邵美琪^,1,2, 赵卫松², 苏振贺², 董丽红², 郭庆港^,2,*, 马平²¹河北农业大学植物保护学院,河北保定 071001
²河北省农林科学院植物保护研究所/河北省农业有害生物综合防治工程技术研究中心/农业农村部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室,河北保定 071000

Effect of Bacillus subtilis NCD-2 on the Growth of Tomato and the Microbial Community Structure of Rhizosphere Soil Under Salt Stress

SHAO MeiQi^,1,2, ZHAO WeiSong², SU ZhenHe², DONG LiHong², GUO QingGang^,2,*, MA Ping²¹College of Plant Protection, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, Hebei
²Plant Protection Institute of Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences/IPM Centre of Hebei Province/Key Laboratory of IPM on Crops in Northern Region of North China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Baoding 071000, Hebei

通讯作者: 郭庆港,Tel：0312-5915678;E-mail： gqg77@163.com

责任编辑: 岳梅
收稿日期:2021-03-17接受日期:2021-03-31

基金资助:

国家自然科学基金(31572051) 河北省重点研发计划(19226510D) 河北省农林科学院现代农业科技创新工程(2019-1-2-3) 河北省自然科学基金(C2019301101)

Received:2021-03-17Accepted:2021-03-31
作者简介 About authors
联系方式：邵美琪,E-mail： 18849208821@163.com。








摘要
【目的】探讨盐胁迫下生防枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NCD-2菌株对番茄的促生效果及对土壤微生物群落多样性的影响,为拓宽NCD-2菌株的应用提供理论依据。【方法】采用温室盆栽试验,测定盐胁迫下NCD-2菌株对番茄株高、地上部、根部干重和鲜重的影响,并测定抗逆相关酶超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性和脱落酸（ABA）含量;采用高通量测序（Illumina MiSeq）技术测定NCD-2菌株菌悬液处理（NCD0）、100 mmol·L^-1 NaCl处理（CK100）、NCD-2菌株菌悬液+100 mmol·L^-1 NaCl处理（NCD100）和清水处理作为对照（CK0）条件下土壤真菌、细菌群落结构,分析盐胁迫下NCD-2菌株对番茄根际土壤微生物群落结构的影响。 【结果】正常条件下,经NCD-2菌株处理,番茄株高、地上部鲜重、地上部干重、根部鲜重和根部干重分别较对照增加了9.08%、10.37%、16.64%、15.42%和16.78%;在100 mmol·L^-1 NaCl盐胁迫下,经NCD-2菌株处理,番茄株高、地上部鲜重、地上部干重、根部鲜重和根部干重分别较对照增加了16.86%、18.96%、21.32%、10.50%和23.99%。盐胁迫下,经NCD-2菌株处理,番茄体内SOD、POD、CAT活性和ABA含量分别较对照提高了50.45%、56.18%、29.55%和34.60%。细菌群落组成分析表明,在没有盐胁迫的条件下,NCD-2菌株处理后番茄根际放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）和绿弯菌门（Chloroflexi）菌群的相对丰度分别较清水对照（CK0）提高了7.28%、15.14%和23.03%;节杆菌属（Arthrobacter）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、微枝形杆菌属（Microvirga）和链霉菌属（Streptomyces）菌群的相对丰度分别较CK0提高了50.88%、15.31%、11.32%和16.41%。在100 mmol·L^-1 NaCl盐胁迫下,经NCD-2菌株处理,番茄根际变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门、厚壁菌门（Firmicutes）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）菌群的相对丰度分别较单独NaCl处理（CK100）提高了6.08%、8.19%、14.11%和4.70%;节杆菌属、芽孢杆菌属（Bacillus）、鞘氨醇单胞菌属和微枝形杆菌属菌群的相对丰度分别较CK100提高了5.54%、31.80%、23.39%和23.08%。真菌群落组成分析表明,在没有盐胁迫的条件下,NCD-2菌株处理后番茄根际被孢菌门（Mortierellomycota）、球囊菌门（Glomeromycota）和壶菌门（Chytridiomycota）菌群相对丰度分别提高至CK0的186%、477%和1 650%;小被孢霉属（Mortierella）、木霉属（Trichoderma）和光黑壳属（Preussia）菌群分别提高至CK0的186%、108%和120%。在100 mmol·L^-1 NaCl盐胁迫下,NCD-2菌株处理后番茄根际被孢菌门、球囊菌门和壶菌门菌群分别提高至CK100的345%、154%和921%;小被孢霉属较CK100提高了246%。 【结论】盐胁迫环境下NCD-2菌株处理后通过提高番茄体内抗逆相关酶的活性、ABA的含量,增加番茄根际有益微生物的种群数量,从而提高了番茄对盐胁迫的耐受能力,显著促进了番茄的生长发育。
关键词： 枯草芽孢杆菌;盐胁迫;抗氧化酶活性;高通量测序;土壤微生物群落结构

