叶方婷^,, 潘鑫峰, 毛志君, 李兆伟, 范凯^,*福建农林大学农学院/作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室,福州 350002

Molecular Evolution and Function Analysis of bZIP Family in Nymphaea colorata

YE FangTing^,, PAN XinFeng, MAO ZhiJun, LI ZhaoWei, FAN Kai^,*College of Agriculture, FuJian Agriculture and Forestry University/Key Laboratory of Ministry of Education for Genetics, Breeding and Multiple Utilization of Crops, Fuzhou 350002

通讯作者: 范凯,E-mail： fankai@fafu.edu.cn

责任编辑: 赵伶俐
收稿日期:2021-01-18接受日期:2021-06-28

基金资助:

国家自然科学基金(31701470) 中国博士后基金(2017M610388) 中国博士后基金(2018T110637) 福建农林大学****科研人才计划(xjq201917) 福建农林大学科技创新专项基金(CXZX2020007A) 福建省自然科学基金(2021J01073)

Received:2021-01-18Accepted:2021-06-28
作者简介 About authors
联系方式：叶方婷,E-mail： fangtingye@163.com。







摘要
【目的】基于睡莲基因组鉴定睡莲bZIP（basic leucine zipper）家族成员,并对其进行分析,以揭示睡莲bZIP家族的分子进化和功能。【方法】从Waterlily Pond数据库获取睡莲基因组序列,利用HMMER3.0程序识别睡莲的bZIP家族成员,并使用CDD程序进一步确认其含有的保守bZIP结构域,使用IQ-tree软件构建系统进化树。利用ExPASy和SOPMA在线网站进行蛋白质结构分析,通过MEME程序进行保守基序分析,使用MCScan和Circos软件对基因复制事件进行分析以及可视化展示。从NCBI下载睡莲转录组数据（SRA Study：SRP222853）,用R软件对睡莲bZIP家族成员表达数据的Pearson相关系数（PCC）进行计算和可视化分析,使用Cytoscape软件对NcbZIP成员之间的表达数据关系进行分析。【结果】从睡莲基因组中共鉴定出46个bZIP家族成员,按成员在染色体上的分布命名为NcbZIP01—NcbZIP46。根据系统进化分析可以将睡莲bZIP家族成员分为A、B、C、D、E、G、H、I、J和S共10个亚家族,其中A亚家族所含成员最多（11个）,相同亚家族成员具有相似的保守结构域和基因结构。理化性质分析表明,睡莲bZIP家族成员蛋白质长度介于101—1 898 aa,分子量大小介于12.04—214.64 kD。染色体定位分析发现,睡莲共有14条染色体,46个bZIP家族成员不均匀地分布在其中的10条染色体上,其中1号染色体上分布最多。睡莲bZIP基因家族发生10个复制事件,其中9个片段复制事件,1个串联复制事件,A亚家族所含基因复制事件最多（3次）。对NcbZIP成员在不同组织下的表达进行分析,根据表达情况分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组,Ⅰ组成员在所有组织中均高度表达,Ⅱ组成员几乎在所有组织中均不表达,Ⅲ组成员在不同组织中表达水平各不相同,其中C、D和G亚家族的大部分成员集中在Ⅲ组。通过睡莲bZIP成员表达量的Pearson相关系数分析,发现NcbZIP45与所有NcbZIP成员之间的相关性最高。【结论】在睡莲基因组中鉴定出46个bZIP成员,分为10个亚家族,不均匀地分布在14条染色体上,结构进化保守,组织表达模式多样。
关键词： 睡莲;bZIP家族;分子进化;表达谱;功能分析

