吡咯伯克霍尔德菌WY6-5产二甲基二硫对储藏期花生黄曲霉及毒素的抑制作用

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宫安东^,, 董飞燕, 吴楠楠, 孔宪巍, 赵倩, 闫建丽, Cheelo DIMUNA信阳师范学院生命科学学院/河南省茶树生物学重点实验室,河南信阳 464000

Inhibitory Effect of Dimethyl Disulfide from Burkholderia pyrrocinia WY6-5 on Aspergillus flavus and Aflatoxins in Peanuts During Storage Period

GONG AnDong^,, DONG FeiYan, WU NanNan, KONG XianWei, ZHAO Qian, YAN JianLi, Cheelo DIMUNACollege of Life Science, Xinyang Normal University/Henan Key Laboratory of Tea Plant Biology, Xinyang 464000, Henan

通讯作者: 宫安东,E-mail：gongad@xynu.edu.cn。

责任编辑: 岳梅
收稿日期:2019-04-18接受日期:2019-05-13网络出版日期:2019-09-01

基金资助:

国家自然科学基金.31701740
河南省科技攻关项目.172102110260
河南省科技攻关项目.182102110018
河南省科学技术研究重点项目.16A180036

Received:2019-04-18Accepted:2019-05-13Online:2019-09-01
作者简介 About authors
宫安东

摘要
【目的】验证吡咯伯克霍尔德菌（Burkholderia pyrrocinia）WY6-5的抑菌作用,评价其对储藏期花生黄曲霉（Aspergillus flavus）及毒素的防治效果,分析抑菌作用机制,鉴定活性物质,并检测其最低抑菌浓度,为储藏期真菌病害及毒素的防控提供新材料。【方法】采用非接触培养皿对扣培养法,检测菌株WY6-5对黄曲霉的抑制效果,添加活性炭,验证挥发性物质的抑菌作用;密闭储藏环境,检测WY6-5产二甲基二硫对花生黄曲霉及毒素的抑制效果;收集处理后的花生籽粒,锇酸固定,并进行扫描电镜观察,检测黄曲霉细胞显微结构变化,通过透射电镜观察,检测黄曲霉细胞内部结构的显微差异;购买活性物质标准品,梯度稀释,与黄曲霉菌丝和孢子对扣培养,分析最低抑菌浓度。【结果】吡咯伯克霍尔德菌WY6-5分离自茶园根际土壤,可产生挥发性物质二甲基二硫,并高效抑制黄曲霉的生长,抑菌率达95%以上;同时,在高水活度（a_w）条件下,WY6-5还可抑制储藏期花生黄曲霉和毒素污染;两种水活度下,对照组中发病率高达100%,黄曲霉毒素总含量分别为399.32 μg?kg ^-1（a_w 0.859）和3 143.19 μg?kg ^-1（a_w 0.923）;WY6-5添加组,花生黄曲霉发病率降为2%（a_w 0.859）与21%（a_w 0.923）,毒素含量降为4.86 μg?kg ^-1（a_w 0.859）和121.37 μg?kg ^-1（a_w 0.923）,与对照组相比,对毒素的抑制率达98.78%和96.14%。扫描电镜观察显示,WY6-5产生的挥发性气体能抑制黄曲霉孢子的萌发,透射电镜显示,黄曲霉细胞结构未呈现明显损伤。挥发性物质二甲基二硫抑菌作用明显,对黄曲霉菌丝生长的最低抑菌浓度为100 μL?L ^-1(物质体积/培养体积),对孢子萌发的最低抑菌浓度为50 μL?L ^-1(物质体积/培养体积)。【结论】吡咯伯克霍尔德菌WY6-5可产生高效抑菌挥发物二甲基二硫,在低浓度下即可完全抑制黄曲霉菌丝生长和孢子萌发,并能抑制储藏期花生黄曲霉的侵染和黄曲霉毒素的产生,为储藏期真菌病害及毒素的防控提供了新型生物材料。
关键词： 吡咯伯克霍尔德菌;黄曲霉;黄曲霉毒素;二甲基二硫;抑菌;储藏期

