孙洪影^,1, 王岩¹, 李伟佳^1,2, 朱天姝¹, 姜颖¹, 许妍¹, 吴清悦¹, 张志宏^,11沈阳农业大学园艺学院/辽宁省草莓育种与优质栽培重点实验室,沈阳 110866
²山西大同大学炭材料研究所,山西大同 037009

Expression Characteristics and Function of FveD27 in Woodland Strawberry

SUN HongYing^,1, WANG Yan¹, LI WeiJia^1,2, ZHU TianShu¹, JIANG Ying¹, XU Yan¹, WU QingYue¹, ZHANG ZhiHong^{,1 1}College of Horticulture, Shenyang Agricultural University/Liaoning Key Laboratory of Strawberry Breeding and Cultivation, Shenyang 110866
²Institute of Carbon Materials Science, Shanxi Datong University, Datong 037009, Shanxi

通讯作者: 张志宏,E-mail: zhangz@syau.edu.cn

责任编辑: 赵伶俐
收稿日期:2020-08-5接受日期:2020-11-14网络出版日期:2021-05-16

基金资助:

国家自然科学基金.31672113 辽宁省“兴辽英才计划”项目.XLYC1902069

Received:2020-08-5Accepted:2020-11-14Online:2021-05-16
作者简介 About authors
孙洪影,E-mail: 2019200077@stu.syau.edu.cn。










摘要
【目的】新型植物激素独脚金内酯是调控植物分枝发育的关键因子,但独脚金内酯在草莓生长发育中的作用尚不清楚。揭示森林草莓（Fragaria vesca）中独脚金内酯生物合成关键基因DWARF27（D27）的表达特性及主要功能,探索FveD27在草莓分枝以及生长发育过程中的作用,为研究草莓植株构型奠定理论基础。【方法】本研究选用森林草莓作为试验材料,利用RT-PCR方法克隆FveD27的编码区序列,利用MEGA 6.0分析草莓FveD27与苹果、拟南芥等物种中D27的系统进化关系;构建FveD27与GFP的融合载体,利用注射烟草叶片的方法对FveD27进行亚细胞定位分析;通过qRT-PCR技术对FveD27在森林草莓不同器官的表达水平进行定量分析,同时构建FveD27启动子与GUS融合表达载体并通过农杆菌介导法将其转化到森林草莓中,利用GUS染色进一步分析FveD27的表达特性;构建FveD27过表达载体并通过农杆菌介导的叶盘法进行稳定遗传转化,获得FveD27过表达草莓株系。【结果】从森林草莓中克隆出编码区长度为789 bp的FveD27序列;烟草的亚细胞定位结果表明FveD27定位在叶绿体;FveD27在森林草莓组织器官中的表达量由高至低依次为幼叶、茎尖、叶柄、成熟叶、根;克隆出长度为1 670 bp的FveD27启动子序列,GUS活性分析结果显示转pFveD27::GUS融合基因草莓植株的幼叶和芽等部位GUS活性较强,而成熟叶与叶柄部位GUS活性较弱,根部几乎无GUS活性,GUS染色分析揭示的基因表达结果与qRT-PCR结果相符;构建了FveD27过表达载体并通过农杆菌介导获得了过表达FveD27的草莓转基因株系,表型调查结果表明过表达FveD27能够显著抑制新茎分枝的形成,同时增加花序数量。【结论】FveD27具有调控森林草莓新茎分枝发育、花序数量等功能。研究结果可为调控草莓新茎分枝数量和产量等提供新思路。
关键词： 森林草莓;独脚金内酯;D27;亚细胞定位;分枝