Abstract
【Objective】The genome-wide analysis of the bZIP family in Nymphaea colorata was used to identify the bZIP (basic leucine zipper) family members in waterlily, and then which were further analyzed. This study revealed molecular evolution and function of the bZIP family in waterlily.【Method】The genome sequence of N. colorata was downloaded from Waterlily Pond database. The bZIP members in waterlily were identified by using HMMER 3.0 program, and the conserved bZIP domain was verified by using CDD program. The phylogenetic tree was constructed by the IQ-tree software. The ExPASy and SOPMA online website were performed to analyze protein structure characters. The conserved motifs were identified by using MEME program. The gene duplication events were found and visualized by the MCScan and Circos software. Transcriptome data of NcbZIP members were obtained from the NCBI website (SRA Study: SRP222853). The Pearson Correlation Coefficient (PCC) about the expression levels of the NcbZIP family members was calculated by using R software, and the network of the expression levels in the NcbZIP family was analyzed by using Cytoscape software.【Result】46 bZIP members were identified in N. colorata, and were named from NcbZIP01 to NcbZIP46 according to their chromosome distributions. The A subfamily contained the most NcbZIP members (11 NcbZIPs). There were 10 subfamilies (A, B, C, D, E, G, H, I, J and S) according to the phylogenetic analysis. The protein length in the NcbZIP family was from 101 aa to 1 898 aa, and the molecular weight ranged from 12.04 kD to 214.64 kD. The NcbZIP members from same subfamily had the similar distributions of the conserved motifs and gene structures. Waterlily had 14 chromosomes, and 46 NcbZIP members were unevenly distributed across 10 chromosomes. Chromosome 1 had the highest number of NcbZIP members. There were 10 gene duplication events in the NcbZIP family, including nine segmental duplication events and one tandem duplication event. The A subfamily had the most number of the gene duplication events (three). Based on the expression patterns in different tissues, the NcbZIP family could be divided into three groups (I, II and III). The NcbZIP members in Group I were highly expressed in all tissues, while the NcbZIP members in group II were not expressed in almost all tissues. The NcbZIP members in group III had tissue-specific expression profiles, and most of NcbZIP members in C, D and E subfamilies belonged to group III. The PPC analysis about the expression levels of NcbZIP members indicated NcbZIP45 had the highest connection with other members.【Conclusion】46 NcbZIP members were identified in Nymphaea colorata, and were unevenly distributed in 14 chromosomes. The NcbZIP family could be divided into 10 subfamilies with conserved motifs distributions and diverse expression levels. The current study could lay the foundation on the functional analysis of the bZIP family in N. colorata.
Keywords：Nymphaea colorata;bZIP family;molecular evolution;expression profile;function analysis


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本文引用格式
叶方婷, 潘鑫峰, 毛志君, 李兆伟, 范凯. 睡莲转录因子bZIP家族的分子进化以及功能分析. 中国农业科学, 2021, 54(21): 4694-4708 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.21.018
YE FangTing, PAN XinFeng, MAO ZhiJun, LI ZhaoWei, FAN Kai. Molecular Evolution and Function Analysis of bZIP Family in Nymphaea colorata. Scientia Agricultura Sinica, 2021, 54(21): 4694-4708 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.21.018


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0 引言

【研究意义】睡莲是基部被子植物,对植物进化的研究具有重要意义。睡莲基因组的破译,揭示了睡莲科植物与十字花科植物之间的分化时间大约为147—185百万年前,基因组共线性分析为睡莲发生全基因组复制事件提供了证据^[1],这有助于解析睡莲中基因家族的分子进化研究。【前人研究进展】在植物界中,转录因子bZIP（basic leucine zipper）是一类包含众多成员的家族^[2,3]。bZIP家族包含两个保守的功能结构域,一个是由16个氨基酸残基组成的基本碱性区域,另一个是由1个七肽重复的亮氨酸或其他质量较大的疏水氨基酸组成的亮氨酸拉链二聚体基序区域^[4,5],bZIP家族在植物胁迫应答、生物合成等方面发挥重要作用^[6,7,8]。转录因子bZIP家族与植物生长发育有密切关系。在橄榄（Olea europaea L.）中,OebZIP在果实快速积油期高度表达,通过比较油分积累的动态变化,发现4个与橄榄果实发育和油脂合成密切相关的基因,说明橄榄bZIP成员可能参与果实的发育和脂质的合成^[9]。转录因子bZIP家族在物质积累和胁迫应答过程中也发挥着重要作用。在花生中,发现bZIP家族中G亚家族成员AdbZIP15、AdbZIP19和AibZIP17可能具有抗盐胁迫的能力^[10]。对菠萝转录因子bZIP家族的全基因组分析鉴定以及表达谱分析,发现AcobZIP57在所有组织中均表达上调;对菠萝的根和地上部进行抗盐、干旱、冷和热胁迫处理后发现,部分bZIP转录因子在植物遭受胁迫一段时间后也出现上调表达^[11]。此外,bZIP成员可能参与许多生物代谢过程。通过对亚洲棉和雷蒙德士棉bZIP蛋白的功能进行GO分析预测,发现bZIP成员可能参与有机物代谢过程、初级代谢过程、细胞代谢过程的调节和氮化合物代谢过程等^[12]。另外,在柳枝菊中也进行了全基因组分析,并对bZIP可能参与的表达和功能进行了预测^[13]。【本研究切入点】目前未见对睡莲bZIP家族的研究,本研究利用全基因组分析的方法对睡莲bZIP家族分子进化及功能进行探索。【拟解决的关键问题】本研究通过构建系统发育树对睡莲与拟南芥bZIP家族同源关系进行比较基因组学研究,进而对睡莲bZIP成员基因结构、保守基序和基因复制事件进行分析,揭示bZIP成员的分子进化历程,同时通过分析睡莲中bZIP成员表达量、启动子元件等,为阐明睡莲转录因子bZIP家族的功能奠定一定的基础。

