张辰^1,2, 谭秀文², 魏晨², 张相伦², 靳青², 刘桂芬², 刘晓牧², 万发春^,1,21 山东师范大学生命科学学院,济南 250014
2 山东省农业科学院畜牧兽医研究所/山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室/山东省肉牛生产性能测定中心/山东省畜禽健康养殖工程技术中心,济南 250100

Protective Effect of Astaxanthin on Inflammatory Injury of Endometrial Cells in Bovine

ZHANG Chen^1,2, TAN XiuWen², WEI Chen², ZHANG XiangLun², JIN Qing², LIU GuiFen², LIU XiaoMu², WAN FaChun^,1,2 1 College of Life Sciences, Shandong Normal University, Jinan 250014
2 Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Key Lab of Animal Disease Control and Breeding/ Shandong Provincial Testing Center of Beef Cattle Performance/Shandong Provincial Engineering Technology Center of Animal Healthy Breeding, Jinan 250100

通讯作者: 万发春,E-mail：wanfc@sina.com

谭秀文与张辰为同等贡献作者。
责任编辑: 林鉴非
收稿日期:2018-12-10接受日期:2019-05-9网络出版日期:2019-09-01

基金资助:

国家自然科学基金.31802062 现代农业肉牛牦牛产业技术体系建设专项资金.CARS-37 山东省农业科学院农业科技创新工程.CXGC2018E10

Received:2018-12-10Accepted:2019-05-9Online:2019-09-01
作者简介 About authors
张辰,Tel：18505440868;E-mail：zcsdnu@163.com。

谭秀文,Tel：18615638322;E-mail： lafta@sina.com。









摘要
【目的】利用虾青素较强的抗氧化特性,通过探讨黏膜屏障重塑对脂多糖（LPS）诱导的牛子宫内膜细胞炎症的影响,为牛子宫内膜细胞炎的预防和治疗提供理论基础。【方法】培养液中添加1 μg·mL ^-1 LPS,培养子宫内膜细胞6 h,检测培养液中炎症因子TNF-α和IL-6含量,建立细胞的体外炎症模型。在此基础上去掉培养液,重新加入含1×10 ^-6 mol·L ^-1 虾青素的新鲜培养液,继续培养细胞24 h。对照组为不添加LPS或AST,LPS组为仅添加LPS,AST组为添加LPS和AST。采用ELISA法检测培养液中TNF-α和IL-6炎症因子分泌量以及细胞SOD和CAT酶活性,利用流式细胞仪检测细胞内活性氧簇（ROS）水平,利用免疫荧光染色检测细胞紧密连接蛋白Claudin、CDH1、TJP1的分布情况,利用荧光定量RT-PCR法和Western Blot法分别检测Claudin、CDH1、TJP1基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平。【结果】利用1 μg·mL ^-1 LPS培养子宫内膜细胞6 h,检测发现培养液中炎症因子IL-6和TNF-α分泌水平显著高于对照组（P小于0.05）,说明LPS诱导子宫内膜细胞产生炎症反应。与对照组相比,细胞内ROS水平显著增加（P小于0.05）,SOD和CAT酶活性都显著降低（P小于0.05）,说明LPS诱导的子宫内膜细胞炎症造成了氧化损伤。加入1×10 ^-6 mol·L ^-1 虾青素培养细胞24 h后,发现培养液中IL-6和TNF-α因子的分泌水平显著低于LPS组（P小于0.05）,同时ROS阳性细胞比率显著下降（P小于0.05）,SOD和CAT酶活性都显著升高（P小于0.05）。LPS组与对照组相比,细胞膜处Claudin、CDH1、TJP1蛋白的荧光信号减弱,这3种紧密连接蛋白的mRNA和蛋白表达水平也都显著降低（P小于0.05）。加入1×10 ^-6 mol·L ^-1虾青素培养24 h后,与LPS组相比,在细胞边缘和细胞核内可以检测到荧光信号很强的Claudin、CDH1、TJP1蛋白,而且这3种紧密连接蛋白的mRNA和蛋白表达水平也都显著升高（P小于0.05）。【结论】虾青素通过降低子宫内膜细胞因炎症反应产生的氧化损伤,减轻炎症导致的子宫内膜细胞紧密连接结构损伤,对子宫内膜的物理免疫屏障起保护作用,为牛子宫内膜炎的预防和治疗提供理论借鉴意义。
关键词： 牛;虾青素;子宫内膜细胞;炎症因子;紧密连接蛋白

