易敏^1,2, 吕青¹, 刘柯柯¹, 王礼君¹, 吴玉娇¹, 周泽扬¹, 龙梦娴^,1,21 西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室/微孢子虫感染与防控重庆市重点实验室,重庆 400715
2 西南大学生物技术学院,重庆400715

Expression, Purification and Localization Analysis of Polar Tube Protein 2 (NbPTP2) from Nosema bombycis

YI Min^1,2, Lü Qing¹, LIU KeKe¹, WANG LiJun¹, WU YuJiao¹, ZHOU ZeYang¹, LONG MengXian^,1,2 1 State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Southwest University/Chongqing Key Laboratory of Microsporidia Infection and Prevention, Chongqing 400715
2 College of Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715

通讯作者: 龙梦娴,Tel：023-68251088;E-mail： longmx@swu.edu.cn

编委: 岳梅
收稿日期:2019-01-11接受日期:2019-03-15网络出版日期:2019-05-16

基金资助:

国家自然科学基金.31402138、重庆市基础科学与前沿探索项目 cstc2018jcyjAX0550 西南大学科研基金.GZRY20180042 中央高校基本科研业务费.XDJK2018AA001 西南大学博士基金.SWU111081

Received:2019-01-11Accepted:2019-03-15Online:2019-05-16
作者简介 About authors
易敏,E-mail： y970417@163.com。









摘要
【目的】微孢子虫是一种细胞内专性寄生的真核生物,几乎能感染所有生物,包括人类。极管作为微孢子虫特有的侵染器官,主要由极管蛋白组成。极管蛋白在微孢子虫侵染宿主与稳定孢子结构中发挥重要作用。本研究通过克隆、表达家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）极管蛋白2（NbPTP2）,分析其在成熟孢子极管上的定位特征,为深入研究极管蛋白的功能打下基础。【方法】克隆家蚕微孢子虫NbPTP2。利用Expasy、SignalP 4.1、TMHMM Server V.2.0和NetPhos 3.1 Server等在线软件对NbPTP2的序列特征进行分析,包括氨基酸组成、蛋白质理论分子量、等电点、信号肽、跨膜结构域和磷酸化位点。此外,利用MEGA 7.0软件构建不同种属微孢子虫极管蛋白2的系统进化树。通过克隆NbPTP2,将其与原核表达载体pET32a(+)连接,构建pET32a(+)-NbPTP2重组表达质粒。将测序正确的重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta中,IPTG诱导异源表达,经镍柱亲和层析纯化融合蛋白后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用免疫印迹检测NbPTP2在成熟孢子中的表达情况,并通过间接免疫荧光试验（IFA）分析NbPTP2在家蚕微孢子虫成熟孢子中的定位特征。【结果】成功克隆并获得长为834 bp的NbPTP2基因序列,该蛋白编码278个氨基酸残基,理论分子质量为30.9 kD,等电点为9.39,无跨膜结构域,N端存在信号肽,具有潜在的磷酸化修饰位点。系统进化树分析结果显示,家蚕微孢子虫NbPTP2与西方蜜蜂微孢子虫NaPTP2、东方蜜蜂微孢子虫NcPTP2的亲缘关系最近。Western blot结果表明,NbPTP2编码的蛋白质在成熟孢子的孢子总蛋白中有表达,分子量大小约为39 kD。IFA定位特征分析结果显示,NbPTP2能定位于家蚕微孢子虫的整条极管上,证实其为一种极管蛋白。【结论】明确了NbPTP2与其他微孢子虫极管蛋白2的亲缘关系,NbPTP2在成熟家蚕微孢子虫中有表达,且能定位于微孢子虫发芽后的整条极管上。研究结果可为极管的结构解析与极管蛋白功能的研究提供依据。
关键词： 家蚕;家蚕微孢子虫;极管蛋白2;原核表达;定位分析

