张宁波^,1, 韩照清¹, 金太花¹, 庄桂玉², 李炯奎³, 郑全胜³, 李永洙^,11临沂大学农林科学学院,山东临沂 276005
²青岛西海岸新区农业农村局,山东青岛 266400
³山东琅琊鸡种业有限公司,山东临沂 276000

Comparison Analysis on Eggshell Quality, Biochemical Index of Calcium Metabolism and Calcium Binding Protein CaBP-D28k mRNA Expression Between Langya Chicken and Its Synthetic Lines

ZHANG NingBo^,1, HAN ZhaoQing¹, JIN TaiHua¹, ZHUANG GuiYu², LI JiongKui³, ZHENG QuanSheng³, LI YongZhu^,11College of Agriculture and Forestry Science, Linyi University, Linyi 276005, Shandong
²Agricultural and Rural Bureau of Qingdao West Coast New District, Qingdao 266400, Shandong
³Shandong Langya Chicken Breed Industry Co., Ltd., Linyi 276000, Shandong

通讯作者: 李永洙,E-mail：liyongzhu@lyu.edu.cn

责任编辑: 林鉴非
收稿日期:2020-04-13接受日期:2020-09-3网络出版日期:2021-05-01

基金资助:

山东省农业重大应用技术创新项目.20186243 琅琊鸡配套系构建与产业化推广项目.20171125

Received:2020-04-13Accepted:2020-09-3Online:2021-05-01
作者简介 About authors
张宁波,E-mail：ningbo712@126.com。









摘要
【目的】探讨影响琅琊鸡及其配套系蛋壳质量和钙代谢的差异因素,为琅琊鸡品种资源保护及开发提供理论依据。【方法】选取240日龄琅琊鸡及其浅麻羽色、深麻羽色配套系各180只,各品系随机分为6个重复,每个重复30只,在相同饲养条件下饲养至300日龄时各重复随机收集鸡蛋30枚,各重复随机选取6只,翅下静脉采集血样、屠宰后收集左腿胫骨及十二指肠、蛋壳腺、肾脏等组织样,用于检测蛋壳质量、钙、磷相关指标及钙结合蛋白CaBP-D28k mRNA的表达量。【结果】浅麻羽色配套系的蛋重显著低于深麻羽色配套系（P<0.05）,而蛋壳重低于其他品系（P>0.05）;另外,蛋壳厚度和蛋壳比率显著高于深麻羽色配套系（P<0.05）,蛋壳强度显著高于其他品系（P<0.05）;浅麻羽色配套系的蛋黄、蛋壳、胫骨中钙含量显著高于深麻羽色配套系（P<0.05）,蛋壳、胫骨中磷含量显著高于其他品系（P<0.05）;蛋壳中灰分含量浅麻羽色配套系最高,其次为琅琊鸡、深麻羽色配套系,而胫骨中灰分含量和胫骨重浅麻羽色配套系最高,其次为琅琊鸡、深麻羽色配套系,品系间均差异显著（P<0.05）;浅麻羽色配套系的体重、胫骨长度显著低于深麻羽色配套系（P<0.05）;浅麻羽色配套系的血钙、降钙素含量显著低于其他品系,而浅麻羽色配套系的血磷、碱性磷酸酶、甲状旁腺素含量显著高于其他品系,且品系间均差异显著（P<0.05）;浅麻羽色配套系的钙结合蛋白含量显著低于深麻羽色配套系（P<0.05）,而两个配套系的骨钙素显著高于琅琊鸡（P<0.05）;浅麻羽色配套系的十二指肠部位钙结合蛋白CaBP-D28k mRNA表达量显著高于其他品系（P<0.05）,而蛋壳腺部位表达量显著高于深麻羽色配套系（P<0.05）,肾脏部位钙结合蛋白表达量显著高于琅琊鸡（P<0.05）。【结论】在240—300日龄产蛋期,浅麻羽色配套系的血磷、碱性磷酸酶、甲状旁腺素、骨钙素等相关活性物质及十二指肠、肾脏、蛋壳腺部位钙结合蛋白CaBP-D28k mRNA表达水平高于其他品系,可能促进其小肠上段对钙磷的吸收和骨钙的释放、转运能力,影响蛋黄、蛋壳中矿物质的沉积和改善蛋壳、胫骨质量。
关键词： 琅琊鸡;配套系;蛋品质;营养成分;钙结合蛋白

