李宇^,1, 汪芳¹, 翁泽斌², 宋海昭^,1, 沈新春^,11南京财经大学食品科学与工程学院/江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心/江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室,南京 210023
²南京中医药大学中医学院/中西医结合学院,南京 210000

Preparation of Soybean Protein-Derived Pro-osteogenic Peptides via Enzymatic Hydrolysis

LI Yu^,1, WANG Fang¹, WENG ZeBin², SONG HaiZhao^,1, SHEN XinChun^{,1 1}College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics/Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety/Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing, Nanjing 210023
²College of Traditional Chinese Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210000

通讯作者: 宋海昭,Tel：18806508653;E-mail： songhaizhaothu@nufe.edu.cn; 沈新春,Tel：13675121836;E-mail： shenxinchun@nufe.edu.cn

责任编辑: 赵伶俐
收稿日期:2020-10-29修回日期:2021-02-8网络出版日期:2021-07-01

基金资助:

国家自然科学基金.21476103 国家自然科学基金.31800280 江苏省自然科学基金.BK20181415 江苏省高等学校自然科学基金.18KJB550006 江苏省研究生科研与实践创新计划.KYCX19_1403

Received:2020-10-29Revised:2021-02-8Online:2021-07-01
作者简介 About authors
李宇,Tel：18795845118;E-mail： 18795845118@163.com。







摘要
【目的】探究从大豆分离蛋白双酶分步酶解产物中分离促成骨细胞增殖肽的工艺,为大豆产品的开发提供参考。【方法】以促成骨细胞增殖活性作为测定指标,选用木瓜蛋白酶酶解大豆分离蛋白（SPI）,采用MTT法检测不同浓度的木瓜蛋白酶酶解产物对成骨细胞的促增殖活性。采用pH-Stat法检测水解时间为1、2、3、4、5和6 h的木瓜蛋白酶酶解产物的水解度,并检测相应水解时间的酶解产物对成骨细胞的促增殖活性。然后分别采用截留分子量为30 kD和10 kD两种超滤膜对活性较高的酶解产物进行超滤,并测定各超滤组分对成骨细胞的促增殖活性。再将具有较高促成骨细胞增殖活性的超滤组分分别在0.5、1、1.5、2和2.5 h进行碱性蛋白酶酶解,并检测相应水解时间的酶解产物对成骨细胞的促增殖活性。然后选用交联葡聚糖（Sephadex G-15）对具有较高促成骨细胞增殖活性的酶解产物进行分离,并检测各分离组分对成骨细胞的促增殖活性。最后,对各分离组分进行氨基酸分析,并采用质谱（ESI-TOF MS/MS）对最高促成骨细胞增殖活性的分离组分进行结构鉴定,并筛选出具有较强促成骨细胞增殖的大豆活性肽。【结果】在浓度为200 μg·mL ^-1时,木瓜蛋白酶酶解物对成骨细胞的促增殖活性随着酶解时间的增加逐渐增强,当酶解时间为5 h时达到最高促增殖活性（（118.24±2.73）%）。木瓜蛋白酶酶解产物经超滤分离、碱性蛋白酶酶解和凝胶过滤色谱分离后,对各分离组分进行氨基酸分析并筛选得到对成骨细胞具有最强增殖活性的组分F3,该组分的成骨细胞增殖率为（125.80±2.94）%,且F3中丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等疏水性氨基酸以及芳香族氨基酸和必需氨基酸的含量明显高于其他组分。进一步通过质谱鉴定出F3主要由10个肽段组成。其中,DAMDGWFRL、GQTPLFPR、ADFYNPK、KDWYDIK的疏水性氨基酸、芳香族氨基酸以及必需氨基酸占比较高。对上述4个肽段进行活性测定,发现GQTPLFPR的促成骨细胞增殖活性最强,在浓度为100 μmol·L^-1时,其成骨细胞增殖率为（129.11±3.12）%。【结论】采用双酶分步酶解结合超滤和凝胶过滤色谱等蛋白分离纯化技术,从大豆分离蛋白中分离纯化出了具有较强促成骨细胞增殖活性的多肽,为促成骨细胞增殖活性肽的制备和应用提供了技术参考。
关键词： 大豆分离蛋白;成骨细胞增殖;双酶分步酶解;分离纯化;活性肽

