0 引言
【研究意义】长久以来,沙门氏菌一直是食品加工贮藏中污染最为严重的致病菌之一[1]。消费者食用了被沙门氏菌污染的食物后会出现腹痛、恶心、呕吐、发烧等症状,严重者甚至会导致死亡[2],这对人体健康造成了极大的威胁,而鼠伤寒沙门氏菌在沙门氏菌感染中常居首位。因此,如何实现对鼠伤寒沙门氏菌的快速灵敏检测一直是食品安全领域的热门研究方向。【前人研究进展】最传统的食源性致病菌检测法为平板计数法（SPC）,但由于其耗时过长且准确度低,故实用性较差。近年来建立的酶联免疫法（ELISA）、聚合酶链式反应法（PCR）以及胶体金免疫层析法（GICA）在食源性致病菌的检测上实现了重大突破,但仍存在部分缺陷。ELISA法通常要对抗原或抗体进行酶标记,存在成本较高、耗时较长且表征复杂等弊端;PCR法通过对细菌特定序列进行指数倍的扩增使其变得易于检测,然而这种技术常会出现错检和漏检的问题[3];GICA法依靠固相载体纤维的毛细管作用,使待测物沿膜表面前移与检测区胶体金标记物结合显色,它先将抗体固定在硝酸纤维素（NC）膜上,膜上有控制线和显示结果的测试线,当样品中抗原与抗体特异性结合,着色物胶体金使该区域显色,通过对比测试线与控制线颜色实现目标物的快速检测。该方法凭借其操作简便、检测迅速、肉眼直观可见等优势在食源性致病菌检测中也较为常用,但由于细菌的体积较大,会受到NC膜的孔径限制,使得免疫层析法的检测灵敏度较差,另外细菌易团聚,使得纸层析受阻,从而影响试纸条的灵敏度[4,5]。电化学传感器可以监测反应体系中由组分变化而导致的电信号变化来完成检测,它具有高度的检测灵敏性与特异性,并且操作便捷、成本较低[6]。在各类电化学传感器中,电化学生物传感器有着不可替代的优势,在实际生产中应用最广的为酶传感器、适体传感器与免疫传感器3大类[7]。核酸适配体通常是一段由指数富集配体系统进化（SELEX）技术筛选获得的长度为15—40个碱基长的DNA或RNA寡核苷酸片段[8]。这些核酸序列类似抗体,可以紧密且特异地与目标分子结合,但又具备抗体所不具有的易于修饰、合成迅速、稳定、成本低廉等优势。由于适配体的空间三维构象易折叠形成一些如螺旋、发卡、茎环、凸环、三叶草和假结等稳定的三环空间结构,使其能够依靠范德华力、氢键和疏水作用等方式与目标物紧密结合,并可以区分结构类似的物质[9,10]。此外,适配体的靶标分子种类丰富,既可以捕获包括蛋白质、小分子、离子、核酸等多种靶目标,也可以与完整的细胞结合[11,12]。因此,适配体传感器非常适宜用于食品加工贮藏中致病菌的检测。亚甲基蓝（MB）作为一种电活性有机染料,其能够嵌入核酸双链中。近年来,亚甲基蓝作为一种无标的电化学指示剂被广泛应用于电化学适配体传感器中[13,14]。还原氧化石墨烯（rGO）是对石墨烯进行一系列氧化还原反应后,制得的可用于提高电子传输的新型纳米材料[15]。【本研究切入点】笔者课题组在以往的研究中,曾成功构建出一种基于复合纳米材料和酶切信号放大的沙门氏菌适配体传感器,最低检测限为200 cfu/mL[16],其检测性能仍有待提升。目前国内外关于应用电化学适配体传感器检测食源性致病菌的文献已不罕见,且多数研究取得了令人满意的成果,但成功用于鼠伤寒沙门氏菌定量检测的电化学适配体传感器的报道非常少。【拟解决的关键问题】本研究以MB为电化学活性物质,利用Apt与鼠伤寒沙门氏菌的高特异性结合实现MB的定量脱落,同时引入rGO和AuNPs两种纳米材料以及Exo I协助电信号的放大,通过监测电极表面的电信号变化情况来完成鼠伤寒沙门氏菌的定量检测,为食品工业中鼠伤寒沙门氏菌的现场快速定量检测提供一种高效便捷、灵敏准确的新型检测方法。1 材料与方法
试验于2016年9月至2017年3月在陕西师范大学食品工程与营养科学学院畜产品加工实验室进行。1.1 菌株和DNA序列
鼠伤寒沙门氏菌CMCC 50115、大肠杆菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、福氏志贺氏菌CMCC 51572、单核增生李斯特菌ATCC 19115、副溶血性弧菌ATCC 17802均购自北纳创联生物技术有限公司,-40℃保存备用。鼠伤寒沙门氏菌适配体：
