李广贤¹, 姚方印², 侯恒军³, 孙召文¹, 姜明松¹, 朱文银¹, 周学标^1,*
1山东省水稻研究所, 山东济南 250100

²山东省农业科学院高新技术研究中心, 山东济南 250100

³济宁市任城区农业局, 山东济宁 272000

^* 通讯作者(Corresponding author): 周学标, E-mail: 15866620098@163.com 第一作者联系方式: E-mail: lgxrice@126.com
收稿日期:2015-03-21 接受日期:2015-05-04网络出版日期:2015-06-23基金:本研究由山东省现代农业产业技术体系水稻产业创新团队建设项目(SDAIT-01-016-01), 山东省农业良种工程项目(2013-2015)和山东省农业科学院科技创新重点项目(2014CXZ11)资助

摘要水稻叶色突变体是研究高等植物光合作用、叶绿体发育和叶绿素代谢的重要材料。从水稻转基因育种材料中国91与镇稻88的BC₄F₃后代中分离到稳定遗传的粳型黄绿叶突变体 ygl209, 与野生型亲本镇稻88相比, 突变体 ygl209在苗期、分蘖期及抽穗期叶片中叶绿素 a、叶绿素 b和类胡萝卜素含量均显著降低, 其中叶绿素 b降幅最大; 其他农艺性状中抽穗期、株高、有效穗数、主茎穗总粒数、结实率和千粒重无显著变化。遗传分析表明, ygl209的黄绿叶突变性状由1对核隐性基因控制。应用( ygl209/9311) F₂、F₃分离群体, 将 ygl209的叶色突变基因定位于第1染色体着丝粒附近571.6 kb的染色体区段内。对区段内与叶绿体发育有关的基因 LOC_Os01g31110序列测定, ygl209突变体中 LOC_Os01g31110基因的编码区1390位(位于第5外显子)上碱基由C转换成G, 使编码蛋白序列由丙氨酸(Ala)变成了甘氨酸(Gly), 推测 LOC_Os01g31110即为 ygl209的候选基因。

关键词:水稻; 黄绿叶突变体; 遗传分析; 精细定位
Genetic Analysis and Fine Mapping of Yellow-Green Leaf Mutant ygl209 in Rice
LI Guang-Xian¹, YAO Fang-Yin², HOU Heng-Jun³, SUN Zhao-Wen¹, JIANG Ming-Song¹, ZHU Wen-Yin¹, ZHOU Xue-Biao^1,*
1 Shandong Rice Research Institute, Jinan 250100, China

² High-tech Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China

³ Agricultural Bureau of Rencheng Distinct, Jining 272000, China


AbstractEtiolation mutants of rice play an important role in studies on the photosynthesis, chloroplast development, and chlorophyll metabolism in higher plants. A japonica rice mutant ygl209 with yellow-green leaf was identified from the BC₄F₃ progeny of the cross between the transgenic variety of Zhongguo 91 and Zhendao 88 with the latter as the recurrent parent. Compared with the wild-type parent Zhendao 88, the contents of chlorophyll a, chlorophyll b and carotenoid decreased dramatically in the mutant ygl209at the seedling, tillering and heading stages, respectively. In particular, chlorophyll b decreased most significantly. However, there was no significant change in other agronomic traits, such as heading stage, plant height, number of effective panicles per plant, number of grains in main stem panicle, seed setting rate and 1000-grain weight. Genetic analysis showed that the yellow-green leaf trait of the ygl209 mutant was controlled by one pair of recessive nuclear genes. With F₂ and F₃segregation populations derived from the cross between ygl209 and Zhendao 88, the YGL209 gene was mapped to the centromere region of chromosome 1, with a physical distance of 571.6 kb. We further analyzed the putative candidate genes in the target region through sequencing. A single base substitution (G1390C) was detected in the coding region of the LOC_Os01g31110 gene, which resulted in a missense mutation (A348G) in its encoded protein. Bioinformatic analysis predicted that the LOC_Os01g31110gene is related to the chloroplast development in rice. Therefore, LOC_Os01g31110 is likely to be the candidate gene of YGL209.

Keyword:Rice ( Oryza sativa L.); Yellow-green leaf mutant; Genetic analysis; Fine mapping
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叶片是植物光合作用的主要场所, 光合作用效率与叶片中叶绿体发育和叶绿素含量紧密相关, 叶绿体发育缺陷及叶绿素代谢紊乱, 均可形成典型的叶色突变体。叶色突变体是开展光合作用、叶绿体分化与发育以及光合色素代谢机制等基础研究的理想材料。
水稻叶色突变比较常见, 类型非常丰富。迄今, 已发现160多个水稻叶色突变体, 这些突变体可分为黄化、黄绿、绿黄、浅绿、绿白、白化、白翠和条纹等多种类型^[1]。遗传分析发现, 水稻叶色突变体多为核基因控制的隐性突变^{[2, 3, 4, 5]}; 关于细胞质突变及由显性基因或多基因控制的叶色突变体报道相对较少^[6]。叶色突变基因在水稻基因组中分布广泛, 目前已鉴定和定位了130多个, 其中部分已被成功克隆^[1]。已克隆的水稻叶色突变基因主要参与叶绿素的生物合成与降解以及叶绿体的形成与发育等过程。研究发现, GluRs、OsCHLH、OsCHLD/YGL98、OsCHLI/Chl9、OsDVR、OsPORA、OsPORB、YGL1、OsCAO1、OsCAO2、CBL等基因与叶绿素生物合成有关^{[7, 8, 9, 10, 11, 12, 13]}, 其突变使叶绿素合成受阻, 突变体叶片呈黄化、白化等变异类型, 植株生长受抑制; SGR、NOL、NYC1、NYC3等基因与叶绿素降解有关, 其突变减慢叶片中叶绿素的降解速度, 使植株成熟后期叶片持绿^{[14, 15, 16]}; OsCHR4、OsNUS1/V1、V2、OsClpP5、OsPPR1、YSA、OsHAP3A、OsHAP3B、OsHAP3C等基因与叶绿体发育有关^{[17, 18, 19, 20, 21, 22, 23]}, 其突变导致叶绿体发育缺陷或叶绿体功能异常, 突变体的叶色呈浅绿、白化、条纹等多种变异类型。
水稻黄绿叶突变体是叶色突变体中的常见类型。根据叶色变异发生时期, 可将其分为苗期叶色变异型、生育后期叶色变异型及全生育期叶色变异型3类。目前发现的水稻黄绿叶突变体多属于苗期叶色变异型和全生育期叶色变异型。如: D83和ygl