Abstract
【Objective】The aim of this research was to provide a theoretical basis for the conservation of Langya Chicken breed resources and the development of its synthetic lines based on the comparative study on eggshell quality and calcium metabolism of Langya Chicken and its two synthetic lines. 【Method】Each of one hundred and eighty 240-day-old birds of Langya Chicken and its two synthetic lines (Light linen and Dark linen synthetic lines), were randomly divided into 6 repeats, each with 30 replicates. When the chicken were raised to 300 days of age under the same breeding conditions, thirty eggs and six birds were randomly collected from each repeat, blood samples were taken from the veins under the wings, and tissue samples from the left leg tibia and duodenum, egg shell glands, and kidneys were collected after slaughter. Calcium- and phosphorus-related indicators and the expression levels of calcium binding protein CaBP-D28k mRNA were detected. 【Result】The results showed that the egg weight of the light linen synthetic line was significantly lower than that of the dark linen synthetic line (P<0.05), and the eggshell weight was lower than other lines (P>0.05). In addition, the eggshell thickness and eggshell ratio were significantly higher than those of the linen line (P<0.05), the strength of eggshell was significantly higher than that of other lines (P<0.05). The calcium content of egg yolk, eggshell, and tibia in light linen synthetic line was significantly higher than that in dark linen synthetic line (P<0.05). The content of phosphorus in the tibia was significantly higher than that of other lines (P<0.05), and the ash content in eggshells and tibia was the highest in the light linen synthetic line, followed by the Langya Chicken and the dark linen synthetic line (P<0.05). The body weight and tibia length of light linen synthetic line was significantly lower than those of dark linen synthetic line (P<0.05). The contents of plasma calcium and calcitonin in the light linen synthetic line were significantly lower than those in other lines, while the plasma phosphorus, alkaline phosphatase, and parathyroid hormone contents in the light linen synthetic line were significantly higher than those in other lines, and the differences between the lines were significant (P<0.05); the calcium binding protein content of the light linen synthetic line was significantly lower than that of the dark linen synthetic line (P<0.05). While the osteocalcin of the synthetic lines was significantly higher than that of the Langya Chicken (P<0.05). The expression level of calcium binding protein CaBP-D28k mRNA in duodenum of light linen synthetic line was significantly higher than that of other lines (P<0.05), and the expression level in eggshell gland was significantly higher than that of dark linen synthetic line (P<0.05). The expression level of calcium binding protein in kidney was significantly higher than that of Langya Chicken (P<0.05). 【Conclusion】The above results showed that the plasma phosphorus, alkaline phosphatase, parathyroid hormone, osteocalcin and other related active substances and calcium-binding protein CaBP-D28k mRNA expression level in duodenum, kidney, and shell glands of light linen synthetic lines was all higher than other lines during the 240-300 day-old laying period. which could promote the absorption of calcium and phosphorus in the upper small intestine and the release and transport of bone calcium, affect the deposition of minerals in egg yolk and eggshell, and improve the quality of eggshell and tibia.
Keywords：Langya Chicken;synthetic line;egg quality;nutrient content;calcium binding protein


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本文引用格式
张宁波, 韩照清, 金太花, 庄桂玉, 李炯奎, 郑全胜, 李永洙. 琅琊鸡及其配套系蛋壳质量、钙代谢生化指标和钙结合蛋白CaBP-D28k mRNA表达的比较[J]. 中国农业科学, 2021, 54(9): 2017-2026 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.09.017
ZHANG NingBo, HAN ZhaoQing, JIN TaiHua, ZHUANG GuiYu, LI JiongKui, ZHENG QuanSheng, LI YongZhu. Comparison Analysis on Eggshell Quality, Biochemical Index of Calcium Metabolism and Calcium Binding Protein CaBP-D28k mRNA Expression Between Langya Chicken and Its Synthetic Lines[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2021, 54(9): 2017-2026 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.09.017


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0 引言

【研究意义】矿物元素中钙磷是动物骨骼发育密切相关的必需元素,饲粮中适宜的钙磷元素含量对家禽的生长发育、产蛋、蛋壳质量及骨骼正常发育起到重要作用^[1],过量或缺乏会导致机体钙磷代谢紊乱,进而引起生长滞留、生产性能下降、蛋壳质量降低以及骨质疏松症等现象^[2]。蛋壳质量直接影响鲜蛋的保存以及孵化期间热湿传递、破壳等环节。蛋壳强度受到品种、日龄、日粮营养水平、光照、疾病等因素的影响^[3,4,5]。优良的蛋壳质量不仅便于保存和运输,而且提高种蛋孵化率。【前人研究进展】由于遗传基础不同,不同品种的蛋壳品质往往有一定差异。在相同饲养管理条件下蛋壳质量主要受到机体的矿物质代谢水平的影响,而机体的钙调节主要受激素及其他些活性因子的协同作用影响^[5,6,7]。研究报道,动物机体的合成代谢基因表达与外部环境变化节律同步,影响着体内的生物过程和机体功能^[8],肠道内钙离子的吸收、转运、沉积是一个复杂的生理反应过程。日粮中的钙不仅维持机体组织细胞的正常活动和血钙水平,而且形成骨组织和蛋壳的主要成分。钙代谢过程中需要V_D和钙结合蛋白（CaBP-D28k）的调节,而钙吸收主要部位在十二指肠和肾脏。其中,钙结合蛋白在十二指肠部位的钙吸收和蛋壳腺中游离钙的沉积以及蛋壳的形成中发挥重要作用^[9]。【本研究切入点】琅琊鸡作为山东省地方品种,具有体格小、抗病力强、适应性好、饲料报酬率高等优点^[10]。清远麻鸡的蛋黄色泽较深、蛋壳厚度、蛋壳强度等方面优于其他品种^[11]。南丹瑶鸡具有蛋大小适中,蛋黄颜色深,蛋清黏稠,口感好等特点^[12]。而琅琊鸡存在蛋重小、产蛋量低、蛋壳质量差等方面的缺陷,为改善产蛋性能,以琅琊鸡为父本,与蛋重大、蛋壳质量较好的清远麻鸡、南丹瑶鸡为母本进行杂交,经过横交、测交后3个世代的选育,培育出浅、深麻羽色配套系。【拟解决的关键问题】本试验通过测定琅琊鸡及其配套系蛋壳质量、生化指标和相关基因表达量变化规律进行比较分析,旨在为琅琊鸡保种、育种工作提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试验设计

