杨勇¹, 陆彦^1,2, 郭淑青¹, 石仲慧¹, 赵杰¹, 范晓磊¹, 李钱峰¹, 刘巧泉^,1,*, 张昌泉^,1,*1 扬州大学农学院 / 植物功能基因组学教育部重点实验室 / 江苏省作物基因组学和分子育种重点实验室 / 粮食作物现代产业技术协同创新中心, 江苏扬州 225009
2 扬州大学测试中心, 江苏扬州 225009

Improvement of rice eating quality and physicochemical properties by introgression of Wx ⁱⁿ allele in indica varieties

YANG Yong¹, LU Yan^1,2, GUO Shu-Qing¹, SHI Zhong-Hui¹, ZHAO Jie¹, FAN Xiao-Lei¹, LI Qian-Feng¹, LIU Qiao-Quan^,1,*, ZHANG Chang-Quan^,1,* 1 Jiangsu Key Laboratory for Crop Genomics and Molecular Breeding / Key Laboratory of Plant Functional Genomics of Ministry of Education / Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops, Agricultural College of Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China
2 Instrumental Analysis Center, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China

通讯作者: 刘巧泉, E-mail: qqliu@yzu.edu.cn; 张昌泉, E-mail: cqzhang@yzu.edu.cn

收稿日期:2018-12-14接受日期:2019-06-20网络出版日期:2019-07-15

基金资助:

本研究由国家重点研发计划项目.2016YFD0100501 国家自然科学基金项目.31872860 国家自然科学基金项目.31561143008 江苏省科技计划项目.BE2018357 江苏省科技计划项目.BK20160464 江苏省高等学校自然科学研究项目.16KJB210011 杂交水稻国家重点实验室(湖南杂交水稻研究中心)开放课题.2018KF04Hunan Hybrid Rice Research Center 扬州大学农学院农学专业本科生创新训练计划项目资助

Received:2018-12-14Accepted:2019-06-20Online:2019-07-15

Fund supported:

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China.2016YFD0100501 the National Natural Science Foundation of China.31872860 the National Natural Science Foundation of China.31561143008 the Government of Jiangsu Province.BE2018357 the Government of Jiangsu Province.BK20160464 the Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions of China.16KJB210011 the Open Research Fund of State Key Laboratory of Hybrid Rice(Hunan Hybrid Rice Research Center).2018KF04Hunan Hybrid Rice Research Center the Personnel Training Program for Undergraduates in Agricultural College of Yangzhou University

作者简介 About authors
E-mail:1046354026@qq.com。











摘要
水稻Wx ^b等位基因已广泛用于籼稻的品质改良, 但携带该等位基因的一些籼稻米饭往往偏软, 仍需进一步改良。为明确籼稻背景下导入Wx ⁱⁿ等位基因对稻米食味品质和理化品质的效应, 分别以携带Wx ⁱⁿ的IR64和携带Wx ^b的9311为供体, 以携带Wx ^a的籼稻SIR3611 (3611)为受体, 基于分子标记辅助选择, 通过杂交和连续回交的方式构建了3611背景下携带Wx ⁱⁿ和Wx ^b的近等基因系。系统比较了不同近等基因系间的农艺性状以及稻米的食味和理化品质。结果表明, 近等基因系与受体亲本3611的主要农艺性状基本接近, 无显著差异。NIL(Wx ⁱⁿ)稻米的表观直链淀粉含量较亲本3611极显著下降而胶稠度极显著增加。NIL(Wx ^b)稻米表观直链淀粉含量最低且与之对应的胶稠度最高。近等基因系NIL(Wx ⁱⁿ)和NIL(Wx ^b)稻米的食味值较亲本极显著提高。NIL(Wx ⁱⁿ)和NIL(Wx ^b)稻米的GBSSI丰度与对应的表观直链淀粉含量具有明显的正相关。稻米粉的黏滞性谱、热糊化特性和晶体结构与直链淀粉含量显著相关性。本研究为在我国籼稻品种品质改良中有效利用Wx ⁱⁿ等位基因提供了重要依据。
关键词： 水稻;食味品质;Wx等位基因;表观直链淀粉含量;分子标记辅助选择

