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葡萄Fe-S簇装配基因的鉴定、克隆和表达特征分析

本站小编 Free考研考试/2021-12-26

张璐,1,2, 宗亚奇1,2, 徐维华2, 韩蕾1, 孙浈育1,2, 陈朝晖3, 陈松利3, 张凯1, 程杰山1, 唐美玲,1,2,3, 张洪霞1, 宋志忠,11鲁东大学农林工程研究院/山东省高等学校重点实验室-作物高产抗逆分子模块育种实验室,山东烟台 264025
2烟台农业科学研究院葡萄研究所,山东烟台 264000
3招远市大户庄园农林专业合作社,山东烟台 264000

Identification, Cloning, and Expression Characteristics Analysis of Fe-S Cluster Assembly Genes in Grape

ZHANG Lu,1,2, ZONG YaQi1,2, XU WeiHua2, HAN Lei1, SUN ZhenYu1,2, CHEN ZhaoHui3, CHEN SongLi3, ZHANG Kai1, CHENG JieShan1, TANG MeiLing,1,2,3, ZHANG HongXia1, SONG ZhiZhong,11The Engineering Research Institute of Agriculture and Forestry, Ludong University/Key Laboratory of Molecular Module-Based Breeding of High Yield and Abiotic Resistant Plants in Universities of Shandong, Yantai 264025, Shandong
2Institute of Grape, Yantai Academy of Agricultural Science, Yantai 264000, Shandong
3Zhaoyuan Dahu Manor Agriculture and Forestry Professional Cooperative, Yantai 264000, Shandong

通讯作者: 宋志忠,Tel:0535-6664662;E-mail: szhzh2000@163.com 唐美玲,Tel:0535-6664662;E-mail: tmling1999@163.com

责任编辑: 赵伶俐
收稿日期:2021-02-8接受日期:2021-05-5
基金资助:国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-29-16)
山东省农业良种工程基金(2019LZGC009-2)
烟台市科技计划(2018XSCC043)
烟台市科技计划(2018XSCC043)
国家重点研发计划(2019YFD1000500)
烟台市葡萄与葡萄酒局专项资金(50012305073)


Received:2021-02-8Accepted:2021-05-5
作者简介 About authors
张璐,Tel:0535-6352051;E-mail: 1169464953@qq.com














摘要
【目的】从葡萄中克隆并鉴定Fe-S簇装配基因,在转录水平探索其组织特异性表达特征及其对缺铁胁迫的差异响应,明确主效基因。【方法】通过同源克隆法,在葡萄基因组中筛选并鉴定参与Fe-S簇装配的基因;借助生物信息学软件分析葡萄Fe-S簇装配相关基因及其编码蛋白的详细特征;利用实时荧光定量PCR分析Fe-S簇装配相关基因在葡萄不同组织部位的表达模式及其对缺铁胁迫的响应情况;利用MEGE 7.0软件建立不同植物ISU1同源蛋白的系统进化树。【结果】在葡萄基因组中检索并克隆获得46个Fe-S簇装配基因,分布于16条染色体上,含有1—21个长度不一的内含子,且主要分布于质体、线粒体和细胞质,分别含有14、21和11个基因成员;葡萄Fe-S簇装配蛋白在多种亚细胞结构中均有定位,且不同装配机制中蛋白的亚细胞定位情况差异很大;所选10种植物ISU1蛋白序列的一致性高达77%,系统发育树分析表明同一属的ISU1同源蛋白如十字花科的拟南芥和盐芥、禾本科的水稻和短柄草、蔷薇科的桃和苹果,倾向于紧密聚在一起,但葡萄ISU1和番茄ISU1紧密聚集在一起;葡萄Fe-S簇装配基因在3年生‘马瑟兰’成年树体和组培幼苗不同组织中的表达水平差异较大,其中,ISU1整体水平的表达量最为丰富(尤其是成熟期果实中的表达量最高),其次是HSCA1ISA2NFU2、SUFASUFB等基因,而SUFE2NFS1、HSCA2HSCA6TAH18CIA2在本研究所有葡萄组织中均未检测到表达量;在‘马瑟兰’幼苗中,葡萄Fe-S簇装配基因对缺铁处理较为敏感,所有基因至少在1个检测的组织部位对缺铁处理有响应,其中,22个基因的表达水平在所有检测组织中均受缺铁处理调控:根部Fe-S簇装配基因的表达水平易受缺铁胁迫诱导而上调,但地上部(茎和叶)Fe-S簇装配基因的表达水平易受缺铁胁迫抑制而下调。【结论】从葡萄中克隆并鉴定了46个Fe-S簇装配基因,分别定位于质体、线粒体和细胞质;葡萄Fe-S簇装配基因在三年生成年树体和组培幼苗不同组织中的表达水平差异较大,且在葡萄幼苗不同组织中的转录水平对缺铁胁迫的响应具有显著差异;ISU1在葡萄所有组织中的整体表达量较高;葡萄ISU1和番茄ISU1同源蛋白遗传进化距离最接近。
关键词: 葡萄;铁代谢;缺铁;Fe-S簇;装配机制;基因克隆及表达

Abstract
【Objective】The aim of this study was to isolate and characterize grape Fe-S cluster assembly genes. The tissue-specific expression characteristics and differential response to iron depletion at the transcriptional level were analyzed to screen the dominant and candidate Fe-S cluster assembly genes in grape. 【Method】The Fe-S cluster assembly genes were screened and identified in grape genome by homologous cloning. The detailed characteristics of Fe-S cluster assembly genes and their encoded proteins in grape were analyzed by using a variety of bioinformatics software. The expression patterns of Fe-S cluster assembly genes in different tissues of grape and their corresponding responses to iron deficiency stress were analyzed by using real-time fluorescent quantitative PCR. The phylogenetic trees of ISU1 homologous proteins from different plants were established by using MEGE 7.0 software. 【Result】 In total, 46 Fe-S cluster assembly genes were retrieved and cloned from grape, which were located on a total of 16 chromosomes, containing 1-21 introns with different lengths. Grape Fe-S cluster assembly genes were mainly distributed in plastid, mitochondrion and cytosol, containing 14, 21 and 11 genes, respectively. Grape Fe-S cluster assembly proteins were found with a variety of subcellular structures. Moreover, the subcellular localization of Fe-S cluster assembly proteins with different assembly mechanisms was quite distinct. The sequence identity of ISU1 homologous proteins from 10 plant species was as high as 77%. Phylogenetic tree analysis indicated that ISU1 members belonging to the same genus, such as Arabidopsis and the llungiella of Cruciferae, rice and Brachypodium of Gramineae, and peach and apple of Rosaceae, were tended to be closely clustered together, while grape ISU1 was closely clustered with tomato ISU1. The expression levels of Fe-S cluster assembly genes were different among different tissues of 3-year-old adult tree and tissue culture seedling of Marselan grape, and the differences were significant. In particular, the expression level of ISU1 gene was the most abundant (especially in the mature fruit), followed by HSAC1, ISA2, NFU2, SUFA and SUFB, while the expression levels of SUFE2, NFS1, HSCA2, HSCA6, TAH18 and CIA2 were not detected in tested tissues of grape. Grape Fe-S cluster assembly genes were more sensitive to iron deficiency treatment, and all genes responded to iron deficiency treatment in at least one detected tissue sample. Notably, the expression level of 22 Fe-S cluster assembly genes were significantly regulated by iron deficiency in all tested tissues, and the expression levels in roots were likely to be up-regulated by iron deficiency, while the expression levels in shoots (stems and leaves) were prone to be down-regulated. 【Conclusion】46 Fe-S cluster assembly genes were cloned and identified in grape, which were located in plastid, mitochondrion and cytosol, respectively. The expression levels of Fe-S cluster assembly genes were significantly distinct among different tissues of 3-year-old adult tree and tissue culture seedlings, while the transcription levels in different seedlings tissues were significantly different in response to iron deficiency. The overall expression level of ISU1 gene was the highest in all tested tissues of grape. The genetic evolution distance between grape and tomato ISU1 homologous proteins was the closest.
Keywords:grape;iron metabolism;iron depletion;Fe-S cluster;assembly mechanism;gene cloning and expression


