王芳权^1,2, 范方军^1,2, 夏士健¹, 宗寿余¹, 郑天清³, 王军^1,2, 李文奇^1,2, 许扬^1,2, 陈智慧^1,2, 蒋彦婕^1,2, 陶亚军^1,2, 仲维功^1,2, 杨杰^,1,2,*1. 江苏省农业科学院粮食作物研究所/国家水稻改良中心南京分中心/江苏省优质水稻工程技术研究中心, 江苏南京 210014
2. 扬州大学江苏省粮食作物现代产业技术协同创新中心, 江苏扬州 225009
3. 中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081

Interactive effects of the photoperiod-/thermo-sensitive genic male sterile genes tms5 and pms3 in rice

WANG Fang-Quan^1,2, FAN Fang-Jun^1,2, XIA Shi-Jian¹, ZONG Shou-Yu¹, ZHENG Tian-Qing³, WANG Jun^1,2, LI Wen-Qi^1,2, XU Yang^1,2, CHEN Zhi-Hui^1,2, JIANG Yan-Jie^1,2, TAO Ya-Jun^1,2, ZHONG Wei-Gong^1,2, YANG Jie^,1,2,*1. Institute of Food Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Nanjing Branch of Chinese National Center for Rice Improvement/Jiangsu High Quality Rice R&D Center, Nanjing 210014, Jiangsu, China;
2. Jiangsu Co-innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China
3. Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

通讯作者: *杨杰, E-mail: yangjie168@aliyun.com, Tel: 025-84390320

收稿日期:2019-07-8接受日期:2019-09-26网络出版日期:2020-03-12

基金资助:

本研究由国家转基因生物新品种培育科技重大专项.2018ZX08001-02B 江苏省自然科学基金面上项目.BK20171326 江苏省现代农业重点研发项目资助.BE2018388 江苏省现代农业重点研发项目资助.BE2017368

Received:2019-07-8Accepted:2019-09-26Online:2020-03-12

Fund supported:

This study was supported by the National Major Project for Developing New GM Crops.2018ZX08001-02B the Jiangsu Province Natural Science Foundation.BK20171326 and the Jiangsu Province Key Research and Development Program (Modern Agriculture).BE2018388 and the Jiangsu Province Key Research and Development Program (Modern Agriculture).BE2017368

作者简介 About authors
E-mail:wfqjaas@163.com,Tel:025-84390320。















摘要
tms5与pms3是水稻的光温敏核不育基因, 其功能位点已经明确, 然而它们在两系不育系中的效应尚不清楚。本研究针对tms5与pms3基因功能位点, 分别设计了功能标记AS-TMS5和CAPS-PMS3。经鉴定发现, 这2个功能标记能准确区分不育、可育性状对应的隐性纯合、杂合和显性纯合3种基因型。利用AS-TMS5和CAPS-PMS3对培矮64S/9311、广占63S/湘恢47和粤光S/宁恢108的F₂群体单株的基因型及育性的关系分析发现, tms5基因是广占63S和粤光S控制光温敏不育性状的主效基因, 而pms3基因在培矮64S和粤光S中并不能独立起作用, 还需要与其他基因共同调控。进一步分析粤光S/宁恢108的F_2:3群体基因型与育性的关系, 发现在粤光S/宁恢108背景下, 携带pms3基因的株系几乎都表现可育, 而携带tms5基因的株系在较高气温条件下表现不育, 但育性转换温度可能较高; 而携带tms5与pms3基因的株系育性转换温度比仅携带tms5基因的株系低, 这为聚合2个基因选育不育性状稳定的光温敏不育系提供了思路和方法。
关键词： tms5; pms3;功能标记;光敏不育;温敏不育

Abstract
The tms5 and pms3 are two photoperiod-/thermo-sensitive genic male sterile genes, and their functional sites are clarified. However, the interactive effects of tms5 and pms3 in two-line sterile lines are still unclear. In this study, the functional markers AS-TMS5 and CAPS-PMS3 were designed, according to the functional sites of tms5 and pms3 respectively. The three genotypes of tms5 and pms3 were accurately distinguished by AS-TMS5 and CAPS-PMS3. The relationship of the phenotype and genotype in the F₂ population of Pei’ai 64S/9311, Guangzhan 63S/Xianghui 47 and Yueguang S/Ninghui 108 were analyzed respectively. The tms5 was the major gene in Guangzhan 63S and Yueguang S, while pms3 was a non-independent gene in Pei’ai 64S and Yueguang S. By the phenotype and genotype analysis of the F_2:3 population of Yueguang S/Ninghui 108, the plants carrying pms3 almost were fertile, while the plants carrying tms5 showed sterility, and had higher transition temperature. Furthermore, the sterility of the plants carrying tms5 and pms3 might have lower transition temperature than those carrying tms5. Pyramiding of tms5 and pms3 provides an efficient scheme to breed photoperiod-/thermo-sensitive genic male sterile lines, which have lower transition temperature and safer production.
Keywords：tms5; pms3;functional marker;photoperiod-sensitive male sterility;thermo-sensitive male sterility


PDF (2299KB)元数据多维度评价相关文章导出EndNote|Ris|Bibtex收藏本文
本文引用格式
王芳权, 范方军, 夏士健, 宗寿余, 郑天清, 王军, 李文奇, 许扬, 陈智慧, 蒋彦婕, 陶亚军, 仲维功, 杨杰. 水稻光温敏核不育基因tms5与pms3的互作效应[J]. 作物学报, 2020, 46(3): 317-329. doi:10.3724/SP.J.1006.2020.92036
WANG Fang-Quan, FAN Fang-Jun, XIA Shi-Jian, ZONG Shou-Yu, ZHENG Tian-Qing, WANG Jun, LI Wen-Qi, XU Yang, CHEN Zhi-Hui, JIANG Yan-Jie, TAO Ya-Jun, ZHONG Wei-Gong, YANG Jie. Interactive effects of the photoperiod-/thermo-sensitive genic male sterile genes tms5 and pms3 in rice[J]. Acta Crops Sinica, 2020, 46(3): 317-329. doi:10.3724/SP.J.1006.2020.92036