Abstract
Nowadays, the Wx ^b allele has been widely used to improve grain quality of indica rice. However, some indica varieties carrying Wx ^b allele usually has a much softer texture, which is not favored by consumers in South China. So the grain quality of these varieties needs to be further improved. To understand the effect of Wx ⁱⁿ allele on rice eating quality and physicochemical properties in indica rice, we developed two Near-Isogenic Lines (NILs) carrying Wx ⁱⁿ and Wx ^b alleles by crossing an indica variety 3611 (receptor, carrying Wx ^a) with IR64 (carrying Wx ⁱⁿ) and 9311 (carrying Wx ^b), and seven times of backcrossing based on molecular marker assistant selection (MAS). The Wx effects in controlling the synthesis of amylose, grain quality, and physicochemical properties were investigated. There were non-significant differences in the agronomic traits among the NILs. However, for grain quality characters, we found that the NIL(Wx ⁱⁿ) rice showed significantly lower apparent amylose content (AAC) and higher gel consistency (GC), compared with the wild type 3611. Besides, the NIL(Wx ^b) rice showed the lowest AAC and highest GC among three lines. The NIL(Wx ⁱⁿ) rice had a significantly higher taste value than the wild type 3611, while the NIL(Wx ^b) rice exhibited the highest taste value among the three samples. The granule-bound starch synthase I (GBSSI) level was the highest in 3611, moderate in NIL(Wx ⁱⁿ) and lowest in NIL(Wx ^b), which showed a positive correlation with the AAC level. Also, the starch viscosity, thermal gelatinization property and crystal structure of different rice flours had a high correlation with the AAC level. To sum up, our results proved that both Wx ⁱⁿ and Wx ^b allele can improve the grain quality in 3611 background, and what is more, the Wx ⁱⁿ allele might be more useful for the improvement of grain quality in indica rice.
Keywords：Oryza sativa L.;eating quality;Wx allele;apparent amylose content;molecular marker assisted selection


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本文引用格式
杨勇, 陆彦, 郭淑青, 石仲慧, 赵杰, 范晓磊, 李钱峰, 刘巧泉, 张昌泉. 籼稻背景下导入Wx ⁱⁿ等位基因改良稻米食味和理化品质 [J]. 作物学报, 2019, 45(11): 1628-1637. doi:10.3724/SP.J.1006.2019.82064
YANG Yong, LU Yan, GUO Shu-Qing, SHI Zhong-Hui, ZHAO Jie, FAN Xiao-Lei, LI Qian-Feng, LIU Qiao-Quan, ZHANG Chang-Quan. Improvement of rice eating quality and physicochemical properties by introgression of Wx ⁱⁿ allele in indica varieties [J]. Acta Crops Sinica, 2019, 45(11): 1628-1637. doi:10.3724/SP.J.1006.2019.82064


水稻(Oryza sativa L.)是世界上食用人口最多、种植范围最广的农作物, 也是我国的主要粮食作物之一。目前我国水稻高产育种已经走在了世界前列, 但是稻米品质普遍不高, 尤其是很多籼稻品种的稻米品质还无法达到优质米标准^[1,2]。因此, 稻米品质性状的遗传改良是当前水稻育种研究的一个重要方向^[3]。稻米的食用部分为胚乳, 其主要成分为淀粉, 包括直链淀粉和支链淀粉两类。一般认为, 两类淀粉形成了淀粉的半晶体结构, 并且不同类型的比例和结构对稻米品质的优劣起着重要作用^[4]。其中直链淀粉含量是影响稻米品质尤其是食味品质的最主要因素, 一直被作为衡量稻米食味品质的一个最重要指标。通常高直链淀粉含量的米饭质地较硬而低直链淀粉含量的米饭软而有弹性^[5,6]。由于直链淀粉含量难以准确测定, 一般用表观直链淀粉含量(apparent amylose content, AAC)来表示。尽管一些研究发现AAC相似的水稻品种间也存在显著的食味品质差异, 并且认为这种差异主要是由支链淀粉的精细结构差异造成的^[7,8], 但是, 最近的一些研究表明直链淀粉的精细结构对米饭的适口性影响也非常大^[9]。

水稻蜡质基因(Waxy, Wx)是控制稻米直链淀粉含量的主效基因, 其编码的颗粒结合淀粉合酶(Granule-Bound Starch Synthase I, GBSSI)直接控制直链淀粉的合成。研究发现Wx基因的不同等位变异是稻米AAC广泛分布的重要原因^[10]。在我国非糯水稻品种中, Wx基因主要分化为Wx^a和Wx^b两种等位类型。其中, Wx^a主要分布在籼稻中, 携带该等位基因的稻米AAC较高, 一般在25%以上^[11]。与Wx^a相比, Wx^b等位基因在第1内含子剪接位点处发生了从G到T的突变, 该突变影响了前体mRNA的剪接效率, 从而降低了其编码蛋白GBSSI的量^[12]。Wx^b主要分布在粳稻品种中, 携带该等位基因的稻米AAC一般在15%~18%之间, 属于中等或偏低水平。随着水稻品质性状遗传改良的进步, 近些年来我国选育的一些籼稻品种(亲本)如扬稻6号(9311)、黄华占、明恢63和Y58S等都已携有Wx^b等位基因, 这些籼稻品种已经在稻米食味品质上有了很大的提升^[3], 但是对于南方地区尤其是以杂交稻米为消费主体的省份, 由于水稻生长季节的高温等环境因素的影响, 一些以携带Wx^b等位基因为双亲配出的杂交组合, 其稻米AAC含量偏低, 米饭偏软, 尚需要进一步改良以满足消费者的多样化需求^[13]。此外, 在籼稻中还存在一个控制中等直链淀粉含量的Wxⁱⁿ等位基因, 与Wx^a相比, 该等位基因在第6外显子62碱基处发生了A到C的突变, 引起了酪氨酸到丝氨酸的替换^[14]。携带该等位基因的稻米AAC一般在18%~20%之间, 米饭软硬适中, 食味较好, 一些优质籼稻如Basmati类和泰国香米等都携带该等位基因。但是Wxⁱⁿ等位基因至今未在我国水稻品种选育中获得大范围应用。

