辛晓萍¹, 王家迎¹, 张爱玲², 钟玉宜¹, 何颖婷¹, 陈赞谋¹, 张哲¹, 张豪¹, 李加琪¹, 袁晓龙^,11 广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室/国家生猪种业工程技术研究中心/华南农业大学动物科学学院,广州 510642
2 广东高校应用生态工程技术开发中心/广东第二师范学院生物与食品工程学院,广州 510310

CEBPα and p53 Regulate Kiss1 Gene Expression in Porcine Ovary Granulosa Cells

XIN XiaoPing¹, WANG JiaYing¹, ZHANG AiLing², ZHONG YuYi¹, HE YingTing¹, CHEN ZanMou¹, ZHANG Zhe¹, ZHANG Hao¹, LI JiaQi¹, YUAN XiaoLong^,1 1 Guangdong Provincial Key Lab of Agro-animal Genomics and Molecular Breeding/National Engineering Research Center for Breeding Swine Industry/College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642
2 Development Center of Applied Ecology and Ecological Engineering in Universities/Biology and Food Engineering Institute, Guangdong University of Education, Guangzhou 510310

通讯作者: 袁晓龙,E-mail：yxl@scau.edu.cn

收稿日期:2018-04-18接受日期:2019-03-18网络出版日期:2019-05-01

基金资助:

科技部科技基础工作专项.2014FY120800 国家现代农业产业技术体系项目.CARS-35 广东扬帆计划.2014YT02H042 广东省科技计划项目.2017A020208043 华南农业大学青年科技人才专项基金.SCAU201801

Received:2018-04-18Accepted:2019-03-18Online:2019-05-01
作者简介 About authors
辛晓萍,Tel：13602262891;E-mail： xiaopingxin1991@163.com。












摘要
【目的】预测母猪Kiss1（GenBank Gene ID: 100145896）上游区域潜在的转录因子结合位点,并验证部分转录因子在猪卵巢颗粒细胞中对Kiss1基因的调控作用,为研究Kiss1基因在母猪卵巢颗粒细胞中的分子调控机制提供理论基础。【方法】参考NCBI数据库中Kiss1基因上游区域的序列,通过生物信息学网站预测的Kiss1基因上游区域潜在转录因子结合的位点,结合文献阅读与资料查询,在转录因子CEBPα和p53与Kiss1基因上游区域潜在结合位点附近设计引物,利用染色质免疫共沉淀（ChIP）技术,验证转录因子CEBPα和p53与Kiss1基因上游区域的结合情况;参照NCBI数据库相关转录因子CEBPα和p53的mRNA序列,使用软件Primer Premier 5设计引物,PCR分别扩增转录因子CEBPα（带有Kpn I和Xho I限制性内切酶的酶切位点）和p53（带有Kpn I和Hind III限制性内切酶的酶切位点）的CDS区序列,并进行测序鉴定,连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,构建含有潜在转录因子CEBPα和p53 CDS区序列的真核表达载体,并获得无内毒素质粒,分别命名为pcDNA3.1-CEBPα和pcDNA3.1-p53;化学合成目标转录因子CEBPα和p53的干扰siRNA片段。屠宰场采集猪的卵巢,快速分离并培养原代猪的卵巢颗粒细胞,阳离子脂质体转染法分别将转录因子CEBPα和p53真核表达载体(pcDNA3.1-CEBPα和pcDNA3.1-p53)或siRNA片段(CEBPα-siRNA和p53-siRNA)转染进母猪卵巢颗粒细胞,使用实时荧光定量PCR和Western Blot技术分别验证预测的转录因子CEBPα和p53对Kiss1基因mRNA水平和蛋白水平的影响。【结果】生物信息学预测结果表明,Kiss1基因上游区域（-850—+221）存在p53（肿瘤抑制蛋白,tumor protein p53,p53）、CCAAT增强子结合蛋白（CCAAT/enhancer binding protein, CEBP）、信号传导及转录活化家族Stat4（signal transducer and activator of transcription 4, Stat4）等转录因子的潜在结合位点,其中转录因子p53（GenBank Gene ID：397276,NM_213824.3）可能结合在Kiss1基因上游区域-533—-523 bp处,转录因子CEBPα（GenBank Gene ID：397307,XM_003127015.4）可能结合在Kiss1基因上游区域-744—-733 bp处;ChIP结果表明,转录因子p53和CEBPα可以特异性的结合在Kiss1基因上游区域-533—-523 bp和-744—-733 bp处;在母猪卵巢颗粒细胞中超表达转录因子p53或CEBPα后,Kiss1基因的mRNA的表达水平显著下降（P<0.05）,蛋白水平显著下降（P<0.05）;在母猪卵巢颗粒细胞中,干扰转录因子p53或CEBPα后,Kiss1基因的mRNA的表达水平显著升高（P<0.05）,蛋白水平显著升高（P<0.05）。【结论】在猪卵巢颗粒细胞里,转录因子p53和CEBPα能结合到Kiss1基因的上游区域降低其启动子转录活性,进而降低其mRNA和蛋白表达水平。
关键词： 猪;卵巢颗粒细胞;Kiss1基因;CEBPα;p53