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本文引用格式
张璐, 宗亚奇, 徐维华, 韩蕾, 孙浈育, 陈朝晖, 陈松利, 张凯, 程杰山, 唐美玲, 张洪霞, 宋志忠. 葡萄Fe-S簇装配基因的鉴定、克隆和表达特征分析. 中国农业科学, 2021, 54(23): 5068-5082 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.23.012
ZHANG Lu, ZONG YaQi, XU WeiHua, HAN Lei, SUN ZhenYu, CHEN ZhaoHui, CHEN SongLi, ZHANG Kai, CHENG JieShan, TANG MeiLing, ZHANG HongXia, SONG ZhiZhong. Identification, Cloning, and Expression Characteristics Analysis of Fe-S Cluster Assembly Genes in Grape. Scientia Acricultura Sinica, 2021, 54(23): 5068-5082 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.23.012


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0 引言

【研究意义】铁是植物正常生命活动所必需的微量矿质元素[1,2],是细胞色素、铁硫(Fe-S)蛋白的组成成分[3],与植物生长发育、花的形成和果实品质与产量密切相关,缺铁严重影响植物生长,降低果实产量和品质[4,5,6,7]。Fe-S簇是Fe-S蛋白的活性部位,虽然其组成元素和结构都较为简单,但是Fe-S簇的组装是需多种组装蛋白参与的有序进行的催化反应,是活细胞中一个高度复杂和协调的过程[8,9,10,11]。由此可见,Fe-S簇装配机制是植物铁素营养和铁代谢的核心环节,在植物的生命过程中具有至关重要的作用。鉴定和克隆果树Fe-S簇装配基因为研究果树Fe-S簇装配机制提供参考,并为解析果树铁素营养和代谢奠定理论基础。【前人研究进展】在植物中,Fe-S蛋白在呼吸、光合、硫和氮同化、氨基酸和嘌呤代谢、植物激素和辅酶合成,DNA修复和翻译等过程中发挥重要作用[8,9,10],大多数代谢途径和细胞过程发生在亚细胞部位,并依赖于Fe-S蛋白[3,12]。研究表明Fe-S蛋白存在于质体、线粒体、细胞质和细胞核中,对许多生理和代谢过程必不可少,例如,硝酸还原酶(nitrite reductase,NIR)在叶绿体中氮的同化过程至关重要,乌头酸酶(aconitase,ACO)和琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase,SDH)是参与线粒体糖代谢柠檬酸循环的关键酶[9]。特别地,Fe-S簇是Fe-S蛋白的辅因子,在光合作用、呼吸和DNA修复中起着不可或缺的作用[11,13-15]。植物中,一个高度保守的Fe-S簇装配过程包括在组装支架上形成Fe-S簇,并转移到目标载体蛋白上,涉及硫供体(NFS)、铁供体、支架(SUFB、SUFC、SUFD、NFU等)以及转运蛋白(ISA、GRX、HSCA)等40多个编码基因[9,12],其中,模式植物拟南芥中Fe-S簇装配机制的研究最为深入和透彻,目前已经确定了3种Fe-S簇装配机制,即质体中存在SUF(sulfur mobilization)装配机制[16],线粒体中采用ISC(iron-sulfur cluster)装配机制[16],这两种机制均以独立的方式运行,而细胞质中的Fe-S簇组装是新出现的一种依赖于线粒体的CIA(cytosolic iron-sulfur cluster assembly)装配机制[16]。在这3种机制中,Fe-S簇的装配过程均可分为两个阶段:第一阶段,即S和Fe结合在支架蛋白上,第二阶段,将Fe-S簇转移到靶蛋白。其中,第二阶段可能涉及具有特殊功能的不同的载体蛋白[9,10,11,12,13,14,15,16]。【本研究切入点】近年来,国内外对植物Fe-S簇装配分子机制的研究主要集中在一年生植物,包括拟南芥[12]、水稻[17]和大豆[18]等,果树学中研究较少,仅在桃[19,20]中有报道,葡萄中Fe-S簇装配机制及其分子基础依然未知。【拟解决的关键问题】本研究以‘马瑟兰’葡萄为材料,克隆葡萄Fe-S簇装配机制相关基因并鉴定其生物信息学特征,明确其在葡萄不同组织部位的表达特征,为研究葡萄Fe-S簇装配和果树铁素营养与代谢的分子机制提供基因资源和理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点

试验于2019年6月至2020年12月在鲁东大学农林工程研究院和“十三五”山东省高等学校重点实验室——作物高产抗逆分子模块育种实验室进行。

1.2 试验材料与处理

供试材料为烟台地区主栽酿酒葡萄品种‘马瑟兰’,由山东省烟台市农业科学研究院果树所提供,种植在招远市大户庄园农林专业合作社试验基地,树体健壮,南北行向,常规田间管理。分别于特定日期采集‘马瑟兰’的果实,包括幼果期(2019年6月30日)、硬核期(7月15日)、膨大期(8月3日)、转色期(8月17日)和成熟期(9月15日),以及葡萄幼叶(6月30日)和老叶(9月15日),样品采集后立即液氮冷冻并保存于-80℃低温冰箱中备用。

胁迫试验供试材料为山东省烟台市农业科学研究院果树所提供的‘马瑟兰’组培脱毒幼苗。自2019年11月起,进行‘马瑟兰’组培脱毒苗的接种培养,所用培养基为1/2 MS固体培养基。组培室环境温度为25℃,湿度70%,光照3 000 lx。接种后的幼苗于一个月左右生根,继而长叶。培养近两个月即可将培养瓶放置于普通室内环境中,逐渐开盖进行3 d炼苗处理,早晚喷洒去离子水。幼苗生长状况良好的情况下,置于蛭石珍珠岩基质中,用正常MS培养液作为对照处理,用不含铁离子的MS培养液进行缺铁胁迫处理,早晚浇营养液,处理96 h后,分别采集处理幼苗的根部、茎部和叶部材料,立即液氮冷冻并保存于-80℃冰箱中备用。

1.3 葡萄Fe-S簇装配基因克隆

以拟南芥中43个Fe-S簇装配基因的氨基酸序列为参考序列,在Phytozome Grape Genome Database (http://www.phytozome.net)中检索葡萄基因组中相对应的Fe-S簇装配基因,以与参考序列比对的覆盖面积>90%且同源性>75%为筛选参数。检索结果在Pfam(http://pfam.xfam.org/search)在线服务器预测功能结构域。根据Phytozome获得的葡萄Fe-S簇装配基因的CDS(coding sequence)电子序列,分别设计上、下游引物(表1),利用Prime STARTM HS DNA聚合酶(TaKaRa,大连)从‘马瑟兰’整株组培苗中扩增目的基因,送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。