有关Wx等位变异对稻米品质的效应研究已有很多报道^{[14,15,16,17,18]}, 但这些研究多采用一些品种或者染色体片段代换系, 可能会存在其他基因的干扰, 而近等基因系是研究基因等位变异效应的理想材料。本研究以携带Wx^a等位基因的籼型杂交稻恢复系亲本SIR3611 (简称为3611)为受体亲本, 以携带Wxⁱⁿ和Wx^b等位基因的籼稻品种IR64和9311为供体, 通过杂交和连续回交, 并结合分子标记辅助选择构建了3611背景下Wx^a、Wxⁱⁿ和Wx^b的近等基因系。系统分析了不同近等基因系间的农艺性状和稻米理化品质等指标, 来重点评价Wxⁱⁿ等位基因在籼稻背景下对稻米品质的改良效应及其育种应用潜力。

1 材料与方法

1.1 供试品种与试验条件

用于研究的水稻材料包括籼型恢复系3611 (携带Wx^a等位基因)、籼型品种IR64 (携带Wxⁱⁿ等位基因)和9311 (又名扬稻6号, 携带Wx^b等位基因)。以上材料及其来源的近等基因系正季均种植于扬州大学文汇路校区试验农场, 春季种植于海南省陵水县试验基地。每个材料种植2行, 每行10株, 株行距分别为14 cm和18 cm。土壤肥力中等, 采用一般田间栽培管理技术。

1.2 近等基因系构建

分别以9311和IR64作为供体亲本(父本)与受体亲本3611杂交, 杂交种F₁再与3611进行多次回交(图1-A), 从回交BC₁F₁代开始, 利用分子标记Wxin1、Wxin2和QRM190分别对Wxⁱⁿ和Wx^b近等基因系进行分子标记辅助选择(MAS)。在回交7代后再进行自交3代。为排除遗传背景的干扰, 利用实验室已有的18个淀粉合成酶基因的51个分子标记进行背景筛选, 参照田志喜等^[19]的相关分子标记信息。通过筛选, 获得了Wxⁱⁿ和Wx^b纯合且主要淀粉合成酶基因一致的近等基因系NIL(Wxⁱⁿ)和NIL(Wx^b)。

图1

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图1近等基因系构建过程(A)与近等基因系糙米表型(B)

MAS: 分子标记辅助选择; NIL: 近等基因系。
Fig. 1Construction of near-isogenic lines (A) and comparison of their grain phenotype (B)

MAS: molecular marker-assisted selection; NIL: near-isogenic line.

1.3 水稻植株DNA提取和PCR分析

在水稻分蘖期, 按照单株取叶片并编号, 用液氮速冻并研磨后, 采用CTAB法^[20]提取总DNA用于PCR分析。在20 μL反应液中混合1 μL总DNA (50~100 ng)、1×反应缓冲液(含镁离子和dNTPs)、1 μmol L^-1引物和1 U Taq DNA聚合酶(诺唯赞)及适量水, 进行PCR扩增。PCR引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。根据Wx^a和Wx^b等位基因第1外显子区CT重复序列, 设计能够区分Wx^a和Wx^b的特异性引物QRM190-F (5′-ATTCCTTCAGTTCTTTGT CTATCTC-3′)与QRM190-R (5′-TCCTGATGAACAA CAGAACAACAC-3′)。根据Wxⁱⁿ和Wx^a在第6外显子A/C的变异, 设计四引物扩增受阻突变(tetra- primer ARMS-PCR)引物对Wxin1-F (5′-AACAACC CATACTTCAAAGGAACATC-3′)和Wxin1-R (5′-GT AGATGCCATTGGGCTGGTAGT-3′)、以及引物对Wxin2-F (5′-GCTTAGCTTCCACTGGTGATTTCA-3′)和Wxin2-R (5′-TCTTGAGATCAATTGTAACTCCC CAT-3′)。QRM190分子标记的PCR条件为95℃, 5 min, 95℃, 50 s, 53℃, 30 s, 72℃, 20 s, 35个循环; 72℃, 10 min。Wxin分子标记的PCR反应条件为95℃, 5 min, 95℃, 50 s, 53℃, 30 s, 72℃, 35 s, 35个循环; 72℃, 10 min。PCR产物在3.0%的琼脂糖凝胶电泳上分离, 然后在Bio-RAD UV 1000核酸成像仪上观察。

