刘秀云, 李慧, 刘志国, 赵锦, 刘孟军. 基于SSR标记的255个枣品种亲缘关系和群体遗传结构分析[J]. , 2016, 49(14): 2772-2791 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.011
LIU Xiu-yun, LI Hui, LIU Zhi-guo, ZHAO Jin, LIU Meng-jun. Genetic Diversity and Structure of 255 Cultivars of Ziziphus jujuba Mill.[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2016, 49(14): 2772-2791 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.011

0 引言

【研究意义】枣（Ziziphus jujuba Mill.）原产中国,栽培历史悠久,遗传变异丰富,“同物异名”和“同名异物”现象较为突出。采用传统的形态学鉴定,费时费力,并且难以准确的鉴定性状相似的品种,而利用分子标记构建枣品种指纹图谱并进行遗传结构分析,有助于枣品种鉴定、遗传进化分析和分子辅助育种等研究。【前人研究进展】RAPD（random amplified polymorphic DNA）、AFLP（amplified fragment length polymorphism）等分子标记曾被成功用于枣的指纹图谱构建和亲缘关系分析。赵锦等^[1]对枣树品种、品系及其近缘种进行了RAPD分析,乔勇等^[2]利用AFLP技术对21个枣品种进行了分析,上述研究中供试材料的聚类结果与传统观点基本一致。近年来,SSR（simple sequence repeat）和SNP（single nucleotide polymorphisms）在国际植物新品种权保护联盟（UPOV）的BMT分子测试指南中被确定为构建DNA指纹数据库的标准标记方法。由于SSR标记操作简单,已成为当前各种作物建库的首选标记^[3]。SSR是由1—6个碱基对组成的简单序列重复,又称微卫星DNA,已经被应用在葡萄、猕猴桃、杏、苹果等果树上进行遗传多样性分析^[4-7]。2012年,麻丽颖等^[8]利用12对SSR引物也构建了36份枣品种的指纹图谱。遗传结构分析研究已在苹果^[9-10]、梨^[11]、杏^[12-16]、毛樱桃^[17]、杨梅^[18]、荔枝^[19]、芒果^[20]、猕猴桃^[21]、核桃^[22-23]、石榴^[24]、桃^[25]中开展。在枣树研究中,李海涛^[26]利用ISSR标记进行研究的结果表明,河南枣主栽品种与灰枣的总群体间分化程度较高,群体间基因交流较少,基因流可防止由遗传漂变引起的群体间的遗传分化;殷晓^[27]利用ISSR标记对237份枣种质的遗传多样性进行了分析,结果表明黄河沿岸枣群体的杂合程度为重度杂合,遗传多样性丰富,变异程度较高,趋向远缘杂交。【本研究切入点】目前尚未有利用SSR技术对大规模枣种质材料进行遗传结构分析的报道,因此,在前人研究基础上,利用前期基于枣基因组测序开发的SSR引物^[28],对来自全国22个省区主产地的255份枣种质进行更广范围的遗传多样性及群体结构研究。【拟解决的关键问题】分析中国枣种质资源的起源,探讨其遗传多样性水平和遗传结构,为指纹图谱构建和分子辅助育种提供理论依据。

1 材料与方法

试验于2015年在河北农业大学进行。

1.1 材料

选取来自全国22个省区及主产地的255个枣树品种,供试品种信息详见表1。所有品种材料均采自山西太谷国家枣种质资源圃,于2013年6月采集供试材料的新鲜幼嫩叶片,置于冰盒中带回实验室,转入-20℃冰箱贮藏,以备提取基因组DNA。
Table 1
表1
表1供试品种材料
Table 1Cultivars used in the study