Abstract
【Objective】 The purpose of this study was to examine whether astaxanthin with strong antioxidant properties could protect endometrial cells against lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammatory injury through mucosal barrier remodeling, so as to provide a theoretical basis for the prevention and treatment of bovine endometritis. 【Method】 The endometrial cells were cultured in the medium supplemented with 1 μg·mL ^-1 LPS for 6 h, then the inflammatory factors (such as TNF-α and IL-6) in the cultured medium were detected to establish an inflammation model in vitro. On this basis, the cultured medium was removed and fresh culture medium containing 1×10 ^-6 mol·L ^-1 astaxanthin was exchanged, and endometrial cells were further cultured for 24 hours. The control group was not added with LPS or AST, the LPS group was only added with LPS, and the LPS+AST group was added with LPS and AST. The inflammatory factors of TNF-α and IL-6 in the cultured medium and the activities of cellular SOD and CAT enzymes were detected by ELISA. The levels of reactive oxygen species (ROS) in the cells were detected by flow cytometry, and the distribution of tight junction protein, such as Claudin, CDH1 and TJP1, were observed by immunofluorescence staining. The mRNA and protein expression were examined by using fluorescence quantitative RT-PCR and Western Blot, respectively. 【Result】 The endometrial cells were cultured in the medium supplemented with 1 μg·mL ^-1 LPS for 6 h, the production of IL-6 and TNF-α in the cultured medium were significantly higher than those in the control group (P＜0.05), indicating that LPS induced inflammation of endometrial cells. Compared with the control group, the level of intracellular ROS significantly increased (P＜0.05), and the activities of cellular SOD and CAT enzymes significantly decreased (P＜0.05), which indicated that LPS-induced inflammation in endometrial cells caused oxidative damage. When endometrial cells were further cultured in the medium containing 1×10 ^-6 mol·L ^-1 astaxanthin for 24 h, the levels of IL-6 and TNF-α in cultured medium were significantly lower than those in LPS group (P＜0.05), the percentage of ROS positive cells decreased significantly (P＜0.05), and the activities of SOD and CAT enzymes increased significantly (P＜0.05). Compared with the control group, the fluorescence signals of Claudin, CDH1 and TJP1 proteins in the LPS group were weakened, and the levels of the mRNA and protein expression of tight junction proteins also decreased significantly (P＜0.05). However, when compared with the LPS group, Claudin, CDH1 and TJP1 proteins with strong fluorescence signals were detected in cell margin and nucleus in LPS+AST group, and the levels of mRNA and protein expression also significantly increased (P＜0.05).【Conclusion】 Astaxanthin reduced the oxidative damage which caused by inflammatory of endometrial cells, relived the structure damage of tight junction proteins in endometrial cells, which might protect the physical immune barrier of endometrium and provided theoretical reference for the prevention and treatment of bovine endometritis.
Keywords：bovine;astaxanthin;endometrial cells;inflammatory factors;tight junction protein


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本文引用格式
张辰, 谭秀文, 魏晨, 张相伦, 靳青, 刘桂芬, 刘晓牧, 万发春. 虾青素对牛子宫内膜细胞炎症损伤的保护作用[J]. 中国农业科学, 2019, 52(17): 3049-3058 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.17.012
ZHANG Chen, TAN XiuWen, WEI Chen, ZHANG XiangLun, JIN Qing, LIU GuiFen, LIU XiaoMu, WAN FaChun. Protective Effect of Astaxanthin on Inflammatory Injury of Endometrial Cells in Bovine[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2019, 52(17): 3049-3058 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.17.012