试验与2019年3月15日开始分组预试验,3月25日正式开始试验,240日龄浅麻羽色配套系、深麻羽色配套系和琅琊鸡商品代母鸡3种品系各180只,随机分为6个重复,每个重复30只,试验至300日龄为止,试验在山东琅琊鸡种禽有限公司保种场进行。

1.2 试验饲粮组成及饲养管理

琅琊鸡以及配套系饲粮营养水平参考普通黄羽鸡的营养需要^[13]。基础饲粮组成及营养水平见表1。各组鸡群在全封闭式鸡舍立体三层阶梯笼养条件下饲养,自由饮水和每日喂3次饲粮,每日光照16 h。

Table 1
表1
表1试验日粮中主要组成及营养水平（风干基础）
Table 1Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis)

项目 Items	含量 Content (%)		营养水平 Nutrient levels	含量 Content
玉米 Corn	58.94		粗蛋白 CP	16.50
大豆粕Soybean meal	1.86		代谢能Me/(MJ·kg-1) 2)	12.82
麸皮Rice bran	8.61		钙 Ca	3.90
玉米胚芽粕Corn germ meal	5.00		有效磷 P3)	0.44
干酒糟DDGS	10.00		盐NaCl	0.34
石粉 Limestone	5.07		赖氨酸 Lys	0.79
玉米蛋白粉Corn gluten meal	5.00		蛋氨酸 Met	0.39
磷酸氢钙 CaHPO4	1.12		蛋+胱Met+Sys	0.66
DL-蛋氨酸 Met	0.03		苏氨酸Thr	0.59
盐(氯化钠) NaCl	0.32
70%赖氨酸Lys	0.50
70%氯化胆碱 Choline chloride	0.05
预混料 Premix1)	3.50
总计 Total	100.00

1)预混料为每千克饲粮提供：VA 1000 IU,VD3 3500 IU,VE 20 IU,VK 32 mg,硫胺素 1 mg,核黄素 5 mg,泛酸钙 6 mg,烟酸 30 mg,吡哆醇 6 mg,生物素 1.5 mg,叶酸 2.5 mg,VB 122 mg,胆碱 500 mg,Mn 65 mg,I 0.8 mg,Fe 60 mg,Cu 8 mg,Zn 80 mg,Se 0.3 mg2)代谢能为计算值,其余为实测值3)饲料表观消化率方法测定有效磷含量
1) The premix provided the following per kg of diets：VA 1000 IU, VD3 3500 IU, VE 20 IU, VK 32 mg, thiamine 1 mg, riboflavin 5 mg, calcium pantothenate 6 mg, nicotinic acid 30 mg, pyridoxine 6 mg, biotin 1.5 mg, folic acid 2.5 mg, VB 122 mg, Chline 500 mg, Mn 65 mg, I 0.8 mg, Fe 60 mg, Cu 8 mg, Zn 80 mg, Se 0.3 mg2) ME was a calculated value, while the others were measured values3)The content of available phosphorus was determined by apparent digestibility method

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1.3 试验方法

1.3.1 生产性能测定 测定琅琊鸡及其配套系5%开产体重、300日龄时蛋重以及240—300日龄期间产蛋率。

1.3.2 样品的采集 300日龄时琅琊鸡及其浅、深麻羽色配套系,每个重复每天6枚,连续收集5 d,各重复30枚鸡蛋中随机取5枚蛋。试验结束后禁食空腹,于第二天7：00—8：30时各重复组中随机选取5只鸡翅下静脉采集血样,3 000 r/min离心15 min,分离血浆于-20℃冻存,以备测定血液相关指标;采血后屠宰取出左腿胫骨、十二指肠黏膜、蛋壳腺和肾脏等组织样,迅速放入液氮中,并在-80℃超低温保存备用。

1.3.3 鸡蛋品质分析 按照鸡蛋品质的测定及计算方法^[14],分析蛋重、蛋黄比例、蛋壳比例、蛋壳厚度（蛋壳厚度计PEACOCK MODEL P-1）、蛋壳强度（蛋壳强度测定仪KQ-1A）等指标。