Abstract
【Objective】It is known that the new plant hormone strigolactone is a key factor regulating plant branching development, but the role of strigolactone in the growth and development of strawberry plants is unclear. In this study, the expression characteristics and function of the key gene DWARF27 (D27) for strigolactone biosynthesis in woodland strawberry (Fragaria vesca) was revealed, and the role of FveD27 in strawberry branching growth and development was explored, which would lay a theoretical foundation for studying strawberry plant architecture. 【Method】The coding sequence region of strigolactone synthesis key gene FveD27 was cloned by RT-PCR from woodland strawberry. The phylogenetic relationship between FveD27 and D27 in apple, Arabidopsis and other species was analyzed by using MEGA 6.0. A fusion vector of FveD27 and GFP was constructed to inject tobacco leaves for analyzing the subcellular location of FveD27. The expression level of FveD27 in different organs of woodland strawberry was analyzed by qRT-PCR technology. The FveD27 promoter and GUS fusion expression vector was constructed and transformed into woodland strawberry by Agrobacterium-mediated method, and the expression characteristic of FveD27 was further analyzed by GUS staining. The overexpression vector of FveD27 was constructed and the FveD27 overexpression strawberry lines were obtained by Agrobacterium-mediated transformation with leaf disks of woodland strawberry as explants. 【Result】The coding sequence region of FveD27 with the length of 789 bp was cloned from woodland strawberry. The subcellular localization in tobacco showed that FveD27 was located in the chloroplast. The expression levels of FveD27 in woodland strawberry organs from high to low were followed by young leaves, shoot tips, petiole, mature leaves and roots. The FveD27 promoter sequence with a length of 1670 bp was cloned, and transgenic plants with pFveD27::GUS gene showed that the young leaves and buds had strong GUS activity, the mature leaves and petioles had weak GUS activity, while the roots had little GUS activity. The result of FveD27 expression revealed by GUS analysis was consistent with the result by qRT-PCR. The FveD27 overexpression vector was constructed and the transgenic woodland strawberry lines overexpressing FveD27 were obtained with Agrobacterium-mediated transformation. Overexpressing FveD27 in woodland strawberry inhibited significantly the formation of branch crowns and increased the number of inflorescences. 【Conclusion】FveD27 had the functions of regulating the development of branch crowns and the number of inflorescences in woodland strawberry, and this study provided new ideas for regulating the number of branch crowns and yield of strawberry.
Keywords：Fragaria vesca;strigolactone;D27;subcellular localization;branching


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孙洪影, 王岩, 李伟佳, 朱天姝, 姜颖, 许妍, 吴清悦, 张志宏. 森林草莓FveD27的表达特性和功能[J]. 中国农业科学, 2021, 54(10): 2179-2191 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.10.013
SUN HongYing, WANG Yan, LI WeiJia, ZHU TianShu, JIANG Ying, XU Yan, WU QingYue, ZHANG ZhiHong. Expression Characteristics and Function of FveD27 in Woodland Strawberry[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2021, 54(10): 2179-2191 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.10.013


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0 引言

【研究意义】植物株型对植物的生长发育起着十分重要的作用,其主要受遗传、植物内源激素以及温度、光周期、营养条件等内外因素共同调控,其中植物激素在株型的调节机制中具有决定性地位^[1]。分枝发育不仅是决定植物株型的关键因素,还能影响其产量^[2]。独脚金内酯（strigolactone,SL）是近年来在植物体内发现的调控植株生长发育和形态建成的一类新型激素,具有抑制植物分枝的显著功能^[3,4,5]。克隆鉴定草莓SL生物合成途径中的关键基因DWARF27（D27）并阐明其生物学功能,探究FveD27在草莓分枝等生长发育过程中的作用,为提高草莓产量提供理论基础。【前人研究进展】SL是一种以类胡萝卜素为前体合成的特异性小分子萜类化合物,D27编码全反式-β-类胡萝卜素异构酶,该酶处于SL生物合成的上游^[6,7,8]。D27的功能最早在水稻中被发现,通过对d27突变体的深入研究,发现D27具有抑制水稻分蘖的作用^[9,10]。之后研究人员在拟南芥中利用反向遗传学、外源GR24（一种以SL为框架的人工合成物质）以及嫁接试验证实AtD27是抑制次生芽生长所必需的^[11]。此外,菊花中克隆出D27的同源基因DgD27,该基因在拟南芥的异位表达降低分枝数并使突变体d27恢复至野生型表型,表明菊花DgD27对枝条分枝的调控效果^[12]。小麦中也分离出TaD27,并且TaD27-7B在拟南芥的异位表达可以恢复拟南芥d27突变体的表型,说明在小麦中TaD27的功能与AtD27相近^[13]。国内外****还分别对苜蓿、森林草莓、甘蔗以及青天葵中D27的同源基因进行克隆分析,但并未揭示其生物学功能^{[14,15,16,17]}。【本研究切入点】目前,关于SL合成及信号传导基因的研究主要集中在拟南芥、水稻等模式植物,在草莓上的研究鲜有报道^[2,15,18]。笔者课题组前期研究发现,无匍匐茎的森林草莓资源‘Yellow Wonder’的匍匐茎发生突变体（srp）的新茎数量减少,FveD27表达水平显著上调^[19]。此外,外源施用5 μmol?L^-1的GR24可显著抑制森林草莓新茎分枝数量（数据尚未发表）。因此,推测FveD27具有调控草莓新茎发生的功能。【拟解决的关键问题】从森林草莓中克隆FveD27,通过在森林草莓中过表达FveD27来明确其生物学功能。

