0 引言
【研究意义】由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的草莓灰霉病是一种常见的设施果蔬病害[1]。该病主要危害果实、花瓣和叶片,病原以菌核、菌丝体和分生孢子形态存在于土壤或者病残体中,翌年通过气流、农事操作等多种途径进行传播,可通过表皮或伤口侵入植物组织造成危害[2-5]。近些年,设施草莓面积迅速增加,但是由于大棚设施简陋和长期连作等原因,灰霉病发生逐年加重,一般轻者减产10%—20%,严重可减产50%以上[6]。由于环境的特殊性,灰霉病一旦发生,往往导致毁灭性损失[7-8]。因此,深入了解设施草莓灰霉病的发生规律可为科学合理地使用杀菌剂[9-10]、制定生态调控措施提供决策依据。【前人研究进展】国内外对草莓灰霉病流行规律已有一些研究。WAKEHAM等[11]在田间不同高度安装孢子捕捉器监测灰霉菌分生孢子数量,并分析了温度、相对湿度以及风速与分生孢子数量的关系,发现高度与分生孢子的数量成反比,温度和相对湿度与孢子数量没有显著性,风速与孢子数量呈显著相关性。草莓灰霉病的发生受地形、气候、种植方式和管理水平等多种因素的影响[12]。张亚等[13-15]对湖南省设施草莓灰霉病调查发现,不同地区、草莓品种、大棚类型以及轮作和连作棚等栽培方式下的草莓大棚中灰霉病发生严重程度存在差异;罗军等[16]对浙江金华地区大棚草莓灰霉病的发病特点进行研究,发现大棚连作田块发病严重,且灰霉病初现比新建大棚提前30 d左右。在温室里气候条件是严重影响灰霉病的发生和流行的主要因素,平均温度与相对湿度与病害发病率呈显著相关性[17-18];花期长时间保持高湿条件灰霉病发生严重[19-20]。韩永超等[21]研究发现草莓果实易从与花瓣接触的地方开始发病,灰霉菌侵染草莓的花和果实引起花枯和果腐;死亡的草莓叶片上分生孢子易感染草莓果实发病[5]。【本研究切入点】湖北省是中国重要的草莓产区,但迄今为止,在湖北省还未系统开展设施草莓灰霉病流行规律研究。【拟解决的关键问题】于2013—2015年对湖北省草莓灰霉病的发生动态进行系统调查,同时对无症组织带菌率进行检测,分析大棚温湿度、组织带菌率与灰霉病发生的相关性,明确设施草莓灰霉病的发生因素,为湖北省设施草莓灰霉病的监测和防控提供理论依据。1 材料与方法
1.1 材料
供试植物：2013—2015年在湖北省农业科学院草莓种植基地选取3个代表性草莓大棚,种植品种为主栽品种“法兰地”。每个草莓大棚间隔大于100 m,大棚高 3 m,宽 6 m,长100—170 m。从9月初定植草莓,12月、翌年3月和5月分别为3轮草莓果实盛期。棚内草莓采用常规种植管理方法。供试菌株：PCR检测用对照灰霉菌菌株B05.10,由华中农业大学植病生防实验室李国庆教授惠赠,在4℃条件保存于PDA斜面中。
试剂：电泳缓冲液0.5×TBE、分别称取Tris 107.8 g,硼酸盐55.1 g,EDTA 7.5 g,溶解于蒸馏水中,使终体积达到1 L,工作浓度0.5×TBE,由笔者实验室自行配置;分子生物学试剂如10×PCR buffer、dNTPs、MgCl2均购自宝生物工程（大连）有限公司;2×Taq PCR StarMix（GenStar）购自康润生物;其他常规化学试剂均为国产分析纯。
仪器：低温冷冻干燥仪（LGJ-10,北京松源华兴科技发展有限公司）;研磨仪（MM400,Retsch）;温湿度自动记录仪（ZDR-20,杭州泽大仪器有限公司）;凝胶成像仪（1708195,Bio-Rad伯乐）,PCR仪（Bio-Rad Laboratories,USA）,以及其他常规实验设备。
1.2 方法
1.2.1 设施草莓灰霉病不同组织带菌检测 在湖北省农业科学院草莓大棚中,2013年从3月初到生产期结束每7 d调查一次,2014和2015年从12月底到生产期结束每14 d调查一次,在3个大棚内5点取样,每点采集未显症的花、叶、果实各10个。花和叶采用特异性PCR法检测灰霉菌带菌率,果实采用室内保湿培养法检测带菌率。无症组织PCR扩增检测：采用CTAB法提取草莓花朵和叶片DNA[22]。以灰葡萄孢特异性检测SCAR标记片段为靶标基因[23],正向引物BC-F1序列：5′-AATGATCGCCTACACAGC-3′,反向引物BC-R1序列：5′-AGCTACCACCGAGAACAA-3′。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。