（Apt,5′-GAGTTAATCAATACAAGGCGGGAA CATCCTTGGCGGTGC-3′）;
鼠伤寒沙门氏菌适配体互补链：
（S,5′-HS-(CH)6-ATCATTGCACCGCCAAGTAT GTTCCCACCTTGTATTCATTAACTC-3′）。
上述DNA序列均由上海生工生物工程有限公司合成,-20℃保存备用。
1.2 仪器和试剂
本研究全部电化学试验操作均于CHI660C型电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）上进行。试验均为三电极系统,其中工作电极：裸玻碳电极（GCE）或修饰后的玻碳电极;对电极：铂丝;参比电极：银/氯化银（饱和氯化钾）电极。KQ-100V型超声波清洗器（上海京工实业有限公司）,HJ-1型磁力搅拌器（江苏省金坛市精达仪器制造厂）,漩涡振荡器（北京中西远大科技有限公司）,离心机（HERMLE）,恒温恒湿培养箱（赛福实验仪器公司）,真空干燥箱（南京苏恩瑞干燥设备有限公司）。核酸外切酶I（Exo I）,纽英伦生物技术（北京）有限公司;氯金酸（HAuCl4）、亚甲基蓝（MB）、6-巯基-1-己醇（97%,MCH）,美国Sigma Aldrich公司;铁氰化钾（K3[Fe(CN)6]）、亚铁氰化钾（K4Fe(CN)6∙3H2O）、磷酸氢二钠（Na2HPO4）、磷酸二氢钠（NaH2P04）、氯化钾（KCl）、柠檬酸三钠（Na3C6H5O7∙2H20）、浓硫酸（98% H2SO4）、无水乙醇（C2H6O）等,西安三浦化学试剂有限公司;石墨烯（Gra）,南京吉仓纳米科技有限公司;其余所用试剂均为分析纯;试验用水为蒸馏水。
1.3 溶液的配制
鼠伤寒沙门氏菌适配体、鼠伤寒沙门氏菌适配体互补链均于12 000 r/min下离心30—60 s后加入无菌水稀释到2 μmmol∙L-1,震荡均匀后于-20℃冻藏。核酸外切酶I反应缓冲液：将随酶提供的10×外切酶I反应缓冲液用无菌水稀释到1×核酸外切酶I反应缓冲液,-20℃保存备用。
各浓度菌液均以0.1 mol∙L-1 PBS缓冲溶液（pH 7.0）配制,4℃保存。
亚甲基蓝以0.1 mol∙L-1 PBS缓冲溶液（pH 7.0）配制成120 μmmol∙L-1的溶液,4℃保存。
巯基乙醇以去离子水稀释为2 mmol∙L-1的溶液,4℃保存。
1.4 样品处理
参照GB4789.17—2003《食品微生物学检验 肉与肉制品检验》对猪肉样品进行处理。新鲜猪肉首先进行表面消毒处理（沸水烫3—5 s）,然后于超净台中以无菌剪刀取深层肌肉20 g,剪碎,置于无菌研钵中捣碎,加入无菌水180 mL混匀后制得1﹕10样品稀释液。在猪肉样品稀释液中加入不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌,混匀,于4℃保存。1.5 金纳米粒子的制备
根据Turkevich-Frens法[17,18],以柠檬酸三钠还原氯金酸的方法制备。1.6 氧化石墨烯的制备
采用传统的Hummers方法[19,20]。1.7 电化学适体传感器的构建
整个构建过程如图1所示。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1电化学适配体传感器检测沙门氏菌原理图
-->Fig. 1Principle of the electrochemical aptasensor of detection of Salmonella typhimurium
-->
首先进行还原氧化石墨烯-纳米金粒子复合电极的制备,取制得的氧化石墨烯1 mg溶于1 mL PBS溶液中,500 W下超声30 min混匀后用移液器滴加10 μL于打磨好的玻碳电极表面,室温下风干。为了得到还原氧化石墨烯,将电极于PBS溶液中进行电化学还原。工作参数如下：循环伏安法（CV）,工作电压为-0.2—0.6 V,扫速为100 mV∙s-1,圈数为100圈。然后将电极于1%的氯金酸中进行恒电位沉积,以将纳米金修饰于电极表面。工作参数如下：计时电流法（CA）,工作电压为-200 mV,工作时间为20 s。将电极晾干,不用时置于4℃ PBS缓冲液中保存。