Abstract
【Objective】Microsporidia are eukaryotic intracellular obligate parasites that infect almost all organisms, including human. As a special infection organ, the polar tube is mainly composed of polar tube proteins. The polar tube protein plays an important role in microsporidia invasion host and maintaining the structure of polar tube. The objective of this study is to clone and express Nosema bombycis polar tube protein 2 (NbPTP2), analyze its localization characteristics in mature spores, and to lay a foundation for further study the function of polar tube proteins.【Method】NbPTP2 was amplified from N. bombycis genome. The amino acid composition, theoretical molecular weight and predicted isoelectric point of NbPTP2 were analyzed by Expasy online software. SignalP 4.1 and TMHMM Server V. 2.0 were used to predict the signal peptide and transmembrane domain of NbPTP2. The phosphorylation site of NbPTP2 was analyzed by NetPhos 3.1 Server. The phylogenetic tree of NbPTP2 from different microsporidia species was constructed by MEGA 7.0. NbPTP2 was amplified from N. bombycis genome, then ligated with prokaryotic expression vector pET32a (+). The correctly sequenced recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli Rosetta, and protein expression was heterologous induced by IPTG. The polyclonal antibody of NbPTP2 was prepared by immunizing New Zealand rabbits with the fusion protein by affinity chromatography purification. The expression of NbPTP2 in mature spores was detected by Western blot. Indirect immunofluorescence assay (IFA) was used to analyze the localization characteristics of NbPTP2 in mature spores of microsporidia. 【Result】 The NbPTP2 with a length of 834 bp was successfully cloned. The protein encodes 278 amino acid residues with a theoretical molecular weight of 30.9 kD, and isoelectric point of 9.39. Moreover, it was predicted to have a N-terminal signal peptide and potential phosphoric acid sites, but no transmembrane domain. The phylogenetic tree analysis result showed that NbPTP2 from N. bombycis was closely related to NaPTP2 from N. apis and NcPTP2 from N. ceranae. Western blot result showed that NbPTP2 was expressed in mature spores of N. bombycis and its molecular weight was about 39 kD. The localization analysis result of IFA indicated that NbPTP2 could locate on the whole polar tube of N. bombycis, and it was confirmed that NbPTP2 was a polar tube protein. 【Conclusion】 The relationship between NbPTP2 and polar tube protein 2 from other microsporidia was clarified. NbPTP2 was expressed in N. bombycis and could be localized on the whole polar tube after germination. These results can provide a basis for polar tube structure analysis and polar tube protein function research.
Keywords：silkworm (Bombyx mori);Nosema bombycis;polar tube protein 2;prokaryotic expression;localization analysis


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本文引用格式
易敏, 吕青, 刘柯柯, 王礼君, 吴玉娇, 周泽扬, 龙梦娴. 家蚕微孢子虫极管蛋白2（NbPTP2）的表达、纯化和定位特征[J]. 中国农业科学, 2019, 52(10): 1830-1838 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.10.015
YI Min, Lü Qing, LIU KeKe, WANG LiJun, WU YuJiao, ZHOU ZeYang, LONG MengXian. Expression, Purification and Localization Analysis of Polar Tube Protein 2 (NbPTP2) from Nosema bombycis[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2019, 52(10): 1830-1838 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.10.015