Abstract
【Objective】The objective of this study is to evaluate the growth promotion effect of Bacillus subtilis strain NCD-2 on tomato seedlings under salt stress, as well as the effect of strain NCD-2 on soil microbial community diversity. The results will be useful for expanding the application of strain NCD-2 in agricultural system.【Method】The pot experiments were conducted to evaluate the effects of strain NCD-2 treatment on stem length, aboveground fresh weight, aboveground dry weight, root fresh weight and root dry weight. The activity of resistance-related enzymes such as peroxidase (POD), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and the content of abscisic acid (ABA) were measured. High-throughput sequencing (Illumina MiSeq) technique was used to determine the bacterial and fungal community structures in the rhizosphere soil. The four treatments were set as NCD-2 strain suspension treatment (NCD0), 100 mmol·L ^-1 NaCl treatment (CK100), NCD-2 strain suspension + 100 mmol·L^-1 NaCl treatment (NCD100) and water treatment as control (CK0).【Result】Under normal conditions, strain NCD-2 treatment significantly increased the biomass of tomato. The plant height, aboveground fresh weight, aboveground dry weight, root fresh weight and root dry weight were increased by 9.08%, 10.37%, 16.64%, 15.42% and 16.78%, respectively, when compared with the control. Under salt stress, compared to the control, the plant height, aboveground fresh weight, aboveground dry weight, root fresh weight and root dry weight were increased by 16.86%, 18.96%, 21.32%, 10.50% and 23.99% after treated with strain NCD-2, respectively. The activity of resistance-related enzymes SOD, POD, CAT and the content of ABA were increased by 50.45%, 56.18%, 29.55% and 34.60% after treated with strain NCD-2, respectively, when compared with the control. For bacteria community composition analysis, compared to CK0, the relative abundance of bacteria phylum Actinobacteria, Acidobacteria and Chloroflexi was increased by 7.28%, 15.14% and 23.03% after treated with strain NCD-2 without salt stress, respectively. The relative abundance of bacteria genus Arthrobacter, Sphingomonas, Microvirga and Streptomyces was increased by 50.88%, 15.31%, 11.32% and 16.41% after treated with strain NCD-2, respectively. Under 100 mmol·L ^-1 NaCl stress, compared to CK100, the relative abundance of bacteria phylum Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes and Gemmatimonadetes was increased by 6.08%, 8.19%, 14.11% and 4.70% after treated with strain NCD-2, respectively. The relative abundance of bacteria genus Arthrobacter, Bacillus, Sphingomonas and Microvirga was increased by 5.54%, 31.80%, 23.39% and 23.08% after treated with strain NCD-2, respectively. For fungal community composition analysis, compared to CK0, the relative abundance of fungal phylum Mortierellomycota, Glomeromycota and Chytridiomycota was increased to 186%, 477% and 1 650% of CK0, respectively. The relative abundance of fungal genus Mortierella, Trichoderma and Preussia was increased to 186%, 108%, and 120% of CK0 after treated with strain NCD-2 without salt stress, respectively. Under 100 mmol·L ^-1 NaCl stress, compared to CK100, the relative abundance of fungal phylum Mortierellomycota, Glomeromycota and Chytridiomycota was increased to 345%, 154%, 921% of CK100 after treated with strain NCD-2, respectively. The relative abundance of fungal genus Mortierella was increased by 246% after treated with strain NCD-2.【Conclusion】After the treatment of strain NCD-2 under salt stress, the activity of stress-resistant enzymes and the content of ABA in tomato were increased, and the population of beneficial microorganisms in tomato rhizosphere was increased, thus improving the tolerance of tomato to salt stress and significantly increasing the growth and development of tomato.
Keywords：Bacillus subtilis;salt stress;activity of antioxidant enzymes;high-throughput sequencing;soil microbial community structure