1 材料与方法

试验于2020—2021年在福建农林大学农学院作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室进行。

1.1 转录因子bZIP家族成员的鉴定和系统发育分析

从Waterlily Pond数据库（ http://waterlily.eplant.org）获取睡莲基因组序列,随后使用HMMER3.0程序进行HMM搜索,从Pfam数据库（ https://pfam.xfam.org/）中获得bZIP结构域的HMM模型（PF00170）,用以识别睡莲的bZIP成员。拟南芥的bZIP成员主要从TAIR数据库中下载获得（ https://www.arabidopsis.org/）。所有的bZIP成员均使用CDD（ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）程序,进一步确保每一个候选基因均含有保守的bZIP结构域。

采用MAFFT v7.453对所有bZIP序列进行氨基酸序列比对分析,然后使用IQ-tree v2.0.7软件构建系统发育树,应用ModelFinder程序选择最佳模型,bootstrap值设置为1 000。使用MEGA v10.1.8软件对系统发育树进行可视化分析,并使用在线工具ExPASy网站（ http://web.expasy.org/protparam/）和SOPMA网站（ http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）对睡莲bZIP成员的一级结构和二级结构进行分析。

1.2 睡莲中转录因子bZIP家族序列分析

拟南芥和睡莲bZIP成员的保守基序通过在线工具MEME（ http://meme-suite.org/tools/meme）进行鉴定,设置参数与前人研究类似^[14]。从Waterlily Pond数据（ http://waterlily.eplant.org）中下载睡莲bZIP成员的注释文件,从中提取基因结构和染色体位置信息,并通过使用TBtools v1.068软件对保守基序、基因结构和染色体定位信息进行可视化展示。

本研究从睡莲基因组数据库中提取NcbZIP成员上游的2 000 bp序列,用PlantCARE数据库（ http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）确定NcbZIP成员启动子中顺式调控元件,最后使用TBtools v1.068软件进行可视化分析。

1.3 睡莲bZIP成员基因复制事件分析

使用MCScan（ https://github.com/tanghaibao/jcvi/wiki/MCscan-Python version）软件对NcbZIP成员的基因复制事件进行分析,基因复制关系使用Circos v0.67软件进行可视化展示。利用TBTools v1.068软件估计非同义替换率（Ka）、同义替换率（Ks）及其比值（Ka/Ks）。

1.4 睡莲bZIP成员的表达分析

本研究从NCBI数据库（ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载了睡莲不同组织（成熟叶、幼叶、成熟茎、幼茎、花、萼片和心皮）的RNA-seq转录组数据（SRA Study：SRP222853）,下载的RNA-Seq数据主要通过之前的转录组数据处理方法进行数据分析^[15]。睡莲中bZIP成员的表达水平通过FPKM值进行log₂（FPKM+1）转换获得。在RStudio中使用ComplexHeatmap v2.4.2软件包对NcbZIP成员的表达水平进行聚类分析,同时使用ggcorrplo v0.1.3软件包对NcbZIP成员之间表达数据的Pearson相关系数（PCC）进行计算和可视化分析,并利用Cytoscape v3.7.2软件对NcbZIP成员之间的表达数据网络图进行分析。