0 引言

【研究意义】子宫内膜炎是牛场最常见的繁殖疾病之一,其主要影响牛的繁殖性能,造成流产、难孕甚至不孕,产犊间隔延长,从而导致其繁殖率降低,会造成严重的经济损失。牛子宫内膜炎是发生在牛子宫内膜组织的病理过程。在牛场饲养管理过程中,多种因素会导致牛子宫内膜炎的发生,但病原微生物感染是引发本病的最主要原因,其中革兰氏阴性菌是主要的致病菌种。目前,对于牛子宫内膜炎的治疗普遍采用抗生素,但这样可造成细菌的耐药性增加,机体免疫力下降,以及奶、肉的药物残留问题。因此,研发安全、高效、绿色的新型饲用抗生素替代产品已迫在眉睫。【前人研究进展】虾青素（Astaxanthin,AST）是一种酮式类胡萝卜素,其广泛存在于海洋生物、藻类、真菌及少数植物中。研究发现,虾青素具有多种生物学效应,包括抗炎、抗凋亡、抗氧化、提高机体免疫等。MEEPHANSAN等报道,虾青素可通过降低小鼠机体氧化应激促进皮肤伤口愈合^[1]。ALAM等利用异丙肾上腺素制作大鼠心肌梗死和心脏肥大模型,发现虾青素处理可防止心脏湿重增加,减少炎症细胞浸润和纤维化^[2]。MENG等利用Cu²⁺诱导前列腺细胞系（RWPE-1）凋亡,发现虾青素处理后可保护细胞免受Cu²⁺诱导的氧化损伤^[3]。【本研究切入点】由于炎症通常是自由基导致的氧化损伤所致,而虾青素是已经发现的最强、最高效的天然抗氧化剂之一。雨生红球藻中虾青素的抗氧化活性是β-胡萝卜素的10倍、维生素E的550倍,被称为超级维生素。【拟解决的关键问题】基于虾青素较强的抗氧化特性,本试验利用细菌脂多糖（LPS,其主要成分是革兰氏阴性菌细胞壁）建立牛子宫内膜细胞炎症损伤模型,研究虾青素对炎症的反应,为虾青素在疾病预防和炎症治疗方面的应用提供理论基础。

1 材料与方法

试验于2017年至2018年在山东省农业科学院畜牧兽医研究所进行,所有生物材料和试剂保存于山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室。

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 DMEM/F12培养基（Gibico公司）、胎牛血清（Biological Industries公司）、0.25%Trypsin- EDTA（Sigma公司）、虾青素（Sigma公司）、LPS（Gibco公司）、Penicillin-Streptomycin（北京Solarbio公司）、CCK-8溶液（上海碧云天生物技术有限公司）、DMSO（德国WAK公司）、血清白蛋白BSA（Sigma公司）、引物（济南铂尚生物）、TRIzon Reagent（康为世纪生物科技有限公司）、Hiscript ⅡQ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)（南京诺唯赞生物科技有限公司）、Cham QTM SYBR Color qPCR MasterMix（南京诺唯赞生物科技有限公司）、ELISA试剂盒（上海朗顿生物）。

1.1.2 主要仪器 CO₂细胞培养箱（美国Thermo公司）、倒置相差显微镜及全自动显微摄像装置（日本Nikon公司）、酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）、高速冷冻离心机（德国Sigma公司）、荧光定量PCR仪（罗氏医学仪器公司）、流氏细胞仪（美国BD公司）、激光共聚焦显微镜（德国Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组处理 牛子宫内膜细胞系（BEND）购自上海冠导生物工程有限公司,其建系于1997年,取自美国拉勒米怀俄明州发情第14天的荷斯坦奶牛子宫内膜。按照常规方法将复苏的细胞放入含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12培养液中,置于38.5℃、5% CO₂的细胞培养箱内培养,待细胞生长至贴壁80%—90%时用0.25%胰酶消化传代。根据不同的试验目的,分别将细胞移入6孔细胞板或96孔细胞板中继续培养,随机分为3组：对照组、脂多糖组（LPS组）和虾青素保护组（LPS+AST组）,每组设置6个平行样本。待细胞贴壁80%—90%后,去除原有细胞培养液,LPS组和LPS+AST组加入终浓度为1 μg·mL^-1的LPS培养液,对照组加入新的培养液。LPS作用6 h后,LPS+AST组更换为含1×10^-6 mol·L^-1 AST的培养液,LPS组和对照组更换为不含AST的相同培养液,继续培养24 h。

