0 引言
【研究意义】番茄黄化曲叶病毒病是由番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）引起的一种毁灭性病害,并通过烟粉虱（Bemisia tabaci）传播[1]。近年来,随着全球气候变化和烟粉虱危害加重,番茄黄化曲叶病毒病在世界各地迅速扩散和蔓延。目前,这一病害已经成为影响全世界番茄生产的主要限制因素之一[2-4]。番茄黄化曲叶病毒病具有发病率高、危害大、传播效率高等特点[5],采用化学农药、物理及生物防治在一定程度上可以减轻该病的危害,但不能从根本上解决问题,而培育番茄抗病品种才是最有效、经济和持久的防控手段[6-7]。【前人研究进展】在抗病育种研究方面,国外已经有一些研究报道[8-9]。当前已经报道的番茄黄化曲叶病毒的抗性基因有Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-3a、Ty-4和Ty-5等。在国内商业品种中Ty-1、Ty-2、Ty-3和Ty-3a已经被开发利用。Ty-4和Ty-5抗性基因尚未在已有商业品种中检测到[10-14]。Ty-1来自野生智利番茄材料LA1969,该基因是第一个被定位的番茄黄化曲叶病抗病基因,位于番茄第6号染色体近着丝粒区域,Ty-3也位于番茄第6号染色体的长臂端,该基因来源于智利番茄LA2779和LA1932。Ty- 3在2个材料中的导入区段大小不同,为了便于区分,将LA1932中的抗病基因称为Ty-3a。Ty-2是源于多毛番茄B6013的一个完全显性遗传的抗性基因。通过选育,Ty-2被转育到栽培番茄H24中,方便了对该基因的利用和研究。Ty-4来源于材料LA1932,被定为在番茄第3号染色体长臂端,Ty-5是秘鲁番茄材料TY172抗黄化曲叶病的主效基因,可以解释46.60%的表型变异,该基因位于番茄第4号染色体[15]。据报道,目前国内田间表现抗病毒的番茄品种中83.26%的番茄品种携带有Ty-1,69.04%的番茄品种携带有Ty-3a,同时携带有Ty-1和Ty-3a的番茄品种高达62.34%,因此,番茄抗TYLCV育种中利用的主要抗病基因是Ty-1和Ty-3a [15]。【本研究切入点】在TYLCV初发阶段,抗病品种多引自国外或国外种业公司直接推广自己的品种[16];后来经过国内番茄育种工作者的努力,一些TYLCV抗源已成功地转育成具有自主知识产权的、品种类型丰富的国产抗TYLCV品种,并在生产中大面积推广应用。但是,不同抗性基因的抗性背景不同,如何将不同来源的抗病基因聚合到同一品种,能否育成对TYLCV抗性更强的品种,在生产中的表现是否更加优秀稳定等亟需进一步明确。【拟解决的关键问题】对北京市农林科学院蔬菜中心培育的含有目前生产中广泛使用的Ty-3a和Ty-1的番茄品种的抗病性进行分析,并对抗病基因和抗病蛋白的表达水平进行检测,以期为种质资源的合理利用和降低番茄黄化曲叶病毒的危害提供参考。1 材料与方法
1.1 材料
携带有Ty-3a的番茄材料秋光285（Ty-3a纯合）、棚137×246（Ty-3a杂合）,携带Ty-1+Ty-3a的秋光120（Ty-1+Ty-3a纯合）、秋光81（Ty-1+Ty-3a杂合）和感病对照M82均由北京市农林科学院蔬菜中心番茄育种课题组柴敏研究员提供。1.2 番茄试材的培育及病毒病的传播
所有番茄植株于2015年4月采取穴盘育苗的方式播种于设有防虫网隔离的温室中,自然生长,待幼苗生长至3—4叶期于5月5日移栽至北京市农林科学院植物保护环境保护研究所日光温室,每个品种移栽60—80株。番茄移栽后按常规方法施肥和管理,定期观察温室内烟粉虱的发生情况,同时观察TYLCV在番茄上的发生情况,PCR方法定期检测TYLCV,同时定时观察和检测TYLCV在番茄上的发生情况[17]。试验在自然虫口密度的条件下进行,取样观察期间不使用任何化学农药。1.3 病情调查与分析
发病症状按严重程度划分为0、0.5、1、3、5、7、9共7个等级,分级标准、调查方法数据统计参见田兆丰等[17]。数据统计分析采用SAS 9.0 软件,用Duncan氏新复极差法进行差异显著性分析。1.4 番茄植株抗病基因及病程相关蛋白基因表达水平的检测
从感病对照M82植株开始发病后的10、20、30 d,选取番茄幼苗生长点下第3片叶,采用半定量RT-PCR分别测定抗病基因Ty-1和Ty-3a以及病程相关蛋白葡聚糖酶和几丁质酶基因的相对表达量。总RNA的提取采用RNeasy Mini kit（天根生化科技有限公司,北京,中国）并参照厂家的说明书进行操作。采用试剂盒avian myeloblastosis virus reverse transcriptase RNA PCRTM（TaKaRa）进行反转录,以不同处理的cDNA为模板进行PCR扩增,引物序列如表1 所示;PCR反应条件为95℃预变性4 min;95℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,35个循环;72℃延伸10 min。取5 μL PCR产物在含有核酸荧光染料Gold View的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离,在凝胶成像系统上观察结果。Actin为内参基因,所有结果重复3次。Table 1
