高了抗氧化酶的活性,提高了转基因植株对干旱胁迫的抗性。
1.2 抗旱转录因子
在拟南芥中,目前鉴定已知的转录因子家族主要包括：AREB、DREB、MYB、WRKY、NAC和bZIP家族。DREB类转录因子在植物响应非生物胁迫的过程中起着重要的作用。JIANG等[16]利用酵母文库分离克隆得到了一个番茄的SlDREB1,SlDREB1在根中的表达显著高于茎中,其表达受到干旱和盐胁迫的诱导。SlDREB1在拟南芥中表达的结果表明,经过干旱处理后,过表达拟南芥植株的抗旱性显著高于对照。凝胶迁移实验（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）结果分析表明,SlDREB1蛋白可以与下游基因启动子上CCGAC的元件相结合进而调控下游基因的表达。ERD15受到SlDREB1的直接调控,进而提高了转基因植株的抗旱性[16]。LIU等[17]克隆分离得到了一个甘蓝的DREB1。为进一步研究BpDREB1的功能,在拟南芥中过表达该基因,结果表明干旱胁迫后转基因植株的可溶性糖和脯氨酸含量显著高于对照,转基因植株表现出更强的抗旱性。
WRKY转录因子是一类植物特有的转录因子,参与到不同的生物胁迫和非生物胁迫的调节过程中。SUN等[18]扩增得到一个番茄的SlWRKY39,其表达受到盐胁迫和干旱胁迫的诱导。在番茄中过表达SlWRKY39,转基因植株积累了更多的脯氨酸和更低的MDA,逆境相关基因SlRD22和SlDREB2A的表达高于对照植株。SlWRKY39作为一个转录激活因子通过提高抗逆基因SlRD22和SlDREB2A的表达提高了植株的抗旱性[18]。
NAC转录因子是一类植物特有的转录因子,其在植物响应逆境胁迫的过程中起着十分重要的作用。ZHU等[19]发现番茄NAC转录因子SlNAC4的表达受到逆境胁迫的诱导,RNAi干扰番茄SlNAC4后,转基因番茄植株受到的逆境伤害更大,生长状况显著弱于对照植株,叶片叶绿素含量和相对含水量显著降低。在RNAi干扰番茄植株中,许多逆境相关基因的表达显著下降,表明SlNAC4作为一个转录激活因子参与番茄的抗旱反应[19]。WANG等[20]分离克隆得到一个番茄的SlNAC11,利用RNAi技术沉默该基因,结果表明转基因番茄的抗旱性降低,表现在叶绿素含量和种子萌发率的降低,而丙二醛的含量显著升高。
bHLH转录因子是一类植物特有的转录因子,响应不同的生物胁迫和非生物胁迫。FENG等[21]扩增得到了一个MYC类的bHLH转录因子SlICE1a（inducer of CBF expression）。为进一步研究SlICE1a的功能,在烟草中过表达SlICE1a,转基因植株的耐旱性显著提高,SlICE1a通过激活下游基因CBF3/DREB1A（C-repeat binding factor/dehydration resistance element binding protein 1）的表达,从而提高转基因植株的抗旱性。bZIP类转录因子是一类植物特有的转录因子,参与不同的生物学过程和非生物胁迫的响应。ORELLANA等[22]在番茄中克隆得到一个SlAREB1（ABA responsive element binding protein）,该基因是ABF（ABRE binding factors）亚家族中的一员,其表达受到干旱胁迫的诱导。在番茄中过表达SlAREB1,提高了转基因植株的抗旱性。
2 盐胁迫
