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酸性硫酸钙对临床常见致病微生物的杀灭能力

本站小编 Free考研考试/2021-12-26
付霞丽,, 郑紫方, 马志倩, 徐乐乐, 李志伟, 李洋, 肖书奇, 李爽,西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100

The Ability of Acidic Calcium Sulfate to Kill Common Clinical Pathogenic Microorganisms

FU XiaLi,, ZHENG ZiFang, MA ZhiQian, XU LeLe, LI ZhiWei, LI Yang, XIAO ShuQi, LI Shuang,College of Veterinary Medicine, Northwest Agricultural and Forestry University, Yangling 712100, Shaanxi

通讯作者: 李爽,Tel：18700192876;E-mail： lishuang2006001@126.com

责任编辑: 林鉴非
收稿日期:2020-06-1修回日期:2020-12-30网络出版日期:2021-07-01
基金资助:国家重点研发计划项目.2017YFD0500605
陕西省重点研发计划项目.2019NY-076
陕西高校青年创新团队项目
西北农林科技大学试验示范站科技创新与成果转化项目.TGZX2020-24


Received:2020-06-1Revised:2020-12-30Online:2021-07-01
作者简介 About authors
付霞丽,Tel：18702910446;E-mail: 1579459296@qq.com。










摘要
【目的】研究消毒剂酸性硫酸钙（ACS）对微生物的杀灭效果,为用消毒剂防控人畜疫病提供基础数据和理论依据。【方法】将ACS与中和剂（3%卵磷脂、5%吐温-80的磷酸盐缓冲液）共孵育一段时间后,再分别加入大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）共培养一段时间,将与细菌的混合物涂布于营养琼脂平板,置于37℃生化培养箱培养18—24 h;将与病毒的混合物接种于细胞板,在37℃细胞培养箱内培养一定时间,评价中和剂的中和效果。其对照设置和评判标准如下：消毒剂+菌悬液或病毒悬液（第1组）,（消毒剂+菌悬液或病毒悬液）+中和剂（第2组）,（中和剂+消毒剂）+菌悬液或病毒悬液（第3组）,（无菌硬水+菌悬液或病毒悬液）+中和剂（第4组）,（无菌硬水+菌悬液或病毒悬液）+PBS（第5组）,无菌硬水+PBS（第6组）;细菌杀灭试验中和剂效果评价标准：第1组有极少量细菌生长或无菌生长,第2组有菌生长且明显少于第3、4、5组但多于第1组,第3、4、5组细菌数接近且与阳性对照组细菌数接近,第6组无菌生长,3次重复试验均符合上述条件,结果一致,判定所选中和剂及浓度合适;病毒灭活试验中和剂效果评价标准：第1组有极少量病毒生长或无病毒生长,第2组有病毒生长且明显少于第3、4、5组但多于第1组,第3、4、5组病毒生长与原接种量相近,第6组细胞正常生长,3次重复试验结果一致,判定所选中和剂及浓度合适。利用悬液定量杀菌法和测定病毒滴度的方法评价ACS对上述细菌和病毒的消灭效果,将ACS 稀释200、300、400、500、600、700倍分别与上述细菌或病毒作用不同时间后加入中和剂进行中和,然后将细菌混合物涂布于营养琼脂平板,通过计算菌落数评价ACS杀灭细菌的效果,测定病毒混合物中病毒滴度评价ACS对病毒的杀灭效果。【结果】所选用的中和剂能够有效地中和ACS 200倍稀释液对细菌和病毒的残留作用,且该中和剂对细菌、病毒和细胞无毒性。当ACS与细菌作用0 h后立即被中和,最大稀释300倍对大肠杆菌的灭菌率为100%,最大稀释600倍对金黄色葡萄球菌的灭菌率为100%,最大稀释700倍时对沙门氏菌的灭菌率为100%。当ACS 稀释至700倍时,分别与上述细菌作用1d或6d后被中和,灭菌率均为100%;此外,ACS稀释200倍时,与PRRSV作用60 min后被中和,未检测出病毒滴度。【结论】ACS稀释700倍与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌作用1 d或1 d以上均能产生较好的杀灭效果;ACS稀释200倍与PRRSV作用60 min能完全杀灭病毒。这可为养殖场选用消毒剂防控疫病提供参考。
关键词： 酸性硫酸钙;微生物;中和剂;杀灭效果