Abstract
【Objective】The objectives of this study were to predict the potential transcription factors in the upstream region of Kiss1, and then to verify the regulatory role of these transcription factors on the expression of Kiss1 in the ovarian granulosa cells of pigs. This study could provide the basic data for the molecular mechanism of Kiss1 in granulosa cells of pigs. 【Method】 By using the bioinformatic software, we predicted the potential binding site of transcription factors in the upstream region of Kiss1 in NCBI database. In addition, we reviewed a lot of relevant papers and references, and then CEBPα and p53 were selected as potential binding transcriptional factors in the upstream region of Kiss1 gene. The primers were designed near the potential binding sites in the upstream region of Kiss1 genes, and verified the binding of transcriptional factors CEBPα and p53 to the upstream region of Kiss1 gene by ChIP. According to the mRNA sequences of CEBPα and p53 in NCBI database, Primer Premier 5 software was used to design primers, and CDS regions of CEBPα (containing KpnI and XhoI sites) and p53 (containing KpnI and Hind III sites) were amplified by PCR and identified by sequencing. Then the CDS regions were connected to the eukaryotic expression vector pcDNA3.1, and the constructed plasmids were extracted with endotoxin-freely, named pcDNA3.1-CEBPα and pcDNA3.1-p53. The interfering siRNA fragments of CEBPα and p53 were synthesized through the chemical method. Pig ovaries were collected from the slaughterhouse, and the ovarian granulosa cells were isolated and cultured. The eukaryotic expression vector or siRNA fragment was transfected into ovarian granulosa cells by cationic liposome, and the effects of p53 and CEBPα on the expression of Kiss1 were verified by the real-time fluorescence quantitative PCR and Western Blotting, respectively. 【Result】 The bioinformatic prediction indicated that there were putative binding sites of p53 (tumor protein p53, p53), CEBP (CCAAT/enhancer binding protein, CEBP), Stat4 (signal transducer and activator of transcription 4, Stat4) and other potential of transcription factor binding sites in the upstream (-850 -+221) of Kiss1. And the putative binding site of CEBPα (GenBank Gene ID: 397307, XM_003127015.4) were found in -744—-733 bp region and the putative binding site of p53 (GenBank Gene ID: 397276, NM_213824.3) were found in -533—-523 bp region. The results of ChIP showed that p53 and CEBPα were bounded at -533—-523 and -744—-733 of Kiss1, respectively. After overexpression of p53 or CEBPα, both mRNA and protein expression level of Kiss1 significantly decreased (P<0.05). Furthermore, both mRNA and the expression level of Kiss1 increased significantly (P<0.05) by interfering p53 or CEBPα. 【Conclusion】 In pigs, p53 and CEBPα could bind at the upstream region of Kiss1 to inhibit its expression in ovarian granulosa cells.
Keywords：pig;ovarian granulosa cells;Kiss1;CEBPα;p53