Abstract

【Objective】The objective of this study is to verify the antifungal effect of Burkholderia pyrrocinia WY6-5, evaluate its control efficacy against Aspergillus flavus and aflatoxins in peanuts during storage period, analyze the inhibitory mechanism, identify antifungal volatiles and detect the minimal inhibitory concentration to A. flavus, so as to provide novel strategies for the prevention and control of fungal diseases and mycotoxin during storage period.【Method】Face-to-face dual cultural test was conducted to analyze the antifungal activity of volatiles from WY6-5. Active charcoal as volatile adsorbent was added into the tests to verify the antifungal activity of volatiles. Dimethyl disulfide (DMDS) emitted form strain WY6-5 was challenged with peanut kernels inoculated with A. flavus conidia in sealed airspace without physical contact. A. flavus cells on peanut coat were collected, fixed in osmic acid, and analyzed through scanning electron microscope (SEM). Transmission electron microscope (TEM) was used to test the inner structure of A. flavus cell affected by volatiles from WY6-5. The commercial DMDS was purchased, serially diluted, and co-cultured with A. flavus conidia and mycelia to detect the minimal inhibitory concentration, respectively.【Result】B. pyrrocinia WY6-5 isolated from rhizosphere soil of tea plants could produce volatile DMDS, prevent the growth of A. flavus mycelia, the inhibition rate was over 95%. Additionally, under the condition of high water activity (a_w), WY6-5 could also inhibit the A. flavus infection and aflatoxins production in peanuts during storage period. In peanuts of control treatment, the disease incidence was 100%, and the total concentration of aflatoxins was 399.32 μg?kg ^-1 (a_w 0.859) and 3 143.19 μg?kg ^-1 (a_w 0.923), respectively. When WY6-5 was added in the treatment, the disease incidence decreased to 2% (a_w 0.859) and 21% (a_w 0.923), respectively. The concentration of aflatoxins decreased to 4.86 μg?kg ^-1 (a_w 0.859) and 121.37 μg?kg ^-1 (a_w 0.923), respectively. The inhibition rate of WY6-5 against aflatoxins contamination was 98.78% and 96.14% compared to the control treatment. SEM analysis proved that DMDS from WY6-5 inhibited the germination of A. flavus conidia. TEM analysis further proved that the inner cell structures of A. flavus conidia were not severely damaged by volatiles. Volatile DMDS showed great antifungal activity. The minimal inhibitory concentration against mycelia growth was 100 μL?L ^-1(compound volume/airspace volume). The minimal inhibitory concentration against conidia germination was 50 μL?L ^-1(compound volume/airspace volume). 【Conclusion】B. pyrrocinia WY6-5 can produce valid antifungal volatile DMDS, which can completely inhibit the mycelia growth and conidia germination of A. flavus at low concentration, and greatly prevent the development of A. flavus disease and aflatoxins contamination in peanuts during storage period. WY6-5 and the produced DMDS provide novel bio-active agents for fungal diseases control and mycotoxins during storage period.

Keywords：Burkholderia pyrrocinia; Aspergillus flavus;aflatoxin;dimethyl disulfide;antifungal;storage period

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宫安东, 董飞燕, 吴楠楠, 孔宪巍, 赵倩, 闫建丽, Cheelo DIMUNA. 吡咯伯克霍尔德菌WY6-5产二甲基二硫对储藏期花生黄曲霉及毒素的抑制作用[J]. 中国农业科学, 2019, 52(17): 2972-2982 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.17.006
GONG AnDong, DONG FeiYan, WU NanNan, KONG XianWei, ZHAO Qian, YAN JianLi, Cheelo DIMUNA. Inhibitory Effect of Dimethyl Disulfide from Burkholderia pyrrocinia WY6-5 on Aspergillus flavus and Aflatoxins in Peanuts During Storage Period[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2019, 52(17): 2972-2982 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.17.006