Abstract
【Objective】The purpose was to study the effect of disinfectant acid calcium sulfate (ACS) on the killing of microorganisms, and to provide basic data and theoretical basis for disinfectant prevention and control of human and animal diseases.【Method】After incubating ACS with 3% lecithin and 5% Tween-80 as phosphate buffer neutralizer for a period of time, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonellaand porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) were added respectively for a period of time, We spread the culture mixture with bacteria on nutrient agar plates and cultured at 37℃ biochemical incubator for 18-24 h, the mixture with virus was inoculated on the cell plates and incubate in 37℃ cell incubator for a certain period of time to evaluate the neutralizing effect of the neutralizer. The comparison settings and evaluation criteria were as follows: disinfectant mixed with bacterial suspension or virus suspension (group 1), the mixture of disinfectant and bacterial suspension or virus suspension was mixed with neutralizer (group 2), the mixture of neutralizer and disinfectant was mixed with bacterial suspension or virus suspension (group 3), the mixture of sterile hard water and bacterial suspension or virus suspension was mixed with neutralizer (group 4), the mixture of sterile hard water and bacterial suspension or virus suspension was mixed with PBS (group 5), sterile hard water mixed with PBS (group 6). The evaluation criteria of the neutralizer effect in the bacteria killing test were as follows: group 1 had a very small amount of bacterial growth or aseptic growth; group 2 had bacterial growth, which was significantly less than that of groups 3, 4, and 5, but more than the group 1; the number of bacteria in group 3, 4,5 was close to that of the positive control group, no bacterial growth in group 6. All three repeated tests met the above conditions, and the results were consistent, it was determined that the selected neutralizer and concentration were appropriate. The evaluation criteria of the neutralizer effect in the virus inactivation test were as follows: group 1 had very little virus growth or no virus growth; group 2 had virus growth and was significantly less than that of groups 3, 4, and 5, but more than group 1. The growth of viruses in groups 3, 4, and 5 was similar to the original inoculation; the cells in group 6 grew normally. The results of the three repeated tests were consistent, and it was determined that the selected neutralizer and concentration were appropriate. We used the suspension quantitative sterilization method and the method of determining the virus titer to evaluate the elimination effect of ACS on the above-mentioned bacteria and viruses. We diluted the ACS 200, 300, 400, 500, 600, and 700 times to interact with the above-mentioned bacteria or virus for different time and added neutralizer for neutralization, then spread the bacterial mixture on nutrient agar plates to evaluate the killing effect of ACS by calculating the number of colonies, and determined the virus titer in the virus mixture to evaluate the killing effect of ACS on the virus.【Result】 The selected neutralizer can effectively neutralize the residual effects of ACS 200-fold dilution on bacteria and viruses, and the neutralizer was non-toxic to bacteria, viruses and cells. When ACS interacted with the bacteria for 0 h, it was neutralized immediately. The sterilization rate ofEscherichia coli at the maximum dilution of 300 times was 100%, the sterilization rate of Staphylococcus aureusat the maximum dilution of 600 times was 100%, and when the maximum dilution was 700 times, the sterilization rate of Salmonella was 100%. When ACS was diluted to 700 times, it was neutralized one day or six days after treatment with the above bacteria, and the sterilization rate was 100%. In addition, when ACS was diluted to 200 times, it was neutralized 60 minutes after treatment with PRRSV, and no virus titer was detected.【Conclusion】 When ACS diluted 700 times withEscherichia coli,Staphylococcus aureus and Salmonella for one day or more, it can produce better killing effect; when ACS diluted 200 times with PRRSV for 60 minutes, it can completely kill the virus, which will provide strong data support for the selection of disinfectants in the farms and provide reference for the prevention and control of epidemic diseases.
Keywords：acid calcium sulfate;microbial;neutralizing agent;killing effect


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本文引用格式
付霞丽, 郑紫方, 马志倩, 徐乐乐, 李志伟, 李洋, 肖书奇, 李爽. 酸性硫酸钙对临床常见致病微生物的杀灭能力[J]. 中国农业科学, 2021, 54(13): 2906-2915 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.13.018
FU XiaLi, ZHENG ZiFang, MA ZhiQian, XU LeLe, LI ZhiWei, LI Yang, XIAO ShuQi, LI Shuang. The Ability of Acidic Calcium Sulfate to Kill Common Clinical Pathogenic Microorganisms[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2021, 54(13): 2906-2915 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.13.018