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本文引用格式
辛晓萍, 王家迎, 张爱玲, 钟玉宜, 何颖婷, 陈赞谋, 张哲, 张豪, 李加琪, 袁晓龙. 转录因子CEBPα和p53在猪卵巢颗粒细胞中 对Kiss1基因表达的调控[J]. 中国农业科学, 2019, 52(9): 1624-1634 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.09.013
XIN XiaoPing, WANG JiaYing, ZHANG AiLing, ZHONG YuYi, HE YingTing, CHEN ZanMou, ZHANG Zhe, ZHANG Hao, LI JiaQi, YUAN XiaoLong. CEBPα and p53 Regulate Kiss1 Gene Expression in Porcine Ovary Granulosa Cells[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2019, 52(9): 1624-1634 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.09.013

0 引言

【研究意义】Kiss1基因位于人类1号染色体1q32—41区^[1],最早是在1996年由LEE等发现并命名^[2]。目前,关于Kiss1基因的研究主要集中在哺乳动物中枢和神经内分泌系统的调节上^[3]。有研究表明,Kiss1基因可以促进卵巢卵泡的发育和排卵^[4],在卵泡生长发育的过程中扮演着重要角色^[5],例如,在成年发情期的大鼠中,抑制kisspeptin的表达导致卵巢卵泡的发育异常^[6,7]。除此之外,外源性的kisspeptin可以影响小鼠卵巢卵泡的正常发育与排卵^[6,7]。猪的Kiss1基因位于9号染色体上^[8],包含2个外显子,蛋白质编码区长度为417 bp（含终止子）,编码138个氨基酸^[9],编码的多肽类激素是kisspeptin,经剪切后生成含有54个氨基酸的kisspeptin-54多肽,kisspeptin-54在体内可被分解为kisspeptin-10,kisspeptin-13,kisspeptin-14,它们可以特异性结合在G蛋白偶联受体54（G Protein-Coupled Receptors 54,GPR54）上^[10]。本研究以猪卵巢颗粒细胞为模型,通过构建p53和CEBPα的超表达载体和小干扰RNA,在mRNA和蛋白水平探索p53、CEBPα与Kiss1之间的表达调控关系,为探索Kiss1基因在卵巢颗粒细胞中的功能提供一定的理论基础。【前人研究进展】2008年,臧猛等克隆出了猪Kiss1基因全长,发现Kiss1基因在下丘脑、卵巢、垂体、心、肝等组织中都有不同水平的表达^[9]。在小梅山猪卵巢组织中,刘萍等人发现Kiss1基因主要分布于各级卵泡颗粒细胞和卵泡膜细胞上^[11],同时,在人类、狨猴和大鼠的卵巢和颗粒细胞中都有检测到kisspeptin的表达。研究发现,Kiss1基因突变可以导致人类、大鼠和小鼠的卵泡数量减少,阻碍卵巢卵泡的生长发育^[12,13,14]。这些结果表明,Kiss1基因影响着卵泡的生长发育。但是,目前Kiss1基因在猪卵泡中的表达调控机制仍不清楚。【本研究切入点】本课题组前期研究发现,Kiss1的上游区域存在p53和CEBPα的潜在结合位点,但是在猪卵巢颗粒细胞中,有关Kiss1、p53和CEBPα之间的表达调控关系尚不清楚。【拟解决的关键问题】研究转录因子p53和CEBPα在猪卵巢颗粒细胞中对Kiss1基因之间的表达调控作用。

1 材料与方法

本研究所有试验工作于2016年6月至2017年6月在广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室完成。

1.1 试验材料

动物组织与细胞：用于基因克隆的DNA样品来源于中山白石猪场的长大二元杂母猪卵巢组织;猪卵巢颗粒细胞是取自广州嘉禾望岗屠宰场母猪卵巢组织的原代细胞。

主要试剂：DNA提取试剂盒购自OMEGA公司;总RNA提取试剂Trizol、PrimeScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit、DL2000、DL500均购自TaKaRa公司;Taq酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司;Lipofectamine? 3000、Opti-MEM? 购自Invitrogen公司;凝胶回收试剂盒、普通质粒小提试剂盒、无内毒素质粒小提试剂盒购自广州欣研（美技）生物科技有限公司;胰蛋白酶、DMEM基础培养基、PBS缓冲液、胎牛血清、青链霉素（双抗）购自Hyclone公司;其他均为常规化学试剂。