1.3.4 蛋壳和胫骨中矿物质含量以及胫骨强度、密度、指数测定 鸡蛋破壳后,小心去掉蛋壳和蛋清部分,蛋黄表面附着的蛋清剩余液用吸水纸清理后可食蛋黄部分用打蛋器混匀后,取蛋黄混合样中150 g于65℃烘干测定初水分并粉制风干样,之后105℃下烘干24 h;左侧胫骨完全剔净之后在乙醚脱脂12 h,用游标卡尺测量胫骨长度,在105℃下把胫骨和蛋壳烘干24 h。灰分含量系用灼烧、称重后计算得出（GB 5009.4-2016）,钙含量的检测采用EDTA滴定法（GB 5009.92-2016）,磷含量检测采用钼蓝分光光度法（GB 5009.87-2016）进行测定。取琅琊鸡及配套系的完整左胫骨,采用三点弯曲法,用TAXT-Plus 质构仪（Stable Micro Systems Corp,英国）测定胫骨强度;骨矿物质的含量采用单光子吸收测定法（骨矿测定仪SD200）进行测定,胫骨面积取胫骨骺端处。胫骨密度（kg/cm²）=骨矿含量（g）/[测定面积（cm²）×1000];胫骨指数=胫骨重（g）/体重（g）×100%。

1.3.5 血液生化指标分析 血浆钙（Ca）、磷（P）和碱性磷酸酶（ALP）采用比色法（可见分光光度计V-5600）测定^[15];钙结合蛋白D28k（CaBP- D28k）^[16]、骨钙素（BGP）^[17]、甲状旁腺素（PTH）^[17]含量测定采用放免法（全自动放免计数仪XH-6020）;降钙素（CT）^[17]含量采用酶联免疫吸附（酶标仪ELX808）试剂盒测定,试剂盒均购自武汉基因美科技有限公司。

1.3.6 钙结合蛋白CaBP-D28k mRNA表达量检测 用Trizol（Invitrogen）法提取十二指肠、蛋壳腺、肾脏样品总RNA,反转录为cDNA后-20℃保存待测。用Primer 5.0软件设计CaBP-D28k和β-actin特异性引物,由上海生工生物技术有限公司合成,引物序列见表2。

Table 2
表2
表2Real-Time PCR引物序列
Table 2Primer sequences for RT-PCR

基因 Gene	基因编号 GenBank ID	引物序列 Sequence of primers (sense/antisense) (5′-3′)	产物大小 Length (bp)
钙结合蛋白 CaBP-D28k	NM_205513	5′-TTAAATCTGCGTTGCTTCCATACA-3′ -3′	298
		5′-GGCCCATCCTGCACTCCATAAC-3′ -3′
β肌动蛋白 β-actin	NM_205518	5′-CCCAAGGCCAACCGTGAGAAGAGT-3′ -3′	337
		5′-CGAAGTCCAGGGCCACGTAGCAGAG-3′ -3′

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参照TAVERNIERS等^[18]方法,提取阳性克隆质粒,用紫外分光光度仪测定质粒浓度,将此定量模板倍比稀释得到7个不同浓度的标准模板,采用优化好的PCR条件进行荧光定量PCR,以Ct值为纵坐标,以稀释倍数的对数为横坐标,建立相对定量标准曲线。以β-actin作为内标,使用Real-Time PCR检测十二指肠、蛋壳腺、肾脏中CaBP-D28k mRNA的表达量。用SYBR Green I染色,在荧光定量仪（Light Cycler,Rotor-Gene）上进行扩增和数据分析。

1.4 数据处理

试验数据采用SPSS 18.0软件进行统计分析,并处理数据,组间差异用LSD法分析,结果以（平均数±标准差）表示。CaBP-D28k mRNA表达量使用Bio-Rad CFX Manager软件分析,其相对表达量以2^-△△Ct形式表示。

2 结果

2.1 琅琊鸡及其配套系产蛋性能和蛋壳质量的分析

表3数据显示,浅麻羽色配套系产蛋率、蛋壳厚度和蛋壳比例显著高于深麻羽色配套系（P<0.05）;浅麻羽色配套系蛋重显著低于深麻羽色配套系（P<0.05）,蛋壳重差异不显著（P>0.05）;另外,浅麻羽色配套系蛋壳强度显著高于其他品系（P<0.05）,而蛋黄比例高于其他品系,但差异不显著（P>0.05）。

Table 3
表3
表3琅琊鸡及其配套系产蛋性能和蛋壳质量分析
Table 3Egg shell quality and performance analysis of Langya Chicken and its synthetic lines

项目 Items	琅琊鸡 Langya Chicken	浅麻羽色配套系 Light linen synthetic line	深麻羽色配套系 Dark linen synthetic line	P值 P value
产蛋率 Egg production (%)	68.23±5.35ab	73.45±6.32a	62.78±3.45b	0.027
蛋重 Egg weight (g)	49.58±4.25ab	46.09±2.55a	55.92±1.79b	0.035
蛋壳重Eggshell weight (g)	4.53±0.34	4.44±0.26	4.87±0.18	0.747
蛋壳强度 Eggshell strength (kg·cm-2)	32.27±5.74a	39.65±8.34b	30.87±8.90a	0.041
蛋壳厚度Eggshell thickness (mm)	34.85±2.61ab	35.36±3.07a	32.26±2.32b	0.024
蛋黄比例Yolk ratio (%)	33.82±5.74	34.23±2.45	33.64±2.19	0.874
蛋壳比例 Eggshell ratio (%)	9.14±0.86ab	9.63±0.22a	8.71±0.43b	0.036