Table 1
表1
表1葡萄Fe-S簇装配基因CDS扩增所需引物
Table 1Primers used for CDS amplification of grape Fe-S cluster assembly genes
基因Gene上游引物 Forward primer (5′-3′)下游引物 Reverse primer (5′-3′)产物长度 Product length (bp)
ADX1ATGTTCGCTTCTAGACTTTCATTAGTGTGGTTTTGGAATAAA597
ADXRATGGCGTTTTGTCGTGCGAAGTCATTCCATGGTAACTTTCAG1461
ATM3ATGGCGGGCGTTGCTTCTTGCTCACGCCTCCAATTTAATGGT2181
CIA1ATGGATTTCTCGGAAGAGGGCTCAGGTTATAGAAGCCAGCTC1035
CIA2ATGTTTTTCCCTGAGGTGGACTTAGAGTTCATTGGAGTAGAG360
CIA3ATGTTCTTAAATCATATTAGATCAACCATATGATGGAGCCAG363
DRE2ATGTTGCAAAATAGCACATTGTTAAATGTCAGCCACAAGAA819
ERV1ATGTCTGAAACCCCATTTCATTTAATGTGATCTCTCACCAAA597
FHATGGCTTCTGCTTCTTCTTCCTTAGGAAAGGCTGATGGGTGT594
GRXS14ATGCTTATGCTTATATCAATATCAGGAGCACATCGCCTTCTC552
GRXS15ATGGCAAGGTCACTATCTAACTCATTCGGACTTTTCCTGGGG513
GRXS16ATGGCAACAATCAGTCTATCTCTACTTCTTAAATAAACCAAC894
HCF101ATGAGGCTAACAAACACTCTTTCATGCCTGTGCAGGAGTTAG1671
HSCA1ATGGCTGCCTCCGTTTTGCTCCTACTTCTTCACCTCTTCATA1842
HSCA2ATGGCCACTTCGGTGCTTCTTCTACTTCTTGGCCTGCTCATA1716
HSCA3ATGTCGGAGTGCCCAGCGATCTCACATCACCATCCGGTCCCTT1503
HSCA4ATGTACGGTGCGTGGGGTCTACTACAGCTCATCATGGGAGTC1947
HSCA5ATGGACGAGGTGGGTGAGGATCACTTGCTCTCGGTGAAGTC1677
HSCA6ATGGAAAGCTCGTGGAGAAGATCAAAGTTCATCATGGGAATC1821
HSCA7ATGGCGGTGAAGAACAGGGCGTCAGAACTGGAAGAAGCCCCA1731
HSCBATGTGGAAGAAGAATCTATGGTCAGAGTTTCTTCATGATTTC804
IBA57ATGGCCTCGCTTCTCAAGTCCCTAAGCGGACGCAGTATCTTG1113
INDLATGGAGTCACCGACCCAGGGATCACAGTGAAATCTCTGGCCG1026
ISA1ATGGCATCTTCATTTCTCGCGCTACTTAGCAGCTCCAGGATT402
ISA2ATGCCCCAGCCCTCCACTTCGTCACATTTCAGCAGCAAAGGA453
ISA3ATGTCAAGATCGGTGCTTCGGCTATTCTTTCACCATGAAAGA465
ISD11ATGGCATCAACACCTTCGAAATTATTCCAACTGCCTTCTGGC219
ISU1ATGAAGCTTCAAATCAAGGTCCTACTCAGTCTTTGCTCGCTT273
MMS19ATGGCACAACTGAGTCAATTGTCAGAAATGAAGACTTCTGGA3441
NAR1ATGTCGGAGAAGTTCTCGGCATCACCAGTTGTGTAATTGAGA1437
NBP35-1ATGGAGAACGGCGACAGCAATTCAAGTGGTAGACAGTGCCTG957
NBP35-2ATGGAGTCACCGACCCAGGGATCACAGTGAAATCTCTGGCCG1026
NFS1ATGGCTTCCAGGCTTCATTCTTTAGGTTATTTGTTTTTGTAG3267
NFS2ATGGCAAGTGTTCTGAAATTCTACTTGAAAGAAGAGAAGA1392
NFU1ATGGCGTCTCTCACAGCAACACTAGTCACTGAAGACAACATT642
NFU2ATGCAAGGCGTGGTGGTGGCGCTATAGAAGCTGAACTGCTGC684
NFU3ATGGGCTTCACAGCATTCACATTATCCATCTATCAACTGGAC714
NFU4ATGTTCATCCAAACTCAATCCTTAATCCATCTGGCCAGATAG609
SUFAATGCCCCAGCCCTCCACTTCGTCACATTTCAGCAGCAAAGGA453
SUFBATGGCTTCTCTACTGGCCAACCTAACCGACTGATCCTTCAAGC1536
SUFCATGGCTCGATTCTGCTGCGCCTTACAGTTGGGCCTCAGAAAT966
SUFDATGGCTGCTACATTGCTTTCATCATGAGGAACCTTTAAGTGT1443
SUFE1ATGTCTCTGTCCAATCTCCAATCAACATAGATTCCCAAGTTG1224
SUFE2ATGGACTCTGCAACTTTGGGTCATATCCTGAAAGGACTCTG855
SUFE3ATGGGGTGTACGGCGCAGGTGTCAACTTATTGAAGTTGATC1806
TAH18ATGAATGGGAGGGAGAAGCAGTCAAGACCATGCTTCCACATG1899

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1.4 葡萄Fe-S簇装配基因的生物信息学分析

参考LIANG等[17]和SONG等[20]的报道,在Phytozome葡萄基因组数据库中获得Fe-S簇装配基因的CDS编码区序列及基因组DNA序列和编码氨基酸序列,然后通过Gene Structure Display(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)在线服务器进行基因结构分析;利用WoLF PSORT在线服务器(https://wolfpsort.hgc.jp/)预测葡萄Fe-S簇装配基因的亚细胞定位;参考SONG等[20]报道,在Phytozome基因组中下载拟南芥AtISU1(At4g22220)、水稻OsISU1(Os01g47340)、大豆GmISU1(Glyma05g02260.1)、短柄草BdISU1(Bra020855)、番茄SlISU1(Solyc03g112900)、柑橘CsISU1(orange1.1g030644m)、苹果MdISU1(MDP0000778166)和桃PeISU1(ppa012356m),根据王壮伟等[21]描述,利用分子进化遗传分析软件MEGA 7.0中的邻接法(Neighbor-joining)构建不同植物ISU1蛋白的系统进化树。

1.5 总RNA提取与实时荧光定量PCR分析

采集田间葡萄树体不同发育时期的果实和叶片,通过RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(DP441)(TIANGEN,北京)提取葡萄样品的总RNA,并利用Fast Quant cDNA第一链合成试剂盒(去基因组)100rxn(TIANGEN,北京)合成第一链cDNA作为模板,采用Perfect Start Green qPCR Super Mix(TransGen,北京)进行实时荧光定量PCR。利用NCBI/PrimerBLAST在线服务器,设计葡萄Fe-S簇装配基因的特异性表达引物(表2)。以葡萄内参基因Ubiquitin(GenBank No. MH114011)[21,22],通过BIO-RAD实时荧光定量PCR仪检测葡萄Fe-S簇装配基因在不同组织部位的表达特征。反应体系参照商品说明书的描述,反应程序为95℃ 30 s;95℃ 5 s,60℃ 34 s(40个循环);72℃ 10 s。每个样品进行3次生物学重复,不同样品在实时荧光定量PCR仪获得相应的Ct值,经内参基因Ubiquitin均一化处理后,采用2-ΔCT法计算基因的相对表达量[21,22]。根据DENG等[23]描述,通过Log2计算法分析缺铁胁迫前后表达倍数,通过HemI软件制作表达差异变化的热图。分别以对照植物根、茎或叶的表达值设定为1,若缺铁胁迫条件下的表达值<1,表示基因表达水平被下调;表达值>1,则表示基因表达水平被上调。