1.2 母猪Kiss1基因上游区域潜在转录因子的预测

根据NCBI公布Kiss1基因的序列信息,参考基因转录起始上游850 bp到下游221 bp序列,通过以下4个在线软件预测其潜在转录因子结合位点,并取交集作为预测结果：

TFBIND：http://tfbind.hgc.jp/

Biobase：http://www.gene-regulation.com/pub/ programs/alibaba2/index.html

Jaspar：http://jaspar.genereg.net/

Research：http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/ promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3

1.3 猪p53和CEBPα真核表达载体的构建

根据NCBI数据库转录因子p53和CEBPα的基因序列信息,以猪卵巢颗粒细胞mRNA反转录的cDNA为模板,分别以CDS-p53和CDS-CEBPα引物（表1）克隆其CDS区序列,长度分别为1 161 bp和1 227 bp,测序验证后连接到真核表达载体pcDNA3.1（+）上,分别命名为pcDNA3.1-p53和pcDNA3.1-CEBPα,用于转染颗粒细胞,酶切鉴定结果如图1。抽提无内毒素质粒,-20℃保存,用于下一步试验。PCR程序：94℃预变性5 min;94℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸 2.5 min,35个循环;72℃后延伸 10 min。

Table 1
表1
表1引物序列
Table 1Primer sequences

名称 Name	序列 Sequence	片段长度 Size (bp)
CDS-p53	F: GGGGTACCATGGAGGAGTCGCAGTCCGA	1161
	R: CCAAGCTTTCAGTCTGAGTCAGGTCCTT
CDS-CEBPα	F：GGGGTACCAGACCAAGACTTGCCCTCCAC	1227
	R：CCCTCGAGTCTTCGGGTTTTGGTATCCTCA
qRT-Kiss1	F: AGGTACCTGTGGATCCTGTC	192
	R: TTCTGCCATTATCCTATGTCTAC
qRT-p53	F: CGATGGCCAGGGATCTCTTC	151
	R: TCGGCCAAGTTTAAGAGCGT
qRT-CEBPα	F: CTGAGGTCTGCCAGAAGC	150
	R: AACAGAAGAAGGAAGGGAGT
qRT-GAPDH	F: TCCCGCCAACATCAAAT	163
	R: CACGCCCATCACAAACAT
ChIP-kiss1-p53	F：CTCAGAGCCCATGGAGAATAG	135
	R：TGCTTGCTCTCATAACCCTTAAC
ChIP-kiss1-CEBPα	F：CACTGTGCAAGTGGTCTCGG	131
	R：CCCGTTAGAATGTGCCTTCC
ChIP-GAPDH	F：GATGTCCTGAGCCCCTACAG	102
	R：GGTAGGTGATGGGGACTGAG
p53-siRNA	GGAACTTGTTCAAGCAGCT
CEBPα-siRNA	TCGACATCAGCGCCTACAT

5′-3′, Underline type: protective bases; Italic type: KpnI (GGTACC), Hind III (AAGCTT), XhoI (CTCGAG)
5′-3′,下划线为保护碱基,阴影部分为酶切位点, p53上游酶切位点均为KpnI,下游酶切位点为Hind III,CEBPα上游酶切位点为KpnI,下游酶切位点为XhoI

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图1

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图1p53和CEBPα真核表达载体的酶切鉴定

A. pcDNA3.1-p53真核表达载体的酶切鉴定;B. pcDNA3.1-CEBPα真核表达载体的酶切鉴定
Fig. 1Identified the eukaryotic expression vector of p53 and CEBPα

A. The enzyme digestion of eukaryotic expression vector pcDNA3.1-p53; B. The enzyme digestion of eukaryotic expression vector digestion pcDNA3.1- CEBPα