2 结果

2.1 睡莲中bZIP成员的鉴定与系统发育分析

在睡莲中共鉴定出46个bZIP成员,根据其在染色体上的位置,将其命名为NcbZIP01-NcbZIP46。根据前人对拟南芥的研究结果进行分类^[13],可以将睡莲的46个bZIP成员共分为10个亚家族,并命名为A、B、C、D、E、G、H、I、J和S（图1）。在睡莲bZIP家族中,A亚家族和D亚家族的bZIP成员数量最多,分别有11个成员和7个成员;在I亚家族中有6个成员,S亚家族和G亚家族有相同的成员数量（5个）;C、E、H、B和J五个亚家族分别只有4、3、2、2和1个bZIP成员,而在F亚家族中没有发现睡莲bZIP成员。

图1

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图1拟南芥和睡莲bZIP家族的系统发育分析

Fig. 1Phylogenetic analysis of the bZIP family in Arabidopsis thaliana and Nymphaea colorata



睡莲bZIP成员的蛋白质长度介于101 aa（NcbZIP43）—1 898 aa（NcbZIP13）;分子量大小12.04 kD（NcbZIP43）—214.64 kD（NcbZIP13）;其中,B亚家族成员的平均蛋白质长度（774 aa）和分子量（84.17 kD）最大,H亚家族成员的平均蛋白质长度（167 aa）和分子量（18.57 kD）最小。在睡莲bZIP家族成员中,有一半的pI小于7.0,最低达4.79;另一半pI值大于7.0,最高可达9.92（表1）。

Table 1
表1
表1本研究中NcbZIP成员的鉴定及结构分析
Table 1The identification and structural analysis of NcbZIP members in this study

名称 Name	位点名称 Locus name	亚家族 Subfamily	蛋白质长度 Protein length (aa)	分子量 Molecular weight (kD)	理论pI Theoretical pI	α-螺旋 α -helix	延伸链 Extended strand	β-折叠 β -turn	无规则卷曲 Random coil
NcbZIP01	GWHPAAYW000832	D	418	46.54	6.09	215	19	9	175
NcbZIP02	GWHPAAYW000931	G	537	59.56	9.08	200	46	16	275
NcbZIP03	GWHPAAYW000954	A	425	45.47	9.24	155	44	25	201
NcbZIP04	GWHPAAYW000981	D	564	62.21	7.12	260	47	19	238
NcbZIP05	GWHPAAYW001299	C	415	44.86	6.11	164	6	5	240
NcbZIP06	GWHPAAYW001709	J	377	41.80	5.40	151	67	22	137
NcbZIP07	GWHPAAYW002908	A	336	37.46	7.80	115	19	5	197
NcbZIP08	GWHPAAYW002911	A	336	37.46	7.80	115	19	5	197
NcbZIP09	GWHPAAYW002993	D	461	50.44	7.20	242	30	7	182
NcbZIP10	GWHPAAYW003042	B	792	86.18	5.84	179	94	28	491
NcbZIP11	GWHPAAYW003339	E	266	29.16	6.15	107	16	10	133
NcbZIP12	GWHPAAYW011330	S	152	17.55	5.91	98	5	2	47
NcbZIP13	GWHPAAYW014950	S	1898	214.64	9.00	712	280	94	812
NcbZIP14	GWHPAAYW015527	A	167	18.44	9.48	87	22	5	53
NcbZIP15	GWHPAAYW015722	I	428	47.31	6.74	145	17	11	255
NcbZIP16	GWHPAAYW015723	I	217	23.98	9.92	72	37	9	99
NcbZIP17	GWHPAAYW019618	E	450	49.50	5.62	147	27	16	260
NcbZIP18	GWHPAAYW020485	S	160	18.11	5.48	94	6	4	56
NcbZIP19	GWHPAAYW020561	I	372	40.4	5.69	154	21	13	184
NcbZIP20	GWHPAAYW021201	H	166	18.22	9.90	76	7	0	83
NcbZIP21	GWHPAAYW021532	C	385	40.82	8.58	164	8	5	208
NcbZIP22	GWHPAAYW025680	A	310	34.00	5.30	110	24	6	170
NcbZIP23	GWHPAAYW025682	D	178	20.14	9.19	79	21	1	77
NcbZIP24	GWHPAAYW025732	A	488	51.90	9.37	141	55	17	275
NcbZIP25	GWHPAAYW025769	A	149	16.94	9.52	78	16	16	39
NcbZIP26	GWHPAAYW026086	D	429	46.68	7.70	211	30	15	173
NcbZIP27	GWHPAAYW026335	S	195	22.17	5.82	105	10	2	78
NcbZIP28	GWHPAAYW026612	G	371	39.05	8.48	118	27	9	217
NcbZIP29	GWHPAAYW026862	B	755	82.16	5.57	147	90	21	497
NcbZIP30	GWHPAAYW027461	G	298	30.89	4.79	94	19	6	179
NcbZIP31	GWHPAAYW027688	I	541	59.03	6.30	183	22	12	324
NcbZIP32	GWHPAAYW028327	A	268	30.70	6.11	132	30	5	101
NcbZIP33	GWHPAAYW004093	A	462	49.89	7.11	124	55	14	269
NcbZIP34	GWHPAAYW004840	A	362	40.15	6.13	143	24	10	185
NcbZIP35	GWHPAAYW004844	D	364	40.64	7.00	227	21	8	108
NcbZIP36	GWHPAAYW004881	G	283	32.04	8.68	147	54	24	58
NcbZIP37	GWHPAAYW005079	H	168	18.92	6.64	78	7	6	77
NcbZIP38	GWHPAAYW005229	E	452	49.64	5.71	162	33	9	248
NcbZIP39	GWHPAAYW005452	S	169	18.77	5.53	103	5	2	59
NcbZIP40	GWHPAAYW005509	I	355	38.40	5.68	145	28	11	171
NcbZIP41	GWHPAAYW005714	G	545	60.52	8.75	175	66	22	282
NcbZIP42	GWHPAAYW005783	C	410	44.35	5.67	153	36	17	204
NcbZIP43	GWHPAAYW005814	A	101	12.04	8.96	81	4	0	16
NcbZIP44	GWHPAAYW005854	D	511	56.99	7.75	245	23	19	224
NcbZIP45	GWHPAAYW009588	I	334	36.76	7.01	137	19	13	165
NcbZIP46	GWHPAAYW028567	C	264	28.72	6.13	119	10	7	128