表1
表1PCR 扩增引物
Table 1Primer sequences for PCR
| 引物Primer | 引物序列Primer sequence | 描述 Description | 参考文献Reference |
|---|---|---|---|
| P1 | TAATCCGTCGTTACCTCTCCTT | Ty-1 CAPS标记正向引物 CAPS labeled forward primer of Ty-1 | 文献[15] Reference [15] |
| P2 | CGGATGACTTCAATAGCAATGA | Ty-1 CAPS标记反向引物 CAPS labeled reverse primer of Ty-1 | |
| P3 | GTAGTGGAAATGATGCTGCTC | Ty-3a SCAR标记正向引物 CAPS labeled forward primer of Ty-3a | 文献[15] Reference [15] |
| P4 | GCTCTGCCTATTGTCCCATATATAACC | Ty-3a SCAR标记反向引物 CAPS labeled reverse primer of Ty-3a | |
| P5 | CAACTTGCCATCACATTCTG | 葡聚糖酶基因正向引物 Glucanase gene forward primer | 文献[18] Reference [18] |
| P6 | CCAAAATGCTTCTCAAGCTC | 葡聚糖酶基因反向引物 Glucanase gene reverse primer | |
| P7 | AATTGTCAGAGCCAGTGTCC | 几丁质酶基因正向引物 Chitinase gene forward primer | 文献[19] Reference [19] |
| P8 | TCCAAAAGACCTCTGATTGC | 几丁质酶基因反向引物 Chitinase gene reverse primer | |
| P9 | GTCCTCTTCCAGCCATCCA | Actin正向引物 Actin forward primer | 文献[20] Reference [20] |
| P10 | ACCACTGAGCACAATGTTACCG | Actin反向引物 Actin reverse primer |
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2 结果
2.1 不同番茄品种病情调查情况
从感病对照M82有个别植株开始发病后第10天调查结果显示如表2,感病品种M82在第10天的发病率达到53%,病情指数为13.8,而其他几个抗病品种没有观察到明显的病状或症状;在对照发病后第20天调查中,各番茄品种都有发病症状,其中对照发病率达到100%,而且病情指数也相应较高,而抗病材料发病率较低且病情指数也很低。在对照发病后第30天调查中,对照的病情指数进一步升高,且其他几个抗病品种的发病率也有所增加,但病情指数相对很低。综合发病率和病情指数,几个抗病品种发病程度从高到低依次为秋光285（Ty-3a纯合）、棚137×246（Ty-3a杂合）、秋光120 （Ty-1+Ty-3a纯合）和秋光81（Ty-1+Ty-3a杂合）。统计分析结果表明,含有抗性基因的品种与不含抗性基因的对照品种的抗病性差异极显著。但几个抗病品种中,携带单一抗性基因的纯合体和杂合体以及携带两个抗性基因的纯合体和杂合体之间的抗病性没有差异显著性。Table 2
表2
表2不同时期番茄品种病情调查结果
Table 2The disease degrees of tomato varieties at different times
| 品种 Variety | 基因型 Genotype | 发病率 Disease incidence (%) | 病情指数 Disease index | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 10 d | 20 d | 30 d | 10 d | 20 d | 30 d | ||
| 秋光285 Qiuguang 285 | Ty-3a纯合 Ty-3a isozygoty | 0 | 33.3 | 46.7 | 0 | 3.1Bb | 10.6Bb |
| 棚137×246 Peng 137×246 | Ty-3a杂合 Ty-3a heterozygosis | 0 | 26.7 | 44.4 | 0 | 2.9Bb | 9.9Bb |
| 秋光120 Qiuguang 120 | Ty-1+Ty-3a纯合 Ty-1+Ty-3a isozygoty | 0 | 26.7 | 48.9 | 0 | 2.9Bb | 10.4Bb |
| 秋光81 Qiuguang 81 | Ty-1+Ty-3a 杂合 Ty-1+Ty-3a heterozygosis | 0 | 22.0 | 42.2 | 0 | 2.2Bb | 9.6Bb |