1.4 田间农艺性状测定

水稻成熟时, 选取每个系中间10个单株, 测量株高和有效穗数。随后, 选取每株一个主穗, 统计穗长、结实率和千粒重。

1.5 稻米样品前处理

收获的成熟稻谷经40℃烘干后用砻谷机出糙获得糙米, 去除发霉变质及未成熟米粒后用精米机(日本Kett公司)处理得精米。利用旋风式磨粉机(丹麦FOSS公司)将精米磨成粉, 并过100目筛, 放入40℃烘箱中烘2 d, 在室温下平衡2 d后装于自封袋密封, 于4℃存放备用。

1.6 蛋白SDS-PAGE分析

准确称取100 mg米粉, 加入1.5 mL抽提缓冲液[Tris-HCl (pH 6.8) 0.05 mol L^-1, SDS 2.8%, 甘油10%, 2-ME 5%], 放于摇床上, 37℃抽提30 min, 10,000×g离心, 吸取上清液, 获得总蛋白抽提物(含有游离态GBSSI), 放于4℃备用。剩余沉淀, 用相同抽提液抽提3次, 每次30 min, 离心, 去掉上清液。沉淀再次加入500 μL抽提缓冲液, 混匀后高温煮沸5 min, 冷却至室温后再加入500 μL抽提缓冲液, 10,000×g离心10 min, 吸取上清液到新的离心管中, 获得淀粉粒结合GBSSI。对上述总蛋白和淀粉粒结合GBSSI参照Liu^[21]的方法进行SDS-PAGE分析。

1.7 稻米理化品质测定

采用万深公司大米外观品质检测仪(SC-E)测定稻米外观品质; 采用STA1A食味仪(日本佐竹公司)测定米饭食味值; 参照农业部颁布的标准《NY147- 88米质测定方法》测定稻米AAC及胶稠度(Gel consistency, GC); 稻米粉黏滞性(RVA)的测定参照Zhang等^[22]的方法; 利用差示扫描量热仪(DSC) (德国耐驰公司, DSC 200 F3型号)测量米粉的热力学特性^[22]; 参照Zhang等^[22]的方法, 分别利用多晶X-射线衍射仪(德国布鲁克AXS公司, D8-ADVANCE)和傅里叶红外光谱分析(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)测定米粉的晶体结构。

1.8 统计分析

每个样品测定至少作2次重复, 利用Microsoft Excel 2016进行数据收集, 用统计分析软件SPSS 15.0进行方差分析。实验中所有的数据均为平均值±标准差(mean±SD)。

2 结果与分析

2.1 近等基因系的构建及其田间表现

如图2-A所示, QRM190能够很好的对Wx^a和Wx^b进行区分。如图2-B所示, 分子标记Wxin1和Wxin2能够很好地区分Wxⁱⁿ和非Wxⁱⁿ基因型。通过分子标记辅助选择, 回交系继续与轮回亲本3611回交7代并自交3代, 获得了BC₇F₃群体。通过筛选, 获得了3611背景下Wxⁱⁿ 和Wx^b基因型纯合且其他18个淀粉合成酶基因型与受体亲本一致的近等基因系NIL(Wxⁱⁿ)和NIL(Wx^b) (图1-A)。

图2

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图2不同Wx等位基因特异分子标记的检测

A图为利用QRM190分子标记区分Wx^a和Wx^b的PCR检测结果, 泳道1为3611, 2为9311, 3~7为近等基因系NIL(Wx^b); B图为利用基因特异分子标记区分Wx^a和Wxⁱⁿ的PCR检测结果, 泳道1为3611, 2为IR64, 3~7为近等基因系NIL(Wxⁱⁿ)。
Fig. 2Detection of specific molecular markers for different Wx alleles

(A): allelic specific molecular marker QRM190 for detecting Wx^a and Wx^b. Lanes 1-7: 3611, 9311 and their derived NIL NIL(Wx^b) (lanes 3-7), respectively. (B): allelic specific molecular marker for detecting Wx^a and Wxⁱⁿ. Lanes 1-7: 3611, IR64 and their derived NIL NIL(Wxⁱⁿ) (lanes 3-7), respectively.