Table 2
表2
表2本研究所用特异性表达引物
Table 2Specific expression primers used in this study
基因 Gene上游引物 Forward primer (5′-3′)下游引物 Reverse primer (5′-3′)产物长度 Product length (bp)
ADX1AACCACAATCGGGGACCAAGGTGGAACAGGCAAGTGAACC250
ADXRTGGGCATCCAGACTGCAAAATGGTCCACGTCTTCCTACCA211
ATM3CACCGACACCCTAGTTGGACTAGCCCCAACCAAGAAACCC232
CIA1GCAACGTTCTCCCTCCACTTGACCCGGATGCATTCCAAGA231
CIA2TGTTTTTCCCTGAGGTGGACATGCCAATTACTGTTGCCATGCT164
CIA3AAACTTCTGCGCAGTTTGCCGGAGCCAGACATTCATCAACC167
DRE2ATAGCACATTGGCCCTCACATGTCCCACCAGGCTTCAAAA248
ERV1TCGGCAGCAGAAGAAGGATGCCCCACCTTGCATCAACTCT222
FHGGCCGCCATTGATTACAGTTCGCTCACAGGAGAGGACAACC235
GRXS14GGAACCAAGGAGTTCCCACACGCCTTCTCCAACTGTTCCT243
GRXS15TGAAAGGGGTGCCTGATGTGTTGTGGAAATGTGGGCCAGT158
GRXS16AAACTGAGCCGATTCCCCTGCTCTGGCACCGATTTCCTGT167
HCF101GAGTGGGGAGAGCTGGACTAAACAACAGCAACACAGGGGA192
HSCA1CTCGCTTCCCCTTCTCTCTCCCACTGATGGTGTAGTCCGAG235
HSCA2CCATTCAGCTCAAAGCCTGCGGGAGCTCTGAGTTTAGTTCCA243
HSCA3AGAGAGGTTTGCAAAGGAGGAGTCCCTTTCCTGATGACTTTCC244
HSCA4ACCAATGACAAGGAGGAAGACACACTCGAGGGCCTCTTTCAC176
HSCA5CAGAGACTGCCGAGAAAGCAGCGTTGAACCACCAACAAGG246
HSCA6GTCAAGGCTGAGGACAAGGGGACAGCTTCCACCTCATCAATC165
HSCA7TACACGAGTTTGCAGAAGAGGAGCCCCACCACTCCTCATAAA177
HSCBTCCATGTTCCTCAACTGCCCACAAGAGTCGCAAGCCAGAA181
IBA57GTGGATGCCACTGTCTTGGAATGTGCCAGCAGGATCAACA202
INDLAGTGGTTCTGCGGGGTTTAGATCAGCATCAAGCACACCCA168
ISA1CCTAACCCTAACGGACGCTGCCAATGACATGCATGAGAGCC213
ISA2GCCCTCCACTTCGGTTTCTCCCAGAGCATCCACCCTGTTT219
ISA3TTGAGTGTCGAGACTGGTGGTGCTCACCAGGAAAGCAGAA193
ISD11ACGCGATTTCTCGGACTACAATTATTCCAACTGCCTTCTGGC156
ISU1CCATCGCCTCTTCCTCTGTTAGTCTTTGCTCGCTTGGCT188
MMS19AGCTTGCTGTTGGGAGTTGTGGGTTTGAGGACGAACTGCT231
NAR1AAAGCTGAGGTTGTGACGGGAAAGGAAGCCCTTGACTGGG204
NBP35-1TTCCTAGTGGTTGATGCCCCACACCTCACTGAAATCTGTCAC232
NBP35-2AGTGGTTCTGCGGGGTTTAGATCAGCATCAAGCACACCCA168
NFS1GACAAATCAAAAAGCCATTTTCCAACACGTACTGCTCTCGGGTT150
NFS2GTTCAGGTGGGGTTCCGTAGAGGCTTCTGTGAGGTTGCTG183
NFU1CAAAACTCAGCGTTTCGCCTATTTGTGGGCCGAGTAGAGC163
NFU2CCTACTGCTGCAGAGCCAAAGCAACAGCCTTGACAACTCG172
NFU3AAACACGCCCTAGAGCCTTCAGCCTTGACAACTCGGCTAC150
NFU4GGGAAGCCACTGTTCCTTGACGATACTCGATGTCCCCACC152
SUFAGCCCTCCACTTCGGTTTCTCCCAGAGCATCCACCCTGTTT219
SUFBACAAAGTTTGCAGATGACAGGACTAGCCCCACTGCATAGACC221
SUFCCCATGCAGTCATGGGGAAGAACCTGGGATCTCTACTGGGG190
SUFDAATTGCCCACTGGCGTTTTCATATCCCCACCCTCAACGGA217
SUFE1TGGACATGCAGGTGTTAGGGTTCCCAAGTTGATTTCCCTGTCT219
SUFE2TGATTCGGGTTTTGGACGGAAGATATTGCAGTGCCAGAGACA227
SUFE3TCCTGAGGTCCAAGGTGTCTGCATCTGCCAAAGAGCAACC243
TAH18GCGCTATTTCTTTGAGGCAAGAATGGCATTTGCACTGAAGGG174

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2 结果

2.1 葡萄Fe-S簇装配基因检索与鉴定

以拟南芥Fe-S簇装配基因的氨基酸序列为参考序列[12],在葡萄基因组数据库中检索到46个Fe-S簇装配基因。其中,14个基因属于质体SUF机制,21个基因属于线粒体ISC机制,11个基因属于细胞质CIA机制(图1表3)。与拟南芥相比,葡萄基因组中缺少了ISU2ISU3NFU5ADX2,但增加了拟南芥中没有的HSCA3-7、NBP35-2CIA3;与桃相比[19,20],葡萄基因组中缺少了ADX2,但增加了桃中没有的SUFC、HSCA6HSCA7;与单子叶植物水稻相比[17],葡萄基因组中缺少了ISU2ADX2,但检索到水稻中没有的SUFE2、HSCA3-7、NBP35-2CIA3表3)。

图1

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图1葡萄细胞中Fe-S簇装配基因功能模拟分布图

Fig. 1The proposed function and distribution model of Fe-S cluster assembly genes in grape