1973年石明松在粳稻品种农垦58中发现了一株不育的水稻材料, 后来证明该不育单株是由细胞核不育基因控制的, 其育性受光照时间调控, 在此基础上提出了两系法育种的新途径^[1]。两系法育种灵活地利用了核不育系的育性转换特点, 具有不育性遗传稳定、遗传行为简单、恢复源广等诸多优势, 使得两系不育系成为我国水稻育种及生产中不可或缺的类型, 在全国范围内得到了广泛的应用^[2]。但两系核不育系的育性容易受光温条件波动的影响, 给不育系的繁殖和杂交种的制种造成了很多困难。2009年江苏、四川、安徽等地的持续低温使不育系育性波动, 给制种造成巨大损失^[3]。因此, 针对两系不育系育性稳定性问题, 很多研究者对育性转换条件及不育的分子机制进行了深入研究^[4,5,6,7]。目前, 已经定位了光敏不育基因Pms1^[8,9]、pms2^[10]、pms3 (p/tms12-1)^[11,12]和pms4^[13], 温敏不育基因tms1^[14]、tms2^[15,16]、tms3^[17]、tms4^[18]、tms5^[19,20]、tms6^[21]和tms6(t)^[22], 其中pms3和tms5基因已被克隆。

tms5基因为温敏不育基因, 该基因编码一个核酸内切酶——RNase Z^S1, 该酶能够把Ub_L40的mRNA降解为短片段^[23]。在温敏不育系安农S-1的tms5编码区第71位碱基C突变为A, 形成终止密码子, RNase Z^S1失活。气温高于23.5℃时, Ub_L40基因表达上调, 安农S-1、株1S等品种由于RNase Z^S1功能缺失, 花粉母细胞中Ub_L40大量积累, 花粉母细胞液泡化, 最终导致雄性不育。目前普遍使用的光温敏不育系大多数由安农S-1衍生而来, 携带tms5不育基因^[23,24,25]。pms3基因来源于农垦58S, 转录一个1236 bp的长链非编码RNA——LDMAR, 在第789位点上存在一个C到G的变异, 影响LDMAR加工而来的小RNA与靶序列的结合, 导致花粉不育^[26,27]。研究表明, LDMAR的表达还受到DNA甲基化调控。在长日照情况下, LDMAR上游转录本AK111270产生的siRNA介导了LDMAR启动子区域的甲基化, 引起雄性不育^[28]。

在实际应用中, 以tms5和pms3基因为背景的不育系产生的杂交稻占据了两系杂交水稻的几乎所有市场。近年来, 以携带tms5基因的Y58S、C815S配置的Y两优和C两优系列组合迅速增加, 至2012年以tms5基因为主导的杂交稻已经占据两系杂交水稻的95%以上^[24,29]。可见, 对于tms5和pms3基因及它们在两系不育系中的应用研究具有非常重要的意义。本研究利用tms5和pms3基因功能位点开发的分子标记, 分析了光温敏不育系与常规水稻杂交F₂和F_2:3家系单株基因型与育性的关系, 以期为tms5和pms3基因在光温敏不育系选育的应用中提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 供试材料及实验设计

供试水稻材料有常规水稻品种5份, 包括日本晴、9311、南京16号、湘恢47和宁恢108; 主流两系不育系品种或品系19份, 包括农垦58S、安农S-1、株1S、培矮64S、广占63S、粤光S、N111S、C815S、Y58S、509S、武香S、深08S、1206S、1208S、L126S、L128S、丰39S、1892S和L816S。其中, 粤光S由广东省农业科学院李传国研究员以超级97/明七596杂交后代选育而成, 为温度敏感性雄性核不育系水稻种质, 1206S、1208S为粤光S的衍生系。

培矮64S/9311、广占63S/湘恢47和粤光S/宁恢108的F₂群体, 以及粤光S/宁恢108的F_2:3家系, 用于分析tms5或pms3基因型与育性的关系。2015年正季在南京的3个F₂群体播种时间为5月20日。灌浆结实后, 选取抽穗期不迟于9月10日的单株, 调查结实率, 取叶片提取DNA, 用于检测tms5或pms3基因型。

1.2 tms5、pms3基因功能标记设计

已克隆水稻光温敏基因tms5, 且明确其功能位点^[23]。安农S-1携带的水稻温敏不育基因在编码区71位碱基C突变为A, 形成TAG终止密码子。参照日本晴和9311基因组序列, 安农S在编码氨基酸的70位碱基也发生了变异, 由G突变成了T, 因此本研究根据该位点的突变特点, 利用Oligo 7.0软件设计等位基因特异PCR (allele-specific PCR, AS-PCR)标记, 命名为AS-TMS5 (表1)。TMS5纯合基因型(TMS5TMS5, TT)只能被T5n-F/T5-R引物组合有效扩增, tms5纯合基因型(tms5tms5, tt)只能被T5m-F/T5-R引物组合有效扩增, 而TMS5tms5杂合基因型(Tt)能同时被T5n-F/T5-R引物组合和T5m-F/ T5-R引物组合有效扩增。理论扩增产物长度为302 bp。

光温敏不育基因pms3属于长链的非编码RNA调控基因, 在789位点由C到G的变异引起了其功能丧失, 导致雄性不育^[26,27]。该位点由C到G的变异使pms3基因能够被Csp6 I (G/TAC)识别并切割。利用Oligo 7.0跨越该位点设计了基因特异性功能标记CAPS-PMS3 (表1)。CAPS-PMS3标记能将待测水稻材料扩增出410 bp片段, PMS3纯合基因型(PMS3PMS3, PP)水稻材料的扩增产物不能被Csp6 I酶切开, pms3纯合基因型(pms3pms3, pp)水稻材料的扩增产物能被Csp6 I彻底酶切为280 bp和130 bp片段, 而PMS3pms3杂合基因型(Pp)水稻材料的扩增产物被Csp6 I酶切后, 存在410、280和130 bp这3种带型。引物序列见表1。

Table 1
表1
表1TMS5、PMS3功能标记引物
Table 1Primer of function marker for TMS5 and PMS3 genes

分子标记 Molecular marker	引物名称 Primer name	引物序列 Primer sequence (5′-3′)	产物长度 Product length (bp)
AS-TMS5	T5n-F	CCACCGGGTCGGCCGAAGGC	302
	T5m-F	CCACCGGGTCGGCCGAAGTA
	T5-R	AGCTCGAAGAGGCGCTCCAC
CAPS-PMS3	PMS3-F	GCTTTCCCAGGATGCACATA	410
	PMS3-R	GTTTGCTCCATTGGTTAGGC

新窗口打开|下载CSV

1.3 DNA提取、PCR扩增及酶切

用CTAB法提取水稻基因组DNA。以DNA为模板, 以下列体系进行PCR。反应体系包括: 10×PCR缓冲液(含20 mmol L^-1 Mg²⁺) 2 µL, dNTP (含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各2 mmol L^-1) 2 µL, 上、下游引物(各2 µmol L^-1) 2 µL, Taq酶0.5 µL, DNA 2 µL, 用灭菌ddH₂O补足至20 µL。PCR扩增条件为94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 63℃或60℃ 30 s, 72℃ 30 s, 30个循环; 72℃延伸5 min, 结束反应。其中, AS-TMS5标记的退火温度为63℃, CAPS-PMS3标记的退火温度为60℃。CAPS-PMS3标记扩增产物用Csp6 I (NEB)酶切, 酶切反应体系含: 10×buffer B 2 µL, PCR产物10 µL, Csp6 I (10 U µL^-1) 1 µL, 用灭菌ddH₂O补足至20 µL, 37℃反应3 h。PCR产物和酶切产物分别在含有核酸染料(DuRed)的琼脂糖凝胶中电泳分离, 用凝胶成像系统记录实验结果。

1.4 TMS5和PMS3突变位点的测序验证

为了进一步明确TMS5和PMS3基因突变位点信息, 用PCR方法扩增包含突变位点的DNA片段并测序。针对TMS5基因突变位点, 设计跨越该位点的测序引物TMS5-F: 5′-CCATCGTGCTTCGTGCC AAAA-3′和TMS5-R: 5′-TCGAGGGGGACGAGGTT GTG-3′进行PCR扩增, PCR理论产物长度约为475 bp。使用CAPS-PMS3标记进行扩增检测PMS3基因突变位点。PCR产物送Invitrogen公司测序。