在选育获得纯合近等基因系后, 首先比较了近等基因系与受体亲本的主要农艺性状, 如表1和图1-B所示, 2个近等基因系在株高、穗长、结实率、千粒重和粒形等方面与受体亲本3611相比均没有显著差异。这些结果表明, 在田间正常种植条件下两个近等基因系主要农艺性状与受体亲本一致, 可以用于后续等位基因的效应分析。

Table 1
表1
表1近等基因系主要农艺性状表现
Table 1Main agronomic traits in different near-isogenic lines

品系 Line	株高 Plant height (cm)	有效分蘖 Tiller number	主穗长 Main panicle length (cm)	结实率 Seed setting rate (%)	千粒重 1000-kernel weight (g)
3611(Wxa)	117.8±1.2 a	5.6±0.9 a	26.5±0.4 a	91.2±2.2 a	30.7±0.8 a
NIL(Wxin)	118.2±2.3 a	5.2±0.8 a	26.7±0.6 a	90.5±3.1 a	29.8±0.5 a
NIL(Wxb)	115.0±1.5 a	6.0±0.6 a	25.8±0.4 a	91.5±2.8 a	31.0±0.2 a

Values within the same column followed by different letters are significant different at P < 0.01 and n = 10.
同列标以不同小写字母的值差异极显著(P < 0.01), n = 10。

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2.2 不同近等基因系稻米中GBSS I表达量的比较

为进一步确认不同Wx等位基因在相同背景下编码的蛋白丰度的差异, 分析了3个近等基因系稻米中GBSSI的积累情况。如图3-A所示, 在其他蛋白总量一致的情况下, 3个样品米粉中可溶性GBSSI蛋白的差异显著, 携带Wx^a的稻米米粉中游离态GBSSI含量最高, 其次为NIL(Wxⁱⁿ)样品, 而NIL (Wx^b)米粉中的游离态GBSSI水平最低。进一步分析GBSSI的量(图3-B)表明, Wx^a米粉中结合态GBSSI量仍然最多, 其次是Wxⁱⁿ米粉, 最少的是Wx^b米粉。这些结果与各近等基因系稻米的AAC具有明显的正相关(表2), 也与已有的报道较为一致^[23]。

图3

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图3近等基因系成熟种子中GBSS I蛋白游离态(A)和结合态(B)的SDS-PAGE分析

M: 蛋白质分子质量标准; 1~2: 3611(Wx^a); 3~4: NIL(Wxⁱⁿ); 5~6: NIL(Wx^b); 箭头所示为60 kD的GBSSI蛋白。
Fig. 3SDS-PAGE analysis of the soluble (A) and bound (B) GBSS I isolated from mature rice of different NILs

Lane M: the protein standard molecular mass; Lanes 1-2: 3611(Wx^a); Lane 3-4: NIL(Wxⁱⁿ); Lanes 5-6: NIL(Wx^b); The arrows indicate the 60 kD GBSSI.


Table 2
表2
表2不同近等基因系稻米理化和外观品质
Table 2Appearance quality and physicochemical properties of different near-isogenic lines

品系 Line	表观直链淀粉含量 Apparent amylose content (%)	胶稠度 Gel consistency (mm)	食味值 Taste value	垩白粒率 Chalkiness rate (%)	垩白度 Chalkness degree (%)
3611(Wxa)	25.51±1.48 a	42.35±4.17 c	43.15±1.35 c	18.62±0.87 a	2.89±1.05 a
NIL(Wxin)	19.85±0.27 b	78.54±2.32 b	55.09±2.51 b	13.04±0.30 b	1.93±0.06 c
NIL(Wxb)	14.78±0.55 c	87.62±3.48 a	60.51±1.87 a	13.05±0.40 b	2.03±0.32 b

Values within the same column followed by different letters are significant different at P < 0.01 and n = 3.
同列标以不同小写字母的值差异极显著(P < 0.01), n = 3。

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2.3 不同近等基因系稻米理化品质的比较

如表2所示, 3611(Wx^a)成熟稻米的表观直链淀粉含量最高, 近等基因系NIL(Wxⁱⁿ)稻米的AAC处于中间水平, 而NIL(Wx^b)稻米AAC较低。这些结果与上述的SDS-PAGE分析具有非常好的一致性, 说明AAC的水平与GBSSI丰度具有直接的正相关性。3611(Wx^a)稻米的胶稠度最硬, 而NIL(Wxⁱⁿ)稻米的胶稠度极显著变软, 与NIL(Wx^b)较为接近, 说明Wxⁱⁿ等位基因能够显著改善籼米的米饭质地, 使其变软。该结果与AAC的水平也表现出非常好的负相关性。进一步比较米饭的食味值发现, 3611(Wx^a)稻米的食味值最低, 其次是NIL(Wxⁱⁿ), 而NIL(Wx^b)的食味值最高。考虑到米饭食味值采用的是黑龙江粳稻打分模式, 可能会对籼稻的分析造成一定影响, 结合胶稠度结果来看, NIL(Wxⁱⁿ)稻米的实际食味表现可能会更好, 甚至优于NIL(Wx^b)稻米。此外, 近等基因系NIL(Wxⁱⁿ)和NIL(Wx^b)的稻米垩白粒率较亲本对照均极显著下降, 稻米垩白度在2个近等基因系中也极显著下降, 说明在杂交和回交过程中3611的外观品质也得到了改良。