编号 Code	名称 Cultivar	原产地 Origin		编号 Code	名称 Cultivar	原产地 Origin		编号 Code	名称 Cultivar	原产地 Origin
1	稷山板枣（B） Jishanbanzao	山西 Shanxi		26	太谷鸡心蜜（F） Taigujixinmi	山西 Shanxi		51	彬县晋枣（B,P） Binxianjinzao	陕西 Shannxi
2	襄汾崖枣（D） Xiangfenyazao	山西 Shanxi		27	太谷葫芦枣（B） Taiguhuluzao	山西 Shanxi		52	大荔耙齿枣（B） Dalipachizao	陕西 Shannxi
3	稷山柳罐枣（D） Jishanliuguanzao	山西 Shanxi		28	历城串铃枣（D） Lichengchuanlingzao	山东 Shandong		53	彬县元枣（D,P） Binxianyuanzao	陕西 Shannxi
4	夏县紫圆枣（D） Xiaxianziyuanzao	山西 Shanxi		29	北京笨枣（B） Beijingbenzao	北京 Beijing		54	清宛大丹枣（B） Qingwandadanzao	河北 Hebei
5	襄汾木枣（D） Xiangfenmuzao	山西 Shanxi		30	婆枣枝变1号（D） Pozaozhibian 1	河北 Hebei		55	枣强脆枣（F） Zaoqiangcuizao	河北 Hebei
6	临汾针葫芦（B） Linfenzhenhulu	山西 Shanxi		31	黎城大马枣（B） Lichengdamazao	山西 Shanxi		56	沧县长小枣（B） Cangxianchangxiaozao	河北 Hebei
7	临猗梨枣（F） Linyilizao	山西 Shanxi		32	交城端枣（B） Jiaochengduanzao	山西 Shanxi		57	枣强婆枣（D） Zaoqiangpozao	河北 Hebei
8	夏县圆脆枣（B） Xiaxianyuancuizao	山西 Shanxi		33	太谷端子枣（D） Taiguduanzizao	山西 Shanxi		58	灵宝大枣（B,P） Lingbaodazao	河南 He’nan
9	洪赵脆枣（B） Hongzhaocuizao	山西 Shanxi		34	赞皇大枣（B） Zanhuangdazao	河北 Hebei		59	新郑鸡蛋枣（B） Xinzhengjidanzao	河南 He’nan
10	襄汾官滩枣（D） Xiangfenguantanzao	山西 Shanxi		35	北京坠子白（F） Beijingzhuizibai	北京 Beijing		60	濮阳三变红枣（D,P） Puyangsanbianhongzao	河南 He’nan
11	运城相枣（D） Yunchengxiangzao	山西 Shanxi		36	平遥苦端枣（D） Pingyaokuduanzao	山西 Shanxi		61	枣强傻枣（D） Zaoqiangshazao	河北 Hebei
12	襄汾圆枣（F） Xiangfenyuanzao	山西 Shanxi		37	北京泡泡枣（D,P） Beijingpaopaozao	北京 Beijing		62	濮阳糖枣（B） Puyangtangzao	河南 He’nan
13	临汾团枣（B） Linfentuanzao	山西 Shanxi		38	中阳团枣（B） Zhongyangtuanzao	山西 Shanxi		63	镇平胎里红（P） Zhenpingtailihong	河南 He’nan
14	平陆尖枣（B） Pinglujianzao	山西 Shanxi		39	黎城小枣（B） Lichengxiaozao	山西 Shanxi		64	新郑齐头白枣（B） Xinzhengqitoubaizao	河南 He’nan
15	榆次牙枣（F） Yuciyazao	山西 Shanxi		40	洪赵十月红（D） Hongzhaoshiyuehong	山西 Shanxi		65	新郑尖头灰枣（D） Xinzhengjiantouhuizao	河南 He’nan
16	平陆屯屯枣（B,P） Pinglutuntunzao	山西 Shanxi		41	蒲城圆梨枣（B） Puchengyuanlizao	陕西 Shannxi		66	延川跌牙枣（F） Yanchuandieyazao	陕西 Shannxi
17	平顺笨枣（D） Pingshunbenzao	山西 Shanxi		42	蒲城绵枣（B） Puchengmianzao	陕西 Shannxi		67	官滩2号（D） Guantan 2	山西 Shanxi
18	永济蛤蟆枣（F） Yongjihamazao	山西 Shanxi		43	大荔马牙枣（F） Dalimayazao	陕西 Shannxi		68	永城长红枣（D,P） Yongchengchanghongzao	河南 He’nan
19	运城婆婆枣（D） Yunchengpopozao	山西 Shanxi		44	大荔小墩墩枣（D） Dalixiaodundunzao	陕西 Shannxi		69	大荔疙瘩枣（D） Daligedazao	陕西 Shannxi
20	平遥大枣（D） Pingyaodazao	山西 Shanxi		45	大荔铃铃枣（B） Dalilinglingzao	陕西 Shannxi		70	大荔蜂蜜罐（F） Dalimifengguan	陕西 Shannxi
21	交城骏枣（D,P） Jiaochengjunzao	山西 Shanxi		46	大荔龙枣（O） Dalilongzao	陕西 Shannxi		71	SS1核桃纹（B） SS1hetaowen	山东 Shandong
22	保德小枣（B） Baodexiaozao	山西 Shanxi		47	蒲城墩墩枣（D） Puchengdundunzao	陕西 Shannxi		72	太谷壶瓶枣（B） Taiguhupingsuan	山西 Shanxi
23	沧县小枣（B） Cangxianxiaozao	河北 Hebei		48	彬县黑疙瘩枣（D） Binxianheigedazao	陕西 Shannxi		73	大荔知枣（B） Dalizhizao	陕西 Shannxi
24	平顺俊枣（B） Pingshunjunzao	山西 Shanxi		49	枣强马连小枣（B） Zaoqiangmalianxiaozao	河北 Hbei		74	新郑鸡心枣（D） Xinzhengjixinzao	河南 He’nan
25	河南龙枣（D,O） Henanlongzao	河南 He’nan		50	临潼轱辘枣（F） Lintongguluzao	陕西 Shannxi		75	陕西面枣928（B） Shanximianzao 928	陕西 Shannxi
续表1 Continued table 1
编号 Code	名称 Cultivar	原产地 Origin		编号 Code	名称 Cultivar	原产地 Origin		编号 Code	名称 Cultivar	原产地 Origin
76	新郑长鸡心枣（D） Xinzhengchangjixinzao	河南 He’nan		102	喀什葛尔小枣（B） Kashigeerxiaozao	山西 Shanxi		128	朝阳齐脆枣（F） Chaoyangqicuizao	辽宁 Liaoning
77	南京枣（P） Nanjingzao	浙江 Zhejiang		103	吾库扎克小枣（B） Wukuzhakexiaozao	山西 Shanxi		129	朝阳棉套枣（D） Chaoyangmiantaozao	辽宁 Liaoning