0 引言

【研究意义】家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）能够在侵染宿主家蚕（Bombyx mori）后通过快速的水平传播和经卵垂直传播引发家蚕微粒子病,给我国乃至世界蚕业生产带来巨大经济损失^[1,2]。极管作为微孢子虫特有的侵染器官,主要由极管蛋白组成。极管蛋白在微孢子虫侵染宿主与稳定孢子结构中发挥重要功能。因此,对家蚕微孢子虫极管蛋白基因进行鉴定及定位分析,可对后续微孢子虫极管蛋白的生物学功能研究提供有利参考。【前人研究进展】微孢子虫是微孢子虫门中的一类胞内专性寄生的真核生物^[3,4]。其宿主十分广泛,能感染几乎所有的无脊椎动物和脊椎动物,甚至免疫功能不全的艾滋病病人与癌症患者^[5,6,7]。不同宿主来源的微孢子都具有相似的侵染机制,即成熟孢子能在特殊外界环境刺激下迅速弹出极管,随后具有感染性的孢原质通过这根中空的极管运输到宿主细胞中,以此开启新的生命周期^[8,9,10,11]。研究发现,极管由两个主要部分构成,即前端垂直区域和后部螺旋区域。前端垂直部分也称为极柄,片状极膜层围绕在其周围;后螺旋区呈4—30圈的螺旋状,不同种属微孢子虫的极管圈数不相同^[12,13]。未弹出的极管会规则盘绕在孢原质周围;弹出后的极管直径为0.1—0.2 μm,其长度约为50—150 μm。极管溶解特性比较特殊,它能溶于DTT或β-巯基乙醇等还原剂中^[14,15],但不溶于1%—3% SDS、1% Triton X-100、1%—10% H₂O₂等溶液中^[16]。极管主要由蛋白质组成,目前经过鉴定的极管蛋白分别为PTP1、PTP2、PTP3、PTP4和PTP5^{[17,18,19,20,21]}。PTP1是一种主要极管蛋白,富含脯氨酸,可使肽链具有一定的硬度和韧性^[22],PTP1在维持极管的结构稳定和运输孢原质等过程中具有关键作用^[12,23]。PTP2的预测分子量大小约为30 kD,N端具有信号肽,不溶于SDS,但易溶于DTT还原剂^[24],具有保守的半胱氨酸位点,推测PTP2通过形成蛋白聚合体发挥维持极管结构稳定的功能^[14,25]。PTP3富含谷氨酸和天冬氨酸,且蛋白分子量明显大于PTP1和PTP2,约为150 kD。其溶解性与PTP1、PTP2相反,PTP3可溶于SDS却不能溶于DTT类还原剂中^[18]。在极管形成过程中,PTP3可能与PTP1、PTP2具有离子键的相互作用,可作为其他极管蛋白组装的支架蛋白^[10,18]。最新研究从海伦脑炎微孢子中鉴定得到PTP4,确定其能与宿主细胞的转铁蛋白受体1发生相互作用,影响微孢子虫对宿主的侵染^[26]。PTP5也在兔脑炎微孢子虫（Encephalitozoon cuniculi）中得到了鉴定,PTP4、PTP5基因座位类似于PTP1/PTP2,二者也位于同一个基因簇中,但关于PTP5与其他蛋白的相互作用与联系还未知^[20,27]。【本研究切入点】迄今,家蚕微孢子虫全基因序列测序分析已经完成^[28],但有关家蚕微孢子虫极管蛋白基因的研究鲜有报道,仅限于对NbPTP1的定位及其糖基化修饰特征进行了研究^[29,30]。而对极管蛋白2（NbPTP2）的基因克隆、表达和定位分析尚未见报道。【拟解决的关键问题】以家蚕微孢子虫为材料,鉴定NbPTP2的表达和定位特征,为解析家蚕微孢子虫极管结构、阐明侵染机制以及微孢子虫病的有效防治提供重要参考。

1 材料与方法

试验于2018年在西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室完成。

1.1 材料与数据来源

1.1.1 菌株与载体 大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α和Rosetta感受态细胞购买自重庆灵精生物有限公司;家蚕微孢子虫CQ1株（保藏号：CVCC102059）和pET-32a(+)表达质粒由本实验室保存。

1.1.2 实验动物 新西兰大白兔购于重庆恩斯维尔生物科技有限公司。

1.1.3 数据来源 家蚕微孢子虫CQ1株的基因组数据来源于本实验室测序数据库（http://microbe.swu.edu.cn/silkpathdb/）;构建家蚕微孢子虫、感染哺乳动物微孢子虫和感染昆虫微孢子虫极管蛋白2的系统进化树数据来源于NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。

1.1.4 试剂与仪器 PrimerSTAR Max DNA聚合酶、NotⅠ和EocRⅠ限制性内切酶购自TaKaRa公司;DNA胶回收试剂盒、Plasmid mini kit Ⅰ质粒提取试剂盒（OMEGA）购于范德生物科技有限公司;150—212 μm玻璃珠、弗氏佐剂、HRP标记山羊抗兔 IgG、His-tag抗体（兔单抗）等购于Sigma;His镍亲和层析柱（GE公司）;ECL化学发光底物购自Bio-Rad公司。核酸电泳仪DYY-12,北京六一仪器厂;UV凝胶成像系统,Bio-Rad公司;化学发光成像系统,四川奥卓科技有限公司;Gene Amp PCR系统9700,Applied Biosystems;超声波细胞粉碎仪JY92-2D,宁波新芝生物科技股份有限公司;激光共聚焦显微镜FV1200,奥林巴斯（中国）有限公司。