2.4 不同近等基因系稻米黏滞性的比较

稻米黏滞性是反映稻米食味品质的另一重要指标, 稻米黏滞性测定能够模拟稻米蒸煮过程的动态变化, 相关指标能贴切反映米饭的口感和质地^[24]。因此, 我们测定了不同近等基因系米粉的RVA谱。如图4所示, 近等基因系NIL(Wx^b) RVA谱的峰值黏度最高, 而NIL(Wxⁱⁿ)和3611(Wx^a)的峰值黏度较为接近。此外, 3611(Wx^a)米粉的冷胶黏度最高, 说明其蒸煮后的米饭冷却后较硬, 这与胶稠度测定结果具有很好的一致性, 也与其米饭食味值测定结果相符, 这进一步说明RVA谱的冷胶黏度越大, 对应稻米的食味品质可能越差^[4]。已有的研究发现食味品质好的稻米一般具有较大的崩解值和较小的消碱值^[24]。通过对表3中RVA谱的特征值分析, 发现与亲本3611(Wx^a)相比, NIL(Wxⁱⁿ)和NIL(Wx^b)稻米的崩解值显著提高, 而冷胶黏度和消减值显著下降, 尤其是NIL(Wx^b)稻米的崩解值最大而消减值最小。这些结果说明在3611背景中导入Wxⁱⁿ或Wx^b等位基因后, 其稻米食味品质得到了显著改良。

图4

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图4不同近等基因系稻米粉RVA谱分析

Fig. 4RVA profiles of rice flours from different near-isogenic lines



Table 3
表3
表3不同近等基因系稻米RVA特征值
Table 3Pasting properties of flours from different near-isogenic lines

品系 Line	峰值黏度 Peak viscosity (cP)	热浆黏度 Hot paste viscosity (cP)	崩解值 Breakdown (cP)	冷胶黏度 Cool paste viscosity (cP)	回复值 Setback (cP)	峰值时间 Peak time (min)	起浆温度 Peak temperature (℃)
3611(Wxa)	3143.2±35.2 b	2607.4±27.1 a	536.4±12.8 c	3960.2±31.6 a	817.6±18.6 a	6.4±0.1 a	70.80±1.1 b
NIL(Wxin)	2961.5±47.1 c	2211.5±31.1 c	750.6±9.3 b	3503.4±28.7 b	514.8±12.6 b	6.3±0.1 a	71.65±1.0 b
NIL(Wxb)	3628.5±28.3 a	2383.3±30.4 b	1245.7±10.5 a	3390.3±21.5 c	-238.7±9.5 c	6.4±0.1 a	73.25±1.0 a

Values within the same column followed by different letters are significant different at P < 0.01 and n = 2.
同列标以不同小写字母的值差异极显著(P < 0.01), n = 2。

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2.5 不同近等基因系稻米糊化特性的比较

稻米糊化温度也是评价稻米食味品质的重要指标。研究表明, ALK基因是控制糊化温度的主效基因且与Wx基因连锁^[15]。我们在近等基因构建过程中, 已经根据分子标记筛选了可能与Wx等位基因连锁导入的ALK等位基因, 排除了由ALK基因带来的可能干扰。为进一步明确不同Wx等位基因对稻米糊化温度的影响, 利用差式量热扫米仪(DSC)分析了不同稻米样品的热糊化特性。如图5所示, 尽管3个样品的吸热曲线比较相似, 但是亲本3611(Wx^a)稻米的吸热峰较为提前, 表现为起始糊化温度较低。通过热糊化参数分析(表4)可以看出, 与亲本3611(Wx^a)相比, 近等基因系NIL(Wxⁱⁿ)和NIL(Wx^b)米粉的起始糊化温度、峰值糊化温度和终止糊化温度都显著提高, 其中NIL(Wx^b)的糊化温度最高。此外, 从吸收的热量来看, NIL(Wx^b)稻米的热焓值也最高, 而3611(Wx^a)稻米最低。这些结果表明不同Wx等位基因的差异也能造成稻米糊化特性的显著改变。这与我们前期的研究结果也较为一致^[25]。

图5

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图5不同近等基因系米粉的DSC分析

Fig. 5Gelatinization of rice flours from different near-isogenic lines as determined by differential scanning calorimetry (DSC)