盐胁迫是指土壤中盐分过多对植物正常生长发育所造成的伤害作用,也称为盐害。盐害是全球作物减产的主要原因之一,全球约有7%的土地受到盐渍化的威胁[23],在中国土壤盐渍化也日益严重。土壤盐碱化严重影响农业的安全生产和健康发展,是当今世界较为严重的生态环境和社会经济问题之一。植物抵御盐胁迫的有效方法之一是维持细胞内离子平衡,防止Na+积累造成毒害,SOS（salt overly sensitive）途径是维持细胞内离子平衡的重要信号通路,它在调节Na+/K+稳态和耐盐性中起重要作用。SOS途径的主要成员包括能够调节根部Na+外排和木质部Na+装载的质膜Na+/H+ 逆向转运蛋白SOS1,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶SOS2和钙结合蛋白SOS3。
在酵母中首次证实在盐胁迫下SOS1能够特异性的转运Na+,sos突变体的生理分析与基因表达的研究表明拟南芥中SOS1参与离子从胞内向维管束或表皮细胞周围介质的运输,从而保持根细胞中Na+的低浓度[24]。
SOS3感应由盐胁迫引起的Ca2+信号,与Ca2+结合后SOS3能够结合并激活SOS2[25,26],随后发现SCaBP8/CBL10（SOS3-like calcium binding protein/ Cineurin B-like）同样能够调节SOS2活性,SCaBP8/ CBL10主要在茎中发挥作用,而SOS3主要在根中发挥作用[27]。SOS2磷酸化SCaBP8从而增强SCaBP8- SOS2复合物的稳定性[28],SOS3-SOS2 /SCaBP8-SOS2复合物将SOS2运输至质膜从而激活SOS1的活性,将Na+排出细胞[27,29-30]。
SOS1的活性调节并不仅仅依赖于SOS3-SOS2复合物,SOS1是PLD(phospholipase D)信号通路的靶蛋白,在盐胁迫下参与离子传感与动态平衡调节。盐处理下,拟南芥PLDα1酶活性增强,引起第二信使磷脂酸（phosphatidic acid,PA）瞬时迅速积累,PA激活MPK6(mitogen-activated protein kinase 6),MPK6直接磷酸化SOS1。PLDα1及MPK6的功能缺失突变体对盐胁迫更为敏感。尽管PLD信号通路通过SOS1调节离子排斥和内稳态的维持,但它对SOS1的调节似乎平行于SOS3-SOS2复合物的调节[31]。有报道发现GI（GIGANTEA）是SOS途径上的负调控因子,GI通过与SOS2结合从而抑制SOS1在无胁迫情况下的激活[30]。Na+外排及离子平衡的调节机制比目前理解的更为复杂,SOS信号通路并不是控制Na+外排的唯一方式。
OLÍAS等[32]发现番茄质膜Na+/H+逆向转运蛋白SlSOS1通过维持离子平衡和和调节植物器官中Na+的分配,使Na+ 大量积累在茎中,从而保护根和光合器官免受Na+毒害,在番茄耐盐中发挥重要的作用。BELVER[33]和HUERTAS[34]等先后发现番茄SlSOS2/ SLCIPK24（calcineurin-interacting protein kinase）和SlSOS2.1增强番茄过表达植株的耐盐性,SlSOS2和SlSOS2.1能够调节SlSOS1和Na+/H+逆向转运蛋白（LeNHX2和LeNHX4）在根中和地上部的表达,根质膜和细胞内膜上的Na+/H+交换活性,这些调控导致Na+更多地在茎及叶片中分布和贮藏。LI等[35]首次在茄子中鉴定出5个CBL（CBL interacting protein kinase）和15个CIPK,并证实SmCBLs和SmCIPKs互作。SmCBL7和SmCIPK17显著响应NaCl胁迫,因此推测SmCBL7-SmCIPK17复合物在盐胁迫信号通路中发挥重要作用。
2.1 抗盐转录因子