1.5 粤光S/宁恢108组合F_2:3家系的获得及育性分析

1.5.1 F_2:3家系的获得 2013年11月利用粤光S/宁恢108的F₂群体种子在光照培养箱发芽长成二叶一心的小苗, 提取DNA。用AS-TMS5和CAPS- PMS3标记对100个粤光S/宁恢108 F₂单株进行检测, 选取TTPP基因型单株3株, TTpp基因型单株5株, ttPP基因型单株3株, ttpp基因型单株4株; 11月30日带到海南三亚荔枝沟南繁基地加代, 2月底抽穗, 套袋自交, 各单株正常结实, 按单株收获F_2:3种子。将2015年春季(4月)海南收获的F_2:3种子, 于2015年正季(5月), 在江苏省农业科学院试验田(南京)分两期播种, 第1期于5月15日播种, 6月10日移栽; 第2期于6月1日播种, 6月25日移栽, 田间管理同常规大田。抽穗扬花期对第1期播种的F_2:3株系(S1~S15)进行花药形态、花粉染色分析, 从每个株系随机选取3个单株。

1.5.2 花药形态观察 用镊子将颖壳小心拨开, 去除外稃, 将花药从内稃中小心拨出, 于体视显微镜(KEYENCE DIGITAL MICROSCOPE VHX-500F)下观察并照相记录。

1.5.3 花粉育性检测 将花药置载玻片上, 用盖玻片压片释放出花药, 然后用1% I₂-KI溶液染色, 在显微镜(OLYMPUS BX51)下观察并用照相机(OLYMPUS DIGITAL CAMERA C5050Z)照相记录。

1.6 气象资料

用气温仪记录试验田8月1日至9月30日的气温, 8月1日至9月10日, 日均温度都高于23.5℃, 但日最低温度从8月9日开始, 只有8月15至20日高于23.5℃ (图1)。日照时间见附图1。

图1

新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT
图12015年8月至9月田间气温走势图

Fig. 1Temperature chart of experimental plot in August and September of 2015

2 结果与分析

2.1 基因的功能标记分析及测序验证

利用AS-TMS5标记分别对24份水稻品种或品系进行检测(图2)。用T5n引物对常规稻日本晴、 9311、湘恢47、宁恢108和不育系农垦58S、培矮64S能扩增出产物, 而用T5m不能扩增出产物, 说明这6个品种均不携带温敏不育基因型tms5; 用T5m对安农S-1、株1S、广占63S、粤光S、N111S、C815S、Y58S、509S、武香S、深08S、1206S、1208S、L126S、L128S、丰39S、1892S和L816S能扩增出302 bp产物, 而用T5n不能扩增出产物, 表明这17个不育系都携带纯合的tms5基因。南京16号为常规籼稻品种, 与日本晴、9311相比, 其TMS5基因的70位碱基由G突变为T (图3), 该材料以AS-TMS5标记扩增的结果与其他常规稻相同, 为TMS5纯合基因型。以上部分结果与已报道的研究结果一致^[24], 表明本研究开发的AS-TMS5标记能经过两次独立PCR准确鉴定可育基因型TT和不育基因型tt。

利用CAPS-PMS3标记引物扩增24份水稻品种或品系的基因组, 然后用限制性内切酶Csp6 I对PCR产物进行酶切(图2)。农垦58S、培矮64S、粤光S、509S、1206S和1208S这6个材料携带pms3基因, 而其他都不携带pms3基因, 也与前人报道一致^[24], 说明本研究的CAPS-PMS3标记能准确鉴定PP与pp基因型。

图2

新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT
图2水稻品种(系)的AS-TMS5和CAPS-PMS3标记检测

1~24分别为: 日本晴、9311、南京16号、湘恢47、宁恢108、农垦58S、安农S-1、株1S、培矮64S、广占63S、粤光S、N111S、C815S、Y58S、509S、武香S、深08S、1206S、1208S、L126S、L128S、丰39S、1892S和L816S。
Fig. 2Detection of rice materials (lines) by AS-TMS5 and CAPS-PMS3 marker

1-24 represent Nipponbare, 9311, Nanjing 16, Xianghui 47, Ninghui 108, Nongken 58S, Annong S-1, Zhu 1S, Pei’ai 64S, Guangzhan 63S, Yueguang S, N111S, C815S, Y58S, 509S, Wuxiang S, Shen 08S, 1206S, 1208S, L126S, L128S, Feng 39S, 1892S, and L816S.


综合两个标记检测的结果, 在24份材料中, 常规稻日本晴、9311、南京16号、湘恢47和宁恢108不携带不育基因; 安农S-1、株1S、广占63S、N111S、C815S、Y58S、武香S、深08S、L126S、L128S、丰39S、1892S和L816S只携带tms5不育基因; 农垦58S和培矮64S只携带pms3基因; 而509S、粤光S及其2个衍生系(1206S和1208S)同时携带2个不育基因。

利用引物TMS5-F/TMS5-R和CAPS-PMS3对部分品种的PCR产物进行测序分析(图3和图4), 进一步验证了这些材料携带的基因型与标记检测结果完全对应。说明本研究设计的2个标记能准确地鉴定TMS5和PMS3这2个基因的等位基因型。

图3

新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT
图3TMS5基因突变位点的测序分析

(a)和(b)的差异位点位于TMS5基因编码区之前, (c)为起始密码子, (d)为功能突变位点。
Fig. 3Sequencing analysis of mutant site in TMS5 gene

The polymorphic sites present in (a) and (b) are before the CDS of TMS5 gene; (c) site represents the start coding site; (d) site is the functional mutant site.

图4

新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT
图4PMS3基因突变位点的测序分析

Fig. 4Sequencing analysis of mutant site in PMS3 gene

2.2 3个F₂群体的育性及基因型分析

经检测, 培矮64S只携带pms3基因(基因型为TTpp), 广占63S只携带tms5基因(基因型为ttPP), 粤光S同时携带tms5和pms3两个基因(基因型为ttpp), 9311、湘恢47和宁恢108都不携带tms5和pms3基因(基因型为TTPP)(图2)。本研究利用培矮64S/9311、广占63S/湘恢47和粤光S/宁恢108的F₂群体, 在南京正季播种, 单苗移栽, 灌浆结实后调查群体的结实率。

用CAPS-PMS3标记对培矮64S/9311的F₂群体中的9个不育单株和53个可育单株检测发现, 不育单株既有pp纯合基因型也有Pp杂合基因型, 而可育单株包含了PP、Pp、pp这3种基因型(附表1)。从以上结果可以看出, 并非所有携带pp基因型的F₂单株都表现雄性不育, 而有些Pp基因型单株也表现雄性不育。推测培矮64S中还有其他基因如Pms1、pms2或目前未发现的基因与pms3互作。