PCR反应体系25.0 μL,包括12.5 μL 2×Taq PCR StarMix,1.0 μL BC-F1（10 μmol·L-1）,1.0 μL BC-R1（10 μmol·L-1）,1.0 μL模板DNA,9.5 μL ddH2O。
PCR扩增条件：94℃ 5 min预热,中间34个循环,每个循环包括94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 1 min,72℃ 5 min,16℃ 2 min。
利用上述反应体系和反应条件进行PCR扩增,以灰霉菌菌株B05.10的菌丝DNA为阳性对照,以无菌ddH2O为阴性对照。反应终止后,取5 μL扩增产物,用1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
无症组织保湿培养检测：果实用75%酒精表面消毒,再用无菌水冲洗干净。将果实置于铺有吸水纸的100 mL烧杯内,每只烧杯放置一个果实,封口膜封口后,置于20℃温室内培养。5 d后检查带菌情况,果实上长出灰色霉层则认为是带菌[7]。
1.2.2 设施草莓灰霉病发生动态 2013年从3月初到拆棚每7 d调查一次,2014和2015年从12月底到拆棚每14 d调查一次,在大棚内5点取样,每点30株,记录和统计花、叶片和果实的发病率。
1.2.3 不同流行因子与果实发病率的相关性分析 在3个草莓大棚中安装温湿度自动记录仪,设置每1 h记录一次大棚内温度和空气相对湿度数据。每月采集一次数据,计算每次调查前10 d的温湿度平均值。利用IBM SPSS 20.0软件处理数据,将2013—2015年影响草莓灰霉病发生的7个相关因子（花朵发病率、叶片发病率、温度、相对湿度、果实带菌率、花朵带菌率、叶片带菌率）与草莓果实发病率进行Pearson相关性分析。其中花朵发病率是指每年两个大棚分别调查数据,叶发病率是指每年两个大棚分别调查数据,温度和相对湿度均选取每次调查前10 d的平均值,果实带菌率是指每年两个大棚分别经保湿培养统计的数据,花朵带菌率是指每年两个大棚分别经PCR检测的数据,叶片带菌率是指每年两个大棚分别经PCR检测的数据,果实发病率是指每年两个大棚分别调查数据;而花朵发病率、叶片发病率、果实带菌率、花朵带菌率和叶片带菌率为果实发病率数据的前一期数据。
1.2.4 模型建立及检验 经Pearson相关性分析,选取与果实发病率呈显著相关性的因子分别建立线性回归预测模型。建模未使用的另一个大棚数据对模型进行验证,其中此大棚数据与另外两个大棚数据处理一致。根据回归方程计算预测值,比较实际值与预测值之间的拟合度评价回归方程的验证效果。上述数据运用Excel进行录入,统计分析则采用SPSS 20.0软件完成。
2 结果
2.1 设施草莓灰霉病不同组织带菌检测
2013—2015年对湖北省设施草莓无症花朵、叶片、果实带菌情况进行检测,结果表明（图1）,从12月下旬开始草莓花朵、叶片和果实均有带菌,花朵带菌率在1月初、2月中旬和4月中上旬是高峰期,平均带菌率为15.5%,高峰期带菌率可达53.3%;叶片带菌率在1月中上旬和3月中旬是高峰期,平均带菌率为8.2%,高峰期带菌率为36.7%;果实带菌率在3月中下旬和4月下旬是高峰期,平均带菌率33.3%,高峰期带菌率达79.3%。总体来说,草莓花、叶、果带菌率变化起伏较大,花和果实带菌率相对较高。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1设施草莓花朵、叶片和果实带菌率（2013—2015年）
-->Fig. 1Disease infection rates of strawberry flowers, leaves and fruits in greenhouse (2013-2015)
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2.2 设施草莓灰霉病发生动态