0 引言

【研究意义】黄曲霉（Aspergillus flavus）是一种常见的腐生性病原真菌,对植物危害严重,田间和储藏期可侵染花生、玉米、大豆、小麦等粮、油料作物及其加工品,导致粮食霉变和黄曲霉毒素（aflatoxin,AFT）污染^[1,2]。粮食污染中AFT主要有4种,分别为AFB₁、AFB₂、AFG₁和AFG₂,其中以AFB₁毒性最大,可诱发肝癌、肾癌和直肠癌等病变,被世界卫生组织（WHO）列为I类致癌物^[3,4]。AFT污染在世界范围内普遍存在,据统计,全球每年约有50亿人饱受其害^[5]。在美国,AFT污染造成的粮食损失每年高达5亿美元,仅玉米损失1.6亿美元^[6]。在经济欠发达的发展中国家,AFT的污染更为严重,2014年国内各产区玉米抽样中均检出AFT,其中华中区域玉米样品AFB₁污染最重,AFB1检出率达100%,超标率达85.7%（食用玉米及其制品>20 μg?kg^-1）^[7]。非洲扎伊尔地区花生抽检样品中95%存在AFB₁污染,食用精米中AFT检出率为50%,污染量高达1 642 μg?kg^-1,玉米中AFT检出率为63%,污染量最高达850 μg?kg^-1^[8]。此外,在乙型和丙型病毒性肝炎病毒流行国家,AFT的叠加危害效果尤为严重,中国每年约有37万人死于肝癌,占全世界肝癌死亡人数的50%以上,AFT污染与病毒流行的双重干扰是造成疾病和死亡的主要诱因^[9]。黄曲霉及其产生的AFT对人类危害严重,如何有效控制粮、油作物及其加工品中AFT的污染是当前面临的首要任务,对粮食稳产和食品安全具有重要意义。【前人研究进展】为控制AFT的严重污染,部分国家出台了食品中AFT污染的最高限量标准,如针对花生及其加工品中,欧盟规定AFT最高限量值为4 μg?kg^-1^[10],美国为20 μg?kg^-1^[11],肯尼亚为10 μg?kg^-1^[12],马来西亚为15 μg?kg^-1^[13],中国尚无针对AFT的最高限量要求,但规定AFB₁的最高限量值为20 μg?kg^-1[14,15]。最高限量值法规的出台,在一定程度上减少了AFT的暴发和危害,但无法从源头上避免AFT的污染,如何从根本上消除黄曲霉的侵染和AFT的产生,是粮食生产、加工和储藏过程中亟需解决的关键问题。目前,针对储藏期黄曲霉及AFT的防控,主要依赖于储藏条件控制、病籽粒去除和化学药剂处理等方法^[16]。但由于存储周期长,储藏条件控制造成极大的能源损耗;发病籽粒去除难以做到精细控制,遗漏的病粒又可导致二次危害;而化学药剂的制剂喷洒,造成潜在的有害物质残留和环境污染,现有方法已无法满足人们对食品安全和绿色防控的需求,因此,开发新型、安全、有效的抑菌资源,是储藏期病害防控的首要任务。生物活性物是生物体内固有组分,与化学药剂相比,来源可靠,安全性高,是良好的抑菌生物材料,目前部分植物源生物活性物质已被应用于黄曲霉和AFT的防治中,如从博路都树（Peumus boldus）、马鞭草科植物Lippia turbinata^[17]和孜然芹属Cuminum cyminum^[18]提取的植物精油,对黄曲霉生长和产毒具有显著抑制作用,部分植物提取物已成功应用并商业化生产^[19]。但受植物所需种植面积大、生长周期长、材料收集难等问题影响,一定程度上制约了其快速发展。与植物相比,微生物个体小、繁殖快、代谢物质丰富,在天然抑菌药物筛选及应用方面优势显著。已报道多种微生物及其代谢产物对黄曲霉及AFT具有抑制作用,如非产毒性黄曲霉^[20]、芽孢杆菌^[21]、假单胞菌等,为黄曲霉及AFT的安全防控提供了重要的微生物材料。此外,笔者课题组前期从海洋中分离到一株海藻希瓦氏菌（Shewanella algae）YM8,可产生挥发性物质,高效抑制储藏期花生黄曲霉的致病和产毒^[14]。【本研究切入点】笔者课题组从茶树根际土壤中分离到一株吡咯伯克霍尔德菌（Burkholderia pyrrocinia）WY6-5,可溶解土壤中难溶性无机磷和有机磷,提升土壤肥力,促进植物生长。同时,该菌株还可产生挥发性物质二甲基二硫,具有较好的抑菌作用,然而,针对吡咯伯克霍尔德菌及其所产二甲基二硫对储藏期黄曲霉及AFT的抑制作用尚未有研究揭示。【拟解决的关键问题】检测吡咯伯克霍尔德菌WY6-5对黄曲霉生长的抑制作用,验证对储藏期花生黄曲霉及AFT的防控效果,鉴定功能抑菌物质,确定最低抑菌浓度,分析作用机理,为储藏期真菌病害及毒素的生物防治提供理论依据。

1 材料与方法

试验于2016—2018年在信阳师范学院生命科学学院/河南省茶树生物学重点实验室完成。

1.1 供试材料

吡咯伯克霍尔德菌WY6-5分离自百年龄茶树根际土壤,划线培养于NA培养基（营养肉汤3.0 g,蛋白胨10.0 g,氯化钠5 g,琼脂15.0 g,蒸馏水1 L,pH 7.2,121℃灭菌20 min）表面,37℃黑暗条件下培养24 h,备用。

黄曲霉菌株AF12分离自霉变的花生籽粒,为笔者实验室保存^[14]。AF12培养于PDA（马铃薯200 g,切片后沸水煮20 min,双层纱布收集滤液,葡萄糖20 g,琼脂15 g,溶解于1 L蒸馏水中,121℃且1.01 MPa条件下,灭菌18 min后备用）培养基表面,28℃黑暗条件下培养5 d,无菌水洗下表面新鲜孢子,双层无菌纱布过滤,收集滤液,待用。

所用花生籽粒为四粒红品种,用于储藏期接种试验。

二甲基二硫标准品（Sigma-Aldrich,St Louis,MO）,CAS：03658-80-8,纯度≥98%,用于抑菌作用分析。

1.2 菌株WY6-5产挥发性物质对黄曲霉生长的抑制作用测定

WY6-5划线培养于NA平板表面,培养24 h后,转皿活化2—3次。无菌水冲洗活化后的WY6-5菌体,混合均匀,调整OD₆₀₀至1.80,用于抑菌试验。新鲜的黄曲霉孢子液接种于50 mL PDB培养液中,28℃黑暗条件下,200 r/min摇培2 d,获取圆形白色的菌丝团,用于抑菌作用分析。

采用双皿对扣培养法,检测菌株WY6-5的抑菌效果。挑取大小一致的黄曲霉菌丝团,分别接种于PDA平板中央;WY6-5菌液涂布于NA平板表面;将接种菌丝团的培养皿对扣培养于含WY6-5的培养皿之上,以黄曲霉菌丝团对扣培养NA培养基的处理为对照,每个处理重复两次,透明胶带密封,28℃黑暗条件下静置培养5 d,测量菌落直径,计算抑菌率^[22]。