杂交组合“广占63S/湘恢47”的89个F₂单株中, 60个可育, 29个不育, 其分离比例符合3﹕1 (χ²=2.34, χ²_{0.05, 1}=3.84)。用AS-TMS5标记检测发现, 携带tt基因型的28个单株都表现为雄性不育, 而Tt杂合基因型的单株都表现为可育; 除了17号单株外, 携带TT纯合基因型的单株都表现为可育(附表2)。tms5基因与“广占63S/湘恢47”F₂单株的育性几乎共分离, 表明tms5是控制广占63S雄性不育的主效基因。

在南京正季种植, 粤光S表现不育, I₂-KI染色镜检属无花粉型, 宁恢108及其杂交种花粉染色正常。利用AS-TMS5标记和CAPS-PMS3标记检测, 粤光S为ttpp基因型; 宁恢108为TTPP基因型, 它们的杂交种F₁为TtPp杂合基因型, 说明两个标记都可以准确区分3种基因型, 是共显性分子标记。79个F₂单株中, 可育单株57株, 不育单株22株, 育性符合3﹕1的分离比例(χ²=0.06, χ²_{0.05, 1}=3.84)。利用分子标记分析发现, 22个不育单株均携带tms5纯合基因型, 而这些不育单株包含了pp、Pp和PP基因型这3种类型; 57个可育单株是TT或Tt两种基因型, 57个可育单株中也同时携带PMS3基因的pp、Pp和PP这3种基因型(表2和图5)。

Table 2
表2
表2粤光S/宁恢108 F₂群体基因型与育性的关系
Table 2Relationship between genotype and fertility of Yueguang S/Ninghui 108 F₂ population

编号 No.	AS- TMS5	CAPS- PMS3	表型 Phenotype	编号 No.	AS- TMS5	CAPS- PMS3	表型 Phenotype	编号 No.	AS- TMS5	CAPS- PMS3	表型 Phenotype
Yueguang S	+	+	S	26	*	*	F	54	-	*	F
Ninghui 108	-	-	F	27	*	*	F	55	*	*	F
F1	*	*	F	28	*	-	F	56	*	*	F
1	+	*	S	29	*	*	F	57	*	+	F
2	+	*	S	30	-	+	F	58	*	*	F
3	+	*	S	31	*	*	F	59	*	*	F
4	+	*	S	32	*	*	F	60	*	*	F
5	+	+	S	33	*	-	F	61	*	+	F
6	+	*	S	34	-	-	F	62	*	+	F
7	+	*	S	35	*	-	F	63	*	*	F
8	+	-	S	36	*	*	F	64	-	*	F
9	+	*	S	37	*	*	F	65	*	-	F
10	+	*	S	38	*	*	F	66	*	+	F
11	+	*	S	39	-	*	F	67	*	+	F
12	+	+	S	40	*	*	F	68	*	*	F
13	+	+	S	41	*	-	F	69	*	+	F
14	+	-	S	42	*	-	F	70	*	-	F
15	+	*	S	43	*	*	F	71	-	+	F
16	+	+	S	44	*	*	F	72	*	-	F
17	+	-	S	45	-	+	F	73	*	*	F
18	+	+	S	46	*	+	F	74	-	-	F
19	+	*	S	47	*	-	F	75	-	*	F
20	+	*	S	48	-	-	F	76	*	+	F
21	+	*	S	49	*	*	F	77	*	-	F
22	+	*	S	50	-	*	F	78	-	*	F
23	*	-	F	51	*	-	F	79	-	-	F
24	*	-	F	52	*	-	F
25	*	*	F	53	*	*	F

F₁: hybrid of Yueguang S/Ninghui 108; +: homozygous genotype tt or homozygous genotype pp; -: homozygous genotype TT or homozygous genotype PP; *: heterozygous genotype Tt or Pp; F: fertile; S: sterile.
Yueguang S: 粤光S; Ninghui 108: 宁恢108。F₁: 粤光S/宁恢108杂交种; +: tt或pp纯合基因型; -: TT或PP纯合基因型; *: Tt或Pp杂合基因型; F: 可育; S: 不育。

新窗口打开|下载CSV

图5

新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT
图5以AS-TMS5和CAPS-PMS3标记检测粤光S/宁恢108 F₂群体部分单株

P₁: 粤光S; P₂: 宁恢108; F₁: 粤光S/宁恢108杂交种; 1~45: 粤光S/宁恢108 F₂群体部分单株。
Fig. 5Detection based on AS-TMS5 and CAPS-PMS3 markers for part of Yueguang S/Ninghui 108

F₂ population P₁: Yueguang S; P₂: Ninghui 108; F₁: hybrid of Yueguang S/Ninghui 108; 1-45: part of Yueguang S/Ninghui 108 F₂ population.


综合3个F₂群体单株的育性和基因型检测结果发现, pms3基因不与雄性不育性状共分离, 而tms5基因与不育性状共分离。在携带tms5基因的2个F₂群体中, 可育单株与不育单株符合3﹕1的分离比例, 说明tms5基因是控制温敏不育的主效基因。

2.3 粤光S/宁恢108组合F_2:3家系育性与基因型分析

为了探讨pms3基因和tms5基因是否存在互作关系, 进一步研究了粤光S/宁恢108组合F_2:3家系4种基因型的育性情况。分两期播种F_2:3家系, 第2期比第1期抽穗期大概迟约15 d (表3), 第2期花粉母细胞发育时的日平均温和最低温都显著低于第1期(图1)。通过对F_2:3家系(第1期)的花药形态、花粉染色和穗结实情况分析发现, 与父本宁恢108相似, TTPP基因型的3个株系和TTpp的4个株系(S8株系的1个单株除外)都表现可育, 其花药饱满、充满花粉, 花粉粒圆、染色深, 穗结实正常(表3和图6), 表明pms3基因不是两系不育系粤光S的主效基因。而ttPP和ttpp基因型的株系则与母本粤光S相似, 表现不育, 其花药细窄, 几乎无花粉粒, 少量花粉粒畸形且不着色, 穗不结实。

Table 3
表3
表3粤光S/宁恢108组合F_2:3株系育性分析
Table 3Fertility of Yueguang S/Ninghui 108 F_2:3 population

株系 Line	基因型 Genotype	第1期 Phase I					第2期 Phase II
		抽穗期 Heading date (month/day)	总数 Total number	不育株 No. of sterile plants	可育株 No. of fertile plants		抽穗期 Heading date (month/day)	总数 Total number	不育株 No. of sterile plants	可育株 No. of fertile plants
S1	TTPP	8/26	11	0	11		9/3	10	0	10
S2	TTPP	8/27	11	0	11		9/9	10	0	10
S3	TTPP	9/11	11	0	11		9/25	10	0	10
S4	TTpp	8/28	11	0	11		9/3	10	0	10
S5	TTpp	9/5	11	0	11		9/14	11	0	11
S6	TTpp	8/20	11	0	11		9/9	11	0	11
S7	TTpp	9/7	11	0	11		9/19	11	0	11
S8	TTpp	9/7	11	1	10		9/22	11	0	11
S9	ttPP	8/28	11	11	0		9/16	11	6	5
S10	ttPP	8/30	11	11	0		9/17	11	2	9
S11	ttPP	9/1	11	11	0		9/17	10	5	5
S12	ttpp	8/23	11	11	0		9/15	10	9	1
S13	ttpp	8/24	11	11	0		9/10	10	10	0
S14	ttpp	8/30	11	11	0		9/13	11	11	0
S15	ttpp	9/10	10	10	0		9/19	9	9	0

新窗口打开|下载CSV

图6

新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT
图6粤光S/宁恢108组合F_2:3株系育性分析

A: 花药形态和花粉育性分析, 大图标尺为1 mm, 小图标尺为100 μm; B: 小穗结实分析, 标尺为2 cm。
Fig. 6Fertility of F_2:3 population from Yueguang S/Ninghui 108

A: the anther morphology and pollen fertility; white bar, 1 mm; black bar, 100 μm; B: the fertility of panicle; bar, 2 cm.