Table 4
表4
表4不同近等基因系稻米米粉热糊化参数
Table 4Thermal properties of rice flours from different near-isogenic lines

品系 Line	起始温度 T0 (°C)	峰值温度 Tp (°C)	终止温度 Tc (°C)	热焓值 ΔH (J G-1)
3611(Wxa)	62.89±0.21 c	67.68±0.62 c	76.54±0.31 c	6.39±0.30 c
NIL(Wxin)	63.57±0.12 b	69.53±0.70 b	77.02±0.07 b	8.01±0.10 b
NIL(Wxb)	64.86±0.41 a	71.33±0.60 a	77.91±0.46 a	8.53±0.11 a

Values within the same column followed by different letters are significant different at P < 0.01 and n = 3.
同列标以不同小写字母间差异极显著(P < 0.01), n = 3。

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2.6 不同近等基因系稻米晶体结构的比较

稻米淀粉是由直链淀粉和支链淀粉形成的半晶体复合物, 其理化特性与淀粉精细结构密切相关。我们首先利用X射线衍射仪(XRD)分析了3个近等基因系米粉样品的晶体衍射情况。如图6-A所示, 3个样品在衍射角15°、17°、18°和23°附近有较强的衍射峰, 属于谷物淀粉中典型的A类型晶体结构^[26]。从衍射曲线来看, 不同近等基因系样品间无显著差异, 但是通过结晶度计算, 发现不同样品间结晶度差异都极显著。如表5所示, NIL(Wx^b)样品的结晶度最高, 其次是NIL(Wxⁱⁿ), 亲本3611(Wx^a)样品结晶度最低。研究表明结晶度越高, 在吸热反应中所需的热量就越多^[27], 该结果能够很好地解释NIL(Wx^b)的热焓值最高而3611(Wx^a)最低。

图6

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图6不同近等基因系米粉的X射线衍射(A)和红外光谱分析(B)

Fig. 6XRD patterns (A) and FTIR spectra (B) of rice flours from different near-isogenic lines



Table 5
表5
表5不同近等基因系米粉的X射线衍射和傅里叶变换红外光谱参数
Table 5XRD and FTIR spectra parameters of rice flours from different near-isogenic lines

品系 Line	结晶度 Crystallinity (%)	峰强比值 IR ratio of 1045/1022 cm-1
3611(Wxa)	27.35±0.31 c	0.64±0.01 c
NIL(Wxin)	29.17±0.28 b	0.76±0.01 b
NIL(Wxb)	32.04±0.41 a	0.80±0.01 a

Values with in the same column followed by different letters are significant different at P < 0.01 and n = 3.
同列标以不同小写字母间差异极显著(P < 0.01), n = 3。

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傅里叶变换红外光谱技术(FTIR)能够用于精确分析淀粉晶体结构中的短程有序结构^[26]。通过计算特定波长的吸收强度比值(1045/1022 cm^-1), 可以分析淀粉分子的短程有序程度, 一般认为其比值越大, 短程有序度越高^[28]。因此, 利用该技术对不同近等基因系样品进行了分析。如图6-B所示, 3个样品的红外吸收曲线较为一致, 但是通过参数计算(1045/ 1022 cm^-1), 发现NIL(Wx^b)样品的短程有序程度最高, 其次是NIL(Wxⁱⁿ), 而最低的是受体亲本(表5)。这与XRD的分析结果完全一致, 也与我们前期通过修饰GBSSI活性而创建的具有不同AAC稻米淀粉的晶体结构分析相符合^[25]。

3 讨论

随着生活水平的提高, 消费者对于稻米品质的要求越来越高, 尤其关心稻米的食味品质。通常认为, 直链淀粉含量对于稻米食味品质的影响最大。因此, 在近些年来的稻米品质改良研究中已广泛开展了Wx等基因的分子标记辅助选择利用^[3,29]。我国目前大部分籼稻产区一般通过引入Wx^b等位基因来改良籼稻的食味品质。但是东南亚一带的优质籼稻一般携带Wxⁱⁿ, 说明该等位基因在籼稻食味品质改良中可能更有效^[30,31,32]。为系统比较Wx^a、Wxⁱⁿ和Wx^b在籼稻背景下对稻米品质的影响, 本研究构建了籼稻3611(Wx^a)背景下Wxⁱⁿ和Wx^b的近等基因系, 分析了Wxⁱⁿ等位基因在籼稻背景下对稻米食味品质的改良效应和不同Wx等位基因对稻米其他理化特性的影响。