| M82 (CK) | — | 53 | 100 | 100 | 13.8 | 32.3Aa | 40.7Aa |
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2.2 番茄植株抗病基因的表达分析
不同番茄品种在感染TYLCV后,体内抗性基因表达量随着发病时间的增加,两个基因的表达量逐渐增强。同时,在每个调查时期,Ty-3a（约320 bp）在4个番茄品种中都有相同的表达趋势,分别为秋光285（Ty-3a纯合）、棚137×246（Ty-3a杂合）、秋光120（Ty-1+Ty-3a纯合）和秋光81（Ty-1+Ty-3a杂合）依次增强,且Ty-1（约400 bp）在秋光81中的表达显著高于在秋光120中的表达,表明两个抗性基因在杂合体中的表达都比纯合体高,而在同一品种中,含有两个抗性基因与单抗性基因的番茄材料比较,Ty-3a的表达没有显著差异（图1）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1不同番茄品种抗性基因Ty-3a（A）和Ty-1（B）的表达
-->Fig. 1Expression of resistance genes Ty-3a (A) and Ty-1 (B) in different tomato varieties
-->
2.3 番茄植株病程相关蛋白基因的表达分析
不同番茄品种在感染TYLCV后,体内葡聚糖酶（约800 bp）和几丁质酶（约750 bp）基因表达量均比对照显著增加。随着发病时间的增加,两个基因的表达量逐渐增强。在发病后第10天,除了对照,各品种间葡聚糖酶基因表达没有显著差异,但是在发病20 d和30 d后,携带Ty-1+Ty-3a杂合的秋光81的葡聚糖酶基因表达显著强于其他几个品种。几丁质酶基因有轻微逐渐增加的趋势,但不显著。由此可见,携带Ty-1+Ty-3a杂合的秋光81番茄品种在整个发病过程中,抗病蛋白葡聚糖酶和几丁质酶基因的表达都高于其他几个品种,并且随着发病时间的延长表达量显著增强（图2）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2不同番茄品种中葡聚糖酶（A）和几丁质酶（B）基因的表达
-->Fig. 2Expression of glucanase (A) and chitinase (B) genes in different tomato varieties
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3 讨论
虽然目前报道的番茄黄化曲叶病毒的抗性基因有Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-3a、Ty-4 和Ty-5 等,且不同抗性基因在番茄TYLCV病害防御中的作用也有少量报道,但不同抗性基因对TYLCV病原的抗性水平不同,相关抗性基因在TYLCV病原侵染下的表达水平及差异鲜有报道。北京市农林科学院蔬菜中心拥有较好的适合国内生产的优势品种,利用从国外引进的抗源材料,育成适宜于中国北方地区栽培的稳定的抗病番茄品种。本文对携带单一抗性基因Ty-3a纯合与杂合和携带多个抗性基因Ty-1/Ty-3a纯合和杂合的几个番茄抗病品种进行了TYLCV病原侵染抗病性调查和抗性基因表达水平的分析,初步从分子水平上阐述了抗性基因与抗病性的关系,该研究结果对于番茄抗TYLCV品种的选育具有重要的参考价值。病程相关蛋白（pathogenesis-related proteins,PRPs）是指植物在受到病原物侵染或非生物因子诱导协迫条件下产生的一类与植物抗性密切相关的水溶性蛋白[21]。其中,β-1, 3-葡聚糖酶和几丁质酶作为抗病蛋白在植物抗真菌病害的防卫反应中发挥重要作用,被广泛应用于植物抗病基因工程育种实践,同时测定β-1, 3-葡聚糖酶和几丁质酶的表达情况也成为研究植物诱导抗病性效果的重要手段[22-24]。本研究结果表明不同番茄抗病品种在感染TYLCV后,体内葡聚糖酶和几丁质酶基因表达量均比感病对照显著增加。随着发病时间的增加,两个基因的表达量逐渐增强,且携带Ty-1+Ty-3a杂合的秋光81的葡聚糖酶基因表达量明显高于其他几个品种,表明抗病番茄品种对TYLCV抗病性与其病程相关蛋白表达存在一定的相关性。综上所述,番茄抗病品种在感染TYLCV后的抗病性除了与抗性基因的表达有关外,同时也与抗病相关蛋白表达增强有关。
4 结论
调查结果表明几个番茄材料对TYLCV的抗性由弱到强依次为秋光285（Ty-3a纯合）、棚137×246（Ty-3a杂合）、秋光120（Ty-1+Ty-3a纯合）和秋光81（Ty-1+Ty-3a杂合）,但4个抗病材料之间的抗性没有显著差异。同时半定量RT-PCR结果显示,秋光81对TYLCV抗病性较强与其抗性基因和抗病蛋白表达增强有关。The authors have declared that no competing interests exist.