同行数据标不同小写字母表示差异极显著（P<0.05）,相同字母或无字母表示差异不显著（P>0.05）。下同。n=6,产蛋率除外
In the same row, values with different small letter mean significant difference（P<0.05）, while with the same or no letter mean no significant difference（P>0.05）. The same as below. n=6,except for egg production rate

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2.2 琅琊鸡及其配套系鸡蛋和胫骨中钙、磷成分含量分析

浅麻羽色配套系蛋黄中钙含量显著高于深麻羽色配套系（P<0.05）,而配套系间磷和灰分含量差异不显著（P>0.05）;浅麻羽色配套系蛋壳中钙含量显著高于深麻羽色配套系（P<0.05）,磷含量显著高于其他品系（P>0.05）,并且灰分含量最高,其次为琅琊鸡、深麻羽色配套系,且品系间均差异显著（P<0.05）;浅麻羽色配套系的胫骨中钙、磷含量显著高于深麻羽色配套系、琅琊鸡,且品系间均差异显著（P<0.05）,而浅麻羽色配套系的灰分含量最高,其次为琅琊鸡、深麻羽色配套系,且品系间均差异显著（P<0.05,表4）。

Table 4
表4
表4琅琊鸡及其配套系鸡蛋和胫骨中钙、磷成分含量分析
Table 4Analysis of calcium and phosphorus content in eggs and tibia of Langya Chicken and its synthetic lines

项目 Items		琅琊鸡 Langya Chicken	浅麻羽色配套系 Light linen synthetic line	深麻羽色配套系 Dark linen synthetic line	P值 P value
蛋黄 Yolk	钙Ca (%)	1.09±0.05ab	1.24±0.07a	1.06±0.02b	0.024
	磷 P (%)	2.40±0.05	2.28±0.04	2.47±0.07	0.821
	灰分Ash (%)	1.70±0.01	1.88±0.02	1.64±0.04	0.067
蛋壳 Eggshell	钙Ca (%)	32.15±2.14ab	33.31±2.62a	31.38±1.38b	0.042
	磷 P (%)	0.12±0.03a	0.14±0.02b	0.12±0.04a	0.045
	灰分Ash (%)	38.17±5.41a	40.38±6.24b	36.40±3.74c	0.037
胫骨 Tibia	钙Ca (%)	34.14±1.42a	38.45±4.11b	36.27±2.85c	0.044
	磷 P (%)	13.18±1.74a	15.78±2.14b	14.12±1.06c	0.032
	灰分Ash (%)	44.56±2.84a	48.26±6.42b	40.42±5.14c	0.067

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2.3 琅琊鸡及其配套系体重和胫骨质量分析

浅麻羽色配套系的5%开产体重、300日龄体重、胫骨长度显著低于深麻羽色配套系（P<0.05）,而胫骨重最高,其次为琅琊鸡、深麻羽色配套系,且品系间均差异显著（P<0.05）;另外,浅麻羽色配套系的胫骨指数最高,其次为琅琊鸡、深麻羽色配套系,而浅麻羽色配套系胫骨密度最高,其次为深麻羽色配套系、琅琊鸡,但品系间均差异不显著（P>0.05,表5）。

Table 5
表5
表5琅琊鸡及其配套系胫骨质量分析
Table 5Tibia quality analysis of Langya Chicken and its synthetic lines

项目 Items	琅琊鸡 Langya Chicken	浅麻羽色配套系 Light linen synthetic line	深麻羽色配套系 Dark linen synthetic line	P值 P value
开产体重 Birth weight (g)	1354.8±35.6a	1368.5±64.8a	1465.3±49.2b	0.037
300日龄体重 Weight at 300 days (g)	1625.71±24.45ab	1551.57±62.41a	1727.14±17.80b	0.011
胫骨重Tibial weight (g)	57.55±2.85a	59.15±3.74b	54.23±5.27c	0.046
胫骨长度Length (cm)	80.17±6.42ab	79.29±3.47a	83.00±2.46b	0.042
胫骨指数Tibial index (%)	3.54±0.14	3.81±0.31	3.14±0.10	0.072
胫骨密度TMD (kg·cm-2)	14.22±2.41a	16.47±3.85b	14.87±2.67a	0.067

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2.4 琅琊鸡及其配套系血液指标分析

浅麻羽色配套系的血浆钙、磷、降钙素含量最低,其次为琅琊鸡、深麻羽色配套系,品系间均差异显著（P<0.05）;而浅麻羽色配套系的碱性磷酸酶含量显著高于琅琊鸡、深麻羽色配套系,且品系间均差异显著（P<0.05）;浅麻羽色配套系的甲状旁腺素含量最高,其次为深麻羽色配套系、琅琊鸡,且品系间均差异显著（P<0.05）;浅麻羽色配套系的钙结合蛋白含量显著高于其他品系（P<0.05）,而配套系的骨钙素均显著高于琅琊鸡（P<0.05,表6）。