1.2 NbPTP2克隆

根据NbPTP2（GenBank登录号：HQ881498.1）基因序列,利用Primer5.0软件设计特异性引物 F（5′-CCGGAATTCATGTTTTTATCTCTAAACCG-3′,下划线为EcoRI酶切位点）和R（5′-TTTTCCTTTT GCGGCCGCTCAAGTAGAATTGGAACCAT-3′,下划线为NotI酶切位点）,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板利用聚合酶链式反应（PCR）扩增。反应体系：Prime STAR Max 12.5 μL,模板DNA 1 μL,ddH₂O 9.5 μL,正反引物各1 μL（100 μmol?L^-1）。反应条件：98℃ 3 min;98℃ 15 s,59℃ 15 s,72℃退火30 s,30个循环;72℃ 7 min,4℃终止。扩增得到的产物利用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测,并利用胶回收试剂盒（Gel Extraction Kit）参照说明书步骤进行胶回收。

1.3 NbPTP2序列特征和系统进化树分析

通过ExPASy Proteomics Server的在线软件Protparam（https://web.expasy.org/protparam/）对NbPTP2进行理化性质的分析和预测;利用SignalP 4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在线分析NbPTP2的信号肽;应用TMHMM Server V.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）程序在线预测NbPTP2的跨膜结构域;应用NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）在线预测NbPTP2中磷酸化位点。使用MEGA 7.0软件绘制家蚕微孢子虫、几种感染昆虫和哺乳动物的微孢子虫极管蛋白2的系统进化树。

1.4 重组质粒的构建

构建pET32a(+) -NbPTP2载体步骤如下：（1）将PCR产物和pET-32a(+)载体进行双酶切。双酶切体系：EcoRI（20 000 U?mL^-1）与NotI（20 000 U?mL^-1）各1 μL,10×CutSmart Buffer 5 μL,目的片段20 μL,ddH₂O补足50 μL。37℃下反应3 h,酶切产物利用1%琼脂糖凝胶电泳检测,并利用胶回收试剂盒（Gel Extraction Kit）参照说明书步骤进行胶回收;（2）连接酶切产物：PCR双酶切产物与pET32a(+) 载体双酶切产物比例为7:1, T₄ DNA连接酶（400 000 U?mL^-1）1 μL,10×T₄ DNA连接酶Buffer 1 μL,ddH₂O补足10 μL。16℃连接过夜;（3）转化：从-80℃取出E. coli DH5α感受态细胞,将10 μL连接产物混入感受态中,冰上放置30 min,42℃热激90 s,冰上放置3 min,加入500 μL LB培养基,180 r/min培养30 min后涂布至含有氨苄青霉素LB平板培养基上;（4）检测阳性克隆：37℃培养过夜后挑取克隆,经菌液PCR与双酶切验证正确后,将其质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.5 NbPTP2-His融合蛋白的表达与纯化

将测序正确的pET32a(+) -NbPTP2重组质粒转化E. coli Rosetta感受态细胞,阳性克隆以1%的接种量接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中,37℃下180 r/min培养至OD₆₀₀=0.6—0.8时,添加IPTG至终浓度为0.6 mmol?L^-1,37℃下180 r/min诱导表达4 h。离心收集菌体,加入适量PBS重悬,同时加入适量蛋白酶抑制剂PMSF,超声裂解后4℃下12 000 r/min离心20 min分别收集上清和沉淀进行后续试验。参照GE公司镍柱亲和层析纯化说明书,纯化融合蛋白,SDS-PAGE电泳检测蛋白的表达形式。并将纯化的融合蛋白样品送上海中科新生命生物科技公司进行蛋白质质谱检测。质谱采用蛋白质内切酶（Trypsin）对蛋白质样品进行酶解,然后使用LC-MS/MS（nano LC-QE）对酶解后的样品进行分析。最后使用MASCOT等质谱匹配软件对LC-MS/MS数据进行分析,同时比对Nosema bombycis uniprot数据库,获得目标蛋白质定性鉴定信息。

1.6 多克隆抗体制备及表达定位分析

1.6.1 多克隆抗体制备 将适量纯化后的融合蛋白混合等体积的Freund佐剂（第1次为完全佐剂,之后用不完全佐剂）充分乳化,皮下注射新西兰大白兔。每隔一周免疫1次,共免疫4次,第3周时取耳缘静脉血清测定抗体效价,第5周后进行心脏采血,收集多克隆抗体血清,分装后-20℃保存备用。