在完成还原氧化石墨烯-纳米金粒子复合电极的制备后,将10 μL 2 μmol∙L-1的互补链（S）均匀滴在复合电极上,室温下完成孵育,以PBS缓冲液冲洗,再将10 μL 2 mmol∙L-1的巯基己醇均匀滴在电极表面反应1 h完成电极的封闭[21]。然后将10 μL 2 μmol∙L-1的适体链（Apt）均匀滴在电极表面,一段时间后用PBS缓冲液冲洗。随后将电极浸入含不同浓度鼠伤寒沙门氏菌和一定浓度核酸外切酶I（Exo I）中37℃下孵育30 min后,用PBS缓冲液冲洗。最后将修饰好的电极浸入120 μmol∙L-1亚甲基蓝（MB）溶液中1 h,充分反应后用PBS缓冲液反复冲洗。通过循环伏安法（CV）和电化学阻抗法（EIS）记录复合电极上MB的电化学信号,以实现鼠伤寒沙门氏菌的定量检测。
1.8 电化学测试方法
循环伏安（CV）、差分脉冲伏安（DPV）和电化学阻抗（EIS）检测均为三电极系统,裸玻碳电极（GCE）或修饰后的玻碳电极为工作电极,Ag/AgCl电极为参比电极,铂电极为对电极。具体检测环境与参数参照徐连应等[16]的研究。2 结果
2.1 还原氧化石墨烯-纳米金粒子复合电极的电化学表征
以循环伏安法（CV）来验证复合电极制备构程中的每一步修饰情况,如图2-A所示。检测环境为K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液,当电极电势在-0.2—0.6 V反复扫描时,[Fe(CN)6]3-被还原为[Fe(CN)6]4-,[Fe(CN)6]4-被氧化为[Fe(CN)6]3-,致使电极表面氧化还原反应得以不间断进行,产生一组相互对称的氧化还原峰,如裸玻碳电极曲线a所示。当在裸玻碳电极上修饰了一层氧化石墨烯后,由于带负电性的含氧官能团的引入,使电极表面的电活性位点被大量占据,不利于电子的传递[22],导致峰电流显著降低,如曲线b所示。将氧化石墨烯用电化学还原的方法去掉含氧官能团后,导电性能得到部分恢复,峰电流升高,如曲线c所示,生成的还原氧化石墨烯与石墨烯的结构和性质相似。最后用电沉积法在电极表面修饰一层纳米金,峰电流大幅度升高,如曲线d所示,这是因为纳米金具有良好的电催化活性,且表面带有大量的负电荷,电子密度极高。同时采用电化学阻抗法（EIS）进行进一步的验证,如图2-B所示,曲线的半圆直径越大,电阻越大,通过观察圆弧半径的大小即可得出电阻的变化。通过观察可知,EIS法所得结果与CV法保持一致,说明复合电极制备的每一步均得到了准确的修饰。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2在铁氰化钾溶液中电极的表征图CV（A）和EIS（B）
a：未修饰的玻碳电极;b：滴涂氧化石墨烯;c：电化学还原为还原氧化石墨烯;d：电沉积修饰纳米金
-->Fig. 2CV(A) and EIS(B) at different electrodes in Fe(CN)63-/4-
a: bare GCE, b: after GO modification, c: electrochemical reduction of GO to rGO, d: after AuNPs modification by electrodeposition
-->
2.2 适配体传感器的电化学表征