转录调控是植物对逆境胁迫产生应答的关键步骤,转录因子在植物对逆境胁迫的应答过程中发挥重要作用。SlNAC11-RNAi番茄植株对盐耐受性降低,在ABA处理下转基因株系幼苗下胚轴和根较对照更长,SlNAC11-RNAi番茄植株对ABA敏感性降低。这些结果表明SlNAC11参与非生物胁迫响应[20]。盐胁迫、细菌病原体和信号分子诱导SlNAC35表达,暗示其参与植物对非生物和生物刺激的反应。与野生型相比,SlNAC35过表达烟草植株在盐胁迫下侧根数更多,根长更长,这些结果表明在盐处理下过表达SlNAC35促进了根的生长和发育[36]。同时在盐胁迫下,SlNAC35过表达株系中影响根系发育的重要转录因子NtARF1、NtARF2和NtARF8表达上升[37]。这说明SlNAC35是通过调节NtARF的表达从而促进根的生长和发育[36]。HAN[38]和YANG等[39]发现NAC家族成员SlNAC1、SlNAM1和SlNAC3在盐处理下上调或下调表达,这暗示他们在逆境响应中发挥作用。
乙烯响应因子（ethylene responsive factor,ERF）在植物响应逆境中发挥了重要作用,LU等[40]发现过表达SlERF1番茄植株幼苗抗盐能力增强,在盐处理下,过表达植株相对含水量比对照高,MDA和电解质渗透较低,并积累了更多的游离脯氨酸及可溶性糖。此外,SlERF1激活了抗逆相关基因LEA、P5CS、DREB3-1等的表达,这些结果都证明SlERF1在番茄抗盐中发挥积极作用[40]。
对黄瓜中82个NAC进行表达分析,发现与其他胁迫相比,CsNACs对盐胁迫更为敏感,说明NAC转录因子是黄瓜盐胁迫应答反应中的重要调控因子[41]。对黄瓜中MYB家族55位成员进行不同处理下的表达分析,发现12个基因响应盐处理,但一些基因在不同的处理下表现出相反的表达方式。例如,CsMYB16的表达量受高盐诱导而被ABA抑制,这表明它们在植物对非生物反应的响应中起重要作用,并参与不同信号转导途径[42]。
2.2 抗盐功能基因
渗透调节是耐盐的最常见方式,脯氨酸和甜菜碱（Betaine）是最重要、最有效的渗透调节剂,植物在受到盐胁迫后体内脯氨酸含量迅速增高。脯氨酸在生物体内具有调节细胞渗透势,稳定蛋白质、膜系统和亚细胞结构,通过清除活性氧保护细胞完整性等作用[43]。CHEN等[44]成功克隆得到菜豆PvP5CS,它编码的吡咯啉-5-羧酸合成酶参与脯氨酸合成。在盐处理下PvP5CS的表达明显上调,而在盐处理9 h后脯氨酸的积累达到峰值。这些结果表明PvP5CS是一个胁迫诱导基因,调节脯氨酸积累应对环境胁迫[44]。番茄tomPRO2编码一个全长的P5CS酶,在200 mmol∙L-1 NaCl处理下在番茄根和叶片中脯氨酸含量增加60多倍,而tomPRO2的表达量仅增加不足3倍[45]。而AMINI等[46]发现在160 mmol∙L-1 NaCl处理下叶片中tomPRO2的表达量明显下降,而根中tomPRO2的表达量未发生明显变化。这些结果说明tomPRO2与番茄耐盐及脯氨酸合成的关系仍有待深入探究。脯氨酸脱氢酶（ProDH）是存在于线粒体内的催化脯氨酸降解的关键酶,杨鹏等[47]从青花菜中克隆得到ProDH cDNA全长,并发现在外源L-脯氨酸存在时,BoiProDH干扰植株脯氨酸脱氢酶的活性受到了明显抑制,说明植物在盐胁迫下可能通过抑制BoiProDH的表达,从而提高游离脯氨酸含量应对胁迫。LI等[48]发现敲除青花菜CesA（cellulose synthase）干扰植株抗盐能力提高,BoiCesA干扰植株中脯氨酸和可溶性糖含量增加,同时逆境相关基因BoiPIP2;2、BoiPIP2;3表达量上升,而BoiProH表达量下降,揭示了BoiCesA干扰植株抗盐能力提高的机理。
甜菜碱在细胞中起着渗透保护剂的作用,其大量积累可保持许多代谢过程中重要酶类的活性,甜菜碱醛脱氢酶（BADH）是甜菜碱合成途径中的关键酶。研究发现,不管是在对照还是盐处理下,过表达SlBADH植株中BADH的表达量都明显高于对照植物。并且随着处理浓度的增加,过表达SlBADH植株中BADH的表达量也随之上升。在盐处理下过表达SlBADH植株长势明显优于对照,盐处理7 d后对照植株开始萎蔫,而过表达SlBADH植株仍 然挺立,说明BADH的超表达增强了番茄的抗盐能力[49]。