1 材料与方法

试验于2016年10月至2020年9月在沈阳农业大学园艺学院/辽宁省草莓育种与优质栽培重点实验室,以及沈阳农业大学教学科研试验基地日光温室完成。

1.1 植物材料

森林草莓（Fragaria vesca）资源‘Yellow Wonder’（YW）用于基因克隆、基因表达分析和稳定遗传转化,‘Ruegen’（RG）用于GUS组织活性试验分析。

本氏烟草（Nicotiana benthamiana）用于基因亚细胞定位。

1.2 植物核酸的提取

草莓基因组DNA以及草莓不同器官中的总RNA提取方法参照改良版的CTAB法^[20]。

1.3 引物设计与合成

参考NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中FveD27序列设计基因全长克隆、实时荧光定量PCR与亚细胞定位所需引物;利用蔷薇科基因组数据库（https://www.rosaceae.org/）获得FveD27启动子的参考序列设计启动子克隆引物,引物设计采用Primer 5.0软件,并交由金唯智生物科技有限公司（苏州）合成。引物信息见表1。

Table 1
表1
表1本试验所用引物
Table 1Primers used in this study

引物 Primer	序列（5′→3′） Sequence（5′→3′）	目的 Purpose
FveD27-F FveD27-R	ACGCGTCGACATGGAAGCATCACATTTCT CGCGGATCCCTAACTGGAGCAGTTAT	基因全长克隆 Full-length gene cloning
FveD27-DL-F FveD27-DL-R	AGCAGAATAAGACCGGCAGA TGCAGCTTGGACATTTTGAG	实时荧光定量 Real-time PCR
Fve-26S-F Fve-26S-R	TAACCGCATCAGGTCTCCAA CTCGAGCAGTTCTCCGACAG	内参基因 Reference gene
FveD27(eGFP)-F FveD27(eGFP)-R	TCCCCCGGGATGGAAGCATCACATTT CGGGGTACCACTGGAGCAGTTATTGT	亚细胞定位 Subcellular localization
proFveD27-F proFveD27-R	GCTGCAGGCTGATTCCTAAGGGTATC TGCTCTAGAATGCATGGTGGGGAATTTAAAG	启动子克隆 Promoter cloning

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1.4 基因编码区扩增

使用TaKaRa公司的反转录（RT）试剂盒将森林草莓YW幼叶提取的总RNA反转录为cDNA,以cDNA为模板通过PCR扩增FveD27编码区,反应体系为20 μL:cDNA 0.5 μL、上下游引物（FveD27-F/R）各0.5 μL、10×LA Buffer 2 μL、dNTP 1.6 μL、LA Taq Buffer（Mg²⁺）0.2 μL、ddH₂O 14.7 μL。反应程序为:95℃ 3 min;95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 1 min,32个循环;72℃ 7 min。将电泳检测正确的产物回收纯化,并连接pMD18-T,转化大肠杆菌Trans 5α,筛选阳性克隆并测序,将序列比对正确的载体命名pMD-T-FveD27。