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2.2 睡莲bZIP成员保守基序分析

本研究在睡莲bZIP成员中共鉴定到20个保守基序,大部分睡莲bZIP成员都含有Motif 1和Motif 7（图2）。对各组所含基序进行统计分析,发现D亚家族和I亚家族所含保守基序的种类最多,有7种保守基序;H亚家族和J亚家族的保守基序种类最少,均只有2种。此外,本研究还发现一些亚家族所特有的基序,如Motif 4、Motif 5、Motif 18和Motif 20为D亚家族所特有,Motif 11、Motif 15和Motif 17只在B亚家族中发现,Motif 16和Motif 19为E亚家族和I亚家族所共有。

图2

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图2睡莲中bZIP家族保守基序（左）与基因结构（右）的鉴定

Fig. 2Identification of conserved motif (left) and gene structure (right) in the NcbZIP family

2.3 睡莲bZIP成员的基因结构分析

最复杂的基因结构出现在NcbZIP13成员（含有16个外显子和15个内含子）,最简单的基因结构出现在NcbZIP12成员（仅含有1个外显子,没有内含子）。D亚家族的基因结构最为复杂,平均每个基因含有10个外显子;其次是G亚家族,每个基因平均有7个外显子;最简单的基因结构出现在S亚家族,除了NcbZIP13外,大部分成员仅含有1个外显子。

2.4 睡莲bZIP成员的染色体定位分析

睡莲共有14条染色体,而46个NcbZIP成员分布在睡莲10条染色体上,4、7、12和14号染色体上没有发现任何睡莲NcbZIP成员（图3）。在睡莲中,不同染色体含有不同数目的NcbZIP成员。睡莲1号和10号染色体上分布较多的NcbZIP成员,分别有11个和8个NcbZIP成员;在2号和13号染色体上分布较少的NcbZIP成员,均只有1个NcbZIP成员。在1号染色体的上端和下端均发现NcbZIP成员的聚集现象,在8号染色体的下端、10号染色体的下端和11号染色体的上端也发现NcbZIP成员的聚集现象。