Abstract
【Objective】 The aim of this study was to develop an effective method and to identify the active peptides and to provide reference for the development of soybean products, so as to promote the proliferation of osteoblasts from soybean protein isolated with the two-step enzymatic hydrolysis. 【Method】The proliferative activity of osteoblast was served as an indicator. Soybean protein isolate (SPI) was hydrolyzed by papain, and the effect of papain hydrolysates on osteoblast proliferation was detected by a MTT assay. The degree of hydrolysis of the papain hydrolysates was determined by the pH-Stat method after 1, 2, 3, 4, 5 and 6 h treatment, respectively. The effects of papain hydrolysates on pro-liferation of osteoblast were determined. Two kinds of ultrafiltration membrane with 30 kDa and 10 kDa cut-off were used to separate the fractions of papain hydrolysates, and their proliferation activities on osteoblast were determined. The enzymatic hydrolysates with the highest pro-proliferative activity of osteoblast were further hydrolyzed with alkaline. The effect of alkaline enzymatic hydrolysate on the proliferation of osteoblast was examined after 0.5, 1, 1.5, 2 and 2.5 h treatment, respectively. The Sephadex G-15 was used to isolate the enzymatic hydrolysates with high pro-proliferative activity of osteoblasts, and the proliferation activity of each component on osteoblasts was determined. Furthermore, the amino acids of the separated fractions were analyzed. The structure of the most active fraction was identified by ESI-TOF MS/MS, and the soybean protein derived from peptides with strong activity to promote osteoblast proliferation was identified. 【Result】 The proliferative rate of osteoblasts was (118.24±2.73)% by the treatment with enzymatic hydrolysis products of papain for 5 h at the concentration of 200 μg/ml. After the enzymatic hydrolysates were separated by ultrafiltration membrane, the active fraction was further hydrolyzed with alkaline protease. The final hydrolysates were separated with gel filtration chromatography (Sephadex G-15). A fraction of component with the strongest pro-proliferative activity on osteoblasts, F3, was identified, and the proliferative rate of osteoblasts treated with this faction was (125.80±2.94)%. Amino acid analysis showed that the contents of hydrophobic amino acids, such as alanine, valine, isoleucine, leucine, and phenylalanine, aromatic amino acids and essential amino acids in F3, were significantly higher than other fractions. In addition, mass spectrometry (ESI-TOF MS/MS) revolved that F3 was mainly composed of 10 small peptides, among which, DAMDGWFRL, GQTPLFPR, ADFYNPK and KDWYDIK had high contents of hydrophobic amino acids, aromatic amino acids and essential amino acids. Moreover, 100 μmol∙L ^-1 of GQTPLFPR had the strongest pro-proliferative activity on osteoblasts, with a proliferative rate of (129.11±3.12)%.【Conclusion】 Two-step enzymatic hydrolysis combined with ultrafiltration membrane and gel filtration chromatography could identify the most active pro-proliferative peptides from SPI, which provided a technical reference for the preparation of peptides with the bio-activity to stimulate the proliferation of osteoblasts.
Keywords：soybean protein isolate;osteoblast proliferation;two-step enzymatic hydrolysis;separation and purification;active peptide


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本文引用格式
李宇, 汪芳, 翁泽斌, 宋海昭, 沈新春. 酶法制备大豆蛋白成骨活性肽[J]. 中国农业科学, 2021, 54(13): 2885-2894 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.13.016
LI Yu, WANG Fang, WENG ZeBin, SONG HaiZhao, SHEN XinChun. Preparation of Soybean Protein-Derived Pro-osteogenic Peptides via Enzymatic Hydrolysis[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2021, 54(13): 2885-2894 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.13.016