Table 6
表6
表6琅琊鸡及其配套系血液指标分析
Table 6The plasma indexes analysis of Langya Chicken and its synthetic lines

项目 Items	琅琊鸡 Langya Chicken	浅麻羽色配套系 Light linen synthetic line	深麻羽色配套系 Dark linen synthetic line	P值 P value
血浆钙Plasma Ca (mmol·L-1)	1.46±0.24a	1.32±0.31b	1.58±0.18c	0.028
血浆磷Plasma P (mmol·L-1)	0.78±0.27a	0.72±0.56b	0.86±0.34c	0.043
碱性磷酸酶ALP (U·L-1)	24.62±2.52a	29.50±2.74b	19.77±5.47c	0.024
甲状旁腺素PTH (pg·mL-1)	75.68±14.12a	96.74±10.27b	87.26±9.51c	0.011
钙结合蛋白CaBP-D28k (ng·mL-1)	17.14±1.21a	19.35±2.17b	16.84±1.72a	0.015
骨钙素BGP (ng·mL-1)	2.98±0.52a	3.75±0.27b	3.64±0.85b	0.041
降钙素CT (pg·mL-1)	16.24±1.40a	14.76±1.85b	17.68±2.40c	0.017

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2.5 琅琊鸡及其配套系不同部位钙结合蛋白基因CaBP-D28k mRNA表达的分析

由图1可知,浅麻羽色配套系十二指肠部位钙结合蛋白基因CaBP-D28k mRNA表达量显著高于其他品系（P<0.05）,浅麻羽色配套系蛋壳腺CaBP-D28k mRNA表达量显著高于深麻羽色配套系（P<0.05）,浅麻羽色配套系肾脏CaBP-D28k mRNA表达量显著高于琅琊鸡（P<0.05）。浅麻羽色配套系十二指肠和蛋壳腺以及肾脏CaBP-D28k mRNA表达量与琅琊鸡比较分别上调28.37%、10.09%、23.88%,而与深麻羽色配套系比较分别上调29.36%、23.40%、9.84%。

图1

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图1琅琊鸡及其配套系不同组织部位钙结合蛋白CaBP- D28k mRNA的表达

数柱标注*表示差异显著（P<0.05）
Fig. 1The expression of CaBP-D28k mRNA in different tissues of Langya Chicken and its synthetic lines

Value columns with * indicated that the difference was significant (P<0.05)

3 讨论

3.1 琅琊鸡及其配套系产蛋性能和蛋壳质量的分析

蛋鸡产蛋性能主要取决于养殖环境、疫病、体重、饲料均能影响^[19]。开产体重反映了后备鸡的体质和性成熟情况,影响产蛋周期产蛋性能的发挥。研究表明,坝上长尾鸡的开产体重与开产日龄呈极显著正相关,开产日龄与前期产蛋量呈极显著负相关^[20]。本研究发现,开产体重较大的深麻羽色配套系产蛋数最少,与前者研究结果相符合。鸡蛋品质指标主要包括蛋重和蛋壳质量（强度、厚度）等方面,受到遗传、饲养管理、健康状态和营养水平等因素的影响^[21]。蛋重作为家禽育种工作中重要的目标,也是衡量蛋品质的主要指标。本试验结果表明,在相同饲养条件下的深麻羽色配套系的蛋重显著大于浅麻羽色配套系,这与选育体系中母系品种直接相关,由于南丹瑶鸡成年鸡平均蛋重50—54 g^[12],远大于清远麻鸡的46.55 g^[11]。蛋壳质量直接影响鲜蛋的保存以及孵化期间热湿传递、破壳等环节。优良的蛋壳质量不仅便于保存和运输,而且提高种蛋孵化率。研究表明,蛋壳厚度、蛋壳重等蛋壳质量与蛋壳强度呈高度的正相关^[22],并且300 d母鸡产蛋量与蛋壳强度呈强正相关^[23],而蛋壳质量主要取决于钙和磷含量及其比率,蛋壳钙主要来自于肠道吸收和骨钙^[24,25]。本研究结果表明,浅麻羽色配套系蛋壳厚度、蛋壳强度、蛋壳比率显著高于深麻羽色配套系,且浅麻羽色配套系产蛋率显著高于深麻羽色配套系,与已有研究结果^[23]相一致。说明两个配套系对钙、磷等矿物质吸收能力存在显著差异。