抑菌率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100。

1.3 活性炭对菌株WY6-5抑菌作用的影响

WY6-5在密闭的环境条件下,可以高效抑制黄曲霉的生长,但作用机制尚未确定。为了进一步检测WY6-5产挥发性气体是否具有抑菌作用,进行了活性炭添加试验。采用双皿对扣培养法,上皿中为PDA培养基,接种新鲜的黄曲霉菌丝团;下层为二分分隔培养皿,分隔区域一侧添加活性炭（6 g）,另一侧加入NA培养基,冷却后涂布WY6-5菌液。下层培养皿设4个不同处理,分别为空白NA培养基、NA培养基+活性炭、NA涂布WY6-5、NA涂布WY6-5+活性炭,4个处理分别与黄曲霉菌丝团密闭共培养,每个试验重复两次,透明胶带封口,28℃黑暗条件下,静置培养5 d,观察黄曲霉菌丝生长状况,统计菌落直径。

1.4 WY6-5对储藏期花生黄曲霉致病和产毒的抑制作用测定

称取颗粒饱满、大小均匀一致的花生籽粒200 g,平均分成两份,分别倒入两个250 mL锥形瓶中,于121℃,1.01 MPa灭菌20 min,室温静置冷却;每个锥形瓶中接入新鲜收集的黄曲霉孢子液1 mL（1×10⁵cfu/mL）,摇匀10 min;向锥形瓶中加入无菌水,调整水活度（a_w）为0.859和0.923,备用。

花生接种试验分两种水活度处理,每种水活度处理中,设WY6-5处理组和对照组;WY6-5处理组中,取两个玻璃培养皿（直径9 cm）,一个皿中加入接种黄曲霉孢子的花生籽粒,另一个皿加入NA培养基,表面涂布WY6-5菌液,将WY6-5培养皿对扣培养于含花生籽粒的培养皿之上;对照组中,以空白NA培养基对扣培养于花生籽粒培养皿之上。所有处理用透明胶带封口,28℃培养箱,黑暗条件下培养 7 d,检测花生籽粒的发病率和不同处理中黄曲霉毒素含量,确定WY6-5对黄曲霉产毒的抑制作用。

AFT的提取与定量分析：称取研磨样品1 g,置于5 mL的聚丙烯塑料管中,加入5 mL已腈/水（84/16,v/v）,混匀后涡旋处理1 min,超声60 min。6 000 r/min离心10 min,取上清1 mL转移至新的离心管中,加入相同体积正己烷,混匀后静置分层。吸取下层500 μL提取液,进行毒素检测分析^[23]。AFT分析采用高效液相色谱质谱联用仪（Thermo Scientific,加利福尼亚大学,美国）。液相色谱分析采用C18色谱柱（50 mm×2.1 mm,3.0 μm填充粒径）,温度设置为35℃。流动相为A：甲醇,B：水（超纯水含5 mmol·L^-1醋酸铵和0.05%甲酸,v/v）。流速为0.3 mL·min^-1,梯度进样洗脱,洗脱程序：0—1 min,20% A;1—4 min,20%—100% A;4—5 min,100% A;5—5.5 min,100%—20% A。质谱分析采用电喷雾质谱（ESI+）选择离子监测模式进行,最优雾化器温度为350℃,毛细管温度为350℃,喷雾电压为3.5 kV（ESI+）。

1.5 WY6-5抑制花生黄曲霉的扫描电镜观察

黄曲霉孢子接种于花生籽粒表面,培养5 d后,观察对照组（不添加WY6-5）与WY6-5处理组花生籽粒发病情况,并进行扫描电镜观察。对照组与WY6-5处理组花生籽粒用0.1%（v/v）的锇酸熏蒸 1 h,室温静置2 h,解剖刀切取花生小块种皮（长约3—4 mm）,固定于样品座上,表面喷金处理后,进行扫描电镜（型号JSM-6390,日立公司,日本）观察,确定黄曲霉菌丝和孢子的显微结构差异^[22]。

1.6 WY6-5抑制花生黄曲霉的透射电镜观察

采用双层培养皿对扣培养法,上层培养皿中加入PDA培养基,冷却后表面覆盖一层玻璃纸,100 μL黄曲霉孢子液（1×10⁷cfu/mL）涂布于玻璃纸表面;下层培养皿中加入NA培养基,WY6-5涂布表面,将PDA平板对扣于NA平板上,以不涂布WY6-5菌液的NA培养基为对照,透明胶带封口,28℃黑暗条件下培养24 h,收集玻璃纸表面黄曲霉菌体,重悬于2.5%的戊二醛（v/v）,固定3—4 h;0.1 mol·L^-1磷酸缓冲液（pH 7.4）漂洗3次,每次15 min;1%的锇酸室温固定2 h;0.1 mol·L^-1磷酸缓冲液（pH 7.4）漂洗3次,每次15 min;依次用50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%乙醇脱水,每次15 min;丙酮与812包埋剂（1﹕1）混合液渗透过夜,812包埋剂渗透过夜;60℃聚合48 h;60—80 nm超薄切片;2%醋酸铀饱和水溶液染色15 min,枸橼酸铅染色15 min;室温过夜干燥,透射电镜（Tecnai G2 F 20）观察真菌细胞结构。