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本文引用格式
邵美琪, 赵卫松, 苏振贺, 董丽红, 郭庆港, 马平. 盐胁迫下枯草芽孢杆菌NCD-2对番茄促生作用及对土壤微生物群落结构的影响. 中国农业科学, 2021, 54(21): 4573-4584 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.21.008
SHAO MeiQi, ZHAO WeiSong, SU ZhenHe, DONG LiHong, GUO QingGang, MA Ping. Effect of Bacillus subtilis NCD-2 on the Growth of Tomato and the Microbial Community Structure of Rhizosphere Soil Under Salt Stress. Scientia Agricultura Sinica, 2021, 54(21): 4573-4584 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.21.008


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0 引言

【研究意义】番茄是我国主要的蔬菜品种,年种植面积约133万公顷,产量约5 500万吨,占蔬菜总量的7%。为追求产量,种植者往往大量施用化肥,致使栽培土壤盐碱化现象逐年加重,抑制了番茄的正常生长^[1]。目前微生物菌剂的施用成为缓解盐胁迫最有效的选择之一^[2,3]。有些植物根际细菌不仅具有防治作物土传病害的能力,同时具有增强植物耐盐性和促进植物生长的效果。评价生防细菌对番茄的耐盐促生效果,揭示生防细菌对根际微生物组的影响,不仅有助于生防菌的广泛应用,同时利于番茄的健康生长。【前人研究进展】接种根际促生菌（PGPR）可有效提高植物的耐盐性,增强植物对非生物胁迫的抗性^[4]。目前报道具有抗逆促生效果的微生物种类有固氮螺菌（Azospirillum）、假单胞菌（Pseudomonas）、伯克霍尔德菌（Burkholderia）、芽孢杆菌（Bacillus）、节杆菌（Arthrobacter）、固氮菌（Azotobacter）和肠杆菌（Enterobacter）^[5,6,7]。接种假单胞菌（Pseudomonas sp.）M30-35通过促进根系的生长和对营养的吸收显著提高了高盐胁迫下多年生黑麦草的生长性能^[8]。接种液化沙雷氏菌（Serratia liquefaciens）KM4通过诱导玉米生物量的提高,增强了其耐盐性^[9]。巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）BOFC15可诱导拟南芥脱落酸（abscisic acid,ABA）的合成,提高了拟南芥的耐盐性,促进拟南芥的光合效能和生长能力^[10]。接种地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）AP6和变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）PB5能产生吲哚乙酸和生物膜,溶解无机磷,提高盐胁迫下向日葵的株高、干物质量、根长等,抵抗盐胁迫造成的危害^[11]。根际细菌可诱导植物抗逆相关酶活性的提高而促进作物的抗逆能力^[11],例如接种圆褐固氮菌（Azotobacter chroococcum）和粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）可提高抗氧化物酶的活性,增加蛋白质、可溶性糖的含量,减少丙二醛、H₂O₂的含量,提高油菜的耐盐性^[12]。大量研究报道,不同微生物菌剂还可改变土壤理化性质,促进作物生长。赵丹丹^[13]研究发现,施用微生物菌剂可降低土壤pH和电导率,使土壤有机质、碱解氮、速效磷、速效钾含量增加,并提高了包括脲酶、过氧化氢酶、蛋白酶、硝酸还原酶在内的土壤酶活性,从而促进番茄的生长。此外,外源施入微生物菌剂后,有益微生物定殖于植物根际,通过改变土壤优势种群而调控整个根际微生物群落结构^[14],达到提高土壤肥力、改善土壤质量的作用,从而调控植物的抗逆促生能力^[15]。王小慧等^[16]利用从土壤中分离得到的西瓜枯萎病拮抗菌将其制成生物肥料,盆栽试验结果表明施用由生防菌制成的生物有机肥能改变土壤中微生物的数量和组成,提高有益细菌、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）在土壤中的比例,同时对真菌的生长有较为明显的抑制作用;黄亚丽等^[17]发现施用枯草芽孢杆菌使设施甜瓜土壤中拟杆菌门（Bacteroidetes）的丰度显著降低,放线菌门（Actinobacteria）和酸杆菌门（Acidobacteria）丰度显著提高,增加了甜瓜株高、茎粗、叶面积,进而促进甜瓜生长;邱勤等^[18]以根瘤菌、联合固氮菌、硅酸盐细菌和巨大芽孢杆菌制成复合菌剂接种于紫花苜蓿后,显著增加了土壤细菌、真菌、放线菌、根瘤菌、硅酸盐细菌和固氮菌数量,且提高了微生物生物碳、氮含量。【本研究切入点】枯草芽孢杆菌NCD-2菌株能有效防治多种作物土传病害,已被广泛应用于番茄移栽前的根际处理。本研究进一步明确NCD-2菌株是否能提高番茄的耐盐促生能力,评价其对根际微生物组的影响。【拟解决的关键问题】评价在盐胁迫的环境下NCD-2菌株对番茄的促生效果,揭示NCD-2菌株对土壤微生物多样性的影响,为生防菌的安全使用和评价提供依据,为设施栽培可持续发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