1.4 猪卵巢颗粒细胞的分离与培养

参考文献[15]的方法分离与培养猪卵巢颗粒,主要步骤为：将屠宰场采集的母猪卵巢组织放入37℃的加入双抗的PBS中,用注射器快速吸取卵巢颗粒细胞;用预热的PBS重悬细胞,洗涤两次,转移到75 cm²的细胞培养瓶,放入CO₂培养箱中培养;48 h之后,换液,继续培养,待细胞长至90%以上时,用胰酶消化,转移至24孔板、12孔板或6孔板,培养待用。

1.5 转录因子p53和CEBPα对Kiss1基因转录表达的影响

培养猪的卵巢颗粒细胞,24孔板分别转染50、100、200和500 ng的pcDNA3.1空载和pcDNA3.1- p53,通过qRT-PCR确定p53的超表达效果。24孔板分别转染200 ng的pcDNA3.1-p53和pcDNA3.1至猪的卵巢颗粒细胞,qRT-PCR检测超表达转录因子p53后Kiss1基因的mRNA表达水平变化。6孔板分别转染200 ng的pcDNA3.1-p53和pcDNA3.1至猪的卵巢颗粒细胞,Western Blot检测转录因子p53对Kiss1基因蛋白表达水平的影响。

根据GenBank上猪p53已知序列,按siRNA序列设计原则,结合Ambion公司提供的网上在线设计工具,设计p53的siRNA引物,将siRNA序列进行BLAST比对,以确定和其它基因没有同源性。该siRNA由广州锐博公司合成,引物序列见表1中p53-siRNA引物。培养猪的卵巢颗粒细胞,24孔板分别转染50 nmol·L^-1的Scrambled和p53-siRNA,qRT-PCR检测转录因子p53的干扰效果。24孔板分别转染50 nmol·L^-1的Scrambled和50 nmol·L^-1的p53-siRNA至猪的卵巢颗粒细胞,qRT-PCR检测干扰p53后Kiss1基因的mRNA水平变化。6孔板分别转染50 nmol·L^-1的Scrambled和50 nmol·L^-1的p53-siRNA至猪的卵巢颗粒细胞,Western Blot检测干扰转录因子p53后对Kiss1基因蛋白表达水平的影响。

转录因子CEBPα的操作同转录因子p53。

1.6 ChIP检测p53和CEBPα在Kiss1基因上游区域的结合情况

使用转录因子p53和CEBPα的特异性抗体,通过染色质免疫共沉淀方式富集DNA;在潜在转录因子结合位点附近设计引物,产物范围为100—160 bp,引物序列见表1（ChIP-kiss1-p53和ChIP-kiss1-CEBPα）以富集的DNA为模板进行扩增;具体操作为：在细胞培养瓶里加入37%甲醛使甲醛终浓度为1%,加10×甘氨酸中和未反应的甲醛,用预冷的PBS洗涤两遍,经超声裂解,染色体免疫沉淀,反向交联和DNA纯化,定性PCR,PCR反应条件为：95℃ 3 s,然后95℃ 10 s,60℃ 30 s,72℃,1 min,共40个循环,72℃ 5 min。

1.7 瞬时转染

当细胞培养板内细胞密度为80%—90%时进行换液,换无双抗的培养基,随后进行瞬时转染,具体操作按照Invitrogen公司提供的Lipofectamine? 3000 Reagents说明书进行,转染6—8 h时更换有双抗的培养基,转染48 h后进行下一步试验。

1.8 qRT-PCR和Western Blot检测p53和CEBPα对Kiss1表达水平的影响

参照Invitrogen TRIzol操作说明书,提取母猪卵巢颗粒细胞的总RNA;总RNA的反转录和PCR参照TaKaRa公司的试剂盒说明书进行操作。根据每个基因的NCBI的GenBank登录号,设计定量PCR引物,引物序列如表1（qRT-p53和qRT-CEBPα）。RT-PCR的反应条件：94℃预变性5 min;94℃变性30 s;57℃退火30 s;72℃延伸15 s;经过45个循环后72℃延伸10 min。