开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

0 引言

【研究意义】大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是危害人或动物健康的病原微生物,环境中若不能及时清除这些微生物,很容易造成疾病的暴发,严重者可导致死亡。如大肠杆菌可以导致人、畜和禽呼吸道和消化道感染,对公共卫生构成巨大威胁[1,2]。金黄色葡萄球菌可引起多种感染,造成呼吸道疾病以及其继发的败血症,威胁人类健康。此外,由金黄色葡萄球菌导致的葡萄球菌乳腺炎严重影响牛羊等家畜的健康及乳制品品质,给养殖业带来巨大经济损失[3,4,5]。沙门氏菌是食源性致病菌,传播力强、致病力高,每年沙门氏菌感染造成约1.15亿人患病和约37万人死亡,是公共卫生和食品安全的重要防控对象[6]。PRRSV可导致妊娠母猪繁殖障碍以及保育猪、生长猪和育肥猪的呼吸道疾病,是长期威胁养猪业健康发展的主要病原[7]。高效的消毒剂对防控病毒和细菌等致病微生物的传播具有重要意义,如消毒剂在防控新型冠状病毒的过程中发挥了不可替代的作用。因此,在生产实践中应用一种安全且高效的消毒剂对人和动物的健康尤为重要。同时,消毒剂的不同作用时间和不同作用浓度对于其发挥消毒效果具有重大影响,因此,在应用高效消毒剂时,要选择合适的浓度和作用时间。酸性硫酸钙（ACS）是一种新型酸化剂,由氢氧化钠、硫酸钙、硫酸为原料混合而成,其化学本质是一种IIA族络合物（AGIIS）的酸性溶液,但ACS中的IIA族络合物AGIIS的元素排列与氢氧化钙类似,这种特殊的结构使ACS在具备强酸特性的同时不具备较强的腐蚀性[8,9,10,11],并且能与水以任意比例互溶[12]。ACS最开始是以食品添加剂的方式从美国引进[13,14,15],近年来该化合物作为抑菌和杀毒剂,逐渐引起人们重视。【前人研究进展】张利平等发现ACS在700倍稀释时杀灭金黄色葡萄球菌的效果与350 mg·L-1有效氯相当[16]。王劲等发现ACS对载体表面细菌繁殖体有较好的杀菌效果,且稳定性好[17]。谈智等发现ACS对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、脊髓灰质炎病毒具有较强的抑制作用[18]。吉钟山等发现ACS杀灭微生物的效果与它的pH呈反比,即ACS的pH越高,其杀灭微生物的能力越弱[19]。ACS出色的抑菌和杀毒能力可能与其强酸特性有关[20]。基于ACS优良的抗微生物性能,且使用较为安全,不影响食品色泽和口感,低毒无害,被广泛应用到食品防腐保鲜[21,22]、肉质品防腐、蔬果保鲜中,以减少蔬菜和水果中的生物毒素残留[23,24,25,26,27,28]。2016年黄明杰等研究表明,ACS 食品保鲜机制可能是其创造较低的pH环境限制了大多数微生物的生存空间,使微生物不能生存[29]。ACS除了可以保鲜食品,还具有其他优良特点。BENLI等发现ACS添加到鸡的饮用水中,可增加鸡肠壁的厚度,使其不易破裂,提高饲料的转化率[30]。且ACS作为膳食补充剂对虾进行饲喂能提高虾的免疫力[31]。此外,在饲料中添加ACS降低了猪的腹泻率,且不影响猪肉品质[32]。【本研究切入点】鉴于大肠杆菌在环境中广泛存在、金黄色葡萄球菌具有抗生素耐药性、沙门氏菌血清型多样化和PRRSV基因组的快速变异等问题,通过经典药物抑制或疫苗预防这些病原微生物的传播困难较大。利用新型药物消灭致病微生物,可从源头遏制疾病的传播。ACS具有优良的杀灭病原微生物的能力,但是ACS的剂量和作用时间严重影响其效力,且不同微生物对药物的反应性不尽相同。【拟解决的关键问题】本研究拟通过悬液定量杀菌法和病毒滴度测定法研究ACS对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的最佳抑制时间和浓度,并明确ACS在短时间内抑制PRRSV复制的效果,为拓宽ACS的应用范围、防治人畜疾病提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点