枯草芽孢杆菌NCD-2菌株在含有30%甘油的LB培养基中于­80℃长期保存,使用前在LB固体培养基上37℃活化。

1.2 菌体制备及对番茄幼苗的处理

将NCD-2菌株在LB培养基中37℃、160 r/min培养过夜,次日按照1:100（体积比）接种量转接到100 mL营养肉汤（NB）培养基中,37℃、180 r/min振荡培养36 h。发酵液经5 000 r/min离心5 min,收集菌体,用无菌水悬浮并调整浓度至1.0×10⁹ cfu/mL,为NCD-2菌株菌悬液。

苗期试验于2019年7—9月份在河北省农林科学院植物保护研究所温室进行,将番茄种子（品种为合作918粉红番茄）用2%次氯酸钠表面消毒3—4 min,无菌水洗涤5遍后,在无菌滤纸上吸干种子表面水分,于25℃培养箱中催芽过夜。将露白的种子播种到装有灭菌蛭石的育苗盘中,待子叶完全展开后选择健康、一致的幼苗,移栽到装有培养基质（土壤:蛭石:草炭=2:2:1,体积比）的花盆（直径8 cm,高度为13 cm）中,每盆16株,3次重复。移栽后在每株番茄根部滴加3 mL NCD-2菌株菌悬液,5 d后再次滴加3 mL/株NCD-2菌株菌悬液,2 d后在每株番茄根部加入100 mL浓度为100 mmol·L^-1的NaCl溶液。番茄于25℃,16 h/8 h光/暗周期培养,NaCl处理2周后测定番茄株高、地上部和根部的干重及鲜重。试验分为4个处理,NCD-2菌株菌悬液处理（NCD0）、100 mmol·L^-1 NaCl处理（CK100）、NCD-2菌株菌悬液+100 mmol·L^-1 NaCl处理（NCD100）、清水处理作为对照（CK0）。

1.3 番茄生长量的测定

番茄苗经100 mmol·L^-1的NaCl溶液处理2周后,用剪刀紧贴培养基质处剪断植株,测量番茄株高（茎基部到生长点的距离）和鲜重;将番茄根轻轻拔出,抖掉根上附着的土壤,再用流水轻轻将根部土壤冲洗掉,用吸水纸吸干水分后测量根部鲜重。将番茄地上部和根部分别烘干至恒重,称量地上部和根部干重。根部抖去与根系松散结合的土壤后,用小毛刷轻轻刷下与根系紧密结合的土壤为根际土壤。称取10 g新鲜根际土样于无菌管中用于微生物组分析,每处理3次重复,并于-80℃保存。

1.4 酶活性及脱落酸（ABA）含量测定

番茄苗经100 mmol·L^-1的NaCl溶液处理2周后取样,每个处理称0.3 g新鲜番茄叶片,干冰速冻于-80℃保存,每处理3次重复,送苏州科铭生物技术有限公司进行酶活性测定。超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定^[19],过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚法测定^[20],过氧化氢酶（CAT）活性采用过氧化氢氧化还原法测定^[21,22],脱落酸含量采用高效液相色谱法测定^[23]。