具体操作参考文献[16],取培养好的母猪卵巢颗粒细胞,细胞按比例加入裂解液,用枪吹打数下,研磨器研磨使裂解液和细胞充分接触,充分裂解后,4℃高速离心机以12 000×g离心30 min,取上清,提取总蛋白后,立即测定蛋白浓度。取已定量蛋白,按1﹕4的体积比加入5×protein loading buffer,沸水煮5 min,12 000×g离心3min,待用。上样（考马斯亮蓝G-250法总蛋白定量,上样量分别为80 μg总蛋白/个样品）、SDS-PAGE胶电泳、蛋白转膜、室温封闭1.5 h,抗体孵育,ECL显色,样品膜放置暗箱中曝光定影,基因的灰度值与GAPDH内参的灰度值比值代表基因蛋白的相对表达水平。

1.9 数据的统计分析

DNASTAR分析基因序列;primer5.0 设计PCR引物;每个处理至少3个生物学重复,所有数据均用平均值±标准差表示,并经双尾 T-test 检验差异是否具有统计学意义。**代表P<0.01,*代表P<0.05。

2 结果

2.1 猪Kiss1基因上游区域生物信息学预测以及与转录因子结合的鉴定

通过在线生物学软件分析猪Kiss1基因的-850—+221 区域序列,发现该区域存在p53（肿瘤抑制蛋白,tumor protein p53,p53）、CCAAT增强子结合蛋白（CCAAT/enhancer binding protein, CEBP）、信号传导及转录活化家族Stat4（signal transducer and activator of transcription 4, Stat4）等转录因子的潜在结合位点,其中,在-744—-733处存在CEBPα因子潜在结合位点,在-533—-523处存在的p53潜在结合位点（图2-A）。

图2

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图2猪Kiss1基因上游区域区结合潜在转录因子生物信息学预测以及转录因子结合猪Kiss1基因上游区域的ChIP鉴定

M：DNA分子量标准（DL5 000 Marker）,从上到下依次为：5000,3000,2000,1500,1000,750,500,250和100 bp. IgG：阴性对照;Input and H3：阳性对照。A：猪Kiss1基因上游区域区结合潜在转录因子生物信息学预测结果;B：转录因子p53结合猪Kiss1基因上游区域的ChIP鉴定;C：转录因子CEBPα结合猪Kiss1基因上游区域的ChIP鉴定。其中,IgG：阴性对照;Input和H3：阳性对照
Fig. 2Bioinformatics prediction for the potential binding site of transcription factors in the upstream region of porcine Kiss1, and ChIP results of transcription factors binding to the upstream region of porcine Kiss1 gene

M：DL5 000 DNA marker,from up to bottom：5000, 3000, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250, and 100 bp. IgG: Negative control; Input and H3: Positive control. A: The analysis of the binding sites for the transcription factor of the upstream region of porcine Kiss1 gene. B: The ChIP results for the binding of p53 with the upstream region of porcine Kiss1 gene. C: The ChIP results for the binding of CEBPα with the upstream region of porcine Kiss1 gene


p53的潜在结合序列为AGGCACATTC,CEBPα的结合序列为AATAAGACAAT。使用转录因子p53和CEBPα的特异性抗体,免疫共沉淀方式富集DNA;在潜在转录因子结合位点附近设计引物,产物范围为100—160 bp,以富集的DNA为模板进行扩增,其结果见图2-B。引物ChIP-p53和ChIP-CEBPα扩增到了预期的DNA片段（图2-B中p53和图2-C中CEBPα泳道）;阴性对照（IgG）则没有扩增到相应的DNA片段（图2-B和图2-C中IgG泳道）;阳性对照则获得了预期大小的DNA片段（图2-B和图2-C中的 Input和H3）。结果表明转录因子p53和CEBPα可通过相应的DNA作用元件与猪Kiss1基因上游区域结合,分别特异性的结合在Kiss1基因-533—-523和-744—-733上。