1.7 二甲基二硫对黄曲霉生长的抑制作用

WY6-5产生的挥发性物质抑菌作用显著,经GC-MS/MS鉴定,确定抑菌物质为二甲基二硫,以购买的二甲基二硫标准品检测其抑菌作用。采用培养皿对扣培养法,上层培养皿中加入PDA培养基,中心接种黄曲霉菌丝团,下层为空白培养皿,中心处放一圆形滤纸片（直径5 mm）,滤纸片上滴加二甲基二硫标准品,调整终浓度为200、100、50、10和 0 μL·L^-1（物质体积/空间体积）,以添加相同浓度的无菌水为对照。将接种菌丝团的培养皿对扣于含二甲基二硫培养皿之上,透明胶带封口,28℃黑暗条件下培养3 d,测量黄曲霉菌落直径,计算抑菌率。

1.8 数据处理与分析

数据采用SPSS17.0软件进行统计学分析,每个处理至少重复两次,数据表示为平均值±标准误,不同处理间进行单因素方差分析,P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 吡咯伯克霍尔德菌WY6-5对黄曲霉生长的抑制作用

对扣培养试验中,菌株WY6-5可高效抑制黄曲霉的生长,培养5 d后,对照组中黄曲霉菌丝生长迅速,菌落直径达5 cm以上,且菌丝表面产生大量的绿色黄曲霉孢子。添加WY6-5后,黄曲霉菌丝的生长受到明显抑制,接种菌丝周边无新的菌丝体产生,且不能产生新鲜的绿色孢子。结果表明,密封培养过程中,吡咯伯克霍尔德菌WY6-5与黄曲霉菌丝团无直接接触情况下,可抑制黄曲霉菌丝的生长,抑菌率高达100%（图1）。

图1

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图1菌株WY6-5挥发性气体对黄曲霉的抑制作用

Fig. 1The inhibitory effect of volatiles from strain WY6-5 on the growth of A. flavus

为证明WY6-5的抑菌作用方式,进行了活性炭添加试验。培养5 d后观察生长状况,单独接种黄曲霉菌丝团处理中,菌丝生长迅速,菌落直径达5.15 cm;向反应体系中添加活性炭后,菌丝生长未见明显变化,菌落直径达5.12 cm,与对照组相比无显著差异,表明活性炭对黄曲霉菌丝的生长无抑制作用;当添加WY6-5后,菌丝生长受明显抑制,菌落直径仅为0.85 cm,抑制率达到83.50%;当WY6-5处理组中添加活性炭后,抑菌作用明显减弱,菌落直径为4.50 cm,抑菌率降至12.62%,表明添加活性炭可降低WY6-5的抑菌作用（图2）。综上所述,活性炭作为挥发性物质吸附剂,可以吸附菌株WY6-5产生的挥发物,进而降低密闭体系中挥发性物质有效浓度,降低了对黄曲霉的抑制作用,因此,可以证明菌株WY6-5抑菌的主要作用机制为产生挥发性抑菌物。

图2

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图2活性炭对菌株WY6-5抑菌作用的影响

CK：黄曲霉菌丝对照A. flavus mycelia only;CK+C：菌丝+活性炭Mycelia challenged with active charcoal;CK+WY6-5：菌丝+WY6-5 Mycelia challenged with WY6-5;CK+WY6-5+C：菌丝+WY6-5+活性炭Mycelia challenged with active charcoal and WY6-5
Fig. 2Effect of active charcoal on the inhibitory activity of strain WY6-5 against A. flavus

2.2 菌株WY6-5对储藏期花生黄曲霉及毒素的抑制作用

以花生籽粒为试验对象,分析WY6-5产生的挥发性物质对储藏期黄曲霉侵染的防控作用。不同水活度下,花生籽粒接种黄曲霉孢子后,共培养5 d。对照组花生籽粒发病严重,水活度0.859处理中,籽粒表面长出菌斑,表面着生绿色孢子,发病率达85%;随水活度升高,花生籽粒发病越明显,水活度0.923处理组中,种皮表面布满菌丝,着生大量绿色孢子,发病率高达100%（图3）。当添加WY6-5处理后,由于挥发性物质的高效抑菌作用,两种水活度下,花生黄曲霉的发病受到明显抑制,水活度0.859处理组中,仅单个籽粒呈现发病状况,发病率为2%,水活度0.923处理组中,少部分籽粒呈现发病症状,表面产生孢子,发病率为21%。综上所述,菌株WY6-5产生的挥发性抑菌物质显著抑制储藏期花生黄曲霉的侵染,具有较好的生防活性。