研究于2019年在西北农林科技大学动物医学院完成。

1.2 试验材料

硬水(硬度为342 mg·mL-1)由0.034 g氯化钙、0.139 g氯化镁加蒸馏水至1 000 mL配置而成。中和剂由含3%的卵磷脂、5%的吐温-80的磷酸盐缓冲液配置而成。

ACS为无色透明液体,无特殊气味。进行杀菌试验时,用无菌硬水配制成不同浓度的稀释液。

试验所用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、PRRSV均由西北农林科技大学动物医学院动物病原微生物防控实验室保存。

1.3 试验方法

1.3.1 细菌悬液与病毒悬液的制备 细菌悬液的制备：取试验菌株的斜面营养琼脂新鲜培养物（37℃培养18—24 h）,用无菌吸管吸取胰蛋白胨生理盐水（TPS）将斜面菌苔洗下,震荡混匀,制成细菌悬液备用（菌数范围1×108—5×108 cfu·mL-1）[33]。

病毒悬液制备：将MARC-145细胞铺布于T75细胞瓶中,用含10% FBS 的DMEM培养基培养,置于37℃、5% CO2培养箱中培养约24 h（细胞密度为80%—90%）,将病毒接种于培养有MARC-145的细胞瓶中。待有80%—90%的细胞出现细胞病变（CPE）时收获病毒,制备病毒悬液,按Reed-Muench法计算半数组织感染量（median tissue culture infective dose,TCID50）[34]。

1.3.2 中和剂鉴定试验 细菌杀灭试验中和剂鉴定试验：设计6组试验：消毒剂+菌悬液（第1组）、（消毒剂+菌悬液）+中和剂（第2组）、（中和剂+消毒剂）+菌悬液（第3组）、（无菌硬水+菌悬液）+中和剂（第4组）、（无菌硬水+菌悬液）+PBS（第5组）、无菌硬水+PBS（第6组）。结果判定：第1组有极少量细菌生长或无菌生长;第2组有菌生长且明显少于第3、4、5组,但多于第1组;第3、4、5组细菌数接近且与阳性对照组细菌数接近;第6组无菌生长。3次重复试验均符合上述条件,结果一致,判定所选中和剂及浓度合适[35]。

病毒灭活试验中和剂鉴定：试验设计6组：消毒剂+病毒悬液（第1组）、（消毒剂+病毒悬液）+中和剂（第2组）、（中和剂+消毒剂）+病毒悬液（第3组）、（无菌硬水+病毒悬液）+中和剂（第4组）、（无菌硬水+病毒悬液）+PBS（第5组）、无菌硬水+PBS（第6组）。结果判定：第1组有极少量病毒生长或无病毒生长;第2组有病毒生长且明显少于第3、4、5组,但多于第1组;第3、4、5组病毒生长与原接种量相近;第6组细胞正常生长。3次重复试验结果一致,判定所选中和剂及浓度合适[18]。

1.3.3 定量杀菌试验 试验在室温下进行,将ACS用无菌硬水分别稀释200、300、400、500、600、700倍。取稀释好的消毒液4.5 mL（阳性对照为无菌硬水）加入无菌试管中,随后加入0.5 mL细菌悬液,充分混匀,作用不同时间后,取0.5 mL菌药混合物（细菌悬液+消毒剂）放入含有4.5 mL中和剂试管中,充分混匀,作用10 min后稀释接种,37℃培养18—24 h后活菌计数,计算杀菌率：杀菌率（%）=1-（残存菌数/总菌数）×100。试验重复3次每次2个生物学重复。

1.3.4 病毒灭活试验 将ACS用无菌硬水分别稀释200、300、400、500、600、700倍。取稀释好的消毒液0.5 mL加入指形管中,室温放置5 min后加入0.5 mL病毒悬液,混匀,作用至规定时间后,取0.1 mL加入0.9 mL的中和剂中,中和10 min,随后取出适量中和后的混合液进行倍比稀释,在铺好的MARC-145的96孔板中测定病毒滴度。平均灭活对数值按下式计算：设阳性对照组（病毒）平均病毒感染滴度为N0,试验组（消毒剂）平均病毒感染滴度为NX,平均灭活对数值=lgN0-lgNX。试验重复3次。