对F_2:3家系(第2期)的结实情况分析发现, TTPP和TTpp基因型的所有单株(S1~S8)都表现可育; ttPP基因型株系(S9-S11)约59%的单株都可育, 与第1期相比, 可育单株数显著增加, 可能与后期气温下降及光照时间缩短有关。而ttpp基因型株系(S12~S15)中, 除S12中的1个单株外, 所有单株都表现不育, 表明ttpp基因型株系比ttPP基因型株系的育性更不易受后期气温降低及光照时间缩短的影响。

结合两期育性情况的结果可以看出, 在粤光S/宁恢108遗传背景下, tms5基因是调控育性的主效基因, 对植株的育性起决定作用; pms3基因可能是调控育性的微效基因, 能增强tms5基因背景下植株不育性状的稳定性; 推测tms5基因和pms3基因之间可能存在着直接或间接的互作关系。

2.4 粤光S/宁恢108后代ttpp基因型株系的育性表现

明确粤光S/宁恢108的F_2:3株系部分植株不结实后, 对表3中株系S12 (ttpp基因型)的3个单株、株系S13 (ttpp基因型)的2个单株和株系S14 (ttpp基因型)的1个单株去穗留稻桩, 让植株再生, 2次孕穗。由于温度降低, 花粉恢复育性, 套袋自交, 收取种子, 带海南加代繁殖, 后代按单株收种, 每个系各收取5个单株。2016年南京正季种F₅代, 分两期播种, 第1期于5月10日, 第2期于5月23日, 每个株系种35株苗。抽穗时间第1期在8月4日至8月22日之间, 第2期在8月13日至9月2日之间。观察单株结实情况发现, 选育的30个株系的所有单株均表现雄性不育, 表明通过标记选择聚合tms5、pms3基因, 能够选育出育性更稳定的不育系。

3 讨论

两系杂交水稻是我国南方稻区的主要水稻类型, 对国家粮食安全起着重要作用。近年来, 两系杂交稻的推广面积逐年增加^[30]。两系不育系是培育优良两系杂交水稻的关键。然而, 目前两系不育系的选育通常是在田间自然条件下鉴定, 选育过程容易受环境条件的直接影响, 工作量大且周期长, 育种效率低; 利用人工气候房选育能够获得较准确的结果, 但工作量大, 成本很高。tms5和pms3基因的克隆和功能的明确为通过分子标记辅助选择培育两系不育系提供了可能。本研究根据tms5和pms3基因功能突变位点分别设计了等位基因特异PCR标记AS-TMS5和酶切扩增多态性序列标记CAPS-PMS3。与前人报道类似^[31,32,33], 本研究开发的2个标记能够准确且高效地区分两个基因的可育和不育基因型, 可用于分子标记辅助选择育种。利用分子标记辅助选择tms5和pms3基因, 辅以田间或人工气候房选育, 能够大大缩短两系不育系选育周期, 较准确获得不育起点温度低、育性稳定的光温敏不育系。

水稻两系不育系的光温调控机制非常复杂, 很多不育系的育性转换都是光温效应连动的结果^[34]。农垦58S的育性主要受光照时间调控, 而农垦58S的衍生不育系培矮64S则受温度和光照的共同影响^[27]。光温敏雄性不育受主效不育基因和发育感温、感光基因的共同调控, 而众多微效不育基因影响育性转换的条件。在本研究中, 广占63S/湘恢47组合的F₂单株中, 凡是携带tms5基因的单株都表现不育, 表明tms5基因是水稻光温敏不育的主效基因。TMS5基因编码一个核糖核酸酶RNase Z^S1, 其转录受转录因子OsbHLH138调节, 但TMS5和OsbHLH138的表达均不受气温调控^[23,35]。TMS5基因突变导致RNase Z^S1失去活性, 不能降解泛素基因Ub_L40的mRNA, 而Ub_L40基因的表达受高温诱导。在高温条件下, Ub_L40蛋白过量积累, 导致雄性不育。因此, 广占63S光温敏不育性状的遗传符合tms5基因为主效基因, Ub_L40基因为发育感温、感光基因的调控机制。与tms5基因调控育性的机制不同, pms3基因则是通过小RNA的表观遗传学机制调控农垦58S的光温敏不育。培矮64S/9311组合的F₂单株中, 不育性状不与pms3基因共分离, 很多携带纯合pms3基因型的单株也表现为可育, 表明培矮64S中pms3基因并不是独立起作用的, 还需要与其他基因(如Pms1、pms2或目前未发现的基因)共同调控。研究表明, pms3基因还受到其上游转录本AK111270产生的siRNA介导的甲基化调控^[28]。在农垦58S品种中过表达AK111270下调了pms3基因的表达并影响了水稻对光周期育性转换的条件。因此, 花粉的育性除了与pms3基因型有关, 还与其表达量有一定关系。在不同遗传背景下, pms3基因的表达量可能不同, 从而引起了育性的分化。进一步对粤光S/宁恢108 F₂单株育性和基因型情况分析也发现, F₂单株的育性与携带tms5基因完全共分离, 而与pms3基因无直接关系。本研究还发现, 广占63S/湘恢47组合中1个基因型为TTPP的F₂单株及粤光S/宁恢108组合1个基因型为TTpp的F_2:3家系单株均表现不育, 这些现象也暗示了水稻两系不育系光温调控机制的复杂性。随着两系杂交稻的应用和推广, tms5基因在两系不育系中起着主要作用。直至2012年, 携带tms5基因的杂交水稻组合已占两系杂交稻的95%以上^[24]。

水稻光温敏两系不育系不仅受日平均温度的影响, 同时也受到低温持续时间的影响。通过粤光S/宁恢108四种基因型组合的F_2:3家系育性与基因型关系分析发现, 虽然在9月10日前, 田间日平均气温都连续高于23.5℃, 但在8月21日之后, 田间日最低气温就持续低于23.5℃。持续低温可能是引起只携带tms5基因的部分株系可育的原因。彭海峰等^[7]研究表明, 携带不育基因tms5的籼S、N28S的育性更不易受外界持续低温的影响, 而培矮64S、N9S和N2S则更容易受低温影响。研究发现, 利用基因编辑技术敲除TMS5基因, 能够获得水稻温敏不育材料^{[36,37,38,39]}。在粤光S/宁恢108选出的F_2:3单株中, 同时携带tms5和pms3基因的株系比仅携带tms5基因的株系更不易受持续低温的影响(表3)。表明pms3基因增加了tms5基因背景下育性的稳定性, 预示着tms5和pms3基因可能在信号通路上存在直接或间接的关系。在已审定的水稻两系不育系品种中, 同时含有不育基因tms5和pms3的品种还比较少, 目前鉴定到的仅有N422S、广湘S和双8S等^[22]。然而, 是否在不同遗传背景下, 同时携带tms5和pms3基因的品种的育性都相对稳定, 仍然需要更全面深入的研究。但可以预测的是, 通过聚合光温敏不育基因, 对于选育不育起点温度更低、育性更加稳定的不育系是有利的。