78	保定斑枣（F） Baidingbanzao	河北 Hebei		104	新疆小圆枣（D） Xinjiangxiaoyuanzao	山东 Shandong		130	鲍庄大铃枣（D） Baozhuangdalingzao	山东 Shandong
79	合阳铃铃枣（F） Heyanglinglingzao	陕西 Shannxi		105	泰安灵枣（D） Tai’anlingzao	河南 He’nan		131	鲍庄小枣（B） Baozhuangxiaozao	山东 Shandong
80	延川狗头枣（B） Yanchuangoutouzao	陕西 Shannxi		106	泰安疙瘩枣（F） Tai’angedazao	山东 Shandong		132	鲍庄小圆枣（B） Baozhuangxiaoyuanzao	山东 Shandong
81	鸡心枣（D） Jixinzao	河南 He’nan		107	泰安大脆枣（F） Tai’andacuizao	湖南 Hu’nan		133	北京31（U） Beijing 31	北京 Beijing
82	北京缨络枣（B） Beijingyingluozao	北京 Beijing		108	河津晋枣（F） Hejinjinzao	湖南 Hu’nan		134	鲍庄尖枣（U） Baozhuangjianzao	山东 Shandong
83	武乡碳枣（D） Wuxiangyazao	山西 Shanxi		109	万荣脆枣（B） Wanrongcuizao	湖南 Hu’nan		135	朝阳无核枣（F） Chaoyangwuhezao	辽宁 Liaoning
84	武乡甜枣（D） Wuxiangtianzao	山西 Shanxi		110	万荣耧疙瘩（D） Wanronglougeda	湖南 Hu’nan		136	北京大脆枣（F） Beijingdacuizao	北京 Beijing
85	太原十月红（D） Taiyuanshiyuehong	山西 Shanxi		111	临猗圆铃枣（D） Linyiyuanlingzao	湖南 Hu’nan		137	太谷郎枣（B） Taigulangzao	山西 Shanxi
86	阜阳蚂蚁枣（B） Fuyangmayizao	安徽 Anhui		112	定襄小枣（B） Dingxiangxiaozao	山西 Shanxi		138	太谷壶瓶酸（F） Taiguhupingsuan	山西 Shanxi
87	西双版纳小枣（D） Xishuangbannaxiaozao	云南 Yunnan		113	宁阳宣铃枣（F,P） Ningyangxuanlingzao	新疆 Xinjiang		139	榆次面枣（U） Yucimianzao	山西 Shanxi
88	昆明枣（U） Kunmingzao	云南 Yunnan		114	镇平九月寨（D） Zhenpingjiuyuezhai	新疆 Xinjiang		140	榆次奶头枣（F） Yucinaitouzao	山西 Shanxi
89	云南2号（U） Yunnan 2	云南 Yunnan		115	成武冬枣（F） Chengwudongzao	新疆 Xinjiang		141	临猗珍珠枣（U） Linyizhenzhuzao	山西 Shanxi
90	山西哈八枣（D） Shanxihabazao	山西 Shanxi		116	溆浦小果算盘枣（F） Xupuxiaoguosuanpan	山东 Shandong		142	榆次长木枣（D） Yucichangmuzao	山西 Shanxi
91	永济鸡蛋枣（F） Yongjijidanzao	山西 Shanxi		117	溆浦岩枣（D） Xupuyanzao	山东 Shandong		143	太谷没心红（B） Taigumeixinhong	山西 Shanxi
92	山西小令枣（U） Shanxixiaolingzao	山西 Shanxi		118	溆浦香枣（D） Xupuxiangzao	山东 Shandong		144	大馍枣（U） Damozao	山西 Shanxi
93	湖北铃铛枣（U） Hubeilingdangzao	湖北 Hubei		119	溆浦木枣（D） Xupumuzao	山西 Shanxi		145	交城牙枣（D） Jiaochengyazao	山西 Shanxi
94	河北圆枣（B） Hebeiyuanzao	河北 Hebei		120	溆浦米枣（F） Xupumizao	山西 Shanxi		146	太谷没心核（U） Taigumeixinhe	山西 Shanxi
95	湖北鸡心枣（U） Hubeijixinzao	湖北 Hubei		121	临猗甜酸枣（F） Linyitiansuanzao	山西 Shanxi		147	晋枣1号（B） Jinzao 1	山西 Shanxi
96	西安羊奶枣（F） Xi’anyangnaizao	陕西 Shannxi		122	临猗脖脖枣（D） Linyibobozao	山西 Shanxi		148	新蔡大圆丰枣（U） Xincaidayuanfengzao	河南 He’nan
97	大荔林檎枣（B） Dalilinqinzao	陕西 Shannxi		123	河津木枣（D） Hejinmuzao	山西 Shanxi		149	驻马店羊角枣（F） Zhumadianyangjiaozao	河南 He’nan
98	佳县细腰腰枣（D） Jiaxianxiyaoyaozao	陕西 Shannxi		124	北京马牙枣（F） Beijingmayazao	北京 Beijing		150	保定月光（F） Baodingyueguang	河北 Hebei
99	溆浦薄皮枣（F） Xupubopizao	湖南 Hu’nan		125	泰安金丝（B） Tai’anjinsi	山东 Shandong		151	运城蛤蟆枣（F） Yunchenghamazao	山西 Shanxi
100	猴头枣（B） Houtouzao	山东 Shandong		126	山东梨枣（F） Shandonglizao	山东 Shandong		152	运城脆枣（F） Yunchengcuizao	山西 Shanxi
101	滕州落地红（D） Tengzhouluodihong	山东 Shandong		127	庆云小梨枣（F） Qingyunxiaolizao	山东 Shandong		153	榆次晚红枣（U） Yuciwanhongzao	山西 Shanxi
154	太谷辣角1号（D） Taigulajiao 1	山西 Shanxi		179	陕西奶枣（F） Shanxinaizao	陕西 Shannxi		204	溆浦大果算盘枣（F） Xupudaguosuanpanzao	湖南 Hu’nan
155	铃枣（D） Lingzao	河南 He’nan		180	大荔八升胡枣（B） Dalibashenghuzao	陕西 Shannxi		205	汝城枣（D） Ruchengzao	湖南 Hu’nan
156	石楼脆枣（U） Shiloucuizao	山西 Shanxi		181	河北13号（U） Hebei 13	河北 Hebei		206	衡山长大枣（D） Hengshangchangdazao	湖南 Hu’nan
157	佳县长木枣（D） Jiaxianchengmuzao	陕西 Shannxi		182	深县串杆红枣（D） Shenxianchuanganhongzao	河北 Hebei		207	溆浦秤砣枣（U） Xupuchengtuozao	湖南 Hu’nan
158	户县太平尖枣（U） Huxiantaipingjianzao	陕西 Shannxi		183	薛城冬枣（F） Xuechengdongzao	山东 Shandong		208	溆浦观音枣（D） Xupuguanyinzao	湖南 Hu’nan
159	醉贵妃（U） Zuiguifei	北京 Beijing		184	黄骅冬枣（F） Huanghuadongzao	河北 Hebei		209	甘肃吊吊枣（B） Gansudiaodiaozao	甘肃 Gansu