3.2 琅琊鸡及其配套系鸡蛋和胫骨中钙、磷成分含量分析

蛋黄中富含蛋白质、脂肪和钙、磷等矿物质,主要来源于日粮中养分,其中钙、磷通过母鸡的一系列吸收、转运过程沉积在卵泡中。家禽的卵巢发育受遗传、环境、营养等因素的影响, 其中遗传决定其生产潜能。董传豪报道,地方优质鸡和锦医大1、2号配套系间蛋黄含钙量呈现显著差异^[26]。本试验也发现,浅麻羽色与深麻羽色配套系间蛋黄中含钙量差异显著,说明两个配套系父母代对蛋黄中矿物质的沉积有较大影响,并且产蛋性能的高低直接反映成熟卵泡的正常排卵能力。本研究结果显示,浅麻羽色配套系产蛋率显著高于深麻羽色配套系,而体重显著低于深麻羽色配套系。是否与深麻羽色配套系体重过大或卵巢过重而导致过多的卵泡干扰次级卵泡的发育和钙、磷等矿物质的沉积有关,尚需要进一步验证。蛋壳在形成过程中由于子宫本身不存在或含有很少量的钙,钙离子跨膜转运对子宫内膜的钙代谢有重要的影响,故蛋壳形成所需要的钙磷直接来源于血液和骨骼^[27]。蛋壳中钙有60%—75%直接来自饲料,其余来源于骨钙^[22],产蛋期饲粮中的钙优先沉积在髓骨中,而髓骨成为蛋壳形成的动态钙源^[28]。本研究发现,浅麻羽色配套系蛋壳、胫骨中钙、灰分含量显著高于深麻羽色配套系。说明在饲养条件相同情况下,浅麻羽色配套系在产蛋期骨钙分解能力优于深麻羽色配套系,高产蛋鸡需释放骨骼钙、磷进入血液以满足产蛋需求,当蛋鸡产蛋率降至70%时,由于产蛋所需钙、磷消耗下降,骨动员相关基因表达减少,骨骼、血液钙含量均略有回升^[29]。本试验过程中深麻羽色配套系一直处在低产蛋水平,并且血钙浓度高于浅麻羽色配套系,促进降钙素分泌,抑制小肠对钙的吸收和骨钙的释放^[30],影响深麻羽色配套系蛋壳、胫骨中钙水平。另外,本试验结果也显示产蛋率较低的深麻羽色配套系血磷含量显著高于浅麻羽色配套系,与产蛋高峰期血磷含量低于低产期的研究结果相一致,而血磷中含量过高会影响钙的吸收,影响蛋壳质量^[31]。本研究还发现,浅麻羽色配套系胫骨长度显著小于深麻羽色配套系,而胫骨指数、胫骨密度高于深麻羽色配套系。胫骨长度是反映母鸡骨骼发育情况,其发育程度直接说明母鸡整个产蛋期产蛋个数和产蛋总量。本试验结果显示,浅麻羽色配套系产蛋率高于深麻羽色配套系,但其胫骨长度显著低于深麻羽色配套系。其结果是否与深麻羽色配套系体重显著大于浅麻羽色配套系相关,有待于进一步探讨,并且目前尚未有琅琊鸡胫骨标准指标,按照仅有胫骨长度大小评定产蛋性能高低缺乏依据。胫骨中钙、磷含量是反映蛋鸡钙、磷营养状况的指标,而骨强度、骨密度等指标是对骨骼质量评价的重要指标。随着产蛋性能的提高,机体为不断满足产蛋需求,髓质骨进一步降解,同时开始动用皮质骨,降低了骨骼质量,骨的稳定性变差,并且不同产蛋率蛋鸡胫骨骨吸收水平存在显著差异^[29]。本试验结果显示,产蛋率高的浅麻羽色配套系胫骨中钙、磷、灰分含量以及胫骨密度显著高于其他品系。说明浅麻羽色配套系在产蛋阶段胫骨动员和重建能力强于深麻羽色配套系,并且反映胫骨中钙磷含量和胫骨密度与鸡蛋和蛋壳中钙磷水平有一定的相关性。因此,胫骨质量指标可作为评价鸡蛋中钙、磷以及蛋壳质量的有意义指标^[32]。