4 结论

开发了水稻光温敏不育基因tms5和pms3的功能标记, 分析了培矮64S/9311、广占63S/湘恢47、粤光S/宁恢108这3个群体F₂单株及粤光S/宁恢108的F_2:3家系中tms5和pms3基因与育性的关系, 发现tms5基因是水稻光温敏不育系的主效基因, 而pms3基因并不能独立起作用, 还需要与其他基因共同调控; 推测tms5和pms3基因同时存在可能提高不育系育性的稳定性。本研究为利用tms5和pms3基因培育起点温度低且育性稳定水稻两系不育系提供了思路。

Supplementary table 1
附表1
附表1 培矮64S/9311 F₂群体基因型与育性的关系
Supplementary table 1The relationship between genotype and fertility of Pei’ai64S/9311 F₂ population

编号 No.	CAPS- PMS3	表型 Phenotype	编号 No.	CAPS- PMS3	表型 Phenotype	编号 No.	CAPS- PMS3	表型 Phenotype
培矮64S Pei’ai 64S	+	S	20	*	F	42	+	F
9311	-	F	21	*	F	43	+	F
F1	*	F	22	+	F	44	+	F
1	+	S	23	-	F	45	*	F
2	*	S	24	*	F	46	*	F
3	+	S	25	*	F	47	+	F
4	+	S	26	*	F	48	+	F
5	*	S	27	+	F	49	*	F
6	+	S	28	*	F	50	*	F
7	*	S	29	-	F	51	-	F
8	+	S	30	*	F	52	-	F
9	+	S	31	-	F	53	*	F
10	*	F	32	-	F	54	*	F
11	-	F	33	*	F	55	*	F

新窗口打开|下载CSV

Supplementary table 1
附表1
附表1 培矮64S/9311 F₂群体基因型与育性的关系(续附表1)
Supplementary table 1The relationship between genotype and fertility of Pei’ai64S/9311 F₂ population

编号 No.	CAPS- PMS3	表型 Phenotype	编号 No.	CAPS- PMS3	表型 Phenotype	编号 No.	CAPS- PMS3	表型 Phenotype
12	*	F	34	*	F	56	*	F
13	+	F	35	*	F	57	*	F
14	+	F	36	-	F	58	+	F
15	*	F	37	*	F	59	-	F
16	*	F	38	+	F	60	-	F
17	+	F	39	*	F	61	*	F
18	-	F	40	-	F	62	+	F
19	+	F	41	*	F

F₁: 培矮64S/9311杂交种; +: pp基因型; -: PP基因型; *: Pp基因型; F: 可育; S: 不育。培矮64S、9311、杂交种F₁及所有的F₂单株都为TT纯合基因型。
F₁: hybrid of Pei’ai 64S/9311; +: homozygous genotype pp; -: homozygous genotype PP; *: heterozygous genotype Pp; F: fertile; S: sterile; Pei’ai 64S, 9311, hybrid and all F₂ population carry the homozygous genotype TT.

新窗口打开|下载CSV

Supplementary table 2
附表2
附表2 广占63S/湘恢47 F₂群体基因型与育性的关系
Supplementary table 2 Relationship between genotype and fertility of Guangzhan 63S/Xianghui 47 F₂ population

编号 No.	AS- TMS5	表型 Phenotype	编号 No.	AS- TMS5	表型 Phenotype	编号 No.	AS- TMS5	表型 Phenotype
广占63S Guangzhan 63S	+	S	29	+	S	60	*	F
湘恢47 Xianghui 47	-	F	30	*	F	61	*	F
F1	*	F	31	-	F	62	*	F
1	+	S	32	*	F	63	*	F
2	+	S	33	*	F	64	*	F
3	+	S	34	-	F	65	*	F
4	+	S	35	*	F	66	-	F
5	+	S	36	-	F	67	*	F
6	+	S	37	*	F	68	*	F
7	+	S	38	-	F	69	*	F
8	+	S	39	*	F	70	-	F
9	+	S	40	*	F	71	*	F
10	+	S	41	*	F	72	*	F
11	+	S	42	*	F	73	*	F
12	+	S	43	*	F	74	-	F
13	+	S	44	*	F	75	-	F
14	+	S	45	*	F	76	*	F
15	+	S	46	*	F	77	-	F
16	+	S	47	*	F	78	*	F
17	-	S	48	*	F	79	*	F
18	+	S	49	*	F	80	-	F
19	+	S	50	*	F	81	*	F
20	+	S	51	*	F	82	*	F
21	+	S	52	*	F	83	*	F
22	+	S	53	*	F	84	*	F
23	+	S	54	-	F	85	*	F
24	+	S	55	*	F	86	-	F
25	+	S	56	-	F	87	*	F
26	+	S	57	*	F	88	-	F
27	+	S	58	*	F	89	*	F
28	+	S	59	-	F

F₁: 广占63S/湘恢47杂交种; +: tt基因型; -: TT基因型; *: Tt基因型; F: 可育; S: 不育。广占63S、湘恢47、杂交种F₁及所有的F₂单株都为PP纯合基因型。
F₁: hybrid of Guangzhan 63S/Xianghui 47; +: homozygous genotype tt; -: homozygous genotype TT; *: heterozygous genotype Tt; F: fertile; S: sterile; Guangzhan 63S, Xianghui 47, hybrid and all F₂ population carry the homozygous genotype PP.

新窗口打开|下载CSV

附图1

新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT
附图1 2015年8月至9月田间日照走势图

Supplementary fig. 1 Sunshine time of experimental plot in August and September of 2015

参考文献 View Option 原文顺序
文献年度倒序
文中引用次数倒序
被引期刊影响因子

[1] 石明松 . 对光照长度敏感的隐性雄性不育水稻的发现与初步研究
中国农业科学, 1985,18(2):44-48.
[本文引用: 1]

Shi M S . The discovery and study of the photosensitive recessive male-sterile rice (Oryza sativa L. subsp. japonica)
Sci Agric Sin, 1985,18(2):44-48 (in Chinese with English abstract).
[本文引用: 1]

[2] 王智权, 肖宇龙, 王晓玲, 雷建国, 余传元 . 水稻杂种优势利用的研究进展
江西农业学报, 2013,25(6):23-28.
[本文引用: 1]

Wang Z Q, Xiao Y L, Wang X L, Lei J G, Yu C Y . Research advances in rice heterosis utilization
Acta Agric Jiangxi, 2013,25(6):23-28 (in Chinese with English abstract).
[本文引用: 1]

[3] Chen L Y, Lei D Y, Tang W B, Xiao Y H . Thoughts and practice on some problems about research and application of two-line hybrid rice
Rice Sci, 2011,18:79-85.
[本文引用: 1]