160	临潼马莲枣（F） Lintongmalianzao	陕西 Shannxi		185	安阳团枣（B） Anyangtuanzao	河南 He’nan		210	安宁小枣（U） Anningxiaozao	云南 Yunnan
161	北京黑腰子枣（U） Beijingheiyaozizao	北京 Beijing		186	乐陵磨盘枣（D） Laolingmopanzao	山东 Shandong		211	民勤小枣（B） Minqinxiaozao	甘肃 Gansu
162	北京酥枣（F） Beijingsuzao	北京 Beijing		187	聊城圆铃枣（B） Liaochengyuanlingzao	山东 Shandong		212	故城冬枣（F） Guchengdongzao	河北 Hebei
163	洪村白枣（F） Hongcunbaizao	北京 Beijing		188	苏木枣（U） Sumuzao	江苏 Jiangsu		213	赞皇长枣（B） Zanhuangchangzao	河北 Hebei
164	北京嘎嘎枣（F） Beijinggagazao	北京 Beijing		189	盯胎雁来红（D） Yuyiyanlaihong	江苏 Jiangsu		214	新郑九月青（D,P） Xinzhengjiuyueqing	河南 He’nan
165	北京花生枣（F） Beijinghuashengzao	北京 Beijing		190	南京鸭枣（F） Nanjingyazao	江苏 Jiangsu		215	果形柿饼状（U） Guoxingshibingzhuang	陕西 Shannxi
166	北京小枣（B） Beijingxiaomizao	北京 Beijing		191	苏南白蒲枣（B） Sunanbaipuzao	江苏 Jiangsu		216	蒲城直社疙瘩枣（D） Puchengzhishegedazao	陕西 Shannxi
167	北京太子墓（B） Beijingtaizimu	北京 Beijing		192	吴县水团枣（F） Wuxianshuituanzao	江苏 Jiangsu		217	佳县白枣（F） Jiaxianbaizao	陕西 Shannxi
168	北京葫芦枣（F） Beijinghuluzao	北京 Beijing		193	中宁吊铃枣（B） Zhongningdiaolingzao	宁夏 Ningxia		218	蒲城晋枣（D） Puchengjinzao	陕西 Shannxi
169	姜闯2号（B） Jiangchuang 2	江苏 Jiangsu		194	甘肃冬枣（F） Gansudongzao	甘肃 Gansu		219	北京鸡蛋枣（F） Beijingjidanzao	北京 Beijing
170	五台木枣（D） Wutaimuzao	山西 Shanxi		195	中宁小圆枣（D） Zhongningxiaoyuanzao	宁夏 Ningxia		220	北京郎家园枣（F） Beijinglangjiayuanzao	北京 Beijing
171	献县绵枣（F） Xianxianmianzao	河北 Hebei		196	宁夏大红枣（D） Ningxiadahongzao	宁夏 Ningxia		221	香山小白枣（B） Xiangshanxiaobaizao	北京 Beijing
172	南京冷枣（F） Nanjinglengzao	江苏 Jiangsu		197	连县糖枣（F） Lianxiantangzao	广东 Guangdong		222	祁阳糠头枣（F） Qiyangkangtouzao	湖南 Hu’nan
173	连县木枣（P） Lianxianmuzao	广东 Guangdong		198	韶关大枣（B） Shaoguandazao	广东 Guangdong		223	湖南尖枣（D） Hu’nanjianzao	湖南 Hu’nan
174	湖南长枣（D） Hunanchengzao	湖南 Hu’nan		199	广东珍珠枣（U） Guangdongzhenzhuzao	广东 Guangdong		224	衡阳珍珠枣（B） Hengyangzhenzhuzao	湖南 Hu’nan
175	临猗笨枣（D） Linyibenzao	山西 Shanxi		200	灌阳长枣（B） Guanyangchangzao	广西 Guangxi		225	溆浦鸡蛋枣（F） Xupujidanzao	湖南 Hu’nan
176	蒲城直社枣（D） Puchengzhishezao	陕西 Shannxi		201	灌阳短枣（F） Guanyangduanzao	广西 Guangxi		226	溆浦糖枣（B） Xuputangzao	湖南 Hu’nan
177	延川白枣（D） Yanchuanbaizao	陕西 Shannxi		202	圆枣（B） Yuanzao	河北 Hebei		227	太原秋团枣（D） Taiyuanqiutuanzao	山西 Shanxi
178	陕西大白枣（B） Shanxidabaizao	陕西 Shannxi		203	溆浦甜酸枣（D） Xuputiansuanzao	湖南 Hu’nan		228	太原驴粪蛋（D） Taiyuanlvfendan	山西 Shanxi
229	太原长枣（F） Taiyuanchangzao	山西 Shanxi		238	临汾木疙瘩枣（D） Linfenmugedazao	山西 Shanxi		247	库尔勒小枣（U） Kuerlexiaozao	新疆 Xinjiang
230	武乡牙枣（D） Wuxiangyazao	山西 Shanxi		239	溆浦柿饼枣（D） Xupushipingzao	湖南 Hu’nan		248	新疆长圆枣（B） Xinjiangchangyuanzao	新疆 Xinjiang
231	晒枣（D） Shaizao	北京 Beijing		240	溆浦砂糖枣（F） Xupushatangzao	湖南 Hu’nan		249	阿克苏赞新小枣（D） Akesuzanxinxiaozao	新疆 Xinjiang
232	冷4（F） Leng 4	江苏 Jiangsu		241	溆浦蜜蜂枣（F） Xupumifengzao	湖南 Hu’nan		250	阿拉尔圆脆枣（B） Alaeryuancuizao	新疆 Xinjiang
233	遵义甜枣（D） Zunyitianzao	贵州 Guizhou		242	溆浦槟榔枣（F） Xupubinlangzao	湖南 Hu’nan		251	阿克苏小枣（U） Akesuxiaozao	新疆 Xinjiang
234	奉节鸡蛋枣（D） Fengjiejidanzao	重庆 Chongqing		243	天津大马牙枣（D） Tianjindamayazao	天津 Tianjin		252	义乌酸甜枣（D） Yiwusuantianzao	浙江 Zhejiang
235	宁阳大柿饼枣（P） Ningyangdashibingzao	山西 Shanxi		244	夏津茶壶枣（F） Xiajinchahuzao	山东 Shandong		253	义乌鹅子枣（P） Yiwuezizao	浙江 Zhejiang
236	平陆棒槌枣（D） Pinglubangzhuizao	山西 Shanxi		245	孔府酥脆枣（F） Kongfusucuizao	山东 Shandong		254	兰溪乌枣（P） Lanwuzao	浙江 Zhejiang
237	山西大令枣（U） Shanxidalingzao	山西 Shanxi		246	乐陵蚂蛉枣（F） Laolingmalingzao	山东 Shandong		255	嵊县白蒲枣（P） Shengxianbaipuzao	浙江 Zhenjiang