1.2.2 ELISA法检测炎症因子含量 处理结束后收集培养液,10 000×g离心5 min取上清液,分别用于检测培养液中炎症因子IL-6 和TNF-α含量。按照ELISA试剂盒说明书操作,分别将标准品、待测样品各100 μL加入酶标板孔中,保留两个空白孔,37℃孵育90 min,洗板5次。除空白孔外,每孔加入50 μL生物素化抗体工作液,37℃孵育60 min,洗板5次;除空白孔外,加入100 μL酶结合物工作液,37℃避光孵育30 min,洗板5次;加入100 μL显色底物,37℃避光孵育15 min;加入100 μL终止液,混匀后用酶标仪检测450 nm的吸光度,经空白校准后绘制标准曲线并计算样品蛋白浓度。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞内ROS 用0.25%胰蛋白酶消化细胞,PBS洗涤2次,加入1 mL DCFH-DA染液重悬细胞,37℃避光孵育30 min,PBS洗2次。利用流式细胞仪上机检测细胞荧光强度,以Cell Quest软件分析平均荧光强度。

1.2.4 抗氧化酶（SOD、CAT）活性测定 用0.25%胰蛋白酶消化细胞,PBS洗涤2次,将细胞混悬于RIPA裂解液,冰上放置30 min,4℃、12 000×g离心10 min,收集细胞裂解液。按照试剂盒说明书中所述步骤操作,最后在酶标仪450 nm处检测吸光度,并绘制标准曲线,根据标准曲线计算SOD和CAT活性。

1.2.5 紧密连接蛋白免疫荧光染色 将细胞按1×10⁴个/mL接种到激光共聚焦专用培养皿中,待贴壁至80%—90%时,用PBS洗涤1次,加入4%多聚甲醛4℃固定30 min。将多聚甲醛去除,加入预冷的PBS洗3次,每次5 min。加入含0.1% Triton X-100的PBS透膜处理10 min,PBS洗3次,每次5 min。加入含3% BSA的PBS,常温封闭2 h。去除封闭液后加入一抗,分别是兔抗Claudin多克隆抗体（1﹕1 000,4933T,CST）、兔抗CDH1多克隆抗体（1﹕1 000,4068S,CST）和兔抗TJP1多克隆抗体（1﹕500,10804,SANTA CPUZ）,4℃孵育过夜。去除一抗,PBS洗3次,每次5 min。加入二抗,Cy3连接的山羊抗兔IgG（1﹕200;Jackson Immuno Research）,室温避光孵育1 h。去除二抗,PBS洗3次,每次5 min。加入0.01 mg·mL^-1 Hoechst33342染色10 min,PBS洗3次,每次5 min。加入荧光防淬灭液,用激光共聚焦显微镜（Leica）观察并采集数据。Hoechst和Cy3分别用蓝色二极管（405 nm）和氦/氖激光管（543 nm）激发,同时采集相应带宽的发射光分别为420—480 nm（Hoechst）和560—605 nm（Cy3）,对应伪彩分别为蓝色和红色。采用相同的参数进行成像,并采集原始照片,然后将这些照片用Image-Pro Plus软件（Media Cybernetics Inc.,Silver Spring,MD）在固定的参数下进行总荧光强度分析。将对照组的荧光值设为1,其他各组细胞的荧光值为与对照组的比值。

1.2.6 荧光定量RT-PCR法检测紧密连接的mRNA表达水平

（1）引物设计 利用Primer 5.0软件设计PCR引物（表1）,由铂尚生物技术有限公司合成。

Table 1
表1
表1PCR引物序列参数
Table 1PCR primer sequence parameters

基因 Gene	引物序列 Primer sequence	序列号 Accession number	产物长度 Length
β-actin	F:CACCGCAAATGCTTCTAGGC R:TGTCACCTTCACCGTTCCAG	NM_173979.3	186
Claudin	F: AAGACGACGAGGCACAGAAG R: CGGGGTCATGGGGTCATAGA	NM_001001854.2	137
CDH1	F: CGTGACCGACCAGAATGACA R: GGCTGGGATTGTGTAACCGA	NM_001002763.1	166
TJP1	F: CTGCTGCCAAAGAAGGCTTG R: CGGATTCTACGATGCGACGA	XM_010817146.1	177

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（2）细胞总 RNA 的提取 采用北京康为世纪生物科技有限公司试剂盒（RNApure超纯总RNA快速提取试剂盒）按照说明书提取细胞总RNA。细胞处理结束后去掉培养液,加入PBS洗1次,每孔加入1 mL Trizol试剂裂解细胞,加入0.2 mL氯仿,4℃,12 000× g离心10 min,吸取上层水相,加入水相体积一半的无水乙醇混匀,室温放置10 min后于4℃,12 000×g离心15 min。弃上清液缓慢加入1 mL 用DEPC水配制的75%乙醇洗涤,于4℃,7 000×g离心5 min。RNA沉淀于室温风干10 min,加入30 μL的1%DEPC水溶解。采用 One Drop测定样品总RNA的浓度和纯度。