3 温度胁迫
温度是影响蔬菜生长发育的关键环境因素之一。近年来,全球气温波动加剧,极端高温、低温天气频次增加[50]。为提高蔬菜作物对于极端温度条件的耐受性,研究蔬菜作物抵御极端高温及低温条件过程中的分子机理具有非常重要的意义。3.1 高温胁迫
环境温度的上升对农作物生长发育带来重大影响,极端高温天气会引起农作物一系列生理生化水平的变化[51]。在高温条件下,植物光合系统会到影响,其中光系统Ⅱ（PSⅡ）电子传递被抑制,光化学效率降低,造成大量光能剩余,从而产生大量的活性自由基[52]。这些植物细胞内产生的大量剩余自由基导致膜脂过氧化,细胞膜透性发生改变,电解质外渗,对植物造成伤害。为减轻或避免这种伤害,由过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）构成的膜保护酶系统与可溶性糖和脯氨酸等渗透调节物质会起到清除活性氧、维护细胞膜稳定性的作用[53]。在高温条件下,植物内源激素的含量、分布都会出现变化,这其中ABA参与植物抗逆反应,并在逆境信号转导以及生理生化保护性反应过程中起着重要作用。毛胜利等[54]在研究高温胁迫下番茄中ABA变化时,发现番茄耐热品种叶片ABA含量提高的幅度明显大于不耐热品种;耐热品种花器官中ABA含量无论在常温还是在高温下,都高于不耐热品种,推测花器官中形成高水平的ABA对高温胁迫下花粉活力有决定性影响。张玉华等[55]在对黄瓜的研究也表明黄瓜花器官中的ABA参与了对高温逆境的响应。
在植物对于高温逆境的响应过程中,热激蛋白作为一类高度保守的功能性蛋白可以起到维护细胞结构的稳定,维持细胞正常生理功能的作用[56],而热激转录因子（heat stress transcription factors,HSFs）作为一类转录调节因子可以调控热激蛋白基因在内的多种抗逆基因的表达,在整个植物响应高温逆境的分子调控网络中处于中心位置,具有重要作用[57]。AHSAN等[58]在经过热激处理的大豆幼苗的叶、茎和根中分别分离出了54、35和61种不同的蛋白质,发现多种热激蛋白在不同组织中皆有不同程度的上调表达,说明热激蛋白在大豆幼苗对高温胁迫的响应中具有重要作用。BHARTI等[59]发现在番茄中,热激转录因子HsfB1可以作为共激活子与HsfA1结合形成复合体,增强下游相关基因的表达从而提高植株对于高温逆境的耐受性。LI等[60]发现番茄热激转录因子SlHsfA3可直接调控SlHsp26.1- P和SlHsp21.5-ER的表达,使其表达量显著增加,过表达SlHsfA3的拟南芥植株耐热性增强并且花期推迟。FRAGKOSTEFANAKIS等[61]在番茄中发现HsfA1a的共激活子HsfA2在经过热激处理的番茄幼苗中大量表达并调控大量下游的热激响应基因,提高了番茄对高温胁迫的耐受性,此外还发现HsfA2的过表达会导致花粉的活力及萌发率降低,表明HsfA2是在热胁迫下维持花粉活性的重要调控因子,其具体调控机制还有待研究。目前,植物热激蛋白及热激转录因子功能及调控网络的研究是分子生物学的热点问题之一,蔬菜作物中有关热激蛋白及热激转录因子响应高温逆境的具体作用机制及功能的研究主要集中在番茄中,其他蔬菜作物的研究报道相对较少。
此外,植物响应高温胁迫的过程中还有许多基因具有重要的功能。SHEN等[62]将拟南芥中的受体激酶基因ERECTA过表达至番茄和水稻野生型植株中,发现在番茄和水稻的过表达株系中热激蛋白的表达量与野生型相比显著升高,植株也表现出对于高温胁迫更强的耐受性。YANG等[63]将菠菜的甜菜碱醛脱氢酶基因SoBADH-1过表达转入烟草中,发现转基因烟草的耐热性高于对照,进一步研究表明,甜菜碱可以维持Rubisco活化酶的活性从而缓解其活性的降低,提高了植株在高温条件下对CO2同化的耐受性,增强了转基因烟草对高温的耐受性。张扬[64]利用VIGS技术沉默了番茄S-亚硝基谷胱甘肽还原酶基因SlGSNOR,发现高温下沉默植株与野生型植株相比叶片净光合速率下降,Rubisco酶活性降低,对高温的耐受性下降。