1.5 土壤微生物多样性分析

每个处理3次重复,分别取10 g根际土壤送交上海美吉生物公司进行微生物多样性分析。

按照FastDNA^TM SPIN Kit for Soil（MP Biomedicals,Solon,OH,USA）试剂盒说明书进行土壤微生物群落总DNA提取。DNA 的纯度和浓度由NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA,USA）进行检测,使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量。使用338F （5′-ACTC CTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTA CHVGGGTWTCTAAT-3′）对16S rRNA基因V3—V4 可变区进行PCR扩增^[24],真菌ITS rDNA的ITS1区采用ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）^[24]进行PCR扩增,扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳进行检测,并对其目标片段进行切胶回收,纯化后利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。原始数据上传至NCBI SRA数据库。使用Trimmomatic软件对原始测序序列进行质控,使用FLASH软件进行拼接,使用UPARSE软件（version 7.1, http://drive5.com/uparse）,根据97%的相似度对序列进行OTU 聚类并剔除嵌合体。利用RDP classifier（ http://rdp.cme.msu.edu/）对每条序列进行物种分类注释,比对Silva数据库（SSU128）和Unite数据库,设置比对阈值为70%。

1.6 数据统计与分析

试验数据采用Microsoft Excel 2010进行整理,IBM SPSS Statistics Version 20进行单因素方差分析,Duncan法进行显著性检验（P<0.05）,采用OriginPro8.6进行绘图。

2 结果

2.1 NCD-2菌株在盐胁迫下对番茄幼苗的促生作用

为评价NCD-2菌株在NaCl胁迫下对番茄生长的影响,分别测定了番茄幼苗株高、地上部鲜重、地上部干重、根部鲜重和根部干重,发现无NaCl胁迫下,NCD-2菌株处理后番茄的株高、地上部鲜重、地上部干重、根部鲜重和根部干重分别较对照提高了9.08%、10.37%、16.64%、15.42%和16.78%,在100 mmol·L^-1 NaCl胁迫下,NCD-2菌株处理后番茄的株高、地上部鲜重、地上部干重、根部鲜重和根部干重分别较对照提高了16.86%、18.96%、21.32%、10.50%和23.99%。同时,在100 mmol·L^-1 NaCl胁迫下,NCD-2菌株处理后株高、地上部鲜重、地上部干重、根部鲜重、根部干重分别恢复到清水对照的103.62%、98.52%、100.60%、82.87%和89.38%（图1）。以上结果表明,在盐胁迫环境下NCD-2菌株对番茄幼苗具有明显促生作用。

图1

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图1NCD-2菌株在NaCl胁迫下对番茄生长的影响

Fig. 1Effects of NCD-2 strain on tomato growth under NaCl stress

2.2 NCD-2菌株对番茄抗逆相关酶活性及脱落酸（ABA）含量的影响

NaCl胁迫下,接种NCD-2菌株后提高了番茄抗逆相关酶的活性和ABA含量,经NCD-2菌株处理番茄叶片中SOD、POD、CAT活性和ABA含量分别较对照提高了50.45%、56.18%、29.55%和34.60%。无NaCl胁迫下,接种NCD-2菌株反而降低了番茄抗逆相关酶活性和ABA含量,与未接种NCD-2相比,接种NCD-2后SOD、POD、CAT活性和ABA含量分别降低了6.00%、20.16%、23.18%和24.20%。在100 mmol·L^-1 NaCl胁迫下,NCD-2菌株处理后,与清水对照相比,POD、SOD、CAT活性和ABA含量分别恢复到清水对照的106.97%、99.35%、96.34%和106.74%（图2）。以上结果表明,在盐胁迫环境下NCD-2菌株促进番茄幼苗抗逆相关酶的活性,进而抵抗盐胁迫的伤害。

图2

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图2番茄抗逆相关酶活性和脱落酸含量

Fig. 2Activity of antioxidant enzymes and ABA content in tomato

2.3 土壤细菌群落结构比较

土壤微生物组测序分析获得细菌有效序列为812 284条,每个样本测序去除低质量序列后,选出与代表序列相似性在97%以上的序列进行主坐标（PCOA）分析。土壤细菌群落在门水平下的PCOA分析（图3-a）可观察到不同处理间的3次重复可以在坐标轴上显著分开,说明不同处理对番茄根际细菌组成影响明显。进一步分析发现,第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）分别可以解释所有变量的61.98%和14.72%,两个主成分方差贡献率累计达到76.70%;属水平下PCOA分析表明（图3-b）,提取到两个主成分,第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）分别可以解释所有变量的38.08%和21.81%,两个主成分方差贡献率累计达到59.89%。