F：鲜食 Fresh;D：制干 Dry;B：兼用 Fresh and dry;P：加工 Processing;O：观赏 Ornamental;U：不详 Unknown
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1.2 方法

基因组DNA提取方法按照肖京^[29]的方法进行。
SSR引物为笔者实验室前期开发出的引物^[28],SSR扩增在BIO-RAD公司生产BS97 MyCycler型的PCR仪上进行,反应体系（12.5 µL）中含有0.5 µL基因组DNA（含量10—25 ng）,6.3 µL Taq MasterMix（天根）,正向引物和反向引物各0.5 µL,4.7 µL ddH₂O。SSR扩增程序：94℃预变性3 min,然后94℃变性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸30 s,27个循环,最后72℃延伸7 min。扩增产物用10%聚丙烯酰胺凝胶进行分离,银染技术检测。

1.3 统计分析

依据SSR扩增产物在电泳凝胶上的相对位置,对扩增条带进行记录,分别以“1”和“0”表示同一位置谱带的有无,建立原始数据阵,用NTSYS-pc 2.10e软件^[30]进行后续分析。
计算多态性位点百分率P（%）=（k/n）×100,其中k为多态位点数,n为所测位点总数。SSR位点的多态性信息量（poly-morphism information content,PIC）按如下计算公式进行计算：PIC=1-ΣPi²,式中Pi表示第i个等位位点出现的频率^[31]。
利用NTSYS中的Qualitative date模块计算任意两个品种间的相似系数（GS）。其计算公式为GS=2Nij/（Ni+Nj）,其中Nij为材料i和j共有的扩增片段总数,Ni为材料i中出现的扩增片段数,Nj为材料j中出现的扩增片段数。以Clustering程序中SHAN进行UPGMA（非加权组平均法）聚类分析,并通过Treeplot模块生成聚类图。
将数据转换成Structure默认的数据格式,并通过Structure软件进行群体遗传结构分析。将K值设为2—20,采用马尔可夫链的蒙特卡洛模拟算法（markov chain monte carlo,MCMC）,不作数迭代（length of burn-in period）设为10 000次,再将不作数迭代后的MCMC设为100 000次。但依此得到的数据所绘制的折线图常常不能提供真正的K值。因此,在此基础上推算对数变化率ΔK来更为准确的反应真正的K值^[32]。ΔK的计算公式为：ΔK=m(|L(K+1)-2L(K)+L(K- 1)|)/s[L(K)]。L(K)为每个K对应的对数值,s为标准差,m为平均值。根据ΔK的变化规律来确定最适的群体数目,构建遗传结构图。计算群体中品种基因组变异源于该群体中的概率Q,用于分析其遗传成分^[33]。

2 结果

2.1 高效率SSR引物的筛选与多态性位点百分率P的计算

利用供试材料中30份枣品种的基因组DNA为模板,从课题组前期设计并筛选出的SSR引物^[28]中进行二次引物筛选。根据扩增效果,从中选取23对多态性和重复性好的SSR引物（表2,图1）,用于255份枣种质的SSR分析。
23对引物在255份供试枣种质中共扩增出117条多态性条带,多态位点百分率达100%。各引物扩增的多态性条带数为2—10条,平均每对引物扩增5.09个多态性条带,扩增片段范围90—290 bp（图2）。BOTSTEIN等^[31]提出了衡量基因变异程度高低的多态性信息量指标PIC;PIC>0.5时,该引物为高度多态性信息引物;0.25<PIC<0.5,为中度多态性信息引物;PIC<0.25,为低度多态性信息引物。本研究中筛选出的引物PIC值变幅为0.359—0.727（平均值0.548）,均为高度或重度多态性信息引物（表2）。
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图1筛选出的引物（JSSR97、JSSR128）对30份枣材料的扩增结果
-->Fig. 1Amplified results of 30 jujube cultivars with selected primer pairs JSSR97 and JSSR128
-->

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图2引物JSSR183对255份枣材料的扩增结果
-->Fig. 2Amplified results of 255 jujube cultivars with primer JSSR183
-->

Table 2
表2
表2筛选出的23对多态性SSR引物
Table 2The 23 SSR primer pairs selected for this study

