0 引言
【研究意义】脊椎数是影响猪胴体长和产肉量的重要经济性状,也是一个高遗传力性状（遗传力可达0.7以上）[1]。家猪的祖先野猪的胸腰椎数共有19根[ 2],而西方商业猪种在长期选育的过程中对体型的大小特别是体长进行了高强度的人工选择,胸腰椎数可达20—23根 [3-4]。研究发现每增加一根脊椎数可使成年猪的胴体增长80mm,体重可增加4—8 kg,单位产肉效率明显提高[5-6]。因此,揭示猪脊椎数性状形成的分子机制对提高猪的产肉性能和养殖效益等均具有重要的实践意义。【前人研究进展】由于与生产性能关系密切,猪脊椎数性状在生产实践和科学研究领域均引起了广泛关注,科学家一直在寻找影响猪脊椎数的QTL、主效基因和遗传标记。2000年WADA等[7]首先利用318个遗传标记（主要为微卫星）对梅山猪×哥廷根猪资源家系进行全基因组扫描,发现在1号和2号染色体上存在影响猪脊椎数的QTL。2003年SATO等[8]利用180个微卫星标记和梅山猪×杜洛克猪家系,发现7号染色体上也存在影响猪脊椎数的QTL。2011年MIKAWA等[9]将7号染色体上影响猪脊椎数的QTL进行了精细定位,认为精细QTL内唯一的编码蛋白基因VRTN（Vertebrae Development Homolog,是人类C14orf115同源基因）是候选基因,且Q/Q型个体的脊椎数显著高于wt/wt型。随后多个课题组利用Illumina PorcineSNP60 Beadchip在不同的资源家系和群体中均发现VRTN是影响猪脊椎数的主效基因,如REN等[10]和FAN等[11]在白色杜洛克猪×二花脸猪家系,FAN等[11]在二花脸猪×通城猪家系、苏太猪群体和杜长大三元杂交猪群体,DUIJVESTEIJN等[12]在大白猪群体。欧阳子璇[13]在白色杜洛克猪×二花脸猪家系中发现VRTN基因ins291和NV027 C>A等2个位点符合因果突变的条件,其中ins291位点为291 bp的大片段插入突变（PRE1元件）,为因果突变的可能性更大。FAN等[11]进一步证实ins291突变可能就是影响猪脊椎数的致因突变。【本研究切入点】近年来,在国内猪新品种（品系）培育过程中脊椎数的选育正逐渐引起关注[13]。苏淮猪是2011年国家审定的新品种,是以新淮猪为母本,与大白猪杂交培育而成的。但目前关于苏淮猪脊椎数的研究还未见报道。【拟解决的关键问题】拟以苏淮猪为研究对象,以VRTN为候选基因,克隆苏淮猪VRTN基因编码区全序列,了解其序列特征和组织表达特征,分析苏淮猪VRTN基因ins291位点的多态性,以期为揭示苏淮猪脊椎数性状形成机制和苏淮猪选育提高提供理论依据。1 材料与方法
1.1 试验时间、地点
本试验于2014年12月至2015年10月在南京农业大学动物遗传育种实验室进行。1.2 试验动物
在淮阴种猪场随机选取3头成年苏淮猪,屠宰后立即采集心、肝、脾、肺、肾、下丘脑、肌肉和卵巢等组织,置于液氮中冻藏,用于提取组织总RNA。随机选取健康无病、体况良好的成年苏淮猪繁殖母猪106头,采集耳组织样,置于装有75%酒精的离心管中,用冰盒带回实验室,用于提取基因组DNA。1.3 DNA和RNA提取
采用常规的酚/氯仿法提取苏淮猪耳基因组DNA。采用TRlzol Reagent（Invitrogen公司）提取苏淮猪各组织总RNA,采用PrimeScriptTM RT Master Mix试剂盒（Takara公司）进行反转录,具体方法详见说明书。反转录产物置于-20℃冰箱中保存。1.4 RT-PCR反应与克隆测序
根据猪VRTN基因序列（NM_001195113.1）,利用Premier 5.0软件设计2对引物（P1和P2）,扩增苏淮猪VRTN基因编码区序列,引物序列见表1。RT-PCR反应程序：98℃预变性30s;98℃ 5 s、退火30 s、72℃ 1.5 min 35个循环;最后72℃延伸7 min。PCR 产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳分离,用Gel Purification Kit凝胶回收试剂盒（Omega公司）进行PCR产物纯化。纯化产物克隆入pMD19-T vector（TaKaRa公司）,并转化到DH5α感受态细胞中;采用质粒提取试剂盒（Axygen公司）提取质粒,送由苏州金唯智公司进行测序。Table 1
表1
表1PCR引物及反应条件
Table 1Primers and conditions of PCR
| 基因 Gene | 引物序列（5'-3'） Primer sequences | 退火温度（℃） Annealing temp | 产物长度（bp） Product size | 用途 Usage | |