图3

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图3细菌群落结构PCOA分析

a：门水平细菌群落结构PCOA分析 PCOA analysis of bacterial community structure at phylum level;b：属水平细菌群落结构PCOA分析 PCOA analysis of bacterial community structure at genus level
Fig. 3PCOA analysis of bacterial community structure



门水平不同处理土壤细菌群落组成结果表明（图4）,NaCl处理和NCD-2菌株处理后获得的前11个丰度较高的菌群分别为变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、绿弯菌门（Chloroflexi）、厚壁菌门（Firmicutes）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、蓝细菌（Cyanobacteria）、Pateecibacteria、Rokubacteria和尤微菌门（Verrucomicrobia）,其相对丰度分别介于30.37%—32.59%、15.24%—18.23%、11.96%—17.11%、6.62%—9.93%、7.60%—9.35%、4.75%—7.87%、3.36%—4.01%、2.01%—3.20%、1.68%—2.00%、1.27%—1.62%和0.96%—1.51%。其中,NCD-2菌株处理（NCD0）与清水对照（CK0）相比,相对丰度在放线菌门、酸杆菌门和绿弯菌门均高于CK0,平均增幅分别为7.28%、15.14%和23.03%。NaCl胁迫下NCD-2菌株处理（NCD100）与单独NaCl处理（CK100）相比,相对丰度在变形菌门、放线菌门、厚壁菌门和芽单胞菌门显著高于CK100,平均提高了6.08%、8.19%、14.11%和4.70%。

图4

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图4门水平下细菌群落组成相对丰度变化

Fig. 4Changes of relative abundance of bacterial community composition at phylum level



属水平不同处理土壤细菌群落组成的研究结果表明（图5）,NaCl处理和NCD-2菌株处理后获得的前9个丰度较高的菌群分别为节杆菌属、芽孢杆菌属、RB41、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、Pontibacter、微枝形杆菌属（Microvirga）、链霉菌属（Streptomyces）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）和Bryobacter,其相对丰度分别介于2.28%—3.81%、2.39%—3.83%、1.75%—2.37%、1.71%—2.26%、1.63%—2.34%、1.59%—2.08%、0—1.51%、0—1.60%和0—1.39%。其中NCD-2菌株处理（NCD0）与清水对照（CK0）相比,节杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、微枝形杆菌属和链霉菌属菌群相对丰度均高于CK0,分别增加了50.88%、15.31%、11.32%和16.41%。NaCl胁迫下NCD-2菌株处理较单独NaCl处理（CK100）相比,节杆菌属、芽孢杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、微枝形杆菌属和Bryobacter属菌群相对丰度均高于CK100,分别增加了5.54%、31.80%、23.39%、23.08%和10.32%。

图5

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图5属水平下细菌群落组成相对丰度变化

Fig. 5Changes of relative abundance of bacterial community composition at genus level

2.4 土壤真菌群落结构比较

土壤微生物组测序分析获得真菌有效序列为1 176 439条,每个样本测序去除低质量序列后,选出与代表序列相似性在97%以上的序列进行PCOA分析。土壤真菌群落在门水平下的PCOA分析可观察到不同处理间的3次重复可以在坐标轴上显著分开,说明不同处理对番茄根际真菌组成影响明显。进一步分析发现,第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）分别可以解释所有变量的95.00%和1.58%,两个主成分方差贡献率累计达到96.58%（图6-a）;属水平下PCOA分析表明,提取到两个主成分,第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）分别可以解释所有变量的60.31%和17.40%,两个主成分方差贡献率累计达到77.71%（图6-b）。

图6

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图6真菌群落结构PCOA分析

a：门水平真菌群落结构PCOA分析PCOA analysis of fungus community structure at phylum level;b：属水平真菌群落结构PCOA分析PCOA analysis of fungus community structure at genus level
Fig. 6PCOA analysis of fungus community structure