（3）cDNA 的合成 采用诺唯赞试剂盒（HiScript^? II Q Select RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) Kit）按照说明书进行 cDNA 的合成。在RNase-free的0.5 mL PCR管中配制混合液,42℃孵育2 min;加入5× HiScript II qRT SuperMix II,用移液枪轻轻吹打混匀;于50℃ 15 min,85℃ 5 s,迅速置于冰上终止反应得到cDNA,-20℃保存备用。

（4）Real-time PCR 按Real-time PCR试剂盒说明书进行操作,采用20 μL反应体系：SYBR Premix 10 μL、上下游引物各1 μL、cDNA模板2 μL、ddH₂O 6 μL。PCR扩增条件：95℃预变性30 s;95℃ 5 s;60℃ 30 s;反应40个循环。设置β-actin作为内参,以2^-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。

1.2.7 Western Blot法检测紧密连接的蛋白表达水平 处理结束后去掉培养液,加入PBS洗1次,加入细胞裂解液置于冰上操作。反复吹打收集裂解液,4℃,12 000 ×g离心10 min,吸取上清液。利用BCA法测定蛋白浓度,用裂解液将所有样品稀释至同等浓度,加入SDS上样缓冲液100℃孵育5 min,以5%浓缩胶和12%分离胶进行SDS-PAGE电泳。结束后将蛋白条带电转至PVDF膜上,加入封闭液室温孵育1 h,加入一抗4℃孵育过夜,用TBST洗膜3次,每次5 min,加入辣根过氧化物酶标记的二抗,室温孵育2 h,TBST洗膜3次,每次5 min。取出PVDF膜,加入化学发光检测液室温避光孵育2 min,使用凝胶成像系统拍照。采用Quantity One软件进行灰度分析,目的蛋白灰度值与内参灰度值的比值表示蛋白相对表达量。

1.3 数据分析

采用SPSS19.0统计软件进行分析。所有数据以均数±标准差表示,采用单因素方差分析LSD法进行统计处理,当P<0.05时表示差异显著。

2 结果

2.1 虾青素对子宫内膜细胞炎症因子分泌的影响

以LPS处理子宫内膜细胞建立体外炎症模型,由图1可知,1 μg·mL^-1 LPS作用子宫内膜细胞6 h显著提高IL-6和TNF-α蛋白的分泌水平（P<0.05）。在LPS造成细胞损伤的基础上,加入1×10^-6 M 虾青素作用细胞24 h,IL-6和TNF-α蛋白的分泌水平显著下降（P<0.05）。说明虾青素降低LPS诱导的子宫内膜细胞炎症反应。

图1

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图1虾青素对LPS诱导的子宫内膜细胞IL-6和TNF-α水平的影响

Fig. 1Effect of astaxanthin on levels of IL-6 and TNF-α in LPS-induced endometrial cells

2.2 虾青素对子宫内膜细胞氧化应激的影响

利用流式细胞仪检测子宫内膜细胞内ROS水平,结果（图2）发现,LPS作用6 h导致细胞内ROS水平增加（P<0.05）,SOD和CAT酶活性都显著降低（P<0.05）;再加入虾青素作用24 h后, ROS阳性细胞比率显著下降（P<0.05）,SOD和CAT酶活性都显著升高（P<0.05）。说明虾青素降低细胞内ROS形成,提高抗氧化酶系统活性,保护细胞免受LPS导致的氧化应激损伤。

图2

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图2虾青素对LPS诱导的子宫内膜细胞氧化状态的影响

Fig. 2Effect of astaxanthin on oxidative status in LPS- induced endometrial cells