2013—2015年对湖北省设施草莓灰霉病发生动态进行调查,结果表明花从12月中下旬开始发病,无明显高峰期,发病较为平缓,平均发病率为8.7%;叶片从1月上旬或2月上旬开始发病,没有明显高峰期,平均发病率仅为1.4%;果实从12月上旬开始发病,高峰期为3月份到采收结束,平均发病率19.8%,高峰期发病率可达80.1%（图2）。总体来说,草莓花和叶发病较轻,发生较为平稳,果实在3月之后发病逐渐加重。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2设施草莓叶片、花朵和果实上灰霉病发病率（2013—2015年）
-->Fig. 2Disease incidences of strawberry flowers, leaves and fruits in greenhouse (2013-2015)
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2.3 不同流行因子与果实发病率的相关性分析
2013—2015年湖北省设施两个大棚草莓灰霉病果实发病率（y）与7个流行因子——花朵发病率（x1）、叶片发病率（x2）、温度（x3）、相对湿度（x4）、果实带菌率（x5）、花带菌率（x6）、叶片带菌率（x7）进行Pearson相关性分析。由表1可知,草莓叶片发病率（r=0.706,P<0.01）、温度（r=0.668,P<0.01）和果实带菌率（r=0.803,P<0.01）均与果实发病率存在显著相关性,且叶片发病率、温度、果实带菌率之间也存在显著自相关性。Table 1
表1
表1草莓灰霉病流行因子与果实发病率的相关性分析（2013—2015年）
Table 1Correlation analysis between epidemic factors and fruit disease incidence of grey mould of strawberry in 2013-2015
| 发病因子 Epidemic factor | 果实发病率 Fruit disease incidence | 花朵发病率Petal disease incidence | 叶片发病率 Foliar disease incidence | 温度 Temperature | 相对湿度 Relative humidity | 果实带菌率 Percent of fruit infestation | 花朵带菌率 Percent of petal infestation | 叶片带菌率 Percent of foliar infestation |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 果实发病率 Fruit disease incidence | 1 | 0.044 | 0.706** | 0.668** | -0.195 | 0.803** | 0.086 | -0.053 |
| 花朵发病率 Petal disease incidence | 1 | 0.404* | 0.515** | -0.604** | -0.092 | 0.145 | -0.120 | |
| 叶片发病率 Foliar disease incidence | 1 | 0.680** | -0.382* | 0.681** | 0.074 | -0.035 | ||
| 温度 Temperature | 1 | -0.758** | 0.652** | 0.351* | -0.197 | |||
| 相对湿度 Relative humidity | 1 | -0.280 | -0.335* | 0.105 | ||||
| 果实带菌率 Percent of fruit infestation | 1 | 0.197 | 0.114 | |||||
| 花朵带菌率 Percent of petal infestation | 1 | 0.057 | ||||||
| 叶片带菌率 Percent of foliar infestation | 1 |
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2.4 模型建立