Table 3
表3
表3葡萄、拟南芥和桃Fe-S簇装配基因对比
Table 3Complete list of Fe-S cluster assembly genes in grape, Arabidopsis and peach species
位置
Location
基因
Gene
登录号 Locus ID
拟南芥 Arabidopsis葡萄Grape桃 Peach水稻 Rice
质体
Plastid
NFS2At1g08490GSVIVT01037384001ppa005298mOs12g18900
SUFE1At4g26500GSVIVT01014835001ppa007330mOs09g09790
SUFE2At1g67810GSVIVT01000550001ppa017530m-
SUFE3At5g50210GSVIVT01007621001ppa001921mOs12g19304
SUFAAt1g10500GSVIVT01022247001ppa012351mOs06g05400
SUFBAt4g04770GSVIVT01012742001ppa003788mOs01g61400
SUFCAt3g10670GSVIVT01036588001-Os03g21490
SUFDAt1g32500GSVIVT01013180001ppa004982mOs01g03650
NFU1At4g01940GSVIVT01028158001ppa011214mOs03g20010
NFU2At5g49940GSVIVT01023274001ppa011050mOs11g07916
NFU3At4g25910GSVIVT01029242001ppa010743mOs06g47940
HCF101At3g24430GSVIVT01015424001ppa006650mOs01g52170
GRXS14At3g54900GSVIVT01032936001ppa012220mOs03g63420
GRXS16At2g38270GSVIVT01011178001ppa009373mOs12g07650
线粒体
Mitochondria
NFS1At5g65720GSVIVT01003603001ppa005512mOs09g16910
ISD11At5g61220GSVIVT01007919001ppa013993mOs08g14070
ISU1At4g22220GSVIVT01013764001ppa012356mOs01g47340
ISU2At3g01020--Os05g49300
ISU3At4g04080---
ISA1At2g16710GSVIVT01033834001ppa013203mOs12g30030
ISA2At2g36260GSVIVT01022247001ppa12351mOs01g01610
ISA3At5g03905GSVIVT01033842001ppa012679mOs08g28230
NFU4At3g20970GSVIVT01011272001ppa009781mOs05g06330
NFU5At1g51390---
ADX1At4g21090GSVIVT01015024001ppa012568mOs09g26650
ADX2At4g05450-ppa012238mOs07g01930
ADXRAt4g32360GSVIVT01015352001ppa004960mOs02g17700
FHAt4g03240GSVIVT01000441001ppa011940mOs01g57460
HSCA1At4g37910GSVIVT01038517001ppa002402mOs02g53420
HSCA2At5g09590GSVIVT01006769001ppa001973mOs03g02260
HSCA3-GSVIVT01008331001ppa002222mOs09g31486
HSCA4-GSVIVT01038580001ppa002489m-
HSCA5-GSVIVT01026014001ppa002572m-
HSCA6-GSVIVT01019607001--
HSCA7-GSVIVT01031125001--
HSCBAt5g06410GSVIVT01022555001ppa016242mOs12g27070
INDLAt4g19540GSVIVT01000762001ppa019981mOs03g42880
IBA57At4g12130GSVIVT01004911001ppa006632mOs06g04380
GRXS15At3g15660GSVIVT01017244001ppa012405mOs01g07950
细胞质
Cytosol
ATM3At5g58270GSVIVT01024527001ppa002114mOs06g03770
ERV1At1g49880GSVIVT01037859001ppa012227mOs03g10850
NAR1At4g16440GSVIVT01007214001ppa005089mOs03g53750
NBP35-1At5g50960GSVIVT01001845001ppa005998mOs04g40880
NBP35-2-GSVIVT01000762001ppa007759m-
TAH18At3g02280GSVIVT01031054001ppa002941mOs01g53250
DRE2At5g18400GSVIVT01010181001ppa009994mOs04g57810
CIA1At2g26060GSVIVT01033839001ppa007909mOs07g14830
CIA2At1g68310GSVIVT01018962001ppa012624mOs04g50864
CIA3-GSVIVT01034035001ppa012667m-
MMS19At5g48120GSVIVT01016980001ppa023072mOs07g08050

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2.2 葡萄Fe-S簇装配基因及其编码蛋白特征

NFS1HSCA2NAR1染色体定位情况未知外,其他43个葡萄Fe-S簇装配基因在除了5号染色体之外的16条染色体上均有分布;其中,8号染色体含有的基因数目最多,共6个(GRXS16ISA1ISA3HSCB、CIA1CIA3),7号染色体含有5个(SUFA、NFU1、ISA2、INDL、NBP35-2),其他染色体上至少含有一个基因;同一基因家族中的成员ISA1ISA3CIA1CIA3均位于8号染色体(表3),然而,同属于HSCA基因家族的7个成员分布于截然不同的染色体上,但其CDS长度较为接近,均在1 500—2 000 bp(表4)。

Table 4
表4
表4葡萄Fe-S簇装配基因信息
Table 4Information of Fe-S cluster assembly genes in grape
位置
Location
基因
Gene
GenBank登录号
GenBank No.
染色体定位
Chromosome location
编码区
CDS (bp)
氨基酸数目
Amino acid No.
内含子数目
Intron No.
质体
Plastid
NFS2GSVIVT01037384001chr6:14614433..14627074 forward13924639
SUFE1GSVIVT01014835001chr19:10332463..10337676 reverse12244075
SUFE2GSVIVT01000550001chr1:7199706..7203084 forward8552842
SUFE3GSVIVT01007621001chr17:11153636..11159809 reverse18066016
SUFAGSVIVT01022247001chr7:17815443..17819261 forward4531502
SUFBGSVIVT01012742001chr10:1165899..1176476 reverse15365113
SUFCGSVIVT01036588001chr13:18723793..18744366 forward9663215
SUFDGSVIVT01013180001chr2:7019468..7043516 forward14434802
NFU1GSVIVT01028158001chr7:4298897..4301308 forward6422132
NFU2GSVIVT01023274001chr12:20249550..20254467 reverse6842273
NFU3GSVIVT01029242001chr11:18133595..18136869 forward7142373
HCF101GSVIVT01015424001chr11:3539907..3550291 forward167155614
GRXS14GSVIVT01032936001chr14:24341805..24359981 reverse5521833
GRXS16GSVIVT01011178001chr8:7822419..7828262 reverse8942971
线粒体
Mitochondria
NFS1GSVIVT01003603001chrUn:11176164..11189530 forward326710888
ISD11GSVIVT01007919001chr17:7527950..7530932 reverse219721
ISU1GSVIVT01013764001chr1:7813881..7823597 forward273902
ISA1GSVIVT01033834001chr8:17357057..17361779 forward4021332
ISA2GSVIVT01022247001chr7:17815443..17819261 forward4531502
ISA3GSVIVT01033842001chr8:17302334..17306498 forward4651543
NFU4GSVIVT01011272001chr13:10306616..10320274 reverse6092024
ADX1GSVIVT01015024001chr11:532570..538242 forward5971986
ADXRGSVIVT01015352001chr11:2891542..2897423 reverse146148612
FHGSVIVT01000441001chr12:8053062..8056733 reverse5941974
HSCA1GSVIVT01038517001chr3:10899748..10904643 forward18426137
HSCA2GSVIVT01006769001chrUn:28290681..28295479 forward17165718
HSCA3GSVIVT01008331001chr17:3189753..3194345 forward15035009
HSCA4GSVIVT01038580001chr16:21738678..21742840 reverse19476488
HSCA5GSVIVT01026014001chr18:25847096..25853527 forward16775587
HSCA6GSVIVT01019607001chr2:1900757..1904873 forward18216068
HSCA7GSVIVT01031125001chr14:1920620..1924241 forward17315768
HSCBGSVIVT01022555001chr8:4909017..4918207 forward8042675
INDLGSVIVT01000762001chr7:498142..504281 reverse10263418
IBA57GSVIVT01004911001chr2:4748585..4752156 forward11133704
GRXS15GSVIVT01017244001chr9:5862839..5867495 reverse5131705
细胞质
Cytosol
ATM3GSVIVT01024527001chr6:9155464..9213374 reverse218172619
ERV1GSVIVT01037859001chr3:7051150..7055710 forward5971987
NAR1GSVIVT01007214001chrUn:30906448..30911807 forward143747810
NBP35-1GSVIVT01001845001chr14:26263495..26271378 reverse9573183
NBP35-2GSVIVT01000762001chr7:498142..504281 reverse10263418
TAH18GSVIVT01031054001chr14:21477906..21501706 reverse189963211
DRE2GSVIVT01010181001chr1:16897462..16906512 reverse8192726
CIA1GSVIVT01033839001chr8:17322989..17332968 forward10353449
CIA2GSVIVT01018962001chr4:18301283..18304437 reverse3601195
CIA3GSVIVT01034035001chr8:15682406..15687298 forward3631203
MMS19GSVIVT01016980001chr9:3133979..3155012 forward3441114621