采用电化学阻抗法（EIS）对本研究所构建的适配体传感器进行检测。[Fe(CN)6]3-/4-耦合作为氧化还原探针,电荷转移所受到的阻力（Ret）由阻抗图谱来判断,半圆直径越大,电阻越大。如图3-A所示,曲线a还原氧化石墨烯-纳米金复合电极在初始状态下的半圆很小,因为此时电子可以自由移动。当互补链自组装到复合电极表面后,DNA链上显负电性的磷酸盐骨架对电子在电极和[Fe(CN)6]3-/4-缓冲液中的转移起到阻碍作用,导致Ret增大（曲线b）。当滴加适配体后,其与其互补链杂交成双链DNA结构,复合电极上负电荷的增加会导致Ret再次增加（曲线c）。当鼠伤寒沙门氏菌被检测到后,由于鼠伤寒沙门氏菌与适配体的高度特异性结合将适配体带离复合电极表面,此时电极上负电荷减少,对电子移动的空间阻力Ret减小（曲线d）,同时,Exo I将适配体不断剪切从而释放鼠伤寒沙门氏菌循环作用,带离电极上更多的适配体。加入甲苯胺蓝（MB）后,由于MB是一种电化学活性物质,可以促进电子的传递,故半圆直径明显减小（曲线e）。同时用循环伏安法（CV）进行验证,结果如图3-B所示,由图可知CV法与EIS法所得结论保持一致,说明该传感器已成功构建。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3在铁氰化钾溶液中传感器的表征图EIS（A）和CV（B）
a：未修饰的复合电极;b：修饰互补链;c：结合适配体;d：检测到鼠伤寒沙门氏菌;e：加入MB
-->Fig. 3EIS and CV of aptasensor at different conditions in Fe(CN)63-/4-
a: without modification, b: after complementary strand modification, c: after hybridization with aptamer, d: after reaction with Salmonella typhimurium, e: after MB addition
-->
2.3 Exo I对传感器的信号放大效能
在本研究中,Exo I能作用于鼠伤寒沙门氏菌适配体,使其沿着3′到5′的方向水解为单个核苷酸,导致与适配体紧密结合的鼠伤寒沙门氏菌被释放后循环作用于电极,带离更多的适配体,从而实现响应信号的放大。为了验证Exo I的效能,在还原氧化石墨烯-纳米金复合电极上修饰鼠伤寒沙门氏菌互补链与适配体后,直接浸入亚甲基蓝（MB）溶液中,用差分脉冲伏安法（DPV）来记录响应值,如图4曲线a所示。随后再取两根经上述步骤处理后的电极,一根浸入2×107 cfu/mL的鼠伤寒沙门氏菌菌液中,另外一根浸入2×107 cfu/mL的鼠伤寒沙门氏菌菌液与0.8 U∙mL-1的Exo I的混合液中,用DPV法记录下响应值。如图4中曲线b与曲线c可知,加入Exo I与未加Exo I相比,加入Exo I后DPV响应值明显降低,说明Exo I的加入使本研究所构建的传感器在鼠伤寒沙门氏菌检测上的灵敏度得到了大幅提升。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图4不同状态下电极对亚甲基蓝的差分脉冲伏安响应
a：仅浸入MB;b：浸入MB后,再浸入2×107 cfu/mL鼠伤寒沙门氏菌菌液;c：浸入MB后,再浸入2×107 cfu/mL鼠伤寒沙门氏菌菌液与0.8 U∙mL-1Exo I的混合液
-->Fig. 4DPV signals of MB for different conditions of electrode in PBS
a: Electrode only immersed in MB. b: After immersing in MB, electrode then immersed in 2×107 cfu/mL Salmonella typhimurium. c: After immersing in MB, electrode then immersed in 2×107 cfu/mL Salmonella typhimurium and 0.8 U∙mL-1Exo I
-->
2.4 条件优化
图5-A可以得出电化学信号与鼠伤寒沙门氏菌孵育时间的关系,可知电化学信号随着孵育时间的增加不断减小,但当孵育时间超过40 min后,电化学信号的变化趋于平稳,说明40 min足够让鼠伤寒沙门氏菌将适配体带离,因此40 min即为最优孵育时间。由图5-B可知在Exo I浓度达到0.8 U∙μL-1时,电信号下降到最低,因此选择0.8 U∙μL-1作为最适酶浓度。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图5试验条件的优化：（A）孵育时间（B）Exo I浓度