图3

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图3菌株WY6-5产挥发性气体对储藏期花生黄曲霉的抑制作用

Fig. 3Biocontrol activity of volatiles from strain WY6-5 against A. flavus in peanut during storage period

分析花生籽粒中的AFT含量,结果如表1所示。对照组内两种水活度处理,均检出AFT,随水活度升高,毒素污染程度也明显提高。在水活度0.859,毒素总含量为399.32 μg?kg^-1,其中AFB₁毒素含量为372.29 μg?kg^-1,AFB₂为27.03 μg?kg^-1;水活度0.923条件下,毒素总含量为3 143.19 μg?kg^-1,AFB₁为2 547.72 μg?kg^-1,AFB₂为595.47 μg?kg^-1。当添加WY6-5处理后,花生籽粒发病明显减弱,且毒素含量显著降低,水活度0.859条件下,AFB₁检出量为4.86 μg?kg^-1,未检出AFB₂,与对照组相比,抑制率为98.78%;水活度0.923条件下,AFB₁检出量为109.86 μg?kg^-1,AFB₂为11.50 μg?kg^-1,毒素总含量为121.37 μg?kg^-1,与对照组相比,抑制率为96.14%。综上所述,WY6-5产生挥发性抑菌物质,不仅抑制了黄曲霉侵染危害,同时抑制了AFT的产生。

Table 1
表1
表1花生籽粒中黄曲霉毒素含量测定
Table 1The concentration of aflatoxins in peanuts inoculated with A. flavus

水活度 Water activity (a_w)	处理 Treatment	AFB₁含量AFB₁ concentration (μg?kg^-1)	AFB₂含量 AFB₂ concentration (μg?kg^-1)	总含量 Total AFT (μg?kg^-1)	抑制率 Inhibitory rate (%)
0.859	CK	372.29±3.27	27.03±0.47	399.32	—
0.859	WY6-5	4.86±2.35	0	4.86	98.78
0.923	CK	2547.72±0.52	595.47±2.75	3143.19	—
0.923	WY6-5	109.86±5.66	11.50±0.59	121.37	96.14

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2.3 菌株WY6-5对花生黄曲霉抑制效果的扫描电镜观察

为进一步观察花生种皮表面黄曲霉的生长状况,挑选水活度0.859培养条件下的花生籽粒,进行扫描电镜观察。培养5 d后,对照组花生籽粒发病严重,种皮布满黄曲霉菌丝及分生孢子头,并产生大量分生孢子,孢子脱落后,覆盖于花生种皮表面,造成二次侵染。形成的分生孢子为圆形,大小一致,结构均匀,表面为隆起的小球结构。WY6-5处理组中,花生种皮表面仅见少数孢子,为初始接种用黄曲霉孢子,孢子未见萌发（图4）。由此可见,在非接触条件下WY6-5产生挥发性物质可高效抑制密闭条件下的黄曲霉孢子萌发和菌丝生长。

图4

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图4菌株WY6-5产挥发性物质对花生表面黄曲霉抑制效果的扫描电镜观察

箭头指向为黄曲霉孢子
Fig. 4The inhibitory effect of volatiles produced by strain WY6-5 on peanut surface affected by A. flavus through scanning electron microscope observation

Arrows point to the position of A. flavus conidia on the peanut surface

2.4 菌株WY6-5抑制花生黄曲霉的透射电镜观察

WY6-5挥发性物质处理黄曲霉后,进行透射电镜制样观察。结果显示,对照组中黄曲霉菌丝生长正常,切片观察后细胞结构有圆形、线形和肾形等不同结构,细胞质均匀致密,液泡大小均匀,细胞膜连续完整,紧贴细胞壁。WY6-5处理黄曲霉后,切片观察细胞多为圆形,少部分细胞呈现中空坏死症状,多数细胞呈均匀致密,细胞膜完整,液泡在细胞中所占体积明显大于对照组（图5）。结果表明,WY6-5产生的挥发性物质可抑制黄曲霉孢子的萌发和生长,故处理后细胞呈现圆形的孢子居多,对照组中细胞不断生长,体积不断变大,液泡水分消耗较多,在一定程度上,液泡体积比小于WY6-5处理组。

图5

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图5菌株WY6-5产挥发性物质对黄曲霉细胞结构影响的透射电镜观察

箭头指向为细胞壁
Fig. 5Effect of volatiles produced by strain WY6-5 on cell structure of A. flavus through transmission electron microscope observation

Arrows point to the cell wall of A. flavus

2.5 挥发性物质二甲基二硫的最低抑菌浓度分析

与对照相比,二甲基二硫具有明显的抑菌作用,低浓度条件下也具有高效抑制效果,10 μL?L^-1（物质体积/空间体积）,对黄曲霉菌丝和孢子的抑制率分别为70.2%与77.5%;随浓度的升高,抑菌效果越显著,50 μL?L^-1时,即可完全抑制黄曲霉孢子的萌发,当浓度达到100 μL?L^-1,对菌丝生长和孢子萌发均具有完全抑制效果（图6）。