引物名称 Primer name	重复基序 Repeat motifs	引物 primer	扩增片段范围 Allele range (bp)	退火温度 Annealing temperature (℃)	多态性谱带数 No. of polymorphism band	多态信息含量 PIC
JSSR88	TACA	F：tcaataattccagccgaatcctta R：tgggagtctagcttcattcaaaca	130—175	53	6	0.569
JSSR93	TTG	F：ggaaggactttgtcagcatggtag R：aacagcatatttggatccatttcg	127—175	53	7	0.727
JSSR97	TTG	F：gtccaaaggcccaacttctttagt R：aggggactactcctctgctgagat	145—172	57	6	0.655
JSSR102	TTC	F：tcactcataatgtcgtttaggcca R：tctgcattcacctgttaagtccaa	217—244	55	4	0.467
JSSR128	TGT	F：ttcagttgttttgttgttgctgct R：tcgagattgaaagatagacctggc	140—150	53	2	0.375
JSSR129	TGG	F：tgctaatgaaaggaactctgggtc R：tgatgggtatgaagaagcatcaga	140—157	55	5	0.628
JSSR131	TGC	F：gtcacgctaaaaaccattacctgc R：cacacttgggttttgatcccatac	120—150	57	5	0.611
JSSR183	CTT	F：atagcagcaatggctttttctttg R：ttgaattccatgacatgaaggttg	133—185	58	10	0.541
JSSR186	CTT	F：aggcagtgagtttctgtgaccttt R：ttcttgatggccttcatatcaaca	140—185	57	6	0.663
JSSR188	CTT	F：atctcgttagtgcctatcaccagc R：acaggaacataaaagaagaagaacgc	154—175	58	2	0.359
JSSR191	CTT	F：aaatgaatggtcatgagttgcctt R：gcgaatacaccatatgattgattaagag	255—290	57	4	0.422
JSSR194	CTA	F：ccaccaactttcgctacaacttct R：caactaggtaggaaaacaaaaacagtgg	135—180	59	9	0.588
JSSR198	CCG	F：atcaaagagagcattgtcgaggtc R：gggacttcctctttagtctctgcc	150—165	58	4	0.491
JSSR211	CAC	F：atcaagtaccgcaagagaagtgct R：ttctcaactctctccttggcctta	140—175	60	4	0.635
JSSR217	CAA	F：cggcatttgtaataatttcctcca R：gactcatcgtcggacacagagat	92—105	58	3	0.399
JSSR222	ATT	F：gcagctggatgagaaccataa R：acaatacaatacaaagccacattagttc	120—153	57	7	0.497
JSSR239	ATG	F：gcaagtaccatacacaggatacgtc R：gcataaagtttgtggaaaacgtaattt	120—147	57	6	0.534
JSSR244	ATC	F：cactgcaaatgctttgtcatcttt R：aaagcatcacccatcctctacatc	90—150	57	5	0.634
JSSR262	ATA	F：cgtggaccaagtctataccaaaatg R：tggtttttcttctcctaatccatgtg	208—250	57	5	0.595
JSSR284	ACT	F：tggttcctttctatgcctgtaacg R：agaattcagcaaaacacttgggg	140—190	57	6	0.591
JSSR314	AAG	F：tctttacaatttttccactctcacaaaa R：acatgaatgcaatggttgaagttg	120—150	57	3	0.533
JSSR417	AC	F：ctcaaggattctatcgcacaaagc R：gatgattgccacgttgaagctatt	200—230	57	4	0.526
JSSR438	AG	F：tcggattgtataaatgggatttcg R：tgtcacccaaaataccttctcttttt	180—210	57	4	0.562
总计Totel					117	12.603
平均Average					5.09	0.548

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2.2 部分枣品种特有SSR标记的挖掘

供试枣品种的SSR分析结果以Excel表格形式保存,不同品种的SSR指纹以SSR引物名称为前缀、以该标记（扩增带）的分子量为后缀,得到每个品种在某个标记的带型编号。在255个供试品种中,有40个枣品种只需1—2个特有的SSR标记即可鉴别出来（表3）。
Table 3
表3
表340个枣品种的特有SSR指纹
Table 3Special SSR fingerprints of 40 jujube cultivars

品种 Cultivars	SSR指纹标记 SSR marker
交城端枣 Jiaochengduanzao	JSSR88-165 bp
清苑大丹枣 Qingyuandadanzao	JSSR93-120 bp、JSSR93-165 bp
甘肃冬枣 Gansudongzao	JSSR97-145 bp、JSSR97-170 bp
大荔耙齿枣 Dalipachizao	JSSR97-172 bp、JSSR314-140 bp
滕州落地红 Tengzhouluodihong	JSSR97-172 bp、JSSR93-135 bp/JSSR186-173 bp、JSSR97-172 bp
河津木枣 Hejinmuzao	JSSR97-172 bp、JSSR314-150 bp
蒲城晋枣 Puchengjinzao	JSSR97-172 bp、JSSR131-120 bp、JSSR131-140 bp
镇平九月寨 Zhenpingjiuyuezhai	JSSR129-157 bp、JSSR314-200 bp/JSSR222-135 bp、JSSR314-200 bp
冷4 Leng4	JSSR129-157 bp、JSSR314-210 bp/JSSR222-135 bp、JSSR314-210 bp
洪赵十月红 Hongzhaoshiyuehong	JSSR183-185 bp、JSSR211-140 bp
武乡甜枣 Wuxiangtianzao	JSSR183-185 bp、JSSR88-145 bp
榆次牙枣 Yuciyazao	JSSR183-178 bp、JSSR93-175 bp
汝城枣 Ruchengzao	JSSR183-178 bp、JSSR97-170 bp/JSSR194-180 bp、JSSR88-148 bp
阜阳蚂蚁枣 Fuyangmayizao	JSSR183-155 bp、JSSR88-150 bp
湖北铃铛枣 Hubeilingdangzao	JSSR183-155 bp、JSSR88-148 bp
太谷郎枣 Taigulangzao	JSSR183-148 bp、JSSR97-160 bp
太原驴粪蛋 Taiyuanlvfendan	JSSR183-148 bp、JSSR97-170 bp
鸡心枣 Jixinzao	JSSR183-145 bp、JSSR129-150 bp
运城脆枣 Yunchengcuizao	JSSR183-145 bp、JSSR88-130 bp
甘肃吊吊枣 Gansudiaodiaozao	JSSR183-145 bp、JSSR129-155 bp
喀什葛尔小枣 Kashigeerxiaozao	JSSR183-133 bp、JSSR88-150 bp
新疆小圆枣 Xinjiangxiaoyuanzao	JSSR183-133 bp、JSSR88-130 bp
义乌甜酸枣 Yiwutiansuanzao	JSSR186-173 bp、JSSR97-170 bp
西双版纳小枣 Xishuangbannaxiaozao	JSSR186-173 bp、JSSR97-160 bp
平陆棒槌枣 Pinglubangchuizao	JSSR194-153 bp
湖南尖枣 Hannanjianzao	JSSR222-153 bp
临猗珍珠枣 Linyizhenzhuzao	JSSR222-145 bp
连县糖枣 Lianxiantangzao	JSSR222-135 bp、JSSR102-217 bp
蒲城直社疙瘩枣 Puchengzhishegedazao	JSSR222-135 bp、JSSR88-130 bp/JSSR262-204 bp
延川狗头枣 Yanchuangoutouzao	JSSR239-167 bp、JSSR97-155 bp
佳县细腰腰枣 Jiaxianxiyaoyaozao	JSSR239-167 bp、JSSR239-153 bp
蒲城直社枣 Puchengzhishezao	JSSR239-167 bp、JSSR97-160 bp
大荔龙枣 Dalilongzao	JSSR239-156 bp、JSSR97-160 bp
户县太平尖枣 Huxiantaipingjianzao	JSSR239-156 bp、JSSR88-148 bp
临潼马莲枣 Lintongmalianzao	JSSR239-156 bp、JSSR97-155 bp
彬县元枣 Binxianyuanzao	JSSR239-156 bp、JSSR239-120 bp
大荔林檎枣 Dalilinqinzao	JSSR262-245 bp、JSSR191-270 bp
交城牙枣 Jiaochengyazao	JSSR262-245 bp、JSSR191-290 bp
灌阳短枣 Guanyangduanzao	JSSR284-190 bp
灌阳长枣 Guanyangchangzao	JSSR417-228 bp、JSSR417-200 bp