1.6.2 免疫印迹检测 取10⁸个家蚕微孢子虫,分别加入300 μL RIPA裂解液、3 μL蛋白酶抑制剂PMSF、20% DTT 30 μL、0.4 g玻璃珠破碎5 min,于4℃旋转仪旋转5 min后再次破碎,重复5次。12 000 r/min离心15 min,上清即为孢子总蛋白。将提取的孢子总蛋白质样品经SDS-PAGE电泳后转移到PVDF 膜上,封闭。按 1:3 000体积比稀释的NbPTP2抗血清与PVDF膜于室温孵育1 h,TBST洗涤3次后,用1:6 000体积比稀释羊抗兔IgG室温孵育1 h,TBST洗涤后加入ECL化学曝光底物,置于化学发光成像系统检测结果。

1.6.3 间接免疫荧光检测（IFA） 取一个载玻片利用多聚赖氨酸（0.01%,w/v）包被10 min后,均匀涂抹适量的家蚕微孢子虫。待半干时滴加适量0.1 mol?L^-1 KOH,置于30℃恒温培养箱40 min诱导微孢子虫体外发芽。多聚甲醛（4%,w/v）固定25 min,PBST清洗。封闭液封闭2 h,清洗后利用NbPTP2抗血清与阴性血清（未经免疫的健康新西兰大白兔的血清作为阴性抗血清）作为一抗,4℃孵育过夜,PBST清洗。将Alexa594标记的羊抗兔二抗37℃孵育1 h,PBST清洗。DAPI染色15 min,清洗后加入抗荧光猝灭剂封片,利用共聚焦荧光显微镜FV1200（奥林巴斯（中国）有限公司,重庆）观察NbPTP2在家蚕微孢子虫中的定位特征。

2 结果

2.1 NbPTP2的序列特征与进化树分析

利用ExPASy Proteomics Server在线软件Protparam对NbPTP2进行分析和预测,结果显示NbPTP2理论分子质量为30.9 kD,等电点为9.39,富含赖氨酸、谷氨酸,其中赖氨酸含量高达11.9%。利用SignalP预测NbPTP2的N端存在信号肽,NetPhos预测NbPTP2具有潜在的磷酸化位点,TMHMM Server预测NbPTP2蛋白无跨膜区。

对多种属微孢子虫PTP2蛋白进化树分析结果发现（图1）,两种感染蜜蜂的西方蜜蜂微孢子虫（N. apis）和东方蜜蜂微孢子虫（N. ceranae）的极管蛋白2（NaPTP2和NcPTP2）与NbPTP2的距离较近,具有较高的同源性。感染哺乳动物的微孢子虫极管蛋白2（EcPTP2、EiPTP2和EhPTP2）之间具有较高同源性,聚为一支,但与NbPTP2距离较远,同源性较低。

图1

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图1不同种属微孢子虫极管蛋白2系统进化树

Fig. 1Phylogenetic tree of PTP2 from different genus and species microsporidia

2.2 NbPTP2的克隆及重组质粒的构建

将重组pET32a(+)-NbPTP2的质粒,进行PCR及双酶切验证,琼脂糖凝胶电泳检测出现大小与目的片段大小（834 bp）一致的条带（图2）。阳性克隆序列测序正确。

图2

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图2pET32a(+)-NbPTP2重组质粒的PCR及双酶切验证

M：DL2000 Plus Marker;1：pET32a(+)-NbPTP2重组质粒的PCR产物 PCR product of pET32a(+)-NbPTP2 recombinant plasmid;2：pET32a(+)- NbPTP2重组质粒的双酶切产物Double enzyme digestion product of pET32a(+)- NbPTP2 recombinant plasmid
Fig. 2PCR and enzyme digestion analysis of pET32a(+)- NbPTP2 recombinant plasmid

2.3 NbPTP2-His融合蛋白的表达与纯化检测

重组质粒转化E. coli Rosetta表达菌株,SDS-PAGE检测IPTG诱导后获得大量NbPTP2重组蛋白,且蛋白质主要以包涵体形式表达。参照GE公司的镍柱纯化方法得到分子量约为52 kD的融合蛋白NbPTP2-His（图3）。经LC-MS/MS质谱鉴定后,证实其蛋白为NbPTP2（表1）。