2.3 虾青素对子宫内膜细胞紧密连接蛋白分布的影响

利用免疫荧光染色检测子宫内膜细胞紧密连接蛋白Claudin、CDH1、TJP1分布情况,结果（图3）发现,Claudin、CDH1、TJP1主要分布在子宫内膜细胞的细胞膜。用LPS作用6 h后,细胞膜处的Claudin、CDH1、TJP1的荧光信号减弱,说明此蛋白的含量减少,并且可见在子宫内膜细胞边缘分布紊乱、无清晰的轮廓;而再加入虾青素作用24 h后,在细胞边缘和细胞核内可以检测到荧光信号很强的Claudin、CDH1、TJP1,且在细胞边缘分布均匀。说明虾青素能缓解LPS导致的紧密连接蛋白在子宫内膜细胞上分布异常和含量降低。

图3

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图3虾青素对LPS诱导的子宫内膜细胞Claudin、CDH1、TJP1蛋白分布的影响

Fig. 3Effect of astaxanthin on distribution of Claudin, CDH1 and TJP1 in LPS-induced endometrial cells

2.4 虾青素对子宫内膜细胞紧密连接基因mRNA表达的影响

利用荧光定量RT-PCR法检测Claudin、CDH1、TJP1基因的mRNA表达水平,结果（图4）发现,与对照组相比,LPS处理显著降低子宫内膜细胞Claudin、CDH1、TJP1基因的mRNA表达（P<0.05）,加入虾青素作用后Claudin、CDH1、TJP1的mRNA表达显著高于LPS处理组（P<0.05）。说明在mRNA水平上,虾青素提高子宫内膜细胞因LPS刺激导致的紧密连接表达降低。

图4

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图4虾青素对LPS诱导的子宫内膜细胞Claudin、CDH1、TJP1基因表达的影响

Fig. 4Effect of astaxanthin on mRNA expressions of Claudin, CDH1 and TJP1 in LPS-induced endometrial cells

2.5 虾青素对子宫内膜细胞紧密连接蛋白表达的影响

利用Western Blot法检测Claudin、CDH1、TJP1蛋白表达水平,结果（图5）发现,与对照组相比,LPS处理显著降低子宫内膜细胞Claudin、CDH1、TJP1蛋白表达（P<0.05）,加入虾青素后Claudin、CDH1、TJP1蛋白表达显著高于LPS处理组（P<0.05）。说明虾青素能修复LPS导致的子宫内膜细胞紧密连接结构损伤,对子宫内膜屏障起保护作用。

图5

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图5虾青素对LPS诱导的子宫内膜细胞Claudin、CDH1、TJP1蛋白表达的影响

Fig. 5Effect of astaxanthin on protein expressions of Claudin, CDH1 and TJP1 in LPS-induced endometrial cells

3 讨论

大肠杆菌等革兰氏阴性菌是奶牛子宫内膜炎的重要致病菌,而位于细胞壁外膜上的LPS是激活机体免疫应答的重要物质,也是引起炎症的关键细胞毒性因子,在体内激活多种炎症信号通路,促使机体分泌炎性因子抵御炎症反应^[4,5,6]。参与免疫反应的早期和炎症反应各阶段的许多分子包括：TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、iNOS、COX2、趋化因子、黏附分子、集落刺激因子等^[7,8,9]。其中TNF-α和IL-6都是主要的促炎症细胞因子,在很多疾病的发生和转化中起到了重要作用。研究表明,TNF-α是前期炎症反应中最先产生并且起到最关键作用的炎症因子^[10,11,12]。它具有十分广泛的生物活性,引发一系列炎症介质的产生,进而造成炎性因子的瀑布效应,是导致许多疾病生物学变化的重要递质。TNF-α分泌量是炎症病理过程中严重程度的标志,对疾病的发生具有调节和介导作用^[13]。IL-6同样具有多种生物活性,参与机体的炎症反应,能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其功能^[14,15,16]。GHASEMI等报道,亚临床子宫内膜炎奶牛子宫内膜组织中,TNF-α、IL-6和IL-8的水平远高于正常奶牛^[17]。KASIMANICKAM等报道,临床上患子宫内膜炎的荷斯坦奶牛,血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平显著高于正常奶牛^[18]。KIM等报道,奶牛子宫积液中TNF-α、IL-6和IL-10水平显著正常奶牛^[19]。这些都说明奶牛子宫内膜炎的严重程度与机体中炎症细胞因子的水平有重要关系。本研究发现,利用1 μg·mL^-1 LPS处理奶牛子宫内膜细胞6 h后,IL-6和TNF-α的分泌量显著升高,说明奶牛子宫内膜细胞已发生炎症反应,其炎症模型构建成功。