3.2 低温胁迫
低温是主要的非生物胁迫因子之一,低温胁迫可以分为冷胁迫（0—15℃）和冰冻胁迫（<0℃）。研究表明,植物在受到低温胁迫后,会出现水分状况、矿质营养、光合作用、呼吸作用和新陈代谢等生理过程的紊乱,造成冷害甚至死亡。WANG等[65]在番茄的研究中发现植株受到冷胁迫后,光合系统获得的过剩激发能量会导致光抑制和光氧化发生,降低寒冷期间光合速率,表现为叶绿体膜脂质过氧化作用增强,叶绿素、胡萝卜素和叶黄素发生降解。冷胁迫还会造成植物细胞膜流动性及膜结合酶的活性降低,影响植物的生长发育与生理代谢。植物对冷胁迫的响应通常表现为内源激素含量、膜质组成、抗氧化成分及冷胁迫相关基因转录水平的改变[66]。研究表明,在植物对冷胁迫的响应过程中,CBF/DREB1转录因子具有重要作用,位于整个分子调控网络的中心位置。研究显示,植物体内存在2条途径调节CBF的表达：一条为钙离子信号途径[67],质膜感受到冷信号,通过改变胞质中的三磷酸肌醇IP3含量,诱导胞质内钙离子的积累,迅速增加的钙离子与钙调蛋白结合转录因子CAMTA3（Calmodulin- binding transcription activator 3）形成复合物,通过CAMTA3与CBF2启动子上CG-1元件结合,激活CBF的表达;另外一条途径是ICE-CBF寒冷响应途径。ICE是类似MYC的bHLH转录因子,可以与位于CBF上游启动子中的ICE结合元件相结合,诱导CBF表达,而后CBF表达产物与下游一系列COR（cold responsive gene）基因启动子中的CRT/DRE（c-repeat/Dehydration responsive element）元件结合,诱导一系列抗冷基因表达,从而提高植物抗冷性[68]。YU等[69]在番茄中过表达ICE1转录因子,发现转基因番茄植株中,CBF的表达量上调,在冷胁迫条件下,与野生型番茄相比,过表达植株中丙二醛含量降低,脯氨酸含量增加,过氧化物酶、过氧化氢酶活性升高,对冷胁迫的耐受性增强。BEHNAM等[70]将拟南芥的DREB1A及RD29A共转入马铃薯中,发现转基因马铃薯植株中DREB1A及RD29A互作,显著提高了马铃薯植株对冷胁迫的耐受性。
此外,在植物响应冷胁迫的过程中,胚胎后期丰富蛋白、热激蛋白、渗透调节物质生物合成所需的酶等蛋白质对于植物建立对低温的抗性,以及受冻害后的恢复都具有重要作用。LEA和HSPs是在低温胁迫下表达量明显升高的两类重要蛋白,在胁迫过程中起到维持功能蛋白正常结构,防止蛋白质变性,增强细胞膜流动性,维持细胞的正常生理功能[71]。番茄和菠菜在低温下产生一类Hsp70家族蛋白,这些蛋白类分子伴侣可在低温条件下调节蛋白质的折叠和运输,维持酶的活性[72]。
4 其他非生物胁迫
4.1 重金属胁迫
重金属污染一般是指密度在4.5 g∙cm-3以上的金属（包括铜、锌、铬、铅、汞、镍、钴等）或其化合物在环境中所造成的污染。重金属浓度一旦超过植物自净能力,会对植物的生长发育产生极大的抑制作用。中国北京、上海、天津、寿光、哈尔滨、福州、长沙、大同、成都、贵阳等地都对郊区菜园土壤和产出蔬菜中的重金属积累情况进行过调查,结果显示形势十分严峻,各大城市郊区蔬菜都已经受到了不同程度的重金属污染,有些甚至超过了食品卫生安全标准[73]。在长期的进化过程中,植物形成了多种机制防御重金属离子的毒害。根系能够在根尖部分外排分泌物,其成分复杂多样,其中研究较多的是有机酸、氨基酸和糖类等。根系分泌的有机酸,包括柠檬酸、草酸和苹果酸,这些有机酸能够在根际螯合重金属从而形成无毒的稳定复合物。根系分泌物对于铝毒耐受性的研究较为清楚。不同植物会分泌不同的有机酸来缓解铝胁迫,番茄和菠菜能够在铝的刺激下分泌草酸、苹果酸和柠檬酸,四季豆能分泌苹果酸[74],而萝卜能分泌柠檬酸和苹果酸[75]。另外,有两种转运蛋白能够增加铝诱导的苹果酸或柠檬酸的外排和铝抗性。在甘蓝中克隆到了一个铝诱导的柠檬酸转运蛋白MATE[76],但是另一种苹果酸转运蛋白ALMT在蔬菜中尚未报道,在拟南芥、油菜中已被鉴定[77,78]。