1.5 生物信息学分析

用蛋白质系统分析工具（http://web.expasy.org/protparam/）分析FveD27的理化参数;TMHMM跨膜分析在线软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测FveD27蛋白跨膜情况,参考NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）,查找不同物种中FveD27的同源基因,用DNAMAN 6.0软件对其氨基酸序列进行对比分析;并用MEGA 6.0软件完成系统进化树的绘制。

1.6 亚细胞定位

通过Plant-mPLoc软件（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）在线预测森林草莓FveD27的亚细胞定位。以重组质粒pMD-T-FveD27为模板,用FveD27(eGFP)-F/R引物（表1）克隆获得去除终止子的FveD27目的片段,与双元表达载体pRI101-AN-eGFP连接获得融合表达载体pRI101-FveD27-eGFP。参照冻融法^[21]将质粒pRI101-AN-eGFP（对照）和pRI101- FveD27-eGFP分别转化农杆菌GV3101。利用注射法^[22]进行烟草叶片瞬时表达,之后应用TCS SP8激光共聚焦显微镜（Leica,德国）检测烟草叶片中绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况。

1.7 基因表达分析

以转录水平稳定性较好的森林草莓26S为内参基因,利用qRT-PCR分析FveD27在森林草莓‘YW’不同组织（成熟叶、幼叶、叶柄、茎尖和根）中以及野生型与过表达转基因植株中的表达水平。本试验采用SYBR Green荧光染料法,反应体系为10 μL:5 μL SYBR Green mix、引物（FveD27-DL-F/R与Fve-26S-F/R）各0.5 μL、cDNA 0.5 μL、RNase-free H₂O 3.5 μL。使用QuantStudio^TM 6Flex荧光定量仪（Applied Biosystems,美国）,qRT-PCR反应设置程序为二步法:95℃ 10 min;95℃ 15 s,60℃ 1 min,95℃ 15 s,40个循环;60℃ 1 min,95℃ 15 s。参考2^-ΔΔCT法^[23]对PCR结果进行分析,每个样品进行3次生物学重复与3次技术重复。

1.8 启动子克隆与分析

以森林草莓‘YW’幼叶DNA为模板,proFveD27- F/R为引物（表1）,进行FveD27启动子序列的克隆。将PCR产物纯化与pMD18-T构成重组质粒并测序。将测序成功的阳性克隆重组质粒命名pMD-T- proFveD27。利用PlantCARE软件对克隆得到的FveD27启动子顺式作用元件进行在线预测分析。

1.9 FveD27启动子与GUS融合载体及FveD27过表达载体的构建

利用限制性内切酶PstⅠ与XbaⅠ对pMD-T- proFveD27以及双元表达载体pRI201-AN-GUS同时进行双酶切,之后再利用T4 DNA连接酶连接载体与目的片段,使FveD27启动子替换双元pRI201-AN- GUS中CaMV35S启动子序列,得到植物融合载体pFveD27::GUS。

使用限制性内切酶SmaⅠ与KpnⅠ,对pMD-T- FveD27以及空载pRI101-AN同时进行双酶切,之后利用T4 DNA连接酶将两者进行连接得到过表达载体pRI101-FveD27。

1.10 草莓遗传转化

将pFveD27::GUS与pRI101-FveD27植物表达载体转入农杆菌GV3101中用于森林草莓的遗传转化。森林草莓叶片遗传转化方法采用叶盘法^[24]。经农杆菌浸染后,外植体经共培养、推迟培养、卡那霉素（Kan）抗性选择培养3个阶段获得再生抗性芽。待抗性芽长成单株,进行转化植株叶片的Kan抗性试验以及DNA目的片段扩增的阳性植株筛选^[25]。

1.11 GUS组织化学染色

将野生型与pRI201-FveD27-GUS转基因阳性植株不同组织浸入GUS染液（磷酸钠缓冲溶液、K₃[Fe(CN)₆]溶液、K₄[Fe(CN)₆]溶液、Na₂EDTA、Triton-100溶液、蒸馏水以及现用现加X-Gluc）,用锡箔纸做好避光处理,37℃黑暗条件下染色12—16 h,然后加入无水乙醇进行脱色反应,利用体视显微镜（OLYMPUS,日本）观察试材的染色情况^[26]。