图3

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图3睡莲bZIP成员的染色体定位

Fig. 3Chromosomal localization of bZIP members in waterlily

2.5 睡莲bZIP成员的基因复制事件分析

在睡莲bZIP家族中共鉴定出10个基因复制事件,其中有9个片段复制事件（NcbZIP04/NcbZIP44、NcbZIP02/NcbZIP41、NcbZIP22/NcbZIP34、NcbZIP14/ NcbZIP25、NcbZIP05/NcbZIP21、NcbZIP18/NcbZIP39、NcbZIP17/NcbZIP38、NcbZIP03/NcbZIP43和NcbZIP19/ NcbZIP40）和1个串联复制事件（NcbZIP15/NcbZIP16）（图4-A）。不同亚家族含有不同数目的基因复制事件,在A亚家族中有3个复制基因事件,在I亚家族中有2个复制基因事件,而在C、D、E、G和S亚家族中均只有1个复制基因事件（图4-B）。随后对这些复制基因事件的Ka和Ks进行分析,通过计算NcbZIP复制基因对的同义替换率分布,发现其约在1.108处Ks达到峰值（图4-C）。所有NcbZIP复制基因对的Ka/Ks比值均小于1（表2）,因此,以上所有复制基因对都经过纯化选择作用。此外,在睡莲的bZIP家族中,发生串联复制事件基因对的Ks值基本小于发生片段复制事件的基因对。

图4

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图4睡莲bZIP复制基因的共线性分析和Ks分布

A：睡莲bZIP复制基因的共线性分析;B：睡莲bZIP复制基因的亚家族分布;C：睡莲bZIP复制基因的Ks分布,箭头指向Ks峰值
Fig. 4Syntenic analysis and Ks distribution of the duplicated bZIP members in Nymphaea colorata

A: Syntenic analysis of the duplicated bZIP members in Nymphaea colorata; B: Subfamily distribution of the duplicated bZIP members in waterlily; C: Ks distribution of the duplicated bZIPs in waterlily, the arrow points topeak value of Ks


Table 2
表2
表2睡莲复制的NcbZIP成员的Ka和Ks分析
Table 2Ka and Ks analysis for the duplicated NcbZIP in N. colorata

复制基因1 Duplicated gene 1	复制基因2 Duplicated gene 2	亚家族 Subfamily	Ka Ka	Ks Ks	Ka/Ks Ka/Ks	纯化选择 Purifying selection	复制类型 Duplicated type
GWHPAAYW001299	GWHPAAYW021532	C	0.32	1.24	0.26	Yes	Segmental duplication 片段复制
GWHPAAYW000931	GWHPAAYW005714	G	0.36	0.95	0.38	Yes	Segmental duplication 片段复制
GWHPAAYW000954	GWHPAAYW005814	A	0.53	2.19	0.24	Yes	Segmental duplication 片段复制
GWHPAAYW000981	GWHPAAYW005854	D	0.11	0.78	0.15	Yes	Segmental duplication 片段复制
GWHPAAYW015527	GWHPAAYW025769	A	0.61	1.84	0.33	Yes	Segmental duplication 片段复制
GWHPAAYW020485	GWHPAAYW005452	S	0.09	1.29	0.07	Yes	Segmental duplication 片段复制
GWHPAAYW020561	GWHPAAYW005509	I	0.20	1.04	0.19	Yes	Segmental duplication 片段复制
GWHPAAYW019618	GWHPAAYW005229	E	0.22	1.29	0.17	Yes	Segmental duplication 片段复制
GWHPAAYW025680	GWHPAAYW004840	A	0.22	1.61	0.14	Yes	Segmental duplication 片段复制
GWHPAAYW015722	GWHPAAYW015723	I	0.28	0.96	0.30	Yes	Tandem duplication 串联复制

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2.6 睡莲bZIP家族的顺式调控元件分析

顺式调控元件中的光反应、植物激素和高温/低温胁迫等调控元件在植物胁迫应答方面起着重要作用^[16]。本研究通过PlantCARE数据库分析获得的睡莲NcbZIP成员的顺式调控元件,其中包括生长素响应元件、水杨酸响应元件、赤霉素响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、低温响应元件、ABA响应元件、防御和应激响应元件以及MYB结合位点（图5）。其中,茉莉酸甲酯响应元件数量最多,存在于每个NcbZIP成员中;ABA响应元件和茉莉酸甲酯响应元件几乎占所发现顺式调控元件的一半以上,其中几乎有一半分布在A、D和G亚家族中;防御和应激响应元件相对较少,在46个睡莲bZIP成员中只发现14个防御和应激响应元件。在B亚家族中生长素响应元件最多,E亚家族含有最多的顺式调控元件是ABA响应元件。