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基因结构分析结果表明葡萄Fe-S簇装配基因均含有内含子,其中,GRXS16ISD11仅含有1个内含子,而MMS19含有的内含子数目最多(21个),且长度不一(表4图2)。但SUFD含有2个内含子,第2个内含子的长度超过20 kb。

图2

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图2葡萄Fe-S簇装配基因的结构分析

Fig. 2Gene structure of Fe-S cluster assembly genes in grape



2.3 葡萄Fe-S簇装配基因亚细胞定位预测

由亚细胞定位预测结果可知,葡萄Fe-S簇装配机制相关蛋白在多种亚细胞结构中均有定位,且不同装配机制的蛋白亚细胞定位情况差异很大(表5)。其中,质体SUF装配机制的蛋白主要定位在叶绿体中,而SUFE1主要定位于细胞核,SUFE3主要定位于细胞质,此外部分蛋白成员在线粒体、内质网膜、液泡膜和细胞质膜也有不同比例的分布;线粒体ISC装配机制中,HSCA4和HSCA6是100%定位在内质网膜,其他成员中,10个主要定位于叶绿体,6个主要定位于线粒体,3个(HSAC3、HSAC5和INDL)主要定位于细胞质。此外,ISC装配机制的蛋白在细胞核、液泡膜、细胞质膜和高尔基体有不同比例的定位;细胞质CIA装配机制中,CIA3是100%定位在细胞质,其他成员中,6个主要定位于细胞核,3个(NAR1、NBP35-2和CIA2)主要定位于细胞质,ATM3主要在细胞质膜,NBP35-1主要在叶绿体;此外,CIA装配机制的蛋白在液泡膜、内质网膜、线粒体和高尔基体也有不同比例的定位(表5)。

Table 5
表5
表5Fe-S簇装配基因亚细胞定位预测
Table 5Subcellular localization prediction of Fe-S cluster assembly gene
蛋白位置
Protein location
蛋白
Protein
亚细胞定位 Subcellular localization (%)
叶绿体Chloroplast线粒体Mitochondria细胞质Cytosol细胞核Nucleus内质网膜
Endoplastic reticulum
液泡膜
Vacular membrane
细胞质膜
Plasma membrane
高尔基体
Golgi
质体
Plastid
NFS271.4328.57------
SUFE17.14-21.4357.15-7.147.14-
SUFE292.867.14------
SUFE37.14-64.2914.297.14-7.14-
SUFA85.727.147.14-----
NFU17228------
NFU285.72--7.147.14---
NFU357.15-21.437.14--14.28-
SUFB57.5032.50-10.00----
SUFC85.7114.29------
SUFD68.321.95-9.75----
HCF10157.1414.29---21.43-7.14
GRXS1492.86----7.14--
GRXS1683.7216.28------
线粒体
Mitochondria
NFS135.7135.71-28.58----
ISD11-77.42-16.13--6.45-
ISU185.72-14.28-----
ISA192.857.15------
ISA278.577.1514.28-----
ISA321.6345.9427.035.40----
NFU45014.28-14.28-7.14--
ADX114.2878.58-7.14----
ADXR5035.727.147.14----
FH5035.72-14.28----
HSCA114.2885.72------
HSCA214.2885.72------
HSCA321.42-78.58-----
HSCA4----100---
HSCA57.147.1478.58---7.14-
HSCA6----100---
HSCA743.76-15.6215.62-12.5-12.5
HSCB71.4414.28-14.28----
INDL14.28-78.587.14----
IBA5764.3014.287.147.14--7.14-
GRXS1542.8657.14------
细胞质
Cytosol
ATM37.147.14--28.57-57.15-
ERV114.28-14.2857.16-7.147.14-
NAR121.427.1442.8821.42-7.14--
NBP35-157.16-21.4221.42----
NBP35-214.28-78.587.14----
TAH187.14-35.7157.15----
DRE221.42-21.4257.16---7.14
CIA114.28-28.5853-7.14--
CIA27.14-64.3021.42---7.14
CIA3--100-----
MMS1914.28-28.5735.73-14.28-7.14

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2.4 葡萄Fe-S簇装配基因的表达特征分析

实时荧光定量PCR分析结果表明,葡萄Fe-S簇装配基因在成年‘马瑟兰’葡萄不同组织部位的表达水平差异较大:其中,ISU1在整体水平的表达量最高(特别是在成熟果实、老叶和幼叶中的表达量极高),其次是HSCA1ISA2NFU2、SUFASUFB等基因的整体表达水平较高,而SUFE2NFS1、HSCA2HSCA6TAH18CIA2均未检测到表达量,其他未提及的基因在本研究所有不同葡萄组织材料中有较低或极低的表达量(图3)。

图3

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图3葡萄Fe-S簇装配基因组织特异性表达模式分析

A:质体SUF机制基因;B:线粒体ISC机制基因;C:细胞质CIA机制基因
Fig. 3Tissue specific expression pattern analysis of Fe-S cluster assembly genes in grape

A: Plastid SUF machinery genes; B: Mitochondria ISC machinery genes; C: Cytosol CIA machinery genes


在本研究所检测的不同葡萄组织材料中,13个葡萄Fe-S簇装配基因(SUFASUFBNFU3HCF101GRXS14GRXS16ISA1ISA2FHIBA57GRXS15ATM3MMS19)在成熟叶片中的表达量最高,NFS2、SUFE1、NFU1、ISA3、NFU4、ADX1NAR1DRE2等8个基因在幼苗叶片的表达最高,而ISD11ISU1IBA57HSCBNBP35-1CIA1CIA3等6个基因在成熟期果实中的表达量最高,其表达水平随着果实的逐渐发育而递增,均在成熟期果实中达到最高;此外,除HSCA2HSCA6没有检测到外,其他5个HSCA家族成员均在转色期果实中的表达量最高(图3)。

2.5 葡萄Fe-S簇装配基因对缺铁胁迫的响应差异分析

以‘马瑟兰’组培幼苗为材料,通过实时荧光定量PCR分析葡萄Fe-S簇装配基因在转录水平对缺铁胁迫的响应情况。如图4所示,葡萄Fe-S簇装配基因对缺铁处理较为敏感,所有46个基因至少在1个检测的组织部位对缺铁处理有响应,表达量发生显著变化。其中,22个基因(NFS2SUFE1SUFE3SUFBSUFCNFU1NFU2NFU3GRXS14NFS1ISA1-3FHHSCA4HSCA6HSCA7AMT3NAR1TAH18CIA1CIA2)对缺铁胁迫最敏感,其表达水平在‘马瑟兰’幼苗所有检测组织中均受缺铁处理的影响而发生显著变化(图4)。根部中,24个葡萄Fe-S簇装配基因在转录水平的表达量受缺铁处理而降低,12个基因的表达量增强,10个基因的表达量没有显著变化;茎部中,14个葡萄Fe-S簇装配基因在转录水平的表达量受缺铁处理而降低,22个基因的表达量增强,10个基因的表达量没有显著变化;叶片中,9个葡萄Fe-S簇装配基因在转录水平的表达量受缺铁处理而降低,27个基因的表达量被增强,10个基因的表达量没有显著变化(图4)。

图4

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图4利用组培幼苗分析葡萄Fe-S簇装配基因对缺铁胁迫的响应差异

Fig. 4Analysis of differential responses of Fe-S cluster assembly genes under iron deficiency in grape tissue culture seedlings