1.12 转基因植株的表型观察与分析

转基因植株和非转基因对照植株移栽到沈阳农业大学教学科研试验基地日光温室,培养条件为白天20—25℃,夜间12—15℃,相对湿度60%—70%,基质栽培配比是珍珠岩、蛭石、蚯蚓粪与草炭为1:2:2:4。选长势健壮的转基因和对照植株各10株,统一编号后用直尺、电子游标卡尺等工具进行植物学性状调查。调查指标:株高、冠径、新茎分枝数、叶片数、叶柄直径、花序数等^[27]。

1.13 数据统计分析

运用DPS 9.5软件中的Duncan算法对植物学性状调查部分数据进行差异性分析。

2 结果

2.1 FveD27的克隆及生物信息学分析

以FveD27-F/R为引物通过RT-PCR扩增出长度为789 bp的FveD27编码区序列（图1-A）,编码262个氨基酸。扩增序列与突变体srp转录组测序拼接的FveD27序列^[19]长度一致（图2）,但是比NCBI中森林草莓‘Hawaii 4’的FveD27（XM_011460303.1）编码区少3个碱基。预测的FveD27编码蛋白的分子量和理论等电点分别为29.45 kD和8.35 kD;包含20种氨基酸,正电氨基酸32个,负电氨基酸29个;不稳定性指数为49.90,属不稳定蛋白,且亲水性平均系数（GRAVY）为-0.257,属亲水蛋白。TMHMM在线网站分析结果表明FveD27不属于跨膜蛋白。FveD27与其他植物D27相似,具有保守的‘DUF4033’结构域（图3-A,3-B黑框内）,该结构域家族存在于细菌和真核生物中,但其功能尚未明确。系统发育关系分析结果（图4）表明,FveD27与蔷薇科苹果中MdD27蛋白的亲缘关系最近,而与拟南芥中AtD27蛋白的亲缘关系较远。

图1

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图1PCR扩增结果

M1:DL2000分子标记;M2:DL5000分子标记;A:FveD27;B:FveD27启动子
Fig. 1PCR amplified product

M1: DL2000 marker; M2: DL5000 marker; A: PCR amplified product of FveD27; B: PCR amplified product of FveD27 promoter

图2

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图2FveD27序列的比对结果

FveD27 NCBI-Nseq:FveD27基因NCBI核酸序列 Nucleic acid sequence of FveD27 gene in NCBI;FveD27 RNA-Nseq:FveD27基因转录组测序核酸序列 Nucleic acid sequence of FveD27 gene in RNA-seq;FveD27 PCR-Nseq:FveD27基因PCR扩增核酸序列 Nucleic acid sequence of FveD27 gene in PCR amplification;FveD27 NCBI-Pseq:FveD27 NCBI氨基酸序列, Amino acid sequence of FveD27 in NCBI;FveD27 RNA-Pseq:FveD27转录组测序氨基酸序列 Amino acid sequence of FveD27 in RNA-seq;FveD27 PCR-Pseq:FveD27 PCR扩增氨基酸序列 Amino acid sequence of FveD27 in PCR amplification
A:FveD27基因序列比较;B:FveD27氨基酸序列比较
Fig. 2The sequencing alignment results of FveD27 sequence

A: FveD27 gene sequence comparison; B: FveD27 amino acid sequence comparison

图3

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图3D27保守结构域分析

AtD27:拟南芥Arabidopsis thaliana,NP_563673.1;CpaD27:番木瓜Carica papaya,XP_021894148.1;FveD27:森林草莓Fragaria vesca,XP_004290643.1;GmD27:大豆Glycine max,XP_003518899.1;MdD27:苹果Malus domestica,XP_028956369.1;OsD27:水稻Oryza sativa,XP_015615253.1;TcD27:烟草Theobroma cacao,XP_017975973.1;VvD27:葡萄Vitis vinifera,XP_003634993.2;ZmD27:玉米Zea mays,XP_008670838.1
A:FveD27蛋白中DUF4033结构域;B:高等植物中D27蛋白保守结构域序列比对
Fig. 3D27 conserved domain analysis