图5

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图5NcbZIP启动子区域的胁迫响应调节元件分析

Fig. 5Stress-responsive regulatory elements in the promoter regions of NcbZIP members

2.7 睡莲bZIP成员在不同组织中的表达分析

对睡莲NcbZIP成员在成熟叶、幼叶、成熟茎、幼茎、花、雄蕊、萼片和心皮中表达情况进行分析,通过基因表达聚类分析可以将睡莲NcbZIP成员大致分为3个组（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ）（图6）。在Ⅰ组中,14个NcbZIP成员几乎在所有组织中均高度表达。在Ⅱ组中,13个NcbZIP成员几乎在所有组织中均不表达;在Ⅲ组中,19个成员在不同组织中表达水平各不相同,具有一定的组织特异性,例如,NcbZIP20在成熟叶和成熟茎的表达量最高,NcbZIP04仅在花中高表达,而NcbZIP27在雄蕊中具有明显的高表达。此外,大部分的D亚家族成员集中分布在Ⅲ组,该亚家族在花中均有较高的表达,C亚家族和G亚家族的大部分成员也集中分布在Ⅲ组。

图6

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图6睡莲bZIP成员在不同组织中的表达模式

Fig. 6Expression patterns of NcbZIP members in different tissues



本研究根据表达量计算出睡莲NcbZIP成员之间的Pearson相关系数（PCC）（图7）,发现在10个发生基因复制事件的基因对中,有9对基因对呈正相关关系,1对基因对（NcbZIP14和NcbZIP25）呈负相关关系。随后对不同亚家族成员的相关性进行分析,发现E亚家族3个成员（NcbZIP11、NcbZIP17和NcbZIP38）之间的相关系数高达0.707,其次是D亚家族成员的相关系数较高（0.444）。此外,本研究对成员之间的相关性进行了研究,发现NcbZIP45与所有NcbZIP成员间的相关性最高,其次为NcbZIP24。对PCC大于0.5的44对成员进行分析,发现NcbZIP45与其中21个成员均有较高的相关性（图8）。

图7

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图7睡莲bZIP家族表达谱的PCC热图

Fig. 7Heat map of PCC about the expression profiles of the bZIP family in N. colorata

图8

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图8睡莲bZIP家族成员网络关系图

Fig. 8The network of the bZIP family in N. colorata

3 讨论

bZIP家族在植物生长发育、干旱胁迫、盐胁迫、高温胁迫等生物学过程中发挥着重要的作用^{[17,18,19,20,21]}。本研究在睡莲中共鉴定了46个转录因子bZIP成员,而在水稻中鉴定出89个bZIP成员^[22,23],在大豆中鉴定出160个bZIP家族成员^[24],其中,睡莲的基因组大小为409 Mb^[1],水稻基因组大小是466 Mb^[25],大豆的基因组大小为1 100 Mb^[26]。睡莲是古老且保守的植物,所含的bZIP成员数量相对较少,可能与其基因组大小有关。此外,在bZIP家族系统发育分析中,睡莲bZIP家族的A亚家族和D亚家族所含成员数最多,其次为I亚家族,而在J亚家族中成员数量最少,在拟南芥、水稻、棉花中也有类似的分布^[27],这表明植物中bZIP家族的亚家族分布具有一定的保守性。睡莲bZIP家族中共发现10个基因复制事件,不同亚家族发生基因复制事件数不同,因此,基因复制事件在不同亚家族中发生的频率不同可能是导致各亚家族之间成员数量产生差异的原因之一,相似的结果也出现在荞麦bZIP转录因子家族^[28]。另外,在睡莲bZIP家族中,相同bZIP亚家族具有相似的保守基序分布和基因结构分布,这与bZIP家族成员的系统发育分析结果类似。