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0 引言

【研究意义】骨质疏松症是以骨量减少、骨组织退化及微结构破坏导致骨强度和韧度降低为特征的一种代谢性疾病,其发病率较高,尤其是随着老龄化时代的到来,骨质疏松及其并发症如骨折等日益成为一项危害大众身体健康的社会问题。目前,治疗骨质疏松的药物以作用于破骨细胞的骨吸收为主,而靶向于成骨细胞增殖促进骨形成的药物较少,且目前市场上抗骨质疏松药物如双膦酸盐、选择性雌激素受体调节剂和降钙素等^[1]普遍存在严重的副作用。因此,开发高效、安全、副作用小的抗骨质疏松的天然产物成分日益受到关注。大豆作为中国四大粮食作物之一,其蛋白资源丰富且价格低廉,不少研究表明大豆蛋白对骨质疏松有良好的预防和治疗作用^[2]。和大豆蛋白相比,大豆活性肽因其具有较低的过敏原、较高的溶解性和持水性以及可以直接被人体吸收利用等特性越来越受到人们青睐。基于此背景,寻找具有促进成骨细胞增殖活性的大豆肽对预防和治疗骨质疏松及其并发症具有深远意义。【前人研究进展】骨质疏松是一种慢性全身代谢性疾病,其特征是骨微结构改变,骨量和强度减少,从而导致骨质脆性增加、骨折风险升高^[3,4]。有研究表明,大豆能显著提高卵巢切除大鼠和小鼠的骨密度,可见大豆在预防卵巢激素缺乏引起的骨丢失方面是有效的^[5,6],且大豆提取物对骨组织具有良好的保护作用,可在雌激素缺乏的情况下防止骨质流失^[7,8,9]。此外,大豆异黄酮可减轻绝经期妇女的腰椎骨质流失^[10]。有研究表明,在绝经后最初几年的妇女中,大豆蛋白的摄入量与臀部骨密度和全身骨密度有显著的相关性^[11]。大豆蛋白可以间接地增加骨强度^[12,13],有效降低绝经妇女骨质疏松的风险^[14]。生理学研究表明,在成年人骨骼中,骨骼不断地形成和吸收,骨重塑过程是由成骨细胞与破骨细胞的精确协调完成的^[15]。大部分骨质疏松发生时骨形成降低,在骨形成过程中,成熟的成骨细胞到达骨表面,成骨细胞群在自己合成的骨基质内,发生羟磷灰石结晶的生长和矿化^[16]。因此,研究大豆蛋白对成骨细胞的生物活性具有重要的科学意义。有研究发现大豆蛋白的酶解产物能够显著促进成骨细胞的增殖,并初步进行了氨基酸分析,但是并未对其进行结构分析与鉴定^[17]。【本研究切入点】大量研究证明大豆蛋白具有预防绝经后骨质疏松的作用,也有部分研究表明大豆蛋白酶解产物可以促进成骨细胞增殖的功能,但是大豆促成骨活性肽的分离制备及其结构的鉴定尚未见报道。【拟解决的关键问题】本研究以大豆分离蛋白为原料,通过木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶双酶分步酶解结合超滤和凝胶过滤色谱分离纯化技术,从大豆分离蛋白中分离筛选出具有促成骨细胞增殖功能的高活性肽,为大豆活性肽的分离纯化及其作为抗骨质疏松功能成分的开发与应用提供重要参考。

1 材料与方法

试验于2018年在南京财经大学食品科学与工程学院及江苏省粮油品质控制及深加工技术重点实验室进行。

1.1 试验材料

大豆分离蛋白,上海源叶生物科技有限公司;二甲基亚砜（DMSO）,美国Sigma公司;噻唑蓝（MTT）、木瓜蛋白酶,北京索莱宝科技有限公司;MC3T3-E1细胞株,上海中科院细胞库;胎牛血清（Fetal Bovine Serum,FBS）、MEM-α培养基、EDTA-胰酶（0.05%）、Penicillin-Streptomycin（100×）、PBS磷酸盐缓冲液,美国Gibco公司;碱性磷酸酶Alcalase 2.4 L,丹麦诺维信生物技术有限公司;Sephadex G-15,GE（中国）医疗集团;其他试剂均为国产分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SpectraMax M2e酶标仪,美国Molecular Devices公司;蛋白纯化系统,上海沪西分析仪器有限公司;8400型超滤杯,美国Millipore公司;HY-1漩涡混合仪,上海仪电科学仪器股份有限公司;微型垂直电泳系统、化学发光凝胶成像系统,美国Bio-rad公司;冷冻干燥机,美国Labconco公司;JY92-Ⅱ超声细胞粉碎仪,宁波新艺超声设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 木瓜蛋白酶酶解大豆分离蛋白 称取一定量大豆分离蛋白溶于超纯水中,配置成浓度为4.5%（W/V）的蛋白溶液,加入NaOH,调节pH为7.0。加入木瓜蛋白酶3 000 U·g^-1。将容器置于旋转混匀仪上,55℃反应4 h。反应结束后,升温至85℃,灭酶20 min,冷却后在3 000×g条件下离心15 min,取上清液,透析除盐,冷冻干燥后,于-20℃条件下保存。