A: The DUF4033 domain is contained in the FveD27 protein; B: Sequence alignment of D27 protein conserved domains in higher plants

图4

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图4高等植物中D27蛋白的进化树分析

Fig. 4Phylogenetic tree of D27 in higher plants

2.2 FveD27亚细胞定位

Plant-mPLoc软件在线预测结果表明FveD27定位在叶绿体。为验证该结果,本研究在本氏烟草叶表皮细胞中进行FveD27的瞬时表达分析。结果如图5,pRI101-AN-eGFP空载侵染的烟草细胞中,绿色荧光蛋白均匀分布在细胞核、细胞膜以及细胞质（图5-A—D）,pRI101-FveD27-eGFP侵染的烟草细胞中,融合蛋白主要在叶绿体中表达（图5-E—H）,该结果与Plant-mPLoc软件预测一致,表明FveD27定位于叶绿体。

图5

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图5FveD27蛋白亚细胞定位

Fig. 5Subcellular localization of FveD27

2.3 FveD27表达特性

以森林草莓‘YW’的成熟叶、幼叶、叶柄、茎尖、根为试材,经qRT-PCR定量分析不同组织器官中FveD27的表达水平。结果表明,FveD27在草莓不同组织器官中表达量有明显差异,主要在幼叶与茎尖中表达,而在叶柄与成熟叶中表达量次之,在根中表达量最低（图6）。

图6

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图6FveD27的器官表达特性

不同小写字母表示差异显着（P<0.05）。下同
Fig. 6Organ expression specificity of FveD27

Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05). The same as below


以森林草莓‘YW’的幼叶DNA为模板,利用PCR扩增出长度为1 670 bp的FveD27启动子序列（图1-B）,该序列不包括转录本中的5′UTR。为进一步探索FveD27启动子在转录水平的调控机制,本研究采用PlantCARE在线数据库对FveD27启动子区域进行分析。结果显示（表2）:FveD27启动子序列中,除了含有大量的TATA-box核心启动元件、CAAT-box启动子和增强子共同顺式作用元件外,还包含了3大类顺式作用元件:（1）光响应元件;（2）环境胁迫响应元件,涉及MYB、干旱以及缺氧、厌氧;（3）激素响应元件,包括水杨酸、赤霉素与茉莉酸甲酯。因此,FveD27可能受到光信号、激素信号和逆境胁迫的调控,并参与草莓植株的生长发育。

Table 2
表2
表2FveD27启动子相关顺式作用元件的预测
Table 2Prediction of cis-acting elements related to FveD27 promoter

顺式作用元件 cis-regulatory element	位置（方向） Position（stand）	序列 Sequence	功能 Function
ACA-motif	247(-)	AATCACAACCATA	（gapA-CMA1）中gapA的一部分涉及光响应性 Part of gapA in (gapA-CMA1) involved with light responsiveness
AE-box	405(-)	AGAAACAA	光响应的元件的一部分 Part of a module for light response
GT1-motif	382(+)	GGTTAA	光响应元件 Light responsive element
I-box	345(-), 986(+)	TGATAATGT	光响应元件的一部分 Part of a light responsive element
LAMP-element	181(+)	CTTTATCA	光响应元件的一部分 Part of a light responsive element
TCT-motif	1159(-)	AACGAC	光响应元件的一部分 Part of a light responsive element
MRE	379(-)	AACCTAA	参与光诱导的MYB绑定位点 MYB binding site involved in light responsiveness
CCAAT-box	881(+)	CAACGG	MYBHv1结合位点 MYBHv1 binding site
MBS	1487(-)	CAACTG	参与干旱诱导的MYB绑定位点 MYB binding site involved in drought-inducibility
GC-motif	920(-)	CCCCCG	参与缺氧特异性诱导性的增强子元件 Enhancer-like element involved in anoxic specific inducibility
ARE	1781(+)	AAACCA	厌氧诱导的必要顺式作用调节元件 cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction
TCA-element	-384(-), -1107(-)	CAGAAAAGGA	水杨酸响应的顺式作用元件 cis-acting element involved in salicylic acid responsiveness
P-box	117(+)	CCTTTTG	赤霉素响应元件 Gibberellin-responsive element
TATC-box	1127(-)	TATCCCA	赤霉素响应的顺式作用元件 cis-acting element involved in gibberellin-responsiveness
TGACG-motif	1406(-), 1413(+)	TGACG	MeJA响应的顺式作用元件 cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness
CGTCA-motif	1406(+), 1413(-)	CGTCA	MeJA响应的顺式作用元件 cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness
TATA-box	188(-)	TATAATAAT	转录起始位点上游-30左右位置的核心启动元件 The core activation element at about -30 upstream of the transcription start site