|---|---|---|---|---|---|
| P1 | VRTN | F: TCAGTTGCTGCCCACAGG R: GCGTTTGAAGCAGCGATAG | 58 | 1328 | 编码区克隆 CDS clone |
| P2 | VRTN | F: TACCCTATCGCTGCTTCAAAC R: GCGGTCCTCCTTCTTCGTC | 59 | 898 | 编码区克隆 CDS clone |
| P3 | VRTN | F: GAGTGAGAGTGGCGCTCAGTT R: TCGGAGCAGAGGGAATAGC | 60 | 525 | RT-PCR |
| P4 | GAPDH | F: GGACTCATGACCACGGTCCAT R: TCAGATCCACAACCGACACGT | 60 | 246 | RT-PCR |
| P5 | VRTN | F: CCATTGCTGGGCATCACA R: GCGTTTGAAGCAGCGATAG | 58 | 384/93 | 基因分型 Genotyping |
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1.5 序列分析
采用DNAMAN、BioEdit 7.0等生物信息学软件对苏淮猪VRTN基因编码区序列进行拼接、氨基酸序列预测和蛋白性质分析。用Clustal W（http://www.ebi. ac.uk）进行核苷酸和蛋白质序列比对分析。利用UCSC基因组浏览器（http://genome.ucsc. edu/cgi-bin/hgBlat）与NCBI基因组数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ mapview/）进行猪VRTN基因的染色体定位和基因组结构分析。利用SMART软件（http://smart.embl- heidelberg.de）预测蛋白质功能域,CPHmodels软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels）预测蛋白质三级结构。哺乳动物VRTN基因序列均从GenBank数据库下载,包括人（NM_018228.2）、倭黑猩猩（XM_003824163）、小鼠（NM_001168588.1）、大鼠（XM_003750199.3）、绵羊（XM_012111602.1）、牛（NM_001206630.1）和鸡（XM_421265.4）。1.6 苏淮猪VRTN基因组织表达谱分析
以GAPDH基因为内参,根据猪VRTN基因（NM_001195113.1）和GAPDH基因mRNA序列（NM_001206359.1）设计引物P3、P4（表1）,以苏淮猪各组织cDNA为模板进行RT-PCR扩增。PCR产物进行1.5% 琼脂糖凝胶电泳,观察结果并拍照记录。1.7 苏淮猪VRTN基因ins291位点的多态性分析
根据文献[11]中报道的影响猪脊椎数性状的VRTN基因的g.20311_20312 ins291位点,设计引物P5（表1）,以苏淮猪基因组DNA为模板进行PCR扩增。扩增产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳分离,根据条带大小对苏淮猪不同个体VRTN基因ins291位点进行分型。多态信息含量和杂合度等的计算方法见文献[14]。2 结果
2.1 苏淮猪VRTN基因PCR扩增
以苏淮猪肌肉组织cDNA为模板,利用引物P1与P2进行PCR扩增,PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳检测,得到特异性良好且与目的片段大小一致的扩增片段（图1）。测序后发现扩增片段长度分别为1 328和898 bp,与引物设计时预期长度一致。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1苏淮猪VRTN基因PCR扩增产物电泳图谱
-->Fig. 1Agarose gel photograph of VRTN gene in Suhuai pig
-->
2.2 苏淮猪VRTN基因编码区序列分析
通过克隆测序和序列拼接获得了苏淮猪VRTN基因完整的编码区序列,序列长度为2 097 bp（图2）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2苏淮猪VRTN基因核苷酸序列与预测的氨基酸序列