图3

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图3SDS-PAGE检测pET32a(+)-NbPTP2重组蛋白的诱导表达及纯化

M：蛋白Marker Protein Marker;1：未诱导的pET32a(+)-PTP2重组菌蛋白Uninduced recombinant bacterial protein of pET32a(+)-PTP2;2：诱导的pET32a(+)-PTP2重组菌蛋白Induced recombinant bacterial protein of pET32a(+)-PTP2;3：超声破碎后的pET32a(+)-PTP2重组菌上清The supernatant of pET32a(+)-PTP2 recombinant bacteria after ultrasonic breaking;4：超声破碎后的pET32a(+)-PTP2重组菌沉淀The precipitation of pET32a(+)-PTP2 recombinant bacteria after ultrasonic breaking;5：纯化后的融合蛋白Purified fusion protein
Fig. 3SDS-PAGE analysis of expression and purification of pET32a(+)-NbPTP2 recombinant protein



Table 1
表1
表1LC-MS/MS质谱分析融合蛋白
Table 1LC-MS/MS analysis of recombinant protein

蛋白 Protein	等电点/相对分子质量 PI/MW (kD)	唯一肽段数 UniquePepCount	肽段覆盖率 CoverPercent	肽信息Peptide information
				起始位点 Start site	结束位点 End site	序列 Sequence
Polar tube protein 2 （EOB15197.1）	9.39/30.9	23	75.09%	1	8	MFLSLNRK
				8	21	KLFTVASLLTVIRT
				20	38	RTMASVAPPQGGIMVPNRA
				37	51	RAQQQMLPAVVDPRK
				51	63	KAVCNIQYINGKK
				63	78	KIIPANNNNPAECQRD
				77	83	RDLIERA
				86	97	RQAQAIETAARA
				96	106	RAVQTIEHIKQ
				96	110	RAVQTIEHIKQEPKC
				117	124	RETQCIKT
				125	132	KLLNELKN
				125	145	KLLNELKNEPEYTVTGEENKV
				131	145	KNEPEYTVTGEENKV
				144	150	KVNVFKK
				144	151	KVNVFKKG
				152	167	KKIMLAANIQHHFIKV
				153	167	KIMLAANIQHHFIKV
				166	180	KVEKPPSEQFQIVKK
				180	198	KAKEAYVFNAIGEVLSTKQ
				201	213	KRPAPQCICPGKS
				212	229	KSTPQTAEGTPLINECKQ
				228	234	KQAECKN

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2.4 家蚕微孢子虫极管蛋白的免疫印迹

利用制备的NbPTP2兔多克隆抗体对家蚕微孢子虫成熟孢子的总蛋白进行Western blot分析,结果发现在约39 kD位置出现NbPTP2特异性条带（图4）。

图4

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图4Western blot 检测家蚕微孢子虫孢子总蛋白中的NbPTP2

M：EasySee Western Marker;1：孢子总蛋白 Spore total protein
Fig. 4Western blot analysis of NbPTP2 expressed in total protein from N. bombycis

2.5 NbPTP2定位分析

间接免疫荧光试验结果显示,与阴性对照相比,NbPTP2抗血清孵育后的极管发出明显的红色荧光,并且红色荧光信号位于整根极管（图5-G）,说明重组融合蛋白NbPTP2-His的抗血清够能特异地识别发芽孢子的极管。在阴性对照中,采用未经免疫的健康新西兰大白兔的血清作为阴性抗血清,在间接免疫荧光试验结果中显示,阴性抗血清不能与极管特异性识别发出红色荧光（图5-C）。弹出极管的孢子,细胞核随孢原质运输至孢壳外,因此无DAPI染色信号（图5-D）。

图5

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图5间接免疫荧光分析NbPTP2在家蚕微孢子虫中的定位

A—D：阴性对照弹出的极管与阴性血清没有荧光反应,且发芽的孢子中孢原质被输送到孢子外,已检测不到细胞核The negative control showed no fluorescence reaction between the discharged polar tube and the negative serum, and the sporogen was transported outside, the fluorescence could not be detected;A、E：DIC观察DIC observation;B、F：DAPI染色观察DAPI staining observation;C、G：Alexa 594标记荧光观察Alexa 594 fluorescent observation;D、H：叠加图Merged figures。白色箭头所示为极管,蓝色荧光为经DAPI染色的细胞核The polar tube was indicated by white arrow, and blue fluorescence was nuclear stained by DAPI
Fig. 5Indirect immunofluorescence assay analysis of NbPTP2 localization in N. bombycis