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为了进一步明确FveD27在草莓植株中的表达特性,将pRI201-FveD27-GUS载体进行森林草莓遗传转化,然后对野生型与转基因试管苗植株进行GUS组织化学染色分析。与对照植株相比（图7-A—D）,转基因植株的幼叶、芽等幼嫩部位（图7-F）蓝色明显,成熟叶（图7-E）与叶柄（图7-G）只有部分被染成蓝色,而根部几乎无显色（图7-H）。GUS染色结果与qRT-PCR（图6）结果一致,表明FveD27在幼叶与茎尖中表达水平较高。

图7

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图7草莓转基因植株GUS活性分析

A—D:非转基因植株的成熟叶片、幼苗、叶柄、根;E—H:转基因植株成熟的叶片、幼苗、叶柄、根。比例尺:1 mm
Fig. 7GUS activity analysis in transgenic strawberry plants

A-D: Mature leaf, young plantlet, petiole and root of non-transgenic plants; E-H: Mature leaf, young plantlet, petiole and root of transgenic plants. Scale bar: 1mm

2.4 FveD27的功能分析

为了确定FveD27在森林草莓中的功能,本研究构建了FveD27过表达载体并利用农杆菌进行森林草莓的遗传转化,获得2个FveD27过表达转基因株系。qRT-PCR数据显示,转基因株系中FveD27表达量是非转基因对照植株的16.6—52.2倍（图8）。

图8

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图8转基因株系的qRT-PCR鉴定及表型（营养生长期）

**表示差异极显著（P<0.01）
Fig. 8qRT-PCR identification and phenotype of transgenic lines (vegetative phase)

** indicate significant differences (P<0.01)


为了揭示FveD27的生物学功能,将转基因株系（T₀代）和非转基因对照植株同时移栽并在温室中培养。对移栽40 d（处于营养生长期）的野生型与转基因植株进行植物学性状调查（图9）,结果显示该时期的转基因植株与对照植株相比,株高并无显著差异,冠径增加,第三叶面积增大,叶柄直径加粗,叶片数减少,新茎分枝数减少。

图9

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图9转基因植株植物学性状调查（营养生长期）

数据为平均值±SD（n=10）。下同
Fig. 9Investigation on botanic characters of transgenic plants (Vegetative phase)

Values are the mean ±SD (n=10). The same as below


为了进一步探究FveD27在草莓生殖生长阶段的影响,对生殖初期的野生型与转基因植株进行调查。如图10所示,在株高上,野生型与转基因植株两者间依旧未表现出明显不同,相比于对照,该阶段的FveD27过表达株系冠径减小,叶片数减少,新茎分枝数减少,并且转基因株系的花序数量明显增多。此外,对T₁代转基因植株的表型也进行了初步观察,结果显示T₁代转基因植株也表现出新茎分枝减少的表型（图11）。

图10

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图10转基因植株植物学性状调查（生殖生长期）

Fig. 10Investigation on botanic characters of transgenic plants (Reproductive phase)