-->Fig. 2Nucleotide and amino acid sequence of VRTN gene in Suhuai pig
-->
采用BioEdit 7.0软件对苏淮猪VRTN基因编码区核苷酸序列的碱基组成进行分析,结果发现CG含量（64.27%）明显高于AT含量（35.73%）。BLAST比对发现苏淮猪VRTN基因编码区核苷酸序列与引物源序列（NM_001195113.1）的一致性为99.95%。苏淮猪VRTN基因编码区核苷酸序列与其它哺乳动物如人、倭黑猩猩、小鼠、大鼠、牛和羊的一致性分别为84.98%、85.12%、74.53%、73.68%、85.84%和86.45%,而与鸡的一致性只有54.42%。哺乳动物相近物种间VRTN基因编码区核苷酸序列的一致性更高,如人和倭黑猩猩（99.38%）、牛和羊（96.48%）。电子染色体定位发现VRTN基因定位在猪7号染色体上,介于AbcD4基因（XM_013989158.1）与SYNDIG1L基因（XM_013989161.1）之间。基因组结构分析发现猪VRTN基因由2个外显子和1个内含子构成。
2.3 苏淮猪VRTN蛋白氨基酸序列分析
苏淮猪VRTN基因编码蛋白含有698个氨基酸残基（图3）。氨基酸组分分析显示苏淮猪VRTN蛋白氨基酸序列存在全部20种氨基酸,其中Leu（亮氨酸）含量最高,达到10.44%,而Asp天冬氨酸含量最低,只有1.43%。氨基酸残基中酸性氨基酸（Asn、Asp、Gln、Glu）有98个,碱性氨基酸（Arg、His、Lys）有89个;正电荷残基（Asp、Glu）有52个,负电荷残基（Arg、Lys）有75个。同源性分析发现苏淮猪VRTN蛋白氨基酸序列与人、倭黑猩猩、小鼠、大鼠、牛和羊等的一致性分别为85.55%、84.80%、70.07%、70.33%、86.20%和86.06%,但与鸡的一致性只有51.17%。同样地,哺乳动物相近物种间VRTN蛋白氨基酸序列一致性更高,如人和倭黑猩猩（99.00%）、牛和羊（96.71%）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3苏淮猪 VRTN基因氨基酸序列与其他哺乳动物的同源性比较
-->Fig. 3Identical alignments of VRTN amino acid sequence in Suhuai pig with other mammals
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2.4 苏淮猪VRTN基因编码蛋白特征分析
苏淮猪VRTN蛋白的分子量为77.8467kD,理论等电点pI为 9.37,体外半衰期为30 h,不稳定系数63.41,疏水性均值（GRAVY）为-0.274。ProtScale和BioEdit软件分析发现在苏淮猪VRTN蛋白270—320、400—450、550—600氨基酸之间有3个较强的亲水性区域,说明苏淮猪VRTN蛋白具有较强的亲水性。NCBI与SMART在线软件对VRTN蛋白功能结构域进行分析,结果并未在苏淮猪VRTN蛋白上发现跨膜结构,但发现苏淮猪VRTN蛋白氨基酸序列存在2个低复杂区域（LCR）（5Glu—20Glu;247Glu—275Ser）和2个内部重复序列（RPT）（291Val—436Arg;530Ser—687Ala）,另外检测到一个HTH结构域（276Gln—306Glu）（图3）。利用CPHmodels在线工具进行苏淮猪VRTN蛋白质三级结构预测分析,结果见图4。从图4可以看出VRTN蛋白包含6个α螺旋、5个β折叠以及若干无规则卷曲结构。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图4苏淮猪VRTN蛋白三级结构预测
-->Fig. 4Space structure prediction analysis of VRTN protein in Suhuai pig
-->
2.5 苏淮猪中VRTN基因组织表达谱分析
以苏淮猪各个组织cDNA为模板,利用引物P3与P4进行RT-PCR分析,PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图5。可以看出,在苏淮猪心、肝、脾、肺、肾、下丘脑、卵巢和肌肉等组织中均检测到VRTN基因的表达,说明VRTN基因是一个广泛表达的基因。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图5苏淮猪VRTN基因组织表达谱