3 讨论

自从家蚕微孢子虫作为第一种微孢子虫被发现以来,经过160多年不断深入研究,至今在全球已鉴定到200余属、1 400多种微孢子虫^[31,32]。微孢子虫的宿主域广,但所有的微孢子虫都具有结构类似、功能保守的侵染器官——极管^[33]。目前发现至少有5种极管蛋白（即PTP1—PTP5^{[17,18,19,20,21]}）。研究发现不同微孢子虫PTP2间的半胱氨酸位置较为保守^[34],因此推测PTP2能通过形成二硫键,产生分子内或分子间的聚合物,发挥稳定极管的作用^[10]。早期研究基于微孢子虫SSU rRNA进化树分析发现家蚕微孢子虫与西方蜜蜂微孢子虫的亲缘关系最近,但是与哺乳动物微孢子虫亲缘性较远^[35]。本研究中通过构建不同种属微孢子虫极管蛋白2的进化树,得知NbPTP2与蜜蜂微孢子虫的NaPTP2、NcPTP2具有较高的同源性^[14,36],说明PTP2蛋白在进化过程中与其物种的进化具有一致性。

本研究成功诱导出原核表达的pET32a(+)- NbPTP2,经预测NbPTP2的理论分子量约为30.9 kD,在诱导表达后实际大小为52 kD,实际值较预测值偏大,可能是表达载体所带有的2个His标签（1.6 kD）、Trx标签（11.7 kD）、S标签（1.7 kD）及目的蛋白与Trx蛋白融合表达时连接部分的蛋白（5.1 kD）等原因造成。后续LC-MS/MS质谱鉴定结果证实了亲和柱层析纯化后的蛋白为NbPTP2。Western blot检测结果显示家蚕微孢子虫成熟孢子中NbPTP2的分子量为39 kD,比其理论分子量偏大,推测其蛋白进行了翻译后修饰,后续将对其翻译后修饰特征进行进一步研究。

此外,NbPTP2的定位特征与NbPTP1相同,都是位于发芽后家蚕微孢子虫的整根极管^[29],推测NbPTP1与NbPTP2之间存在相互作用。研究发现PTP1和PTP2都富含半胱氨酸^[23],二者之间可以通过二硫键结合形成多聚体从而稳定极管结构,保证孢原质的顺利运输^[18,37]。在兔脑炎微孢子虫的极管交联复合物中发现了EcPTP1、EcPTP2和EcPTP3 3种极管蛋白,在酵母双杂交试验中验证了这3种极管蛋白是具有相互作用的,并推测PTP3在极管发育形成过程中可作为其他极管蛋白组装的支架蛋白^[18,19]。最近研究发现,海伦微孢子虫极管蛋白4（EhPTP4）可以与宿主细胞表面上的转铁蛋白受体1发生相互作用,将孢原质准确地运输并释放到宿主细胞表面的凹陷内,最终通过内吞的方式将孢原质运送到宿主细胞内进行后续侵染、增殖过程^[26]。极管蛋白通过与宿主靶蛋白间的相互作用来提高微孢子虫的侵染率,而对于PTP2与宿主之间相互作用关系的研究尚未报道。

本研究发现,家蚕微孢子虫NbPTP2与感染昆虫微孢子虫PTP2具有一定的保守性,可为今后微孢子虫监测提供可靠的检测靶标。同时,定位特征分析发现NbPTP2能定位于家蚕微孢子虫的整根极管上,推测其在稳定极管结构中发挥重要作用。在后续的研究中也可通过RNAi等试验手段,探索PTP2对极管结构的影响。

4 结论

从家蚕微孢子虫基因组中克隆到全长为834 bp的 NbPTP2,进化树分析发现NbPTP2与蜜蜂微孢子虫的极管蛋白2（NaPTP2和NcPTP2）亲缘关系最近。NbPTP2在家蚕微孢子虫中有表达,分子量为39 kD。定位特征分析结果发现NbPTP2存在于家蚕微孢子虫整根极管上。研究结果可为极管的结构解析与极管蛋白功能的研究提供依据。

（责任编辑 岳梅）

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