2 结果

2.1 中和剂鉴定

2.1.1 定量杀菌试验中和剂鉴定 用含3%卵磷脂,5%吐温-80的磷酸盐缓冲液作为中和剂,可有效中和ACS 200倍稀释液对试验菌的残留作用,且中和剂溶液对试验菌的生长和培养基状态均无影响（表1）。

Table 1
表1
表1定量杀菌试验中和剂中和后的各试验菌的菌落数
Table 1The colony number of each test bacteria after neutralization by quantitative germicidal test neutralizer(cfu/mL)
分组
Grouping 		大肠杆菌
Escherichia coli		金黄色葡萄球菌
Staphylococcus aureus		沙门氏菌
Salmonella
1112025001900
2243003650013800
3359000002740000020200000
4326000002350000020200000
5378000002590000023800000
6000

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2.1.2 病毒灭活试验的中和剂鉴定 试验结果表明,含3%卵磷脂,5%吐温-80的磷酸盐缓冲液可有效中和ACS 200倍稀释时对猪繁殖与呼吸综合征病毒的残留作用,且中和剂溶液和中和产物对MARC-145细胞的生长和病毒滴度均无影响（图1）。

图1

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图1中和剂、消毒剂、中和产物对MARC-145细胞生长状态的影响

A：只加正常培养基的MARC-145细胞生长状态;B：加过中和剂的MARC-145细胞生长状态;C: 加过消毒剂的MARC-145细胞生长状态;D: 加过中和产物的MARC-145细胞生长状态
Fig. 1Effects of neutralizer, disinfectant and neutralization products on the growth of mack-145 cells

A: the growth state of MARC-145 cells with normal medium only; B: growth state of MARC-145 cells with neutralizing agent; C: the growth state of MARC-145 cells with disinfectant added; D: MARC-145 cell growth state with neutralization product added


2.2 定量杀菌试验

2.2.1 ACS与大肠杆菌作用 ACS与大肠杆菌悬液混匀后立即用中和剂中和,然后平板培养、计数（图2）,其在200、300倍稀释时的灭菌率均为100%,在400倍稀释时灭菌率为99.65%,500倍稀释时灭菌率为99.3%,600倍稀释时灭菌率为97.25%,700倍稀释时灭菌率91.54%;ACS与大肠杆菌悬液混匀后室温培养1d后再用中和剂中和,其灭菌率在200、300、400、500、600、700倍稀释时均为100%;ACS与大肠杆菌悬液混匀后室温培养6d后再用中和剂中和,其灭菌率在200、300、400、500、600、700倍稀释时均为100%（表2）。

图2

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图2大肠杆菌在平板的生长情况

A:阳性对照,以及与不同稀释倍数的ACS立即作用立即中和的大肠杆菌的生长情况;B：阳性对照,以及与不同稀释倍数的ACS作用1天后用中和剂中和的大肠杆菌的生长情况;C：阳性对照,以及与不同稀释倍数的ACS作用6天后用中和剂中和的大肠杆菌的生长情况
Fig. 2Growth of Escherichia coli in plates

A: positive control, and the growth of Escherichia coli immediately neutralized with ACS of different dilution ratios; B: positive control, and the growth of Escherichia coli neutralized by neutralizing agent after 1 day of action with ACS with different dilution ratios; C: positive control, and the growth of Escherichia coli neutralized with neutralizer after 6 days of action with ACS with different dilution ratios


Table 2
表2
表2不同稀释倍数的ACS对大肠杆菌的杀灭率
Table 2Killing rate of ACS with different dilution ratio to Escherichia coli
试验菌
Test bacteria 		稀释倍数
Dilution multiple 		杀灭率 Killing rate (%)
0(h)1(d)6(d)
大肠杆菌
Escherichia coli		200100100100
300100100100
40099.65100100
50099.30100100
60097.25100100
70091.54100100