-->Fig. 5Normal expression profile of VRTN gene in Suhuai pig
-->
2.6 苏淮猪VRTN基因ins291位点多态性分析
在苏淮猪群体中检测到VRTN基因ins291位点的3种基因型（图6）,其中仅有93bp条带的为野生纯合型（wt/wt）,仅有384 bp条带的为突变纯合型（Q/Q）,含有384和93 bp条带的为杂合型（wt/Q）。苏淮猪VRTN基因ins291位点的基因型频率、基因频率分析结果见表2。在苏淮猪群体中wt/wt型为优势基因型,基因型频率为0.717;wt为优势等位基因,基因频率是0.816。另外,遗传多态性分析发现苏淮猪VRTN基因ins291位点的多态信息含量为0.331,为中度多态位点,杂合度为0.40,变异程度相对较低。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图6苏淮猪VRTN基因ins291位点基因分型
-->Fig. 6The genotype patterns of the VRTN ins 291 mutation in Suhuai pig individuals
-->
Table 2
表2
表2苏淮猪和其它猪种VRTN基因ins291位点的基因型频率和基因频率
Table 2Polymorphism of VRTN ins291 in Suhuai pig and other pig breeds
| 品种 Breed | 样本量 n | 基因型频率 Genotype frequency | 等位基因频率 Allele frequency | 文献 Ref. | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| wt/wt | wt/Q | Q/Q | wt | Q | |||
| 苏淮猪 Suhuai | 106 | 0.717（76） | 0.198（21） | 0.085（9） | 0.82 | 0.18 | |
| 杭猪 Hang | 31 | - | - | - | 0.71 | 0.29 | [11] |
| 通城猪 Tongcheng | 32 | - | - | - | 0.72 | 0.28 | [11] |
| 巴马香猪 Bamaxiang | 31 | - | - | - | 0.85 | 0.15 | [11] |
| 莱芜黑猪 Laiwu Black | 32 | - | - | - | 0.86 | 0.14 | [11] |
| 藏猪 Tibetan | 30 | - | - | - | 0.92 | 0.08 | [11] |
| 二花脸猪 Erhualian | 205 | - | - | - | 0.94 | 0.06 | [11] |
| 金华猪 Jinhua | 32 | 1.000（32） | 0.00（0） | 0.00（0） | 1.00 | 0.00 | [11] |
| 蓝塘猪 Lantang | 30 | 1.000（30） | 0.00（0） | 0.00（0） | 1.00 | 0.00 | [11] |
| 梅山猪 Meishan | 30 | 1.000（30） | 0.00（0） | 0.00（0） | 1.00 | 0.00 | [11] |
| 宁乡猪 Ningxiang | 32 | 1.000（32） | 0.00（0） | 0.00（0） | 1.00 | 0.00 | [11] |
| 荣昌猪 Rongchang | 32 | 1.000（32） | 0.00（0） | 0.00（0） | 1.00 | 0.00 | [11] |
| 五指山猪 Wuzhishan | 30 | 1.000（30） | 0.00（0） | 0.00（0） | 1.00 | 0.00 | [11] |
| 中国野猪 Chinese wild boar | 31 | 1.000（31） | 0.00（0） | 0.00（0） | 1.00 | 0.00 | [11] |
| 欧洲野猪 European wild boar | 13 | 1.000（13） | 0.00（0） | 0.00（0） | 1.00 | 0.00 | [1] |
| 杜洛克猪 Duroc | 103 | - | - | - | 0.46 | 0.54 | [11] |
| 445 | 0.252（112） | 0.521（232） | 0.227（101） | 0.51 | 0.49 | [6] | |