2.2 转录因子p53对Kiss1基因表达的影响

分别转染50、100、200和500 ng的pcDNA3.1- p53,发现随着转染质粒浓度的增加,p53的mRNA水平显著升高（P&#X0003C;0.01）（图3-A）,说明p53的超表达载体具有转录活性,本研究选择200 ng的浓度用于后续实验。与对照组相比,超表达p53能显著降低Kiss1的mRNA水平（P&#X0003C;0.05）（图3-B）和蛋白水平（P&#X0003C;0.05）（图3-C,D）。这些结果说明,超表达p53能降低Kiss1的mRNA和蛋白表达水平。

图3

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图3超表达p53对Kiss1基因表达的影响

A：超表达转录因子p53后p53的mRNA表达水平;B：超表达转录因子p53对Kiss1基因mRNA表达水平的影响;C、D：超表达转录因子p53对Kiss1基因蛋白表达水平的影响
Fig. 3The effects of over-expressed p53 on the expression of Kiss1

A: Over-expression of p53 on the mRNA level of p53; B: Over-expression of p53 on the mRNA level of Kiss1; C,D: Over-expression of p53 on the protein level of Kiss1


按照使用说明,瞬时转染50 nM的p53-siRNA进颗粒细胞。通过qRT-PCR检测发现,转染p53-siRNA后,p53的mRNA水平显著低于Scrambled组（P&#X0003C;0.05）（图4-A）,说明p53-siRNA能有效的干扰转录因子p53的表达。与Scrambled组相比,p53-siRNA能显著升高Kiss1的mRNA水平（P&#X0003C;0.01）（图4-B）和蛋白水平（P&#X0003C;0.01）（图4-C,D）,这些结果说明干扰转录因子p53的表达能上调Kiss1的mRNA和蛋白表达水平。

图4

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图4干扰p53的表达后对Kiss1基因表达的影响

A：干扰p53的表达后p53的mRNA表达水平;B：干扰p53的表达后对Kiss1基因mRNA表达水平的影响;C、D：干扰p53表达后对Kiss1蛋白表达水平的影响
Fig. 4The effects of interfering p53 on the expression of Kiss1

A: siRNAs interference of p53 on the mRNA level of p53; B: siRNAs interference of p53 on the mRNA level of Kiss1; C, D: siRNAs interference of p53 on the protein level of Kiss1

2.3 转录因子CEBPα对猪Kiss1基因表达的影响

分别转染50、100、200和500 ng的pcDNA3.1- CEBPα,发现随着转染质粒浓度的增加,CEBPα的mRNA水平显著升高（P&#X0003C;0.01）（图5-A）,说明CEBPα的超表达载体具有转录活性,本研究选择200 ng的浓度用于后续试验。与对照组相比,超表达CEBPα能显著降低Kiss1的mRNA水平（P&#X0003C;0.05）（图5-B）和蛋白水平（P&#X0003C;0.01）（图5-C,D）,这些结果说明,超表达CEBPα能降低Kiss1的mRNA和蛋白表达水平。

图5

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图5超表达转录因子CEBPα对猪Kiss1基因表达的影响

A：超表达转录因子CEBPα后CEBPα的mRNA表达水平;B：超表达转录因子CEBPα对Kiss1基因mRNA表达水平的影响;C、D：超表达转录因子CEBPα对Kiss1基因蛋白表达水平的影响
Fig. 5The effects of over-expressed CEBPα on the expression of Kiss1

A: Over-expression of CEBPα on the mRNA level of CEBPα; B: Over-expression of CEBPα on the mRNA level of Kiss1; C,D: Over-expression of CEBPα on the protein level of Kiss1


按照使用说明,瞬时转染50 nmol·L^-1的CEBPα-siRNA进颗粒细胞。通过qRT-PCR检测发现,转染CEBPα-siRNA后,CEBPα基因的mRNA水平显著低于Scrambled组（P&#X0003C;0.05）（图6-A）,说明CEBPα-siRNA能有效的干扰转录因子CEBPα的表达。与Scrambled组相比,CEBPα-siRNA能显著升高Kiss1的mRNA水平（P&#X0003C;0.01）（图6-B）和蛋白水平（P&#X0003C;0.05）（图6-C,D）,这些结果说明干扰CEBPα的表达能上调Kiss1的mRNA和蛋白表达水平。