图6

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图6二甲基二硫对黄曲霉菌丝生长和孢子萌发的最低抑菌浓度

Fig. 6The minimal inhibitory concentration of dimethyl disulfide against mycelia growth and conidia germination of A. flavus

3 讨论

黄曲霉在自然界中分布广泛,可侵染储藏期多种粮油料作物产品及其加工品,并产生强致癌性次生代谢产物AFT,严重威胁人类健康。同时,由于其寄主种类多,产孢能力强,孢子扩散迅速,为储藏期安全防控带来巨大挑战。开发安全、高效的储藏期黄曲霉及毒素防控技术是植物病害防控和食品安全领域研究的热点。

对储藏期黄曲霉及毒素的防治研究表明,挥发性物质易于分散,对黄曲霉及毒素的抑制效果明显优于非挥发性物质。自然界中,微生物种类繁多,代谢类型多样^[24],是挥发性抑菌物质筛选的优势资源。目前,已报道多种微生物可产生挥发性抑菌物质,能够抑制植物病原菌的生长和繁殖,如链霉菌RM-1-138对立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）^[25],解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CPA-8对核果褐腐病菌（Monilinia fructicola）和灰霉菌（Botrytis cinera）^[26],Hypoxylon anthochroum对尖镰孢（Fusarium oxysporum）^[27],短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）AR03对烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica）和链格孢菌（Alternaria alternata）^[28],以及绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens）SPS-41对引起马铃薯黑腐病的长喙壳菌（Ceratocystis fimbriata）等^[29],均具有较好的生物抑菌活性。但针对黄曲霉而言,其产气抑菌微生物的研究相对较少。为筛选对黄曲霉具有产气抑制作用的微生物,鉴定抑菌活性物质,本研究从百年龄茶树根际土壤中筛选到一株吡咯伯克霍尔德菌WY6-5,结果表明其具有较好的产气抑菌活性。

吡咯伯克霍尔德菌属于伯克霍尔德菌属,在土壤中分布广泛,具有多种生物功能,如固氮、解钾、促生长以及防治植物病害等^[30,31]。REN等^[32]研究表明,吡咯伯克霍尔德菌JK-SH007可产生3种胞外水解酶,作用于真菌细胞,对杨树溃疡病具有较好的防治效果;WALLACE等^[33]研究指出,吡咯伯克霍尔德菌FP62具有植物叶部定殖能力,可在叶片表面形成一层不饱和的生物被膜,有效防止灰霉菌的侵染。本研究筛选的吡咯伯克霍尔德菌WY6-5可以溶解土壤中的难溶性无机磷和有机磷,转化为可溶性磷肥,并显著促进植物生长。同时可产生挥发性抑菌物质二甲基二硫,抑制黄曲霉的生长和产孢,并明显抑制储藏期花生黄曲霉的致病和产毒,且具有广谱抑菌作用,为储藏期真菌病害及毒素的生物防控提供了重要材料。花生储藏过程中,极易受黄曲霉侵染危害,且随籽粒水活度增高,发病程度越重,毒素污染量越高^[34]。为检测筛选菌株WY6-5的生防效果,本研究采用两种高水活度（>0.85）处理,分析其对花生黄曲霉及毒素的防控效果。模拟储藏培养试验中,未添加WY6-5处理组黄曲霉在花生表皮快速生长蔓延,覆盖于花生籽粒表面,且水活度越高,发病越严重。AFT总量分别达到399.32 μg?kg^-1（水活度0.859）和3 143.19 μg?kg^-1（水活度0.923）,显著高于中国的最高限量标准（20 μg?kg^-1）;WY6-5添加组花生中AFT总量为4.86和121.37 μg?kg^-1,明显低于对照组,抑制率分别为98.78%和96.14%。由此可知,WY6-5处理后,水活度0.859条件下,花生中毒素含量低于我国最高限量标准,但水活度0.923条件下,毒素含量仍然超标。因为本研究中选用的花生为极端水活度条件,在日常的生产、运输、加工和储藏过程中,花生籽粒的水活度远远低于此标准（<0.7）^[34],在此情况下,WY6-5可发挥更好的抑菌效果,有效防治黄曲霉致病和产毒,将毒素含量控制在有效范围之内,为储藏期黄曲霉的防控提供有效材料。