重金属离子必须跨过根系细胞膜才能进入植物体内产生毒害,因此,细胞膜的选择性吸收是重金属抗性机理的重要部分。目前有大量金属离子的转运器被鉴定,包括铁离子转运器（IRT）[79],ZIP家族转运蛋白[80],自然抵抗相关的巨噬细胞蛋白（Nrump）[81],P-type ATPase家族蛋白[82]。然而这些金属离子转运子的研究多集中于拟南芥、水稻等模式作物中,在蔬菜中少有报道。
当重金属进入细胞后,能够和细胞内的蛋白 质、有机酸、谷胱甘肽等形成复杂的螯合物,从而使重金属的毒性降低。植物络合素（phytochelatins,PCs）是一种重金属结合多肽,最早是从Ophiorrhiza mungos悬浮细胞中分离得到[83]。正常情况下,PCs在植物体内的含量很低,但是在重金属的诱导下,能够由植物络合素合成酶（PCS）催化以半胱氨酸为底物迅速合成。PCs能够与重金属离子结合形成无毒的化合物,之后被送至液泡储存起来。STEFFENS等[84]发现抗高浓度镉（Cd）胁迫的番茄细胞中PCs的含量远高于普通番茄细胞,并且用谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制剂处理抗Cd的番茄细胞后,其抗性消失。另外也有研究显示Cd胁迫提高了马铃薯中PCS的转录活性与酶活性[85]。拟南芥AtPCS1缺失突变体对镉高度敏感,并且过表达AtPCS1能够提高植物对镉的耐受性[86]。目前只有少量蔬菜中的PCS被克隆,包括莴苣[87]、印度芥菜[88]。另一种高等植物具有的能与金属离子结合的多肽是金属硫蛋白（MTs）。除了可以螯合重金属达到解毒的目的外,MTs也可以清除重金属毒害造成的大量自由基[89]。芜菁BrMT1[90]、大蒜AsMT2b和芋CeMT2b[91]能够增加拟南芥的镉抗性。
4.2 水淹胁迫
大多数植物无法长期浸没在水中,蔬菜作物尤其不能耐受水淹[92]。涝害和水淹导致植物根系处于低氧状态,抑制根系生长甚至烂根。拟南芥中的研究表明,乙烯信号和低氧信号在植物抵御水淹胁迫中发挥着重要作用[93]。VIDOZ等[94]发现,乙烯会刺激生长素向茎中运输积累进而刺激更多的乙烯合成。大量积累的乙烯进一步促进生长素在受到水淹的组织中积累,从而诱导番茄生长出新的根系组织替代被涝害损伤的根系。在水淹条件下,乙烯合成抑制剂（ethylene biosynthesis inhibitor aminoethoxyvinylglycine,AVG）和生长素转运抑制剂（auxin transport inhibitor 1-naphthylphthalamic acid,NPA）处理的番茄较未处理的番茄,不定根数量减少,导致番茄耐涝能力降低。乙烯响应转录因子在乙烯抗涝信号中起到重要作用。在拟南芥中,过表达乙烯响应因子HRE1和HRE2（hypoxia-inducible ethylene response factor）表现出较强抗涝性[95]。RAP2.12、RAP2.2和RAP2.3（ERF-VII factor）则不受低氧胁迫诱导,但会在蛋白水平上受到氧含量的负调控[96,97]。在蔬菜作物中,抗涝害的关键转录因子仍未被揭示,但一些功能基因被报道与抗涝相关。CHIANG等[98]在拟南芥中过表达茄子和丝瓜的APX增强过表达拟南芥植株在涝害条件下清除H2O2的能力,进而增强抗涝能力。在黄瓜中,干扰CsSUS3（sucrose synthase 3）使黄瓜耐低氧能力降低[99]。QI等[100]利用高通量Tag-seq测序检测黄瓜在水淹条件下24 h内差异表达的基因,得到的差异基因涉及碳稳态、光合作用、活性氧产生和清除、激素合成及其信号通路等。蔬菜作物应答非生物逆境的基因/转录因子相关研究总结如表1。Table 1