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2.2.2 ACS与金黄色葡萄球菌作用 ACS与金黄色葡萄球菌悬液混匀后立即用中和剂中和,然后平板培养、计数（图3）,其在200、300、400、500、600 倍稀释时的灭菌率均为100%,在700倍稀释时灭菌率为98.32%;ACS与金黄色葡萄球菌悬液混匀后室温培养1d后用中和剂中和,其灭菌率在200、300、400、500、600、700倍稀释时均为100%;ACS与金黄色葡萄球菌悬液混匀后室温培养6d后用中和剂中和,其灭菌率在200、300、400、500、600、700倍稀释时均为100%（表3）。

图3

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图3金黄色葡萄球菌在平板的生长情况

A:阳性对照,以及与不同稀释倍数的ACS立即作用立即中和的金黄色葡萄球菌的生长情况;B：阳性对照,以及与不同稀释倍数的ACS作用1d后用中和剂中和的金黄色葡萄球菌的生长情况;C：阳性对照,以及与不同稀释倍数的ACS作用6d后用中和剂中和的金黄色葡萄球菌的生长情况
Fig. 3Growth of Staphylococcus aureus in the plates

A: positive control, as well as the growth of Staphylococcus aureus which was immediately neutralized with ACS with different dilution ratios; B: positive control, and the growth of Staphylococcus aureusneutralized with neutralizing agent after 1 day of treatment with ACS with different dilution ratios; C: positive control, and the growth ofStaphylococcus aureusneutralized with neutralizer after 6 days of action with ACS with different dilution ratios


Table 3
表3
表3不同稀释倍数的ACS对金黄色葡萄球菌的杀灭率
Table 3Killing rate of Staphylococcus aureus by ACS with different dilution ratio
试验菌
Test bacteria 		稀释倍数
Dilution multiple 		杀灭率 Killing rate (%)
0(h)1(d)6(d)
金黄色葡萄球菌
Staphylococcus aureus		200100100100
300100100100
400100100100
500100100100
600100100100
70098.32100100

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2.2.3 ACS与沙门氏菌作用 ACS与沙门氏菌悬液无论是混匀后立即中和,还是培养1或6d后中和,其灭菌率在200、300、400、500、600、700倍稀释时均为100%（表4,图4）。

Table 4
表4
表4不同稀释倍数的ACS对沙门氏菌的杀灭率
Table 4The killing rate of different dilution ACS to Salmonella
试验菌
Test bacteria 		稀释倍数
Dilution multiple 		杀灭率 Killing rate (%)
0(h)1(d)6(d)
沙门氏菌
Salmonella		200100100100
300100100100
400100100100
500100100100
600100100100
700100100100

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图4

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图4沙门氏菌在平板的生长情况

A:阳性对照,以及与不同稀释倍数的ACS立即作用立即中和的沙门氏菌的生长情况;B：阳性对照,以及与不同稀释倍数的ACS作用1d后用中和剂中和的沙门氏菌的生长情况;C：阳性对照,以及与不同稀释倍数的ACS作用6d后用中和剂中和的沙门氏菌的生长情况
Fig. 4Growth of Salmonella in plates

A: positive control, and the growth of Salmonella immediately neutralized with ACS of different dilution ratios; B: positive control, and the growth of Salmonella which was neutralized with a neutralizer after 1 day of action with ACS with different dilution ratios; C: positive control, and the growth of Salmonella neutralized with a neutralizer after 6 days of action with ACS with different dilution ratios


2.3 病毒灭活试验

ACS与PRRSV悬液作用60 min后,测得各个稀释倍数的病毒滴度为：200倍稀释时的病毒滴度的对数值为0,300倍稀释时为2.94,400倍稀释时为4.56,500倍稀释时为4.63,600倍稀释时为4.69,700倍稀释时为4.75,阳性对照组为7.13（表5）。通过公式：平均灭活对数值=lgN0-lgNX计算ACS各稀释浓度的平均灭活对数值。200倍稀释时的平均灭活对数值为7.13,300倍稀释时为4.19,400倍稀释时为2.57,500倍稀释时为2.50,600倍稀释时为2.44,700倍稀释时为2.38（表6）。

Table 5
表5
表5与不同稀释度的ACS作用后的病毒滴度对数值
Table 5The value of virus titer pair after the interaction with ACS with different dilutions
稀释倍数 Dilution multiple200300400500600700
病毒滴度对数值 Virus titer value0.002.944.564.634.694.75