1.3.2 水解度的测定 蛋白质的酶解过程伴随着羧基或羟基的释放,这两种基团数量的变化会使溶液体系的pH改变。依据pH-Stat法^[18],蛋白水解度可由水解过程中NaOH的消耗量来计算。计算公式如下：

$\mathrm{DH}=\mathrm{B} \times \mathrm{N}_{\mathrm{l}}, \times \frac{1}{\alpha} \times \frac{1}{\mathrm{M}} \times \frac{1}{\mathrm{~h}_{w}} \times 100 \%$

式中,B：水解过程中消耗NaOH体积（mL）;N_b：NaOH浓度（mol·L^-1）;α：氨基酸的解离常数;M_P：底物蛋白质的总量（g）;h_tot：每克原料蛋白质中肽键毫摩尔数。反应过程中用pH计测溶液的pH,通过滴加0.5 mol∙L^-1NaOH溶液维持pH恒定。记录一定时间间隔内NaOH的消耗量,带入公式中计算水解度。以时间为横坐标,水解度为纵坐标绘制水解曲线。

1.3.3 木瓜蛋白酶酶解产物超滤分离 将木瓜蛋白酶酶解产物溶于去离子水中,配置成10 mg·mL^-1的溶液,用0.45 μm的纤维素膜过滤,除去其中的不溶物。将滤液先后通过10 kD和30 kD的超滤膜,调节超滤压力为0.2 MPa,在4℃下进行超滤,收集各组分多肽溶液后冷冻干燥。

1.3.4 碱性蛋白酶酶解制备成骨活性肽 木瓜蛋白酶酶解产物经过超滤分离后,取促成骨细胞增殖活性较高组分用碱性蛋白酶酶解。样品溶于超纯水中配置成5%（W/V）的蛋白溶液,用NaOH溶液调节pH至8.0,碱性蛋白酶加酶量为3 000 U·g^-1,水解温度为55℃,水解时间为0.5、1、1.5、2和2.5 h,比较不同时间酶解产物对成骨细胞增殖活力的影响,选出最佳水解时间。

1.3.5 凝胶过滤色谱分离（Sephadex G-15） 碱性蛋白酶酶解后的分子量较小,因此选用交联葡聚糖Sephadex G-15对其进行分离。首先将Sephadex G-15干粉溶胀之后装入15 mm×600 mm层析柱中,再将碱性蛋白酶酶解产物溶于超纯水配成2%的溶液,经0.22 μm的滤膜过滤除去颗粒物,上样量为柱体积的3%,且分离过程在4℃条件下进行。用超纯水以0.6 mL·min^-1流速洗脱,220 nm处检测吸光值,自动收集器每5 min收集1管（约2 mL）,记录仪记录紫外检测结果。根据记录曲线,收集每个洗脱峰下的洗脱液,冷冻干燥。

1.3.6 成骨细胞的增殖活性测定 将成骨细胞（MC3T3-E1）消化收集后配置成每毫升含5×10⁴个细胞的悬浮液,96孔板每孔加100 μL细胞液,在CO ₂培养箱中培养24 h使细胞贴壁。细胞贴壁后去除培养液,除对照组外,每孔加入含酶解产物的培养液,每组设置6个平行。将细胞在CO₂培养箱中继续培养24 h后,每孔加入10 μL MTT溶液,MTT浓度为5 mg·mL ^-1,继续培养4 h后将MTT溶液及培养液吸出并加入50 μL DMSO。37℃恒温振荡器内振荡20 min后使用酶标仪在570 nm单波长下测吸光值。成骨细胞增殖活力=（OD _加样组-OD_空白组）/（OD_对照组- OD_空白组）×100%。

1.3.7 氨基酸测定 对葡聚糖凝胶柱分离后的组分进行氨基酸分析,氨基酸含量参照GB 5009.124—2016进行测定。利用全自动氨基酸分析仪,使用磺酸型阳离子树脂柱,适量样品中加入10 mL盐酸（6 mol·L^-1）后封管,于110℃烘箱水解24 h,测定样品中氨基酸含量。