WY6-5产生的二甲基二硫具有强逸发性冷薄荷气味,呈无色或苍黄色,也存在于新鲜的洋葱和芸苔属植物中^[33],同时链霉菌、沙门氏菌以及假单胞菌等多种微生物均可产生该物质^[24,35],是国标中允许使用的食品香料添加剂,常用于调味、肉汁、汤类等。本研究证明,该物质具有较好的抑菌活性,其对黄曲霉菌丝生长和孢子萌发的最低抑菌浓度分别为100、50 μL?L^-1,明显优于现阶段报道的其他物质,如己烯醛^[36]、苯乙醇^[37]、二甲基三硫和十二烷醇^[14]等。此外,有研究指出,二甲基二硫可抑制线虫、大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）、尖镰孢等引起的多种土传病害^[38],还具有诱导寄主植物抗性,促进植物生长等多种作用^[39],为潜在的高活性多功能生物菌剂。本研究采用扫描电镜和透射电镜观察二甲基二硫对黄曲霉细胞结构的影响,结果表明二甲基二硫处理后黄曲霉细胞生长受到明显抑制,但细胞内部结构未发生明显变化。推断二甲基二硫为小分子物质,不损伤细胞结构,但可能在细胞内部富集,作用于关键生物大分子物质,导致真菌细胞合成受阻,但其分子靶点仍无法探明。后续将采用多组学分析以及突变体构建等手段,分析其抑菌分子机制和作用靶点,为该物质的广泛应用提供理论参考。

4 结论

吡咯伯克霍尔德菌WY6-5可产生挥发性抑菌物质二甲基二硫,低浓度下（100 μL?L^-1）即可完全抑制黄曲霉菌丝生长和孢子萌发,显著抑制储藏期花生黄曲霉的致病和毒素污染,并具有促进植物生长和广谱抑菌作用,具有较好的生物活性。因此,吡咯伯克霍尔德菌WY6-5及代谢物质二甲基二硫生物功能多样,可作为田间和储藏期真菌病害及毒素防控的重要材料。

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目的 对分离自烟草根际土壤中的一株短小芽孢杆菌（<italic>Bacillus pumilus</italic>）AR03菌株产生的挥发性有机物进行抑菌活性测定和组分分析。方法 采用培养皿对扣熏蒸法和凹玻片孢子萌发法测定挥发性有机物对烟草黑胫病菌（<italic>Phytophthora parasitica</italic> var. <italic>nicotianae</italic>）和赤星病菌（<italic>Alternaria alternata</italic>）菌落、菌丝生长以及孢子萌发的影响,采用离体叶片接种法测定挥发性有机物对烟草黑胫病和赤星病的防治效果;采用顶空加热法收集抑菌挥发性有机物,对其进行气相色谱-质谱（GC-MS)检测,并结合保留指数（retention index,RI）和内标（internal standard,IS）1-十五烯对其组分进行定性和定量分析。结果 短小芽孢杆菌AR03菌株分泌的挥发性有机物对供试的两种病原真菌均具有一定的抑制作用,表现为经处理后的烟草黑胫病菌菌丝生长稀疏缓慢变粗、分支增多且扭曲、断裂;赤星病菌菌丝生长畸形,其上不产生分生孢子梗,内含物大部分聚集成团导致菌丝干瘪、缢缩。对峙培养2、4、6和8 d时,挥发物对黑胫病菌和赤星病菌菌丝生长的抑制率分别为56.21%和59.23%、64.75%和59.86%、66.13%和61.10%、67.04%和70.00%;对黑胫病菌游动孢子和赤星病菌分生孢子的抑制作用表现为延迟萌发且萌发后的芽管生长缓慢;黑胫病菌产生孢子囊数明显减少,赤星病菌分生孢子各分隔处的细胞畸形肿胀成泡状。离体叶片抗病测定结果显示,挥发性有机物抑制黑胫病菌和赤星病菌病斑在叶片的扩展,对峙熏蒸40 h时,对照叶片黑胫病的发病率为92.50%,圆形坏死病斑直径是25.10 mm,经挥发物处理后叶片发病率为70.83%,病斑直径为9.45 mm,对黑胫病斑扩散的抑制率为62.35%;对峙熏蒸80 h时,对照叶片赤星病的发病率为88.33%,病斑扩散为近圆形的褐色坏死斑,平均直径为8.32 mm,经挥发物处理后赤星病的发病率为60.80%,病斑扩展较慢,平均直径为2.85 mm,挥发物对赤星病斑扩散的抑制率为65.75%。SPME GC-MS分析表明,AR03菌株胞外分泌7种组分挥发性物质,均为C15H24结构的倍半萜烯类化合物,分别是二氢姜黄烯、(<italic>E</italic>)-<italic>β</italic>-金合欢烯、<italic>γ</italic>-姜黄烯、<italic>α</italic>-姜烯、<italic>π</italic>-红没药烯、<italic>β</italic>-倍半萜水芹烯和<italic>γ</italic>-<italic>E</italic>-红没药烯;AR03培养1 d后,其中<italic>β</italic>-倍半萜水芹烯相对含量最高,为80.64%,其次为(<italic>E</italic>)-<italic>β</italic>-金合欢烯和<italic>α</italic>-姜烯,相对含量分别为7.20%和6.67%;随着AR03培养时间的延长,各组分种类相同,但相对含量差异较大,除二氢姜黄烯含量保持基本不变外,其他组分含量呈递减趋势,培养至第6天时,各组分含量下降超过50%。结论 短小芽孢杆菌AR03菌株能够产生具有较强抑菌活性的挥发性有机物,有潜力作为开发抗真菌代谢物和新药物的重要微生物资源。

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