门水平不同处理土壤真菌群落组成的研究结果表明（图7）,NaCl处理和NCD-2菌株处理后获得的前8个丰度较高的菌群分别为子囊菌门（Ascomycota）、被孢菌门（Mortierellomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、球囊菌门（Glomeromycota）、壶菌门（Chytridiomycota）、芽枝菌门（Blastocladiomycota）、油壶菌门（Olpidiomycota）和Entomophthoromycota,其相对丰度分别介于49.45%—84.59%、4.68%—16.14%、2.20%—3.43%、0.22%—1.05%、0.04%—1.29%、0.15%—0.28%、0—0.15%和0—0.26%。其中,与NCD-2菌株处理（NCD0）相比,清水对照（CK0）在被孢菌门、球囊菌门和壶菌门相对丰度较低,降幅分别为46.24%、79.05%和93.94%。与NaCl胁迫下接种NCD-2菌株处理（NCD100）相比,单独NaCl处理（CK100）在被孢菌门、球囊菌门和壶菌门菌群相对丰度较低,降幅分别为71.00%、35.09%和89.15%。

图7

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图7门水平下真菌群落组成相对丰度变化

Fig. 7Changes of relative abundance of fungal community composition at phylum level



属水平下不同处理土壤真菌群落组成的研究结果表明（图8）,NaCl处理和NCD-2菌株处理后获得的前9个丰度较高的菌群分别为曲霉菌属（Aspergillus）、小被孢霉属（Mortierella）、青霉属（Penicillium）、木霉属（Trichoderma）、镰孢菌属（Fusarium）、赤霉菌属（Gibberella）、癣囊腔菌属（Plectosphaerella）、绿僵菌属（Metarhizium）和光黑壳属（Preussia）,其相对丰度分别介于10.13%—34.90%、4.67%—16.14%、5.43%—9.12%、3.66%—8.75%、2.11%—4.86%、0.67%—4.63%、1.07%—2.37%、0.93%—2.40%和0.86%—2.13%。其中,与清水对照（CK0）相比,接种NCD-2菌株（NCD0）后小被孢霉属、木霉属和光黑壳属菌群相对丰度显著增加,增幅分别为86.27%、7.92%和20.34%。与NaCl处理（CK100）相比,NaCl胁迫下NCD-2菌株处理（NCD100）小被孢霉属相对丰度显著提高,为CK100的3.46倍。

图8

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图8属水平下真菌群落组成相对丰度变化

Fig. 8Changes of relative abundance of fungal community composition at genus level

3 讨论

3.1 NCD-2菌株对番茄生物量和抗逆相关酶的影响

土壤盐渍化是设施栽培面临的重要障碍,限制了作物的健康生长。枯草芽孢杆菌NCD-2菌株能有效防治多种土传病害,并且在田间应用过程中对植物表现促生效果。本研究在温室系统评价了NCD-2菌株在NaCl胁迫下对番茄的促生效果,结果表明,NCD-2菌株具有促生效果,并且在100 mmol·L^-1 NaCl胁迫下对番茄的促生效果更明显,说明NCD-2菌株可以缓解NaCl胁迫给番茄造成的抑制。盐渍化抑制植物生长的主要原因之一是增加植物根际的渗透势和离子胁迫^[25,26]。为应对盐胁迫,植物增加体内抗逆相关酶（SOD、POD、CAT）的活性,从而减少植物体内水分和养分的流失、生物量的减少、保护膜脂免受过氧化作用以及减少H₂O₂的合成^[27,28,29]。此外,ABA作为植物重要的激素和信号,主要介导植物保卫细胞的离子通道活性和气孔关闭^[30,31],ABA的合成可以减少离子胁迫带来的伤害。某些植物促生菌可通过诱导植物体内抗性相关酶的活性,从而提高植物的耐盐性。郑娜等^[32]筛选获得4株在盐胁迫下显著促进番茄生长的有益菌,发现在盐胁迫下,4株有益菌能提高番茄体内SOD和POD的活性。某些菌根真菌能提高番茄的耐盐性,HE等^[33]研究发现,在NaCl胁迫下,菌根真菌摩西球囊霉（Glomus mosseae）能促进番茄生长,减少番茄细胞膜的透性,进一步研究发现,菌根真菌通过提高番茄体内SOD、POD和抗坏血酸过氧化物酶（APX）的活性,减少活性氧对细胞的损坏,从而提高了番茄的耐盐性。本研究比较了在100 mmol·L^-1 NaCl胁迫下,NCD-2菌株对番茄体内抗逆相关酶（SOD、POD、CAT）的活性以及ABA含量的影响,结果发现,在盐胁迫下,NCD-2菌株处理后诱导了番茄体内抗逆相关酶的活性,表明提高抗逆相关酶活性是NCD-2菌株提高番茄耐盐性的机制之一。本研究同时发现,在没有盐胁迫下,NCD-2同样具有促生效果,但并没有提高番茄体内抗逆相关酶活性,说明提高抗逆相关酶活性是提高番茄耐盐性的指标,但与番茄促生没有直接相关性。