1.3.8 成骨活性肽的结构分析及其化学合成 委托上海博苑生物科技有限公司完成成骨活性肽的结构鉴定。采用串联质谱技术（ESI-TOF MS/MS）对分离得到的促成骨细胞增殖最高的组分进行结构鉴定。流动相A：2%乙腈,0.1%甲酸;流动相B：98%乙腈,0.1%甲酸。质谱采用TripleTOF 5600系统（AB SCIEX）结合纳升喷雾III离子源,喷雾电压为2.5 kV,雾化气压为5 PSI,气帘气压为30 PSI,加热器温度为150℃。

采用化学法固相合成成骨活性肽（纯度95%以上）,该试验委托江苏金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.4 数据分析

试验至少重复3次,试验数据以平均值±标准差（Mean±SD）表示,使用Origin 2018软件作图,采用Excel 2015和SPSS 22.0进行数据统计分析。

2 结果

2.1 木瓜蛋白酶酶解物浓度对成骨细胞增殖活力的影响

用MTT法检测木瓜蛋白酶酶解产物对成骨细胞MC3T3-E1增殖活力的影响。如图1所示,木瓜蛋白酶酶解产物的加样浓度为100 μg·mL ^-1和150 μg·mL ^-1时,成骨细胞MC3T3-E1增殖活力相比对照组显著增强（P<0.05）,当加样浓度为200和250 μg·mL^-1时,与对照组相比具有极显著差异（P<0.01）,但这两种剂量之间无显著性差异（P>0.05）。因此,选取200 μg·mL^-1作为后续试验中木瓜蛋白酶酶解产物的浓度。

图1

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图1木瓜蛋白酶酶解产物浓度对成骨细胞增殖活力的影响

*表示差异显著（P<0.05）,**表示差异极显著（P<0.01）
Fig. 1Effects of papain hydrolysate concentration on osteoblast proliferation

* indicate significant difference (P<0.05), ** indicate extremely significant difference (P<0.01)

2.2 不同酶解时间的水解度及木瓜蛋白酶酶解物对成骨细胞增殖活力的影响

在木瓜蛋白酶酶解过程中,当底物和酶量确定时,水解度依赖不同酶解时间而变化,而不同酶解时间的酶解产物对成骨细胞的增殖活力也有一定的影响。如图2所示,随着酶解时间增加,大豆分离蛋白的水解度也逐渐增加,至5 h时,增长趋势逐渐变缓。木瓜蛋白酶酶解物对成骨细胞的增殖活力随着酶解时间的增加逐渐增强,在酶解时间为5 h时达到最高促增殖活力。此时,水解度和成骨细胞增殖活力分别为（11.08±0.31）%和（118.24±2.73）%,两者在一定程度上趋势一致。

图2

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图2不同酶解时间的水解度及其木瓜蛋白酶对水解度和成骨细胞增殖活力的影响

不同字母表示差异显著（P<0.05）。下同
Fig. 2Relationship between time and degree of hydrolysis and effects of their papain hydrolysates on osteoblast proliferation

Different letters indicate significant difference (P<0.05). The same as below

2.3 超滤产物对成骨细胞增殖活力的影响

采用30 kD和10 kD两种超滤膜将酶解时间为5 h的木瓜蛋白酶酶解产物截留为3个组分,分别为分子量>30 kD组分、10—30 kD组分及<10 kD组分,然后用细胞培养液溶解,加样浓度为200 μg·mL^-1,培养24 h,测定3个组分对成骨细胞增殖活力的影响,结果如图3所示。与对照组（Control）相比,其中酶解产物>30 kD组分对成骨细胞无显著促增殖作用,10—30 kD组分和<10 kD组分均有显著的促增殖作用,其中<10 kD组分具有较高的促增殖活力,细胞增殖率达到（120.45±2.28）%,与其他各组之间具有显著性差异（P<0.05）。由此可知,木瓜蛋白酶酶解产物分子量越小,其促成骨细胞增殖活性越高。因此,选择分子量<10 kD的组分进行后续酶解试验。

图3

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图3超滤产物各组分对成骨细胞增殖活力的影响

Fig. 3Effects of different ultrafiltration fractions on osteoblast proliferation

2.4 不同酶解时间的碱性蛋白酶酶解物对成骨细胞增殖活力的影响

碱性蛋白酶酶解0.5 h时的酶解产物对成骨细胞的促增殖活力较高,细胞增殖率达到（123.02±2.69）%。因此,确定碱性蛋白酶最佳酶解时间为0.5 h（图4）。