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从表1和表3可以看出,很多同一区域来源的枣品种（如同样来源于陕西省关中平原东北部蒲城县的‘蒲城直社疙瘩枣’‘蒲城直社疙瘩枣’和‘蒲城晋枣’可以被1—2个特有SSR标记区分开,这为地方品种的准确鉴定和资源管理提供了有效手段。

2.3 供试枣品种的聚类分析

利用23对引物扩增出的117条多态性条带,可将供试255个品种的251个品种分开,占98.43%,依据23对SSR引物扩增位点构建的0-1矩阵,计算出供试材料间的配对遗传相似系数（GS）,其变化范围为0.71—1.00。由聚类图（图3）可看出,在聚类阀值为0.71处,北京花生枣单独聚到一类,说明其与其他枣品种亲缘关系较远,分析原因可能是北京花生枣是独立起源的品种,也可能是其在长期栽培中与其他枣品种基因交流较少所致;其余254个品种分为14个亚类,包括4个大亚类（每类24—56个品种）和10个小亚类（1—10个品种）。在10个小亚类中,湖南的‘溆浦岩枣’和陕西的‘合阳铃铃枣’亦均单独为一个小类;同时有少部分品种没有分开,如‘奉节鸡蛋枣’和‘溆浦鸡蛋枣’、‘陕西奶枣’和‘天津大马牙枣’之间的相似系数为1.00,表明‘奉节鸡蛋枣’和‘溆浦鸡蛋枣’、‘陕西奶枣’和‘天津大马牙枣’的亲缘关系很近。‘奉节鸡蛋枣’和‘溆浦鸡蛋枣’分别来自重庆、湖南,这两个品种枣果的果形都是近圆形;‘陕西奶枣’和‘天津大马牙枣’分别来自陕西和天津,果形均较尖,本试验中检测出的两两品种间较近的亲缘关系也可能是不同地区间栽培引种造成的,也可能是两两品种是同物异名,或者是本研究中所用引物数量较少,尚不能将这些近缘品种完全分开。
从聚类图中还可以看出：（1）一些类群中,枣品种间的遗传关系与其原产地有明显的相关性。如I和II组的枣品种基本都是来自山西,III组的枣品种基本都来自北京,而O组的基本来自湖南;来自陕西的‘大荔铃铃枣’‘大荔蜂蜜罐’和‘大荔疙瘩枣’聚在一起,来自山东的‘泰安大脆枣’‘酥脆枣’和‘泰安疙瘩枣’也都聚在一起。（2）另一些类群中（如C、E、K组）,枣品种来自于不同的产地,遗传关系与地理分布似乎没有必然的联系。这些类群相对比较分散,每一小类群中品种数量不多。如Ⅳ类群中7个枣品种来自于6个不同地区;Ⅴ类群中20个品种主要来自河北、山西和山东;Ⅵ类群中品种主要来自江苏和湖南。（3）结合聚类图和供试品种的用途和原产地分析,不同枣品种间的亲缘关系与品种原产地有一定相关性,但和品种用途没有显著相关性,例如第一大类中就包括了制干、鲜食、加工等不同用途的品种。

2.4 供试枣种质的遗传结构分析

基于上述获得的SSR分析数据,利用STRUCTURE软件分析供试枣群体的遗传结构,绘制K与ΔK的关系图（图4）,K=15时,ΔK最大。据此,将255个枣品种分成15个群组,进一步以K=15绘制了基于数学模型模拟的255个枣品种遗传结构的贝叶斯分配图（图5）。并计算出了15个居群中最大Q值分布（表4）。
Table 4
表4
表4各群体Q值分布
Table 4Distribution of Q-value of fifteen groups