3.2 NCD-2菌株对土壤微生物菌群的影响

土壤微生物组在调控植物生长、抗逆抗病方面起重要作用^[34,35],微生物组的结构受植物种类以及植物生长状态影响。受到生物和非生物胁迫后,植物可通过调整根际微生物组的结构而缓解胁迫所造成的危害^[36]。通过改变微生物组的结构可影响植物的生长和抗逆性。樊祖清等^[37]研究表明,施用解淀粉芽孢杆菌菌剂改善了烟田土壤微生物结构,增加了有益菌数量,尤其是鞘氨醇单胞菌属的数量,促进烟株吸收根际土壤营养、释放根际分泌物。微生物组包含的微生物种类繁多,其中某些种类组成核心微生物组（core microbiome）,是影响植物生长、稳定微生物组的关键组成,只有改变核心微生物组,才能彻底改变根际微生物组的结构^[33]。QIAO等^[38]研究发现,外源施用生防枯草芽孢杆菌对番茄根际微生物组的改变是短暂的,对细菌多样性的影响仅持续3 d,而对真菌多样性的影响仅持续14 d,表明根际微生物组的结构是相对稳定的。本研究在NCD-2菌株处理14 d后分析了番茄根际微生物的结构,发现NCD-2菌株处理后对根际微生物的结构影响较大。盐胁迫环境下接种NCD-2菌株可以增加节杆菌属、芽孢杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、链霉菌属等细菌数量。芽孢杆菌、链霉菌和鞘氨醇单胞菌均为有益微生物菌群,其中芽孢杆菌可以产生多种抑菌活性物质,抑制病原菌的生长,提高植物的抗病能力。有些芽孢杆菌具有解磷、固氮和产生植物激素的能力,因此,多个以芽孢杆菌为活性成分的微生物菌剂被应用于农业生产中^[39]。链霉菌所产生的链霉素不仅具有抑菌防病的效果,还可以诱导植物产生抗性,是主要的有益微生物菌群之一^[40]。鞘氨醇单胞菌属可维持土壤中各元素循环^[41],稳定土壤功能多样性。ALI等^[41]的研究表明分离到的一株鞘氨醇单胞菌可将安息香转化为苯甲酰胺,通过对叶绿素的调节促进苯甲酰胺胁迫下植物的生长。因此,番茄根际芽孢杆菌、链霉菌和鞘氨醇单胞菌丰度的提高可能是NCD-2菌株提高番茄耐盐性,促进番茄生长的机制之一。在真菌群体结构方面,根际施用NCD-2菌株显著增加了小被孢霉属和木霉属真菌的丰度,其中木霉是一类植物有益真菌,具有防病和促生的功能,EL-LAITHY等^[42]研究表明,木霉菌处理可以提高花生SOD、APX、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性,从而提高花生在对黑曲霉（Aspergillus niger）的抗性。NCD-2菌株处理后减少了曲霉菌属、青霉菌属和镰孢菌属真菌的丰度,其中镰孢菌属中的一些种,例如尖镰孢（Fusarium oxysporum）能引起作物枯萎病,从而影响作物的健康生长。因此,增加有益真菌数量,降低有害真菌数量,可能是NCD-2菌株提高番茄耐盐性、促进生长的机制之一。

4 结论

盐胁迫环境下枯草芽孢杆菌NCD-2菌株处理后通过提高番茄体内抗逆相关酶的活性和脱落酸的含量,增加番茄根际有益微生物的种群数量,从而提高了番茄对盐胁迫的耐受能力,显著增强了番茄的生长发育。

（责任编辑 岳梅）

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