图4

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图4不同酶解时间的碱性蛋白酶酶解产物对成骨细胞增殖活力影响

Fig. 4Effects of alcalase hydrolysate on osteoblast proliferation under different time of enzymatic hydrolysis

2.5 Sephadex G-15分离产物对成骨细胞增殖活力的影响

选用交联葡聚糖Sephadex G-15对酶解时间为0.5 h的碱性蛋白酶酶解产物进行分离。如图5-A所示,经Sephadex G-15分离后,得到4个洗脱峰,出峰时间分别为45、78、100和120 min,按出峰时间的先后分别命名为F1、F2、F3和F4。细胞刺激浓度为200 μg·mL ^-1,培养24 h,测定4个分峰产物对成骨细胞增殖活力的影响,结果如图5-B所示。与对照组相比,4个洗脱峰组分对成骨细胞均有促增殖活性（P<0.05）,其中F3对成骨细胞的促增殖活力最高,达到（125.80± 2.94）%。

图5

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图5Sephadex G-15分离色谱图（A）及各峰洗脱组分的促成骨细胞增殖活性（B）

Fig. 5Chromatogram of hydrolysates separated by Sephadex G-15 (A), osteoblast proliferation of different peaks (B)

2.6 氨基酸含量分析和肽的结构鉴定及其对成骨细胞增殖活力的影响

对凝胶过滤色谱（Sephadex G-15）分离组分进行氨基酸分析（表1）,F3中的疏水性氨基酸、芳香族氨基酸以及必需氨基酸含量分别为（54.44±1.06）%、（26.63±45）%和（39.60±1.78）%,显著高于其他分离组分（P<0.05）;对成骨细胞增殖活力影响最低的F4组分中疏水氨基酸含量只有（26.08±0.59）%,芳香族氨基酸仅为（7.38±0.31）%。经ESI-TOF MS/MS鉴定（表2）,F3组分的大多数肽段中疏水性氨基酸、芳香族氨基酸以及必需氨基酸含量较高,其中最具代表性的肽段序列为：DAMDGWFRL、GQTPLFPR、ADFYNPK和KDWYDIK,且活性预测结果显示其活性较高,因此测定肽DAMDGWFRL、GQTPLFPR、ADFYNPK和KDWYDIK对成骨细胞增殖活力的影响。结果如图6所示,随着大豆活性肽浓度增加,成骨细胞的增殖活力也逐渐增加,当浓度为25 µmol∙L ^-1时,4条肽段均可显著促进成骨细胞的增殖（P<0.05）。当浓度为50 µmol∙L^-1时,GQTPLFPR对成骨细胞的增殖活力相比于25 µmol∙L ^-1具有显著性差异（P<0.05）;ADFYNPK、DAMDGWFRL、KDWYDIK对成骨细胞的增殖活力相比于25 µmol∙L^-1无显著性差异（P>0.05）。当浓度为100 µmol∙L^-1时,大豆活性肽GQTPLFPR对成骨细胞的增殖活力最高,达到（129.11±3.12）%。