图11

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图11FveD27过表达株系TI代新茎分枝表型

Fig. 11Phenotype of branches in T1 generation of FveD27 overexpression line

3 讨论

3.1 FveD27抑制草莓分枝的可能机制

分枝发育是决定植物株型的一个主要因素,对于蔷薇科果树的植株结构有着重要意义。关于D27抑制分蘖分枝的研究在水稻、拟南芥等模式植物中发现并验证^[9,10,11]。本研究中,FveD27过表达株系可以显著抑制草莓新茎分枝数量,确定了该基因在高等植物中的功能保守,但其作用机制尚不清楚,为此,笔者希望在SL抑制分枝研究结果中找到一些线索。一种为生长素极性运输理论,当D27过量表达后,相对减弱的生长素极性运输导致根部分泌出大量SL,从而加强分蘖芽向外生长的抑制作用。然而SL的生物合成需要受其内、外部环境条件的协同作用,植物可能利用影响SL合成基因的转录来调节SL的合成和分泌^[28,29]。最新研究成果阐述了SL影响生长素运输通道相关过程,SL干扰生长素对PIN极性靶向,是创伤后维管系统再生的关键调节剂^[30]。第二种为腋芽形成与生长机制,植物分枝分蘖的过程一般包括腋芽的形成以及生长两个主要阶段^[31],首先是腋芽在叶腋处形成,然后由腋芽直接或间接的生长形成分蘖或分枝,之间存在短时间的休眠期,并通过激素类物质将其打破,推测该激素物质主要是SL,其协同生长素（抑制腋芽产生）、细胞分裂素（促进分枝）一起诱导休眠期腋芽成枝构型^[32,33,34]。近期,LUO等^[35]在水培种植的水稻上使用高度空间分辨的原位杂交和转录组学的组合在腋芽休眠过程中取得新进展,发现SL功能主要作用于腋芽的叶原基,并且脱落酸ABA参与SL介导的腋芽休眠,细胞分裂素CTK及ABA促进早期腋芽休眠,从而影响植物分枝;DUAN等^[36]发现在水稻中SL能快速激活细胞分裂素氧化酶/脱氢酶OsCKX9,即SL通过OsCKX9调控CTK信号传导通路,直接激活CTK分解代谢以调节水稻的分枝。上述研究进一步完善了多种激素协同调控分枝的网络机制,这与FveD27启动子作用元件分析结果相吻合（表2）,由此推测本研究中FveD27过表达株系间表型的差异性可能由相关激素间的互相作用与串扰引起,这一复杂关系网络还需进行深入研究。

3.2 FveD27对开花的调控作用

目前为止,关于SL的研究主要集中在植物的营养生长阶段,比如:拟南芥或水稻中的下胚轴长度、根结构、枝条分枝、茎伸长、叶形等形态发生与抗逆性中的作用^{[37,38,39,40]}。然而,对SL在植物生殖生长中的作用知之甚少。有研究表明,与腋芽形成相关的LBD蛋白家族,其主要表达在腋芽萌动、器官形成以及侧生与顶端分生组织边界形成等方面,拟南芥中LBD蛋白家族的ASL1调控茎和花序的发育,从而影响侧生分生组织的生成^[41,42],这与FveD27过表达株系中生殖生长初期阶段叶柄直径增加、花序数增加等方面的表型相近,推测D27可能与腋芽形成有关的基因存在某种未知的联系,在表型调查过程中还发现转基因植株表现早花特性,转基因#1与#2株系比对照的开花时间提前5—7 d。此外,WU等^[18]确定SL相关基因在发育中的心皮和花柱中高表达,并参与森林草莓果实发育的早期阶段,这些结果说明SL也作用于植物开花及果实发育等过程,为本研究提供了新的方向。

综上所述,本研究表明了SL生物合成基因FveD27不仅有抑制草莓新茎分枝的作用,而且还影响其花序数量。通过分析讨论该基因抑制分枝的可能作用机制,以及结合当前相关领域的最新研究结果,本研究找到了一条可能调控草莓株型,提高草莓产量的新思路,以期在接下来的试验中展开深入研究。

4 结论

从森林草莓中克隆出编码区为789 bp的FveD27序列,该基因在森林草莓的幼叶与茎尖等幼嫩部位表达量较高。FveD27定位在叶绿体。过表达FveD27的森林草莓转基因株系表型揭示FveD27具有抑制新茎分枝的功能。

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