通过MCScan软件分析bZIP成员的基因复制事件,发现A亚家族的基因复制事件发生的最多,这可能是导致其亚家族成员数量较多的原因之一,相似的研究结果也出现在番茄、土豆等植物的bZIP家族^[29,30]。对基因复制事件的Ks值进行计算,发现大部分基因复制事件的Ks值集中在1.108附近,由此推测NcbZIP成员的基因复制事件发生在睡莲全基因组复制事件中。此外,在睡莲bZIP家族中,串联复制事件的Ks值几乎比所有片段复制事件的Ks值小,说明串联复制事件发生的时间是在片段复制事件后,这表明在睡莲中大规模发生的片段复制事件可能早于小规模发生的串联复制事件。与此同时,在睡莲bZIP家族中,有9个片段复制事件和1个串联复制事件,说明在睡莲bZIP家族的扩增中,片段复制事件是bZIP成员扩增的主要原因。此外,所有基因复制事件的Ka/Ks值均小于1,说明所有基因复制事件都经历纯化选择作用,且大部分复制基因对的PCC值都大于0,即呈正相关性,类似的现象也出现在大豆PP2C（蛋白磷酸酶2C）家族^[31]、玉米NAC家族^[14]、棉花KUP家族^[32]等作物。

本研究对睡莲bZIP成员启动子的顺式调控元件进行分析,发现NcbZIP成员的启动子区域中含有最多的响应元件为茉莉酸甲酯响应元件,其次是ABA响应元件,表明NcbZIP成员可能受到茉莉酸甲酯和ABA的调控。在前人的研究中发现,棉花bZIP家族的A亚家族成员GhABF2通过ABA介导可提高植株的抗旱性和耐盐性^[33];在拟南芥A亚家族中,植株受脱落酸和非生物胁迫时,可通过ABA响应元件来诱导bZIP的表达^[4];脱落酸和茉莉酸甲酯是影响植物生长发育和逆境响应的主要信号分子,可以参与植物多种生理过程^{[34,35,36,37,38,39]}。在甘蔗中,曾发现ABA和茉莉酸甲酯调控了8个甘蔗bZIP成员的表达^[40]。由此推测,睡莲的A亚家族成员在ABA或应激信号传导中可能具有重要作用。对转录组数据进行分析,发现睡莲bZIP成员在成熟叶、幼叶、成熟茎、幼茎、花、雄蕊、萼片和心皮的表达可大致分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组。其中,A亚家族一半的成员和E亚家族的3个成员集中出现在Ⅱ组中,它们在所有组织中均不表达;在甘薯转录因子bZIP家族的鉴定分析中,E亚家族的大部分成员在花中也不表达^[41]。来自于D亚家族的NcbZIP23在花和雄蕊中有较高的表达,与其相同亚家族的拟南芥bZIP成员AT1G08320和AT5G06839参与花药的发育^[42];此外在S亚家族中,除NcbZIP13外,其余成员均在雄蕊和心皮中有较高的表达,表明D和S亚家族的成员可能与花器官的发育有关。在对NcbZIP成员表达量的PCC分析发现,NcbZIP45与其他NcbZIP成员的表达谱之间具有高度的正相关性,其在拟南芥的同源基因AtVIP1（AT1G43700）可以通过ABA调控植株的耐旱性^[43],其在水稻中的同源基因LOC_Os11g06170可以调控茉莉酸代谢和信号传导通路的相关基因^[44],而NcbZIP45的启动子元件中含有茉莉酸甲酯响应元件最多,其次是ABA响应元件,表明NcbZIP45可能具有通过ABA和茉莉酸甲酯介导调控睡莲非生物胁迫响应的功能。

4 结论

本研究在睡莲中共获得46个NcbZIP成员,可以将46个NcbZIP成员进一步分为10个亚家族,相同亚家族成员具有保守的基因结构和保守的基序分布;在睡莲中,4号、7号、12号和14号染色体上没有任何睡莲bZIP成员的存在,NcbZIP成员在其他10条染色体上存在不均匀分布;片段复制事件对睡莲bZIP家族的扩增起主要作用;睡莲bZIP成员启动子区中含有最多的茉莉酸甲酯和ABA响应元件;组织特异性表达分析发现各个NcbZIP成员在不同的组织中表达不同,NcbZIP45可以作为睡莲育种中一个具有潜在应用价值的重要候选基因。

（责任编辑 赵伶俐）

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