Table 1
表1
表1各峰的氨基酸含量
Table 1Amino acid composition of different fractions

氨基酸名称 Amino acid name		氨基酸含量 Amino acid content (g/100 g)
		F1	F2	F3	F4
天冬氨酸 Aspartic acid	Asp	10.20±0.66d	8.37±0.68c	4.67±0.33a	6.27±0.36b
苏氨酸 Threonine	Thr	2.15±0.19a	3.69±0.23c	3.24±0.23b	2.88±0.28b
丝氨酸 Serine	Ser	2.66±0.23a	5.13±0.31b	2.52±0.17a	2.58±0.24a
谷氨酸 Glutamate	Glu	20.97±2.17d	14.78±0.92c	6.48±0.52a	12.06±0.69b
甘氨酸 Glycine	Gly	2.64±0.23a	3.61±0.23c	3.08±0.23b	3.45±0.33c
丙氨酸 Alanine	Ala	1.57±0.14a	4.58±0.28b	7.02±0.42d	5.43±0.52c
半胱氨酸 Cysteine	Cys	0.52±0.05d	0.00±0.00a	0.21±0.02c	0.00±0.00a
缬氨酸 Valine	Val	3.98±0.17c	3.59±0.28b	4.98±0.19d	2.51±0.24a
甲硫氨酸 Methionine	Met	0.76±0.07b	0.25±0.02a	1.88±0.14e	1.56±0.16d
异亮氨酸 Isoleucine	Ile	1.90±0.17c	3.91±0.23e	1.69±0.12b	0.86±0.09a
亮氨酸 Leucine	Leu	5.39±0.21b	6.49±0.45c	7.58±0.50d	3.61±0.35a
酪氨酸 Tyrosine	Tyr	6.43±0.43c	5.47±0.52b	13.57±0.45d	3.97±0.47a
苯丙氨 Phenylalanine	Phe	6.38±0.54b	5.79±0.54b	13.06±1.14c	3.41±0.68a
赖氨酸 Lysine	Lys	4.69±0.42c	4.14±0.24b	3.57±0.26a	10.34±0.55d
组氨酸 Histidine	His	1.83±0.16b	1.53±0.09a	3.60±0.26c	6.77±0.64d
精氨酸 Arginine	Arg	5.47±0.47b	4.65±0.28a	5.49±0.40b	7.38±0.71c
脯氨酸 Proline	Pro	4.30±0.38a	5.11±0.31b	4.66±0.33a	4.73±0.45ab
疏水性氨基酸 Hydrophobic amino acid	—	30.71±0.31b	35.19±1.13c	54.44±1.84d	26.08±1.02a
芳香族氨基酸 Aromatic amino acid	—	12.81±0.29c	11.26±0.52b	26.63±0.78d	7.38±0.54a
必需氨基酸 Essential amino acid	EAA	27.08±1.70a	29.39±2.10b	39.60±3.08c	31.94±2.51b

同行不同字母表示Tukey检测有显著性差异（P<0.05）
Different letters in the same line represent significant difference based on Tukey’s post-test (P<0.05)

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Table 2
表2
表2F3中含量最多的肽
Table 2Most abundant peptides in the F3 fraction.

序列 Sequence	离子 Ion (m/z)	观察质量 Observed mass	蛋白质 Protein	补充 Accession
KDWYDIK	484.25 (2)	967.49	40S ribosomal protein S3a OS=Glycine max OX=3847 GN=100813273 PE=2 SV=1	C6TI64
DAMDGWFRL	563.76 (2)	1126.50	Truncated Kunitz trypsin inhibitor OS=Glycine max OX=3847 PE=4 SV=1	Q9ATY0
GQTPLFPR	458.26 (2)	915.50	Uncharacterized protein OS=Glycine max OX=3847 GN=100801918 PE=3 SV=1	A0A0R0JL19
ADFYNPK	427.71 (2)	854.40	Soybean glycinin A3-B4 subunit (Fragment) OS=Glycine max OX=3847 PE=2 SV=1	Q39858
DAMDGWFR	499.22 (2)	997.42	Truncated Kunitz trypsin inhibitor OS=Glycine max OX=3847 PE=4 SV=1	Q9ATY0
NNNPFK	367.19 (2)	733.36	Uncharacterized protein OS=Glycine max OX=3847 GN=GLYMA_03G163500 PE=3 SV=1	A0A0R0KKD6
SNDVYLPR	482.25 (2)	963.49	Seed linoleate 9S-lipoxygenase-3 OS=Glycine max OX=3847 GN=LOX1.3 PE=1 SV=1	P09186
GGQLAMINLESR	435.56 (3)	1304.66	Uncharacterized protein OS=Glycine max OX=3847 GN=100796275 PE=2 SV=1	C6TKL7
DAMDGWFR	507.21 (2)	1013.41	Truncated Kunitz trypsin inhibitor OS=Glycine max OX=3847 PE=4 SV=1	Q9ATY0
THINIVVIGHVDSGK	530.29 (3)	1588.88	Elongation factor 1-alpha OS=Glycine max OX=3847 GN=100785429 PE=3 SV=1	A0A0R0ESZ8

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图6

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图6大豆活性肽DAMDGWFRL(A)、GQTPLFPR（B）、ADFYNPK(C)和KDWYDIK(D)对成骨细胞增殖活力的影响

Fig. 6Effects of soybean active peptides DAMDGWFRL (A), GQTPLFPR (B), ADFYNPK (C) and KDWYDIK(D) on proliferation activity of osteoblast