-->Fig. 5The optimization of experimental conditions: (A) incubation time (B) Exo I concentration
-->
2.5 传感器检测分析性能的考察
当传感器电极在不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌菌液中孵育40 min后,所得到的差分脉冲伏安（DPV）曲线图如图6-A所示。当菌液浓度增大,峰电流随之逐渐减小,并且在菌液浓度为2×102—2×107 cfu/mL,传感器DPV曲线的峰电流值与菌液浓度的对数保持良好的线性关系,线性方程为I（μA）=-30.422x+302.49（R2=0.9975）,检测限为67 cfu/mL（S/N=3）（图6-B）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图6不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌（0—2×107 cfu/mL）下的DPV曲线（A）及DPV峰电流值与鼠伤寒沙门氏菌浓度的校正曲线（B）
-->Fig. 6The DPV curves obtained when detecting Salmonella typhimurium in different concentrations(0—2×107 cfu/mL) and the calibration curve
-->
为了验证该传感器的特异性,在相同的条件 下对另外5种细菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、单增李斯特菌以及副溶血弧菌）进行了检测。由图7可知,5种非目标菌的电化学响应信号接近于空白信号,且明显高于鼠伤寒沙门氏菌的电化学响应信号,表明所构建的传感器特异性良好。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图7不同细菌的电化学信号柱状图
a：鼠伤寒沙门氏菌;b：大肠杆菌;c：金黄色葡萄球菌;d：志贺氏菌;e：单增李斯特菌;f：副溶血弧菌;g：空白对照
-->Fig. 7Comparison of DPV peak currents after reaction with different target bacteria
a: Salmonella typhimurium, b: Escherichia coli, c: Staphylococcus aureus, d: Shigella, e: Listeria monocytogenes, f: Vibrio parahaemolyticus, g: blank
-->
本研究以相同的方法制备同批次的7根工作电极,进行了一组平行试验,以验证该传感器的重复性。将工作电极在2×102 cfu/mL的鼠伤寒沙门氏菌菌液中孵育40 min,随后测量各峰电流值,得RSD为4.0%（n=7）,证明所构建的传感器重复性良好。
2.6 实际样本测定和加标回收试验
以1.4中预处理的含不同浓度鼠伤寒沙门氏菌的猪肉样品作为待检测的实际样本,利用本研究构建的传感器进行检测,所得结果与平板计数法作对比,求回收率。由表1可知本方法回收率为97.3%—106.7%,与平板计数法检测结果高度吻合。证明所构建的传感器检测鼠伤寒沙门氏菌准确性高,可以应用于实际样本的检测。Table 1
表1
表1猪肉样品中鼠伤寒沙门氏菌的检测回收率
Table 1The recovery of Salmonella typhimurium detection in pork