类群 Group	各群体品种数量 Number of cultivars in each group	品种数量 Amount of cultivars (%)
		Q<0.6	Q≥0.6	Q≥0.8	Q≥0.9
1	29	3 (10.3)	26 (89.7)	20 (69.0)	18 (62.0)
2	19	7 (36.8)	12 (63.2)	5 (26.3)	3 (15.8)
3	9	0 (0)	9 (100)	6 (66.7)	5 (55.6)
4	19	4 (21.1)	15 (78.9)	14 (73.7)	9 (47.4)
5	10	2 (20)	8 (80.0)	7 (70)	6 (60.0)
6	15	3 (20)	12 (80.0)	8 (53.3)	7 (46.7)
7	18	1 (5.6)	17 (94.4)	12 (66.7)	8 (44.4)
8	13	1 (7.7)	12 (92.3)	10 (76.9)	9 (69.2)
9	21	1 (4.8)	20 (95.2)	19 (90.5)	17 (81.0)
10	14	3 (21.4)	11 (78.6)	8 (57.1)	5 (35.7)
11	22	2 (9.1)	20 (90.9)	16 (72.7)	14 (63.6)
12	15	2 (13.3)	13 (86.7)	13 (86.7)	13 (86.7)
13	17	5 (29.4)	12 (70.6)	5 (29.4)	3 (17.6)
14	27	1 (3.7)	26 (96.3)	26 (96.3)	24 (88.9)
15	7	1 (14.3)	6 (85.7)	5 (71.4)	3 (10.2)
合计 Total	255	36 (14.1)	219 (85.9)	174 (68.2)	144 (56.5)

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图3基于SSR分析的255个枣品种聚类图
-->Fig. 3Dendrogram of 255 jujube cultivars based on SSR markers
-->

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图4枣255个品种的K值与ΔK的关系
-->Fig. 4Graphical relationship between K and ΔK for 255 jujube cultivars
-->

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图5255个枣品种的遗传结构分析
-->Fig. 5Population structure of 255 jujube cultivars
-->

图5中不同的色块代表不同的群体,纵坐标表示各居群中的品种占某居群祖先成分的比例,横坐标为样品编号。从图5中可看出,根据各个品种的混合比率,将255份供试材料分成15个居群,进一步分析表明,一些居群（如3、8、9、12、14居群）遗传背景比较一致,绝大部分来源于相同的栽培区域,混杂程度相对较低;而有的居群（如2、4、5、13居群）分配率较高,群体间混合程度相对较高,来源于不同的栽培区域,群体间的遗传物质交流相对较多。从遗传结构分析也发现,不同群体的品种和其用途没有显著相关性,但与聚类分析（图3）的结果相似。
Structure群体遗传结构分析中,当某一材料在某类群中的Q≥0.6时,则认为该材料血缘关系相对比较单一,否则认为该材料血缘关系来源复杂^[33]。从根据供试材料在各个群体中的Q值分布（表4）,255个供试材料中有36个品种Q值小于0.6,占所有供试材料总数的14.1%,Q值大于0.8和0.9的品种分别占68.2%和56.5%,说明各群体中大部分品种血缘关系比较单一,较少品种含有其他类群的遗传成分。整体看,来自枣主栽区域山西（居群6、10、11）、陕西（居群14）和河北（居群1）的品种形成了以当地品种为主的居群,说明这些地区在长期的栽培演化过程中选育出了丰富的枣品种资源,其中来自山西或陕西的枣品种出现在绝大部分居群中,说明这两个省的资源在不同群体间的基因交流中发挥了重要作用;南方区域只有来自湖南的枣品种形成了相对独自的居群,可能是其起源相对单一,且在较长一段时间的栽培过程中,栽培环境比较封闭,近亲繁殖,和其他产地枣品种间基因交流较少所致（居群8）。

3 讨论

本研究选用23对SSR引物对255个枣品种进行了分析,共扩增出117条多态性谱带,多态位点比率达到100%。在枣树上,麻丽颖等^[8]报道的SSR标记多态性比率也为100%,而李莉等^[34]报道的RAPD标记多态性为99.78%,白瑞霞^[35]用AFLP标记的多态性则仅为64.30%,谢永波^[36]用AFLP标记的多态性为78.7%,说明本研究的SSR标记的多态性效率较高。分析原因一方面是因为本研究中所用引物经过了二次筛选,另一方面也是因为供试材料多、遗传多样性丰富而使得多态位点比率较高。同时,本试验也注意到,不同SSR引物对枣品种的鉴别能力有较大差异,并不是所有引物的多态性都较高,进一步说明筛选高效率引物的必要性。
中国枣品种繁多,不同品种间复杂的遗传关系一直是研究热点。本研究利用SSR技术进行了22个省区主产地255个枣品种的遗传多样性和群体结构分析,提供了大量的多态性数据信息,为将来表型数据和基因数据的关联性分析奠定了良好的基础。聚类和群体结构两种分析结果均表明,在枣品种的群体结构中大部分品种与来源区域有一定的相关性。相关性不明显的枣品种可能是区域间品种经过频繁的基因交流或重组培育而成,从而融合了不同区域品种的特点,没有了明显的区域特征。前人利用SSR^[17]、ISSR^[18]、AFLP^[2]进行的研究也表明,遗传多样性在一定程度上能够反映品种的地理分布特点。李海涛^[26]对河南主栽枣品种的ISSR分析表明,枣的遗传变异主要来自于居群内的变异,来自于居群间的变异贡献率较低。殷晓^[27]对黄河沿岸六省48个枣品种进行的遗传多样性研究表明,地理区域内变异（93%）远大于地理区域间分化（7%）。本研究中,255个供试材料中Q值小于0.6的品种36个,仅占14.1%（表4）,也进一步说明大部分品种血缘关系比较单一,以居群内或地理区域内变异为主。这些结果均表明,现有的枣种质资源可能是不同区域起源的,在物种演化过程中区域内品种间进行了频繁的基因交流和重组,进而产生了更为丰富的资源结构组成。

4 结论

利用23对SSR引物在255个供试品种中共检测出117个多态性位点,平均每对引物扩增多态位点数为5.09,PIC值变幅为0.359—0.727,平均为0.548;为其中40个枣品种找到了1—2个各自特有的SSR标记;255个枣品种的群体遗传结构与聚类分析结果基本一致,不同地理环境在枣品种的群体进化中发挥了较重要的作用,但不同枣品种的遗传关系与品种用途没有显著相关性。
The authors have declared that no competing interests exist.

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