近年来有关Wx基因的等位变异及其对稻米品质的效应研究已有很多, 如通过不同品种间的关联分析, 发现Wx基因和ALK基因是稻米蒸煮与食味品质调控网络的主效基因^[5,15,32]。此外, 基于Wx等位变异和SSI、SSIIa和SSIIIa的互作研究, 发现Wx不同等位基因类型能够协同SSI、SSIIa和SSIIIa调控稻米的理化品质, 如Wx^a等位基因是ssIIIa控制高抗性淀粉的必要条件^[33,34,35]。在品质性状全基因组关联分析研究方面, 发现Wx基因的不同等位变异位点与稻米品质的理化指标关联密切^[36,37]。为排除遗传背景干扰, Teng等^[38,39]通过染色体片段代换系分析了5个Wx自然等位变异基因的效应, 发现GBSSI活性水平与AAC及其他理化指标存在明显的相关性。本研究尽管没有进行GBSSI的活性测定, 但是对GBSSI的丰度包括游离态和淀粉粒结合态的GBSSI丰度进行了分析, 说明不同Wx等位基因所编码的GBSSI丰度无论是游离态还是淀粉粒结合态都存在显著差异, 并且与AAC呈现出明显的正相关性。我们进一步分析了不同近等基因系稻米的晶体结构, 发现AAC与稻米晶体结构存在直接的负相关性, 即AAC越高, 结晶度越低, 而结晶度又与稻米的热焓值正相关, 即较高的结晶度需要较高的热量去熔解。这些结果不仅符合之前一些有关淀粉精细结构与稻理化指标的相关性结果^[25,39], 而且更加明确了这种相关性。

截至目前, 在水稻中至少发现了8个Wx基因的等位变异类型^[2], 在非糯栽培稻中广泛分布的主要为Wx^a、Wxⁱⁿ和Wx^b。其中Wx^a主要存在于我国传统的籼稻品种中, 而Wx^b主要存在于粳稻品种中。Wxⁱⁿ等位基因目前在国内栽培水稻中分布非常稀少, 而在东南亚以及美国等地区的热带粳稻和部分籼稻中广泛存在^[30,31]。由于水稻品质遗传改良的发展, 我国目前很多籼稻品种中已经通过导入Wx^b等位基因来进行稻米品质改良^[3], 但其AAC水平在籼稻中偏低, 尤其是南方夏季高温稻区很难达到优质米的标准。本研究表明, 较Wx^b而言, 导入Wxⁱⁿ等位基因的稻米具有稍高的AAC, 稍硬的胶稠度和适中的糊化温度, 其可能在食味品质改良方面较Wx^b等位基因具有更大的潜力。近些年来的研究表明, 除了遗传因素, 环境条件也是影响稻米食味品质的众多因素之一^[40,41]。其中, 水稻灌浆结实期的高温环境是降低稻米食味品质的重要因素, 高温一方面能造成外观品质变差, 另一方面也能导致AAC下降^[13,25]。因此, 尽管通过在籼稻中引入Wx^b等位基因能够提高稻米的食味品质, 但在南方高温高湿的环境下会造成其品质表现不稳定, 高温年份品质容易变差^[41,42]。Teng等对籼稻背景下携带不同Wx等位基因的染色体片段代换系的分时播期试验, 证明携带Wx^b等位基因的稻米品质对环境改变更敏感^[38]。目前杂交籼稻也多通过引入Wx^b等位基因进行品质改良, 但我国南方地区的杂交籼稻抽穗灌浆期多位于高温频发季节, 而Wx^b相对Wx^a对高温更敏感^[43], 因此, 携带Wx^b的杂交稻米AAC会偏低, 米饭对于南方消费者而言偏软。而Wxⁱⁿ等位基因可能更适合南方地区的消费者。Wang等利用携带Wx^a、Wxⁱⁿ和Wx^b等位基因的17份亲本材料, 配制了136个杂交组合, 证明Wxⁱⁿ/Wxⁱⁿ和Wx^b/Wxⁱⁿ组合类型的杂交稻米AAC较为适中^[44], 这进一步说明Wxⁱⁿ等位基因在我国籼稻尤其是杂交籼稻品质改良方面可能更有效。

4 结论

在当下栽培稻中广泛分布的Wx^a、Wxⁱⁿ和Wx^b等位基因对稻米食味品质的效应已经非常明确, Wx^b和Wxⁱⁿ等位基因的引入能够显著改善籼稻米饭的食味品质, 其中Wxⁱⁿ在籼稻中由于能够适度提高AAC和改良米饭质地, 可能是今后籼稻尤其是杂交籼稻品质改良重点关注的等位基因。通过Wxⁱⁿ/Wxⁱⁿ或者Wx^b/Wxⁱⁿ组合来尝试杂交稻米品质改良可能是一个重要的研究方向。在稻米品质改良生产实践中, 由于地域和文化的差异, 可能需要在考虑当地消费者对米饭食味偏好性的基础上, 有针对性地引入多样化的Wx等位基因, 搭配出具有不同食味品质的组合以满足不同人群的需求。

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