| 长白猪 Landrace | 175 | - | - | - | 0.29 | 0.71 | [11] |
| 大白猪 Large white | 392 | - | - | - | 0.34 | 0.66 | [11] |
| 皮特兰 Pietrain | 37 | 0.378（14） | 0.243（9） | 0.378（14） | 0.50 | 0.50 | [1] |
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3 讨论
研究表明在猪基因组上存在着大量的QTL,而在这些QTL内一些候选基因的多态性与猪性状之间存在着潜在的联系,例如IGF2基因内含子3上g.3072G>A位点多态性与猪肌肉生长高度关联[15],MC4R基因上 p.D298N（c.892G>A）位点错义突变导致猪采食量和日增重都显著减少[16],VRTN基因ins291突变是影响猪脊椎数的致因突变[11],PPARD基因G32E 位点多态性与猪耳朵面积显著关联[17],PHKG1基因g.8283C>A突变引起猪肌糖原含量升高和肉质下降[18],等等。VRTN基因位于猪7号染色体上,介于控制脂肪分解和乳头数性状的数量性状基因座之间[9,12]。猪VRTN基因全长9 570 bp,有2个外显子,其中一个是编码蛋白[19]。本文通过克隆测序获得了苏淮猪VRTN基因编码区序列,发现苏淮猪核甘酸（氨基酸）序列与其它哺乳动物比较的一致性均高于73%（70%）,明显低于猪某些基因和哺乳动物其它物种的同源性,如Smad4基因（高于86%和98%）[20]、ECE基因（高于87%和96%）[21]、Rb1基因（高于89%和91%）[22]和MSRB3基因（高于84%和88%）[23],而与猪NR5A2基因[24]相近,说明哺乳动物VRTN基因在进化过程中相对保守,这与前人研究发现VRTN基因位于突变位点较为常见的区域是一致的[9,12]。苏淮猪VRTN蛋白特征预测发现VRTN蛋白不具备跨膜功能,包含2个LCR和2个RPT区域,以及1个HTH结构域。研究发现HTH结构域包含螺旋-反转-螺旋基础结构,为一个序列特异性结构单元,常见于转录调节因子蛋白,用以识别靶基因的转录调控序列[25],提示VRTN蛋白可能具有调控转录的功能,但目前尚未见到相关研究报道。VRTN基因是影响猪脊椎数性状的主效基因,于2011年首先在大白猪群体中被鉴定[9]。VRTN基因多态性被认为是影响猪脊椎数变异的主要因素,MIKAWA等[9]在猪VRTN基因中检测到9个突变位点,其中单倍型Q比单倍型wt的脊椎数多1.02根,且这些突变影响VRTN基因在胚胎发育早期的转录,其中单倍型Q型高于单倍型wt。进一步分析发现,NV123位点中Q等位基因是插入了一个291bp的PRE1元件（一种猪SINE元件）形成的,而SINE元件可以作为增强子元件调控相应基因的表达[9,26]。欧阳子璇[13]利用白色杜洛克猪×二花脸猪家系研究认为NV123ins291位点可能是影响猪脊椎数性状的因果突变位点（QTN）,随后FAN等[11]进一步证实了这个观点。本研究以ins291位点为对象,分析了苏淮猪群体VRTN基因ins291位点的多态性,结果在苏淮猪群体中发现了高脊椎数等位基因的存在,Q等位基因的频率为0.18,明显低于另一个等位基因wt的频率（0.82）。研究发现在西方猪商业化猪种中VRTN基因ins291位点Q等位基因频率均较高,例如杜洛克猪、长白猪、大白猪和皮特兰猪中Q等位基因频率分别高达0.54、0.71、0.66和0.50（表2）,这与西方猪种脊椎数较多和体长较长是一致的[1,11]。国内地方猪种中一般检测不到Q等位基因或其频率较低,如梅山猪、金华猪等Q等位基因频率均为0[11]。中外猪种脊椎数和VRTN基因ins291位点Q等位基因频率的差异,是因为西方猪种在近、现代选育过程中注重对猪体长的选育,高强度地选育了具有较多脊椎数的品种,从而人为的提高了西方猪种Q等位基因频率[27]。在苏淮猪群体中检测到VRTN基因ins291位点Q等位基因,可能与苏淮猪血统有关,即在苏淮猪的培育过程中引入了西方猪种大白猪的血统[28]。
4 结论
本研究分离了苏淮猪脊椎数主效基因VRTN基因编码区全序列,了解了其基因特征和蛋白性质。RT-PCR发现VRTN基因在苏淮猪各种组织中广泛表达。在苏淮猪群体中鉴定出VRTN 基因ins291位点高脊椎数等位基因Q的存在,为苏淮猪胴体长和产肉性状的进一步选育提高提供了理论基础和分子标记。（责任编辑 林鉴非）
The authors have declared that no competing interests exist.