[4] 孙宗修, 程式华, 闵绍楷, 熊振民, 应存山, 斯华敏, 杨仁崔, 梁康迳, 王乃元 . 光敏核不育水稻的光温反应研究
作物学报, 1993,19:83-87.
[本文引用: 1]

Sun Z X, Cheng S H, Min S K, Xiong Z M, Ying C S, Si H M, Yang R C, Liang K J, Wang R Y . Studies on the response of photoperiod sensitive genic male sterile (PGMS) rice to photoperiod and temperature
Acta Agron Sin, 1993,19:83-87 (in Chinese with English abstract).
[本文引用: 1]

[5] 程式华, 孙宗修, 斯华敏, 卓丽圣 . 水稻两用核不育系育性转换光温反应型的分类研究
中国农业科学, 1996,29(4):11-16.
[本文引用: 1]

Cheng S H, Sun Z X, Si H M, Zhuo L S . Classification of fertility response to photoperiod and temperature in dual-purpose genic male sterile lines (Oryza sativa L.).
Sci Agric Sin, 1996,29(4):11-16 (in Chinese with English abstract).
[本文引用: 1]

[6] 陈立云, 肖应辉 . 水稻光温敏核不育机理设想及光温敏核不育系选育策略
中国水稻科学, 2010,24:103-107.
[本文引用: 1]

Chen L Y, Xiao Y H . Mechanism of sterility and breeding strategies of photoperiod/thermo-sensitive genic male sterile rice
Chin J Rice Sci, 2010,24:103-107 (in Chinese with English abstract).
[本文引用: 1]

[7] 彭海峰, 陈雄辉, 葛艳艳, 万邦惠 . 不同光温敏核不育水稻对低温耐受度的差异比较研究
华南农业大学学报, 2016,37(1):14-19.
[本文引用: 2]

Peng H F, Chen X H, Ge Y Y, Wan B H . A comparative study on the low temperature tolerability of different photo-thero sensitive genic male sterile lines in rice
J South Chin Agric Univ, 2016,37(1):14-19 (in Chinese with English abstract).
[本文引用: 2]

[8] Liu N, Shan Y, Wang F P, Xu C G, Peng K M, Li X H, Zhang Q . Identification of an 85-kb DNA fragment containing pms1, a locus for photoperiod-sensitive genic male sterility in rice
Mol Genet Genomics, 2001,266:271-275.
[本文引用: 1]

[9] Fan Y, Yang J, Mathioni S M, Yu J, Shen J, Yang X, Wang L, Zhang Q, Cai Z, Xu C, Li X, Xiao J, Meyers B C, Li X . PMS1T, producing phased small-interfering RNAs, regulates photoperiod-sensitive male sterility in rice
Proc Natl Acad Sci USA, 2016,113:15144-15149.
[本文引用: 1]

[10] Zhang Q, Shen B Z, Dai X K, Mei M H, Saghai Maroof M A, Li Z B. Using bulked extremes and recessive class to map genes for photoperiod-sensitive genic male sterility in rice
Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91:8675-8679.
[本文引用: 1]

[11] Li X H, Lu Q, Wang F L, Xu C G, Zhang Q F . Separation of the two-locus inheritance of photoperiod sensitive genic male sterility in rice and precise mapping the pms3 locus
Euphytica, 2001,119:343-348.
[本文引用: 1]

[12] Lu Q, Li X H, Guo D, Xu C G, Zhang Q . Localization of pms3, a gene for photoperiod-sensitive genic male sterility, to a 28.4-kb DNA fragment
Mol Genet Genomics, 2005,273:507-511.
[本文引用: 1]

[13] Huang T Y, Wang Z, Hu Y G, Shi S P, Peng T, Chu X D, Shi J, Xiang Z F, Liu D Y . Genetic analysis and primary mapping of pms4, a photoperiod-sensitive genic male sterility gene in rice(Oryza sativa)
Rice Sci, 2008,15:153-156.
[本文引用: 1]

[14] Wang B, Xu W W, Wang J Z, Wu W, Zheng H G, Yang Z Y, Ray J D, Nguyen H T . Tagging and mapping the thermo-sensitive genic male-sterile gene in rice (Oryza sativa L.) with molecular markers
Theor Appl Genet, 1995,91:1111-1114.
[本文引用: 1]

[15] Yamagushi Y, Ikeda R, Hirasawa H, Minami M, Ujihara P . Linkage analysis of the thermo-sensitive genic male sterility gene tms2 in rice( Oryza sativa L.).
Breed Sci, 1997,47:371-377.
[本文引用: 1]

[16] Lopez M T, Toojinda T, Vanavichit A, Tragoonrung S . Microsatellite markers flanking the tms2 gene facilitated tropical TGMS rice line development
Crop Sci, 2003,43:2267-2271.
[本文引用: 1]

[17] Subudhi P K, Borkakati R P, Virmani S S, Huang N . Molecular mapping of a thermosensitive genetic male sterility gene in rice using bulked segregant analysis
Genome, 1997,40:188-194.
[本文引用: 1]

[18] Dong N V, Subudhi P K, Luong P N, Quang V D, Quy T D, Zheng H G, Wang B, Nguyen H T . Molecular mapping of a rice gene conditioning thermo-sensitive genic male sterility using AFLP, RFLP and SSR techniques
Theor Appl Genet, 2000,100:727-734.
[本文引用: 1]

[19] Yang Q, Liang C, Zhuang W, Li J, Deng H, Deng Q, Wang B . Characterization and identification of the candidate gene of rice thermo-sensitive genic male sterile gene tms5 by mapping
Planta, 2007,225:321-330.
[本文引用: 1]

[20] Peng H F, Chen X H, Lu Y P, Peng Y F, Wan B H, Chen N D, Wu B, Xin S P, Zhang G Q . Fine mapping of a gene for non-pollen type thermo-ssensitive genic male sterility in rice (Oryza sativa L.).
Theor Appl Genet, 2010,120:1013-1020.
[本文引用: 1]

[21] Lee D S, Chen L J, Suh H S . Genetic characterization and fine mapping of a novel thermo-sensitive genic male-sterile gene tms6 in rice( Oryza sativa L.)
Theor Appl Genet, 2005,111:1271-1277.
[本文引用: 1]

[22] Liu X, Li X, Zhang X, Wang S . Genetic analysis and mapping of a thermo-sensitive genic male sterility gene, tms6(t), in rice(Oryza sativa L.).
Genome, 2010,53:119-124.
[本文引用: 2]

[23] Zhou H, Zhou M, Yang Y, Li J, Zhu L, Jiang D, Dong J, Liu Q, Gu L, Zhou L, Feng M, Qin P, Hu X, Song C, Shi J, Song X, Ni E, Wu X, Deng Q, Liu Z, Chen M, Liu Y G, Cao X, Zhuang C . RNase ZS1 processes UbL40 mRNAs and controls thermosensitive genic male sterility in rice
Nat Commun, 2014,5:4884.
[本文引用: 4]

[24] 张华丽, 陈晓阳, 黄建中, 鄂志国, 龚俊义, 舒庆尧 . 中国两系杂交水稻光温敏核不育基因的鉴定与演化分析
中国农业科学, 2015,48:1-9.
[本文引用: 5]