3.3 琅琊鸡及其配套系血液指标分析

本研究发现,在240—300日龄产蛋期,与钙（或磷）代谢相关的结合蛋白和主要激素在两个配套系表现出显著差异。据研究报道,饲粮中大部分钙以难溶性钙盐形式存在,必须经消化道内转变成Ca²⁺才能被吸收,其吸收主要在小肠上段,家禽在相关激素和活性物质的协调下,使血钙、磷浓度保持相对恒定,维持家禽诸多组织和细胞的正常活动^[9,33]。本试验结果显示,浅麻羽色配套系血钙、磷浓度显著低于琅琊鸡和深麻羽色配套系,而浅麻羽色配套系胫骨质量、蛋壳质量优于深麻羽色配套系,同时浅麻羽色配套系具有较高的产蛋率和蛋壳比率,说明浅麻羽色配套系钙磷动态吸收、转运能力可能优于深麻羽色配套系。已有研究表明,在肠黏膜细胞中存在多种钙结合蛋白,能与Ca²⁺结合,促使钙被吸收^[34]。本研究发现,浅麻羽色配套系中钙结合蛋白CaBP-D28k含量显著高于琅琊鸡和深麻羽色配套系,说明血浆中钙结合蛋白CaBP-D28k含量的升高促进钙的吸收,影响其胫骨、蛋壳、蛋黄中钙含量。甲状旁腺素（PTH）、降钙素（CT）影响家禽小肠上段对钙磷的吸收,维持钙磷在骨组织与体液间平衡,促进肾脏对钙磷的排泄,共同调节血钙和血磷浓度的动态平衡,促进骨的代谢。本试验结果显示,浅麻羽色配套系血Ca²⁺浓度显著低于琅琊鸡和深麻羽色配套系,并且PTH浓度显著高于其他品系,可能是蛋壳形成过程中钙沉积增加引起血钙降低,并进一步诱发PTH分泌增加^[35]。降钙素（CT）分泌也受到血钙浓度调控,血钙浓度与降钙素分泌呈正相关。本试验结果也显示,浅麻羽色配套系血Ca²⁺浓度显著低于琅琊鸡和深麻羽色配套系,而CT浓度显示明显低于其他品系。由于浅麻羽色配套系CT浓度降低,能促进间叶细胞转化为破骨细胞,激活破骨细胞活性,促成骨盐溶解及骨基质分解,同时能抑制破骨细胞转化为成骨细胞,并降低其活性,促进小肠对钙的吸收和骨钙的释放^[33],进而影响浅麻羽色配套系蛋黄、蛋壳质量。骨源碱性磷酸酶（ALP）活性可反映成骨细胞和破骨细胞的活性,在产蛋期钙的需要量升高时,碱性磷酸酶通过其活性作用促进骨组织释放钙,满足蛋鸡钙的需要^[33]。本研究结果显示,浅麻羽色配套系的ALP浓度显著高于其他品系,说明浅麻羽色配套系骨组织释放钙能力优于其他品系。骨钙素（BGP）影响骨骼正常矿化和软骨矿化进程,当骨钙素浓度升高时,可促进成骨细胞活性和骨形成,一定程度上活跃骨骼代谢^{[30, 36]}。本研究发现,浅麻羽色配套系BGP浓度显著高于其他品系,反映了浅麻羽色配套系骨骼代谢较为活跃。与之相对应,浅麻羽色配套系的蛋壳和胫骨的钙、磷、灰分含量与其他品系差异显著。

3.4 琅琊鸡及其配套系不同部位钙结合蛋白CaBP- D28k mRNA表达的分析

蛋鸡在产蛋高峰期和产蛋后期对钙需求量比产蛋期之前均会增加,并且主要依赖于十二指肠和肾脏对钙吸收能力的增强以及骨质的降解^[37]。参与Ca²⁺吸收的主要蛋白是钙结合蛋白D28k,其含量影响骨骼的破骨进程,促进蛋壳腺内Ca²⁺转运和蛋壳形成;肾脏和蛋壳腺内钙结合蛋白D28k表达与Ca²⁺的转运密切相关^[33,38]。在mRNA水平,鸡产蛋期十二指肠CaBP-D28k表达量直接或间接与钙磷吸收代谢有关,并影响骨骼的发育;在蛋壳腺内,CaBP-D28k mRNA表达水平在蛋壳钙化的过程中显著增加;而肾脏中CaBP-D28k可促进肾小管对钙的重吸收,其含量与鸡骨代谢调节密切相关,在蛋壳形成时参与钙的分泌^[39—40];且CaBP-D28k第三外显子A5115G突变极显著提高蛋壳强度^[41]。本试验通过对240—300日龄产蛋期琅琊鸡及其配套系不同部位钙结合蛋白CaBP-D28k mRNA表达检测发现,浅麻羽色配套系十二指肠部位CaBP-D28k mRNA表达水平显著高于其他品系,并且通过激素等物质的分析结果证实了浅麻羽色配套系蛋黄、蛋壳和胫骨中钙的沉积优于其他品系,浅麻羽色配套系肠道中钙吸收和Ca²⁺的转运水平表现更佳。蛋壳腺内CaBP-D28k的表达量与Ca²⁺的转运密切相关^[42],本试验结果显示,浅麻羽色配套系钙结合蛋白含量和蛋壳腺内CaBP-D28k mRNA的表达量与深麻羽色配套系比较分别高12.97%和上调23.40%,而浅麻羽色配套系产蛋率、蛋壳比率、蛋壳厚度以及蛋壳中钙含量均高于深麻羽色配套系,说明蛋壳腺内CaBP-D28k mRNA表达量差异影响蛋壳形成过程中Ca²⁺的转运,从而导致品系间蛋壳厚度、蛋壳中钙水平表现差异。

4 结论

在240—300日龄产蛋期,浅麻羽色配套系产蛋率、蛋壳比率、蛋壳厚度、蛋壳强度显著高于深麻羽色配套系,杂交改良在改善蛋壳质量的同时,还影响蛋黄、蛋壳中矿物质的沉积和胫骨质量。浅麻羽色配套系的相关激素和活性物质与其他品系间表现差异,促进小肠上段对钙磷吸收和骨钙的释放、转运能力,骨骼代谢活跃;浅麻羽色配套系十二指肠部位CaBP-D28k mRNA表达水平显著高于其他品系,深麻羽色配套系和琅琊鸡蛋壳腺、肾脏部位CaBP-D28k mRNA表达显著下调,反映了相关部位Ca²⁺的吸收、转运以及钙代谢水平差异,影响蛋黄、蛋壳厚度、蛋壳比率以及蛋壳和胫骨中钙水平。

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