图6

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图6干扰转录因子CEBPα对Kiss1基因的影响

A：干扰转录因子CEBPα后CEBPα的mRNA表达水平;B：干扰转录因子CEBPα对Kiss1基因mRNA表达水平的影响;C、D：干扰转录因子CEBPα对Kiss1基因蛋白表达水平的影响
Fig. 6The effects of interfering p53 on the expression of Kiss1

A: siRNAs interference of CEBPα on the mRNA level of CEBPα; B: siRNAs interference of CEBPα on the mRNA level of Kiss1; C, D: siRNAs interference of CEBPα on the protein level Kiss1

3 讨论

Kiss1基因的突变将导致大鼠^[12]和小鼠^[17]的卵巢功能衰退,引起卵泡发育异常,阻碍卵泡成熟。同时,Kiss1可以影响小鼠卵巢黄体组织的形成^{[7, 18]}。这些研究结果说明,在人和哺乳动物卵巢卵泡成熟的过程中,Kiss1基因可以促进卵巢卵泡的发育和排卵,但是目前关于Kiss1基因在猪卵泡中的表达机制尚不清楚。本研究主要以长大二元杂母猪的卵巢颗粒细胞为模型,扩增猪的Kiss1基因上游区域,通过转录因子预测网站预测其潜在结合的转录因子p53和CEBPα,通过ChIP鉴定p53和CEBPα结合到Kiss1基因上游区域相应的位置（图2）,而且超表达转录因子p53和CEBPα后,Kiss1基因的mRNA和蛋白表达水平均显著下降（图3和图5）,干扰转录因子p53和CEBPα后,Kiss1基因的mRNA和蛋白表达水平均显著上升（图4和图6）,这些结果说明,转录因子p53和CEBPα结合在Kiss1基因的上游区域,抑制Kiss1基因的转录表达。

p53是一种抑癌基因,具有很多生物学作用,可以直接或间接通过调控靶基因,进而促进或抑制细胞生长、细胞增殖、血管生成和炎症反应等过程,此外,p53还具有活化DNA修复蛋白的作用^[19,20]。p53可以调控其他靶基因发挥作用,例如p53可以下调PRR11- SKA2从而抑制肿瘤的生成^[21],上调miR-34c家族基因抑制癌症的发生等^[22]。研究表明,p53蛋白在人卵巢上皮癌组织中过表达^[23],抑制p53基因的表达后,卵巢癌细胞的增殖数目显著减少,凋亡数目显著增加^[24],此外,p53可以促进人颗粒细胞的凋亡^[25],抑制猪卵巢颗粒细胞的增殖,激发凋亡标记物MAP3K5基因的表达,从而影响孕酮、雌激素等性激素的分泌^[26]。CCAAT/增强子结合蛋白（CCAAT/enhancer-binding proteins,CEBPs）是一类可以与DNA增强子结合的转录因子家族,其由CEBPα、CEBPβ、CEBPγ、CEBPδ、CEBPε和CEBPζ六个成员组成^[27],广泛参与到细胞增殖分化、细胞凋亡、胚胎发育、机体能量代谢和免疫反应等。

研究表明,CEBPα的表达对小鼠的排卵、黄体生成和卵巢卵泡关键基因的表达起着至关重要的调节作用^[28]。此外,CEBPα影响大鼠卵巢卵泡的发育和排卵^[29];上调CEBPα的表达能抑制合成FSH或者LH相关基因的表达,从而调控小鼠排卵及黄体形成^[30]。这些研究说明,转录因子p53和CEBPα参与调控哺乳动物卵泡的成熟、颗粒细胞功能和黄体形成等繁殖活动,也佐证了Kiss1基因可能是影响母猪卵巢发育及成熟的重要候选基因。

4 结论

在猪卵巢颗粒细胞中,转录因子p53和CEBPα能结合到Kiss1基因-533—-523和-744—-733区域处,抑制其mRNA和蛋白的表达水平。此研究为Kiss1基因在猪卵巢颗粒细胞中表达调控在分子水平上提供理论依据。

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