| 样本编号 Sample number | 初始浓度 Initial concentration (cfu/mL) | 加入量 Adding amount (cfu/mL) | 检出量 Detectable amount (cfu/mL) | 回收率 Recovery rate (%) | 相对标准偏差 RSD (%) |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 0 | 89 | 95 | 106.7 | 4.8 |
| 2 | 0 | 182 | 177 | 97.3 | 5.0 |
| 3 | 0 | 337 | 329 | 97.6 | 2.9 |
| 4 | 0 | 590 | 605 | 102.5 | 3.0 |
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3 讨论
近年来,纳米材料在传感器构建中起到了关键性作用。LABIB等[23]于2012年成功构建首个可以用于特异性检测鼠伤寒沙门氏菌活菌的核酸适体阻抗传感器。该传感器直接将鼠伤寒沙门氏菌DNA适体链固定到纳米金修饰丝网印刷电极上,鼠伤寒沙门氏菌在适体链上结合量的对数与电极阻抗呈现良好的线性关系,由此可以实现定量检测。该传感器的最低检测限为600 cfu/mL,在食品检测领域其性能仍需进一步提升。MA等[24]于2014年将滴涂在玻碳电极上的氧化石墨烯（GO）进行电化学还原,于电极上修饰了一层石墨烯纳米片,构建了基于复合纳米材料的沙门氏菌适体传感器。石墨烯纳米材料的引入大大增强了电极对于捕获探针沙门氏菌适配体链的固定作用,同时也增强了电子在电极处的转移能力。该传感器的最低检测限可以达到3 cfu/mL,但检测时间需要90 min,且检测范围较窄,最高仅为2.4×103 cfu/mL。为了进一步优化传感器的性能,本研究在应用还原氧化石墨烯和纳米金两种纳米材料的同时,引入了核酸外切酶I与电化学指示剂亚甲基蓝。在裸玻碳电极（GCE）上修饰还原氧化石墨烯（rGO）和纳米金（AuNPs）后,将巯基化的鼠伤寒沙门氏菌适配体互补链及适配体先后固定在rGO-AuNPs复合电极上,随后复合电极被置于滴加了核酸外切酶I的鼠伤寒沙门氏菌菌液中孵育,并于孵育完成后加入电化学指示剂亚甲基蓝,最后通过监测电极表面的电信号变化完成对鼠伤寒沙门氏菌的定量检测。作为一种吩噻嗪类有机染料,亚甲基蓝在电化学传感器研究领域经常被用作杂交反应指示剂[25,26]。亚甲基蓝与DNA的作用包括插入作用与静电作用模式,可以插入双链DNA中[27,28,29]。在本研究中,鼠伤寒沙门氏菌带离电极表面的鼠伤寒沙门氏菌适配体链,导致电极上双链DNA结构部分转变为单链,可通过监测嵌入双链的MB电化学信号的强弱来测定鼠伤寒沙门氏菌的含量。MB的加入大大提高了传感器的检测性能,作为一种电化学活性物质,MB可以明显放大响应电流,这使检测更加便利,同时也减小了测量误差。核酸外切酶I（Exo I）的引入也使传感器的性能得到了提升。作为一种仅作用于单链的3′—5′核酸外切酶,Exo I能沿着3′-OH末端将其剪切为单个核苷酸,且不依赖特定的核酸序列[30,31]。在本研究中,当鼠伤寒沙门氏菌进入到检测体系后,由于其与适体链间的高度特异性结合作用,鼠伤寒沙门氏菌会将适体链从电极上带离,此时Exo I能迅速作用于适体链,将其分解成单个核苷酸,同时鼠伤寒沙门氏菌被从适体链上释放,得以循环作用于电极上的适配体,将更多的适配体带离,这样即便是微量的鼠伤寒沙门氏菌也可以通过循环作用产生较大的电信号,保证了传感器的灵敏度,且整个过程快速高效。
4 结论
本研究以电化学活性物质亚甲基蓝为信号探针,通过在玻碳电极上修饰还原氧化石墨烯与纳米金以提高电极的性能,并引入核酸外切酶I进一步实现信号的放大,成功构建一种新型的用于鼠伤寒沙门氏菌定量检测的电化学适配体传感器。该传感器最低检测限为67 cfu/mL,检测范围在2×102—2×107 cfu/mL,检测时间为40 min,综合性能良好。在鼠伤寒沙门氏菌定量检测上,该传感器表现出较高的灵敏度、特异性以及重复性,加上操作简便、检测迅速,有望推广应用于食品工业中鼠伤寒沙门氏菌的快速检测和有效防控。The authors have declared that no competing interests exist.