虾青素作为自然界存在的一种高度活性的化合物,具有增强机体局部和全身免疫的能力,抵抗机体炎症,这种抗氧化性与免疫调节特性相结合,在防止疾病发生与传播中发挥重要作用。OTTON等对大鼠采取灌胃的方式饲喂虾青素和鱼油,其中鱼油作为多不饱和脂肪酸诱导机体发生氧化应激,结果发现虾青素降低活化的T淋巴细胞和B淋巴细胞中ROS水平,提高SOD、GPx等抗氧化酶活性,降低脂质和蛋白质的氧化损伤程度以及炎症因子IL-1β水平,说明虾青素能增强机体的免疫调节能力,并降低氧化损伤^[20]。WAKABAYASHI等利用虾青素饲喂大鼠4周,然后添加葡萄糖酸氯己定继续饲喂,其中葡萄糖酸氯己定诱导腹膜纤维化,结果发现虾青素降低腹膜厚度、8-羟基-2'-脱氧鸟苷水平以及TNF-α和IL-1β水平,说明虾青素通过降低氧化损伤和抑制炎症反应预防腹膜损伤^[21]。ISLAM等利用四氯化碳（CCl₄）构建大鼠肝损伤模型,然后饲喂虾青素进行治疗,结果发现虾青素降低机体丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）和高级蛋白质氧化产物（APOP）水平,提高CAT和SOD活性,并且阻止炎性细胞浸润,说明虾青素通过抑制脂质过氧化、激活抗氧化系统以及防止炎症反应保护肝损伤^[22]。本研究结果表明,虾青素显著降低奶牛子宫内膜细胞ROS水平,提高SOD和CAT的酶活性,降低IL-6和TNF-α分泌水平,说明虾青素可以降低LPS产生的氧化应激以及抑制炎症反应。

正常情况下,黏膜屏障由上皮细胞以及上皮细胞紧密连接等组成,可阻止致病微生物及毒素等大分子物质通过,是防止感染、参与机体免疫的第一道屏障^[23,24]。紧密连接普遍在于脊椎动物的上皮及粘膜中,在防止病原体入侵中起到重要作用。常见的紧密连接蛋白有claudin、occludin、ZO-1等^[25]。研究发现,大量炎症因子或介质可损伤上皮细胞,影响上皮细胞紧密连接蛋白的表达及分布,破坏黏膜屏障的完整性和功能稳定,进而导致疾病的发生。因此,黏膜结构中紧密连接蛋白的研究也受到许多****的重视。WU等报道,苹果花青素提取物可减轻LPS诱导的Caco-2细胞氧化应激和炎症反应,紧密连接蛋白如occludin、ZO-1等表达升高^[26]。CHO等利用石榴预饲喂大鼠,然后暴饮酒精诱导肠道穿孔和炎症性肝损伤,发现石榴预处理恢复肠道紧密连接蛋白如ZO-1、occludin、claudin-1和claundin-3的表达水平,降低酒精诱导的肠道屏障功能障碍、血浆内毒素和炎性肝病^[27]。KAWABATA等利用葡聚糖硫酸钠构建小鼠结肠炎模型,饲喂柑橘果皮粉末后发现,炎症细胞因子表达降低,结肠的紧密连接蛋白如occludin、ZO-1、连接黏附分子-A表达升高,说明果皮粉有助于抑制小鼠结肠炎症,保护肠道黏膜屏障^[28]。CHEN等研究发现,缺乏维生素D可以引起claudin-2,claudin-4和claudin-12的mRNA和蛋白水平显着降低^[29]。本研究结果表明,虾青素提高子宫内膜细胞中紧密连接蛋白如Claudin、CDH1、TJP1的表达,减轻了LPS导致的子宫内膜细胞紧密连接结构损伤,对子宫内膜屏障起保护作用。

4 结论

通过构建牛子宫内膜细胞炎症模型,将虾青素作用于炎症细胞,发现虾青素对于增强牛的黏膜屏障功能有显著的效果。

参考文献 View Option 原文顺序
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文中引用次数倒序
被引期刊影响因子

[1] MEEPHANSAN J, RUNGJANG A, YINGMEMA W, DEENONPOE R, PONNIKORN S . Effect of astaxanthin on cutaneous wound healing
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