表1
表1蔬菜作物应答非生物逆境的基因/转录因子
Table 1Genes/transcription factors of abiotic stress responses in vegetable crops
| 胁迫 Stress | 作物 Crop | 基因 Gene | 参考文献 Reference |
|---|---|---|---|
| 干旱 Drought | 番茄 Tomato 辣椒 Pepper 黄瓜 Cucumber 甘蓝 Cabbage | SlPIP2;1/SlPIP2;7/SlPIP2;5;SlSIZ1;ShDHN;SlDREB1 SlWRKY39;SlNAC4;SlNAC11;SlICE1a;SlAREB1 CaTIP1-1/CaPIP1-1 CsPIP1;2/CsPIP2;4 BpDREB1 | 11, 14-16 18-22 12 13 17 |
| 盐 Salt | 番茄 Tomato 茄子 Eggplant 黄瓜 Cucumber 菜豆 Kidney bean 青花菜 Broccoli | SlSOS1;SlSOS2;SlSOS2.1;SlNAC11;SlNAC35; SlNAC3;SlNAC1/ SlNAM1;SlERF1;tomPRO2;SlBADH SmCBLs/ SmCIPKs CsNACs;CsMYB16 PvP5CS BoiProDH;BoiCesA | 20, 32-34, 36 38-40, 45-46, 49 35 41-42 44 47-48 |
| 高温 High temperature | 番茄 Tomato 菠菜 Spinach | SlHsfB1/SlHsfA1;SlHsfA3/SlHsp26.1-P/SlHsp21.5-ER;SlHsfA1a/SlHsfA2 SlGSNOR SoBADH-1 | 59-61 64 63 |
| 低温 Low temperature | 番茄 Tomato | SlICE1/SlCBF;SlHsp70 | 69, 72 |
| 重金属 Heavy metal | 甘蓝 Cabbage 油菜 Rape 马铃薯Potato、 莴苣 Lettuce 芥菜 Leaf mustard 芜菁 Turnip 大蒜 Garlic 芋 Taro | BoMATE BnALMT1/BnALMT2 StPCS LsPCS BjPCS BrMT1 AsMT2b CeMT2b | 76 77 85 87 88 90 91 91 |
| 水淹 Water flooded | 黄瓜 Cucumber | CsSUS3 | 99 |
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4.3 弱光胁迫
光是光合作用的能量来源,是植物生长发育最重要的环境因素。而过弱的光照会严重影响光合作用、生物量及抑制抗氧化酶活性,并且会影响叶绿体的定位;过强的光照则会使植物积累过多的自由基,同样会抑制植物的生长发育。在蔬菜中,强光逆境研究少,所以本文仅对蔬菜弱光逆境的响应展开讨论。细胞分裂素（Cytokinins）广泛影响植物的生长发育,能够在维持叶绿体活性、减缓叶绿素降解、延缓衰老等方面起作用。在黄瓜中,6-BA能通过调节叶绿素的含量,减少氧自由基和H2O2的产生,从而减少光合系统的损伤,进而提高CO2的同化效率,积累更多的碳水化合物以供生长[101]。