3 讨论

大豆活性肽在各前体蛋白中的活性较低,目前主要通过化学法、微生物发酵法以及酶解法3种途径,并采用进一步分离纯化来提高其生物活性^[19]。

本研究采用pH-Stat法检测木瓜蛋白酶对大豆分离蛋白酶解产物的水解度,在酶解时间为5 h时,水解度达到（11.08±0.31）%,这与木瓜蛋白酶水解大豆蛋白的水解度基本一致^[20,21]。此外,有研究表明11S和7S大豆球蛋白在酶解时间为5 h时,水解度约为80%^[22],与本研究结果存在较大差异,主要原因在于在酶解前,酶解体系中已存在一定量的酸溶蛋白,采用TCA指数法的测定结果偏高。本研究采用pH-Stat法的可重复性高,在中性和碱性水解条件下都可以测定^[23]。本研究中水解体系pH为7,采用pH-Stat法测定的结果误差较小,与TCA方法相比具有一定的优越性。陈思远等^[24]通过二步酶解结合超滤等3种分离技术从麦胚清蛋白中分离得到单一的高活性抗氧化肽。AMIN等^[25]通过LC-MS/MS分析豆豉水解产物鉴定出新的鲜味肽。本研究利用双酶分步酶解结合超滤膜和凝胶过滤色谱等蛋白分离纯化技术,从大豆蛋白中分离具有较高促成骨细胞增殖活性的多肽,最终得到的大豆活性肽对成骨细胞的增殖活性达到（129.11±3.12）%,而潘晓文^[17]研究发现的大豆蛋白酶解产物促成骨细胞增殖活性最高达到123%,说明本研究的提取纯化工艺具有一定的优势。

大量研究表明肽的活性与其氨基酸序列密切相关,例如,ZHANG等^[26]从水葫芦叶蛋白中分离得到FFE和LF两种抗氧化肽,认为肽段序列中疏水性氨基酸与必需氨基酸Phe、Leu以及Phe等芳香族氨基酸可以提高水葫芦叶中水解蛋白的抗氧化活性。ZHANG等^[27]发现大豆分离蛋白中的肽LPYPR和WGAPSL可以降低极低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯。此外,钟芳等^[28]研究具有最高ACE抑制活性的大豆肽3种可能的结构为：VISTGAEP、VLSTGAEP和ANSAGTVGP。除上述的几种功效外,也有不少研究阐明大豆肽对成骨细胞的增殖分化活性以及对逆转骨丢失具有一定的功效,比如：XU等^[29]从贻贝中发现肽YPRKDETGAERT可以促进成骨细胞的增殖和分化。MIN等^[30]研究发现序列为RVYFFKGKQYWE的肽既可以促进成骨细胞的分化活性,又能够抑制破骨细胞的吸收功能,还可以逆转由卵巢切除引起的骨丢失。此外,潘晓文^[17]对具有促成骨细胞增殖作用的大豆蛋白酶解产物进行氨基酸分析发现,脯氨酸可能是骨骼中胶原蛋白的重要原料,且含硫氨基酸,包括蛋氨酸、胱氨酸、半胱氨酸等不利于骨骼的形成。本研究从大豆分离蛋白中分离筛选出具有促成骨细胞增殖的高活性肽,可初步判断大豆肽促成骨细胞增殖的活性与其序列中具有较高含量的疏水性氨基酸、必需氨基酸和芳香族氨基酸有关。基于上述研究结果,后续将会进一步验证大豆活性肽对于动物骨质疏松的影响以及在动物体内的吸收利用情况。

4 结论

本研究利用双酶分步酶解结合超滤膜和凝胶过滤色谱等蛋白分离纯化技术,从大豆蛋白中分离出具有较高促成骨细胞增殖活性的多肽组分F3,其促成骨细胞的增殖活性为（126.60±3.28）%,经氨基酸组成分析发现F3组分含有较高比例的疏水性氨基酸、芳香族氨基酸和必需氨基酸,并经结构鉴定发现F3由活性较高的肽DAMDGWFRL、GQTPLFPR、ADFYNPK和KDWYDIK组成,且肽GQTPLFPR对成骨细胞的增殖活力最高,促成骨细胞增殖活性为（129.11±3.12）%。研究结果为促成骨细胞增殖活性肽的制备和应用提供了技术参考。

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