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Table 6
表6
表6不同稀释倍数的ACS对PRRSV的平均灭活对数值
Table 6Mean inactivation value of ACS to PRRSV with different dilution ratio
稀释倍数 Dilution multiple200300400500600700
平均灭活对数值 Average inactivation value7.134.192.572.502.442.38

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3 讨论

在2020年抗击新冠疫情的战役中,消毒剂发挥了不可替代的作用,它能及时杀灭环境中存在的新型冠状病毒,有效切断病毒的传播途径[36,37,38]。这使得人们对消毒剂在疫病防控中的作用有了更深刻的认识。在畜牧业中,每年因养殖环境消毒效果不理想所致畜禽疾病对养殖业造成巨大经济损失。滥用抗生素导致的细菌耐药性问题,更加重了对致病微生物防治的困难。大肠杆菌是一种常见的危害人和动物健康的致病菌,能引起人和动物腹泻、出血性肠炎,更严重者可导致溶血性尿毒综合征、终末期肾病。该菌在环境中存活率极高,普通药物难以消灭[1,2]。金黄色葡萄球菌为呼吸道感染常见致病菌,是人和动物获得性感染的一种主要致病菌,可引起化脓性皮肤组织感染、肺炎,重症者可引起脓毒血症、中毒性休克综合征等危及生命[3,4]。沙门氏菌是一种危害较大的食源性致病菌,在我国细菌性食物中毒中,有70%—80%是由沙门氏菌引起的。PRRSV是猪场疫病防控的主要对象,因PRRSV破坏机体免疫系统,至今没有有效的疫苗可彻底地控制该病毒的感染。因此,研究开发一种新型技术攻克致病微生物较难消灭的问题显得尤为重要。消毒剂作为广谱抗菌剂,因价格便宜、使用方便,在畜牧业中被广泛使用。常见的消毒剂有乙醇、含氯消毒剂、二氧化氯、过氧乙酸、过氧化氢、季铵盐类消毒剂。这些消毒剂虽能产生较好的消毒效果,但具有刺激气味或腐蚀性,在日常使用时受到诸多限制。开发一种新型消毒剂迫在眉睫。

ACS作为一种酸化剂,一开始从美国引进,后来逐渐在国内推广,常作为防腐剂广泛应用于即食肉制品的防腐,如牛肉、火腿等,也作为杀虫剂,替代其它有害杀虫剂杀灭软体昆虫,减少树叶和果品霉变[27,30]。ACS强酸低腐蚀的特性,使其作为消毒剂逐渐应用于畜牧业、水产养殖业等。由于我国引进ACS时间较短,其功效尚未被业界广泛认可,因此关于其杀灭微生物的相关研究报道较少。本试验通过研究不同浓度ACS对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的杀灭效果,发现大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌对ACS的敏感性不同。其中,沙门氏菌对ACS最为敏感,其次为金黄色葡萄球菌,最后为大肠杆菌。把不同稀释比例的ACS分别与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌作用不同时间,发现ACS稀释700倍,与菌液作用1 d或1 d以上,能达到100%的灭菌效果。以上结果可为生产应用提供参考,减少ACS用量,节约成本,提高经济效益。

除此之外,本研究还探究了ACS对PRRSV的杀灭效果。PRRSV是对猪场危害性较大的一种RNA病毒,导致猪繁殖与呼吸综合征（PRRS),该病主要以怀孕母猪严重的生殖障碍以及各年龄段猪呼吸系统疾病为特征,每年给我国畜牧业造成巨大经济损失[39,40]。该病毒可通过分泌物在群体中传播,消灭环境中的PRRSV将有助于PRRS的防控工作。本研究结果表明,ACS稀释200倍时与PRRSV作用60 min能完全杀灭该病毒,对PRRSV有较好的杀灭效果。ACS具有低腐蚀性,有望作为一种新兴消毒剂广泛应用于PRRSV的预防工作中。

4 结论

验证了酸性硫酸钙对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的杀灭效果,沙门氏菌对酸性硫酸钙最为敏感,其次是金黄色葡萄球菌,最后是大肠杆菌。并且酸性硫酸钙稀释700倍时与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌悬液作用1 d或1 d以上能达到100%的灭菌效果。200倍稀释的酸性硫酸钙作用60 min能完全杀灭猪繁殖与呼吸综合征病毒。

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