3 讨论

不管是原核生物还是真核生物,Fe-S簇装配机制是极其复杂和高度保守的[9,11-12]。植物中,拟南芥Fe-S簇装配机制的研究最为透彻[9,12],果树学中Fe-S簇装配机制的研究较稀缺。葡萄中缺乏ADX2,仅含有ADX1,而ADX作为铁氧还蛋白起到电子转移体的作用,暗示葡萄ADX1可能功能独特或者能够独当一面;此外,葡萄中含有更多数目的HSCA,揭示葡萄Fe-S簇装配过程中需要更多的HSP70型伴侣蛋白[11,12]。但ISU和NFU家族基因均编码Scaffold支架蛋白进而参与植物Fe-S簇装配[9,11-14],然而,本研究意外发现多年生木本果树相较于一年生草本植物少了一些典型的支架蛋白,即ISU2、ISU3和NFU5丢失(表6),这些丢失的支架蛋白在本研究选定的木本果树作物中肯定不是Fe-S簇装配途径所必需的。其他支架蛋白,包括SUFB、SUFC、SUFD、NFU1-4、ISU1、NBP35-1和NBP35-2均存在,表明这10个基因在功能上对葡萄Fe-S簇装配及铁代谢途径是足够的。因此,推测高等植物Fe-S簇装配机制可能经历了复杂而长期的进化过程,特别是在线粒体ISC装配机制中,多年生木本植物更有可能进化出“非功能性”支架蛋白丢失的策略。

Table 6
表6
表69种高等植物ISU和NFU家族同源基因分析
Table 6Orthologs analysis of ISU and NFU members in 9 species of higher plants
基因
Gene
拟南芥
Arabidopsis thaliana
盐芥
Thellungiella halophila
短柄草
Brachypodium sylvaticum
水稻
Rice
番茄
Tomato
柑橘
Orange
苹果
Apple

Peach
葡萄
Grape
ISU1At4g22220Thhalv10026418mBra020855Os01g47340Solyc03g112900orange1.1g030644mMDP0000778166ppa012356mGSVIVT01013764001
ISU2At3g01020Thhalv10028164mBra013601Os05g49300Solyc07g007450----
ISU3At4g04080Thhalv10029418mBra029483------
NFU1At4g01940Thhalv10028839mBra000905Os03g20010Solyc01g079220orange1.1g027469mMDP0000245391ppa011214mGSVIVT01028158001
NFU2At5g49940Thhalv10014572mBra037947Os11g07916Solyc01g103710orange1.1g026830mMDP0000285539ppa011050mGSVIVT01023274001
NFU3At4g25910Thhalv10026125mBra013933Os06g47940Solyc05g044630orange1.1g038446mMDP0000952041ppa010743mGSVIVT01029242001
NFU4At3g20970Thhalv10021272mBra031245Os05g06330Solyc11g007120orange1.1g023823mMDP0000150995ppa009781mGSVIVT01011272001
NFU5At1g51390Thhalv10011711mBra018906------

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基因表达模式分析结果表明葡萄Fe-S簇装配基因在葡萄不同年龄、不同部位组织材料中的表达量差异很大(图3),且在幼苗不同部位对缺铁胁迫转录水平的响应差异明显,在幼苗根、茎、叶中均有36个基因的表达水平受缺铁处理调控:其中,根部Fe-S簇装配基因的表达水平易受缺铁胁迫诱导而上调,而地上部(茎和叶)Fe-S簇装配基因的表达水平易受缺铁胁迫抑制而下调(图4)。特别值得注意的是,ISU1在‘马瑟兰’葡萄组织中的表达量都是最丰富的,其次是HSCA1ISA2,这一发现与水稻[17]和桃[19,20]中Fe-S簇装配基因的表达特征较为相似,而与大豆[18]略有差异,大豆HSCA1表达量最高,其次是HSCA2;值得一提的是,ISU1HSCA1ISA2都属于线粒体ISC机制的成员[9,10,11,12],暗示线粒体ISC机制需要更多功能性的支架蛋白、伴侣蛋白和电子转移体。

由于ISU1在‘马瑟兰’葡萄果实发育不同时期、叶片发育不同阶段和幼苗组织中的表达量均最高(图3),暗示ISU1是线粒体ISC装配也是葡萄Fe-S簇装配机制不可或缺的支架蛋白,在葡萄铁代谢方面可能发挥关键作用。本研究所分析10种植物ISU1蛋白序列的一致性高达77%,且具有多处高度保守的结构域区域(图5),这些发现暗示了遗传距离较近的不同物种之间的ISU1同源蛋白在长期的进化过程中可能具有相同或相近的功能。进一步的系统发育树分析表明葡萄ISU1和番茄ISU1紧密聚集在一起(图6),而番茄作为典型的模式作物,研究其ISU1蛋白功能可能为揭示葡萄ISU1功能提供理论依据。

图5

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图5不同植物ISU1蛋白序列一致性分析

Fig. 5Identity analysis of ISU1 protein sequences from different species



图6

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图6不同植物ISU1蛋白系统进化树建立

Fig. 6Phylogenetic tree construction of ISU1 protein from different species



此外,本研究表明葡萄Fe-S簇装配基因在‘马瑟兰’成年树体与幼苗中的表达模式有所不同(图3)。但SUFE2编码叶绿体类SufE蛋白[9,12],其在‘马瑟兰’葡萄组织材料中均未检测到表达量,相比之下,SUFE1仅在‘马瑟兰’葡萄幼苗中检测到表达量,而SUFE3在葡萄组织中广泛表达,尽管表达水平相对较低(图3),并且SUFE不同基因成员在转录水平对缺铁胁迫的响应情况较为复杂,且差异明显(图4),这些结果表明同一基因家族不同成员之间的表达模式具有较强的组织特异性。已有研究表明,AtSUFE2表达具有花特异性,在拟南芥花粉中高量表达[20,24]。由此测,葡萄SUFE2可能也有类似特殊的功能,即参与葡萄花粉的发育,但需要进一步的后续功能验证。CIA基因家族编码WD40蛋白、DUF59功能域,在细胞质CIA装配机制中发挥重要功能[11,12,13,14],本研究中发现CIA1仅在‘马瑟兰’成年葡萄果实和叶片中检测到表达量,CIA2在所有检测组织中均没有表达,而CIA3在所有检测组织中的表达量较为均匀(图3),且仅有CIA1在幼苗根部受缺铁胁迫强烈诱导外,CIA家族基因在不同组织中易受缺铁胁迫抑制而降低(图4),再次表明同一基因家族不同成员之间的表达模式具有较强的组织特异性,也暗示葡萄CIA基因功能的发挥依赖于适量的铁素供应。此外,SUFBSUFCSUFDNFU1-4ISU1NBP35-1NBP35-2等支架蛋白编码基因在‘马瑟兰’葡萄不同组织中的表达量较为适中,且易受缺铁胁迫调控,再次暗示这10个基因直接参与葡萄Fe-S簇装配机制。

4 结论

从葡萄中克隆并鉴定了46个Fe-S簇装配基因,其在葡萄果实和叶片发育不同时期的表达水平差异很大,并在葡萄幼苗中对缺铁胁迫在转录水平的响应差异显著;ISU1在葡萄所有组织中的整体表达量较高,且葡萄ISU1和番茄ISU1之间的遗传进化距离最为接近,推测ISU1在葡萄铁代谢方面可能发挥关键作用。

参考文献 原文顺序
文献年度倒序
文中引用次数倒序
被引期刊影响因子

李俊成, 于慧, 杨素欣, 冯献忠. 植物对铁元素吸收的分子调控机制研究进展
植物生理学报, 2016, 52(6):835-842.