油菜素内脂（brassinosteroids,Brs）作为近年新报道的植物激素,同样对植物抵御弱光逆境有一定的作用。CUI等[102]用0.1 μmol∙L-1 EBR处理番茄,ATPase β亚族的活性相比对照植株有所提高,活性氧清除能力提高,使番茄在弱光条件下积累更少量的氧自由基和H2O2。但更加深入的逆境信号传递途径以及激素信号传导途径在蔬菜作物中未见报道。更多的研究主要集中在营养和外源施加某种物质来增强蔬菜作物抵御弱光逆境的能力[103,104]。HU等[103]调整NH4+﹕NO3-比例为1﹕9,从而提高了白菜中rbcL（rubisco large subunit gene）、rbcS（rubisco small subunit gene）、FBPase（fructose-1, 6- bisphosphatase）及TK（transketolase）等基因的表达量,该措施增强了白菜在弱光条件下的光合作用,增加了碳水化合物的积累,提高了白菜抗弱光的能力。YU等[104]通过外源施加亚精胺（spermidine）抑制了弱光条件下番茄的膜脂过氧化过程。5 展望
非生物逆境对蔬菜作物的产量及品质有重要影响。在分子生物学层面研究蔬菜作物抵抗非生物逆境机制成为近年来的热点。在非生物逆境信号刺激下,植物体内ABA水平升高,ABA信号受体PYL（pyrabactin resistance 1-like）与其共受体PP2Cs（protein phosphatase 2Cs）互作并将信号传递给SnRK2（Sucrose nonfermenting related protein kinases 2）[105],进而诱导多种抗逆相关基因的差异表达,如WRKY、NAC,HSF等转录因子。这些转录因子的表达变化会进一步调节下游抗逆相关的功能基因变化及抗逆物质的积累。但目前蔬菜作物的研究仍呈现碎片化,研究内容仅针对某个转录因子或功能基因的研究。蔬菜作物中的逆境响应信号转导途径是否与拟南芥中存在区别,ABA与转录因子之间的信号通路以及转录因子与功能基因间的直接调控关系并未得到深入研究。近年来的研究可以看出,机制性研究正在逐步深入。从基本的功能基因的研究逐步向调控因子上过渡。一些关键的调控因子如CBFs、ABIs在蔬菜中得以涉及,miRNA在蔬菜抵御逆境胁迫过程中的功能也有一定的研究[106,107]。目前,蔬菜作物的非生物逆境响应机制研究受限于遗传转化体系的制约,除番茄、黄瓜等重要蔬菜外,大部分蔬菜的转化体系仍未有效建立,基因功能的验证仅能在拟南芥、烟草等模式植物上进行,制约了蔬菜作物非生物逆境胁迫响应的研究。因此,建立稳定的遗传转化体系对蔬菜作物的非生物逆境响应机理研究十分重要。同时,目前蔬菜非生物逆境的相关研究仍有大量空白,各个非生物逆境的信号通路有待更加深入的研究,生物技术的 进步也将为研究蔬菜非生物逆境响应提供便利。CRISPR-Cas9是近年来研究基因功能的有效工具,在蔬菜作物中,CRISPR技术被用于生长发育及育种方向的研究[108,109],如LI等[109]利用CRISPR敲除多个γ-氨基丁酸合成通路中的多个基因从而研究其代谢,但将其用于非生物逆境研究仍未见报道。CRISPR技术在蔬菜作物上的成功应用将为探究蔬菜非生物逆境胁迫响应机制提供助力。未来的研究可以通过EMS诱变或直接进行基因编辑获得蔬菜作物中ABA信号通路、逆境应答关键基因的突变体。以此为切入点,利用成熟的转录组学、蛋白组学、代谢组学等技术,自上而下研究蔬菜抵御非生物逆境的信号通路。同时研究非生物逆境对蔬菜经济器官的影响（如果类蔬菜的果实发育以及叶类蔬菜的形态建成）,指导蔬菜作物的生产,具有重要的实际应用价值。
The authors have declared that no competing interests exist.