经相关性分析发现,果实带菌率、叶片发病率和温度与果实发病率呈显著相关性,但由于果实带菌率、叶片发病率和温度之间存在自相关性,故分别用果实带菌率、叶片发病率和温度建立3个果实发病率的预测模型：模型一：y=0.55x5+5.76（R2=0.645,P<0.01）;模型二：y=8.18x2+9.25（R2=0.498,P<0.01）;模型三：y=2.49x3-13.62（R2=0.446,P<0.01）。其中,y为2013—2015年草莓灰霉病果实发病率、x5果实带菌率、x2为叶片发病率、x3为温度。2.5 预测模型的检验
采用建模未使用的数据对模型进行检验,3个模型的预测值和实际值得回归模型见图3,3个回归模型的决定系数分别为0.6435（P<0.01）、0.4439（P<0.01）和0.4753（P<0.01）,结果表明所建模型预测值和实际值符合程度好。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3设施草莓灰霉病果实发病率实际值与模型预测值的回归分析（2013—2015年）
-->Fig. 3Correlation analysis between actual and predicted values of fruit disease incidence of grey mould of strawberry (2013-2015)
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3 讨论
本研究分析不同流行因子与草莓果实发病率的相关性,经相关性分析表明,草莓果实发病率与调查取样前3、5、10 d的平均温湿度值的线性回归R2值区间分别为0.787—0.828、0.795—0.851和0.862—0.902,草莓果实发病率与不同天数平均温湿度的相关性分析中前10 d的R2值明显高于前5 d和前3 d的R2值,因此,取前10 d的温湿度值进行相关性分析。本研究采用相关分析法,发现草莓叶片发病率、温度和果实带菌率均与果实发病率存在显著相关性,其相关性大小依次为果实带菌率（r=0.803,P<0.01）、草莓叶片发病率（r=0.706,P<0.01）、温度（r=0.668,P<0.01）。根据本文检测结果,虽然田间果实带菌率很高,但在果实成熟期和储藏期时,成熟的果实也易受到其他组织上的分生孢子侵染[24],这一点可说明其他组织发病与果实带菌对果实发病都有显著影响。相对湿度越大发病情况越严重,烂果上会出现灰色霉状物[25]。中国不同地区气候条件差异很大,湖北省地处长江中下游地区,空气湿度大,加上现有栽培模式下草莓大棚中湿度已满足灰霉病发生所需条件,因此,推测一定范围内的湿度变化在湖北省草莓大棚中对灰霉病的发生影响较小。本文分析发现果实带菌是草莓果实发病最重要的影响因子,进一步验证了分析结果的可靠性。草莓生长周期跨度较长,在湖北省一般从9月开始到次年的5月采收完毕;2013—2015年监测了大棚内温度变化情况,发现3个大棚内日平均气温保持在6—23℃,棚内温度变化显著。随着高温时间和低湿时间的不断增加,草莓灰霉病病菌的菌丝对叶片的侵染发病程度和侵染速率均不断降低,每天保持空气相对湿度在81%以下的时间达6 h,就可以明显抑制灰霉病的发生。在棚温控制方面,可采取大棚温差变温管理,对灰霉病的防治效果较为理想[26]。李宝聚等[27]从群体的角度研究灰霉病菌对温度的适应性,结果表明灰霉病菌孢子的萌发适温在15—25℃,最适温度为20℃。
本研究根据相关性分析的结果建立了分别基于草莓叶片发病率、温度和果实带菌率的预测模型,可以在不同的数据源的情况下使用,简单实用。目前尚未发现对灰霉菌高抗的草莓品种[28],在草莓种植过程中应注重监测影响果实发病的重要因子,以便为后期药剂防治提供参考;同时,控温控湿应作为大棚中草莓灰霉病防控的重要措施;但如何协调病害控制与草莓正常发育的关系,还需进一步研究。
4 结论
利用常规PCR法结合多种病害影响因子预测设施草莓灰霉病的发生,明确了果实带菌率、叶片发病率、温度与草莓灰霉病发生的关系;在防治过程中应及时摘除发病组织,降低果实带菌率,预防灰霉病发生。The authors have declared that no competing interests exist.