[本文引用: 1]

LI J C, YU H, YANG S X, FENG X Z. Research progress of molecular regulation of iron uptake in plants
Plant Physiology Journal, 2016, 52(6):835-842. (in Chinese)

[本文引用: 1]

BARTON L L, ABADIA J. Iron Nutrition in Plants and Rhizospheric Microorganisms
Springer-Verlag, New York, 2006: 85-101.

[本文引用: 1]

COUTURIER J, TOURAINE B, BRIAT J F, GAYMARD F, ROUHIER N. The iron-sulfur cluster assembly machineries in plants: Current knowledge and open questions
Frontiers in Plant Science, 2013, 4:259.

[本文引用: 2]

TAGLIAVINI M, ABADÍA J, ROMBOLÀ A D, ABADÍA A, TSIPOURIDIS C, MARANGONI B. Agronomic means for the control of iron deficiency chlorosis in deciduous fruit trees
Journal of Plant Nutrition, 2000, 23(11/12):2007-2022.

DOI:10.1080/01904160009382161URL [本文引用: 1]

JIMÉNEZ S, GOGORCENA Y, HÉVIN C, ROMBOLÀ A D, OLLAT N. Nitrogen nutrition influences some biochemical responses to iron deficiency in tolerant and sensitive genotypes of Vitis
Plant and Soil, 2007, 290(1):343-355.

DOI:10.1007/s11104-006-9166-4URL [本文引用: 1]

CHEN Y, BARAK P. Iron Nutrition of pants in calcareous soils
Advances in Agronomy, 1982, 35:217-240.

[本文引用: 1]

PESTANA M, BEJA P, CORREIA P J, DE VARENNES A, FARIA E A. Relationships between nutrient composition of flowers and fruit quality in orange trees grown in calcareous soil
Tree Physiology, 2005, 25(6):761-767.

DOI:10.1093/treephys/25.6.761URL [本文引用: 1]

NETZ D J A, MASCARENHAS J, STEHLING O, PIERIK A J, LILL R. Maturation of cytosolic and nuclear iron-sulfur proteins
Trends in Cell Biology, 2013, 24(5):303-312.

DOI:10.1016/j.tcb.2013.11.005URL [本文引用: 2]

BALK J, LOBRÉAUX S. Biogenesis of iron-sulfur proteins in plants
Trends in Plant Science, 2005, 10(7):324-331.

DOI:10.1016/j.tplants.2005.05.002URL [本文引用: 10]

杜璟, 李艳纯, 任雪营, 谭国强, 吕建新. 真核细胞中铁硫簇的组装机制及相关铁硫蛋白疾病
中国细胞生物学学报, 2015, 37(9):1323-1333.

[本文引用: 4]

DU J, LI Y C, REN X Y, TAN G Q, LÜ J X. Mechanisms of iron-sulfur clusters assemble in eukaryotes and related diseases
Chinese Journal of Cell Biology, 2015, 37(9):1323-1333. (in Chinese)

[本文引用: 4]

LILL R. Function and biogenesis of iron-sulphur proteins
Nature, 2009, 460(7257):831-838.

DOI:10.1038/nature08301URL [本文引用: 8]

BALK J, PILON M. Ancient and essential: The assembly of iron-sulfur clusters in plants
Trends in Plant Science, 2011, 16(4):218-226.

DOI:10.1016/j.tplants.2010.12.006URL [本文引用: 11]

JOHNSON D C, DEAN D R, SMITH A D, JOHNSON M K. Structure, function, and formation of biological iron-sulfur clusters
Annual Review of Biochemistry, 2005, 74:247-281.

DOI:10.1146/biochem.2005.74.issue-1URL [本文引用: 3]

LILL R, MÜHLENHOFF U. Iron-sulfur protein biogenesis in eukaryotes: Components and mechanisms
Annual Review of Cell and Developmental Biology, 2006, 22:457-486.

DOI:10.1146/cellbio.2006.22.issue-1URL [本文引用: 3]

ROUAULT T A, TONG W H. Iron-sulfur cluster biogenesis and human disease
Trends in Genetics, 2008, 24(8):398-407.

DOI:10.1016/j.tig.2008.05.008URL [本文引用: 2]

BERNARD D G, NETZ D J A, LAGNY T J, PIERIK A J, BALK J. Requirements of the cytosolic iron-sulfur cluster assembly pathway in Arabidopsis
Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B, Biological Sciences, 2013, 368(1622):20120259.

[本文引用: 4]

LIANG X J, QIN L, LIU P W, WANG W H, YE H. Genes for iron-sulphur cluster assembly are targets of abiotic stress in rice, Oryza sativa
Plant, Cell & Environment, 2014, 37(37):780-794.

[本文引用: 4]

QIN L, WANG M H, CHEN L Y, LIANG X J, WU Z G, LIN Z H, ZUO J, FENG X Y, ZHAO J, LIAO H, YE H. Soybean Fe-S cluster biosynthesis regulated by external iron or phosphate fluctuation
Plant Cell Reports, 2015, 34(3):411-424.

DOI:10.1007/s00299-014-1718-0URL [本文引用: 2]

SONG Z Z, MA R J, ZHANG B B, GUO S L, YU M L, KORIR N K. Differential expression of iron-sulfur cluster biosynthesis genes during peach fruit development and ripening, and their response to iron compound spraying
Scientia Horticulturae, 2016, 207:73-81.

DOI:10.1016/j.scienta.2016.05.024URL [本文引用: 3]

SONG Z Z, YANG Y, XU J L, MA R J, YU M L. Physiological and transcriptional responses in the iron-sulphur cluster assembly pathway under abiotic stress in peach (Prunus persica L.) seedlings
Plant Cell Tissue & Organ Culture, 2014, 117(3):419-430.

[本文引用: 6]

王壮伟, 王庆莲, 夏瑾, 王西成, 宋志忠, 吴伟民. 葡萄KEA家族基因的克隆、鉴定及表达分析
中国农业科学, 2018, 51(23):4522-4534.

[本文引用: 3]

WANG Z W, WANG Q L, XIA J, WANG X C, SONG Z Z, WU W M. Cloning, characterization and expression analysis of K+/H+ antiporter genes in grape
Scientia Agricultura Sinica, 2018, 51(23):4522-4534. (in Chinese)

[本文引用: 3]

沈静沅, 唐美玲, 杨庆山, 高雅超, 刘万好, 程杰山, 张洪霞, 宋志忠. 葡萄钾离子通道基因VviSKOR的克隆、表达及电生理功能
中国农业科学, 2020, 53(15):3158-3168.

[本文引用: 2]

SHEN J Y, TANG M L, YANG Q S, GAO Y C, LIU W H, CHENG J S, ZHANG H X, SONG Z Z. Cloning, expression and electrophysiological function analysis of potassium channel gene VviSKOR in grape
Scientia Agricultura Sinica, 2020, 53(15):3158-3168. (in Chinese)

[本文引用: 2]

DENG W K, WANG Y B, LIU Z X, CHENG H, XUE Y. HemI: A toolkit for illustrating heatmaps
PLoS ONE, 2014, 9(11):e111988.

DOI:10.1371/journal.pone.0111988URL [本文引用: 1]

MURTHY U M N, OLLAGNIER-DE-CHOUDENS S, SANAKIS Y, ABDEL-GHANY S E, ROUSSET C, YE H, FONTECAVE M, PILON-SMITS E A H, PILON M. Characterization of Arabidopsis thaliana SufE2 and SufE3: Functions in chloroplast iron-sulfur cluster assembly and Nad synthesis
The Journal of Biological Chemistry, 2007, 282(25):18254-18264.

DOI:10.1074/jbc.M701428200URL [本文引用: 1]

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