Zhang H L, Chen X Y, Huang J Z, Er Z G, Gong J Y, Shu Q Y . Identification and transition analysis of photo-/thermo-sensitive genic male sterile genes in two-line hybrid rice in China
Sci Agric Sin, 2015,48(1):1-9 (in Chinese with English abstract).
[本文引用: 5]

[25] 斯华敏, 付亚萍, 刘文真, 孙宗修, 胡国成 . 水稻光温敏雄性核不育系的系谱分析
作物学报, 2012,38:394-407.
[本文引用: 1]

Si H M, Fu Y P, Liu W Z, Sun Z X, Hu G C . Pedigree analysis of photoperiod-thermo sensitive genic male sterile rice
Acta Agron Sin, 2012,38:394-407 (in Chinese with English abstract).
[本文引用: 1]

[26] Ding J, Lu Q, Ou-Yang Y, Mao H, Zhang P, Yao J, Xu C, Li X, Xiao J, Zhang Q . A long noncoding RNA regulates photoperiod-sensitive male sterility, an essential component of hybrid rice
Proc Natl Acad Sci USA, 2012,109:2654-2659.
[本文引用: 2]

[27] Zhou H, Liu Q, Li J, Jiang D, Zhou L, Wu P, Lu S, Li F, Zhu L, Liu Z, Chen L, Liu Y G, Zhuang C . Photoperiod- and thermo-sensitive genic male sterility in rice are caused by a point mutation in a novel noncoding RNA that produces a small RNA
Cell Res, 2012,22:649-660.
[本文引用: 3]

[28] Ding J, Shen J, Mao H, Xie W, Li X, Zhang Q . RNA-directed DNA methylation is involved in regulating photoperiod-sensitive male sterility in rice
Mol Plant, 2012,5:1210-1216.
[本文引用: 2]

[29] 柏斌, 吴俊, 庄文, 姚栋萍, 李莺歌, 邓启云 . 广适性光温敏不育系Y58S幼穗分化期耐冷性表现及生理机制
植物遗传资源学报, 2017,18:646-652.
[本文引用: 1]

Bai B, Wu J, Zhuang W, Yao D P, Li Y G, Deng Q Y . Studies on cold tolerance of widely adaptable ptgms line Y58S and its physiological mechanism at the booting stage
J Plant Genet Resour, 2017,18:646-652 (in Chinese with English abstract).
[本文引用: 1]

[30] 雷东阳, 林勇, 陈立云 . 水稻两用核不育系的研究现状与发展策略
湖南农业大学学报(自然科学版), 2019,45(3):225-230.
[本文引用: 1]

Lei D Y, Lin Y, Chen L Y . The research progress and countermeasures of dual-purpose genic male sterile line
J Hunan Agric Univ(Nat Sci), 2019,45(3):225-230 (in Chinese with English abstract).
[本文引用: 1]

[31] Zhang H L, Huang J Z, Liu Q L, Nawaz Z, Lu H P, Gong J Y, Zhu Y J, Yan W, Shu Q Y . Characterization of an RNase Z nonsense mutation identified exclusively in environment-conditioned genic male sterile rice
Mol Breed, 2014,34:481-489.
[本文引用: 1]

[32] 李丁, 赵迎曦, 夏玉梅, 袁隆平, 高婧, 沈春修, 方真, 李祺, 曹孟良 . 水稻光温敏核不育系不育基因的分子检测
杂交水稻, 2013,28(1):68-71.
[本文引用: 1]

Li D, Zhao Y X, Xia Y M, Yuan N P, Gao J, Shen C X, Fang Z, Li Q, Cao M L . The SNP detection of p/tms12-1 and tms5 genes in rice PTGMS lines by PCR-PFLP and sequencing techniques
Hybrid Rice, 2013,28(1):68-71 (in Chinese with English abstract).
[本文引用: 1]

[33] 李军, 李白, 高荣村 . 利用四引物扩增受阻突变体系PCR技术检测水稻光温敏核不育基因p/tms12-1
中国水稻科学, 2014,28:442-446.
[本文引用: 1]

Li J, Li B, Gao R C . Deletion of gene p/tms12-1 for photoperiod- and thermo-sensitive genic male sterility by tetra-primer amplication refractory mutation system PCR in rice
Chin J Rice Sci, 2014,28:442-446 (in Chinese with English abstract).
[本文引用: 1]

[34] 何强, 陈立云, 邓华凤, 唐文邦, 肖应辉, 袁隆平 . 水稻C815S及其同源株系的育性光温特性
作物学报, 2007,33:262-268.
[本文引用: 1]

He Q, Chen L Y, Deng H F, Tang W B, Xiao Y H, Yuan L P . Fertility photo-thermo characteristics in PTGMS rice C815S and its homologous plant lines
Acta Agron Sin, 2007,33:262-268 (in Chinese with English abstract).
[本文引用: 1]

[35] Wen J, Wang L, Wang J, Zeng Y, Xu Y, Li S . The transcription factor OsbHLH138 regulates thermo-sensitive genic male sterility in rice via activation of TMS5
Theor Appl Genet, 2019,132:1721-1732.
[本文引用: 1]

[36] Zhou H, He M, Li J, Chen L, Huang Z, Zheng S, Zhu L, Ni E, Jiang D, Zhao B, Zhuang C . Development of commercial thermo-sensitive genic male sterile rice accelerates hybrid rice breeding using the CRISPR/Cas9-mediated TMS5 editing system
Sci Rep, 2016,6:37395.
[本文引用: 1]

[37] Barman H N, Sheng Z, Fiaz S, Zhong M, Wu Y, Cai Y, Wang W, Jiao G, Tang S, Wei X, Hu P . Generation of a new thermo-sensitive genic male sterile rice line by targeted mutagenesis of TMS5 gene through CRISPR/Cas9 system
BMC Plant Biol, 2019,19:109.
[本文引用: 1]

[38] 黄忠明, 周延彪, 唐晓丹, 赵新辉, 周在为, 符星学, 王凯, 史江伟, 李艳锋, 符辰建, 杨远柱 . 基于CRISPR/Cas9技术的水稻温敏不育基因tms5突变体的构建
作物学报, 2018,44:844-851.
[本文引用: 1]

Huang Z M, Zhou Y B, Tang X D, Zhao X H, Zhou Z W, Fu X X, Wang K, Shi J W, Li Y F, Fu C J, Yang Y Z . Construction of tms5 mutants in rice based on CRISPR/Cas9 technology
Acta Agron Sin, 2018,44:844-851 (in Chinese with English abstract).
[本文引用: 1]

[39] 吴明基, 林艳, 刘华清, 陈建民, 付艳萍, 杨绍华, 王锋 . 利用CRISPR/Cas-9技术创制水稻温敏核不育系
福建农业学报, 2018,33:1011-1015.
[本文引用: 1]

Wu M J, Lin Y, Liu H Q, Chen J M, Fu Y P, Yang S H, Wang F . Development of thermo-sensitive male sterile rice with CRISPR/Cas9 technology
Fujian J Agric Sci, 2018,33:1011-1015 (in Chinese with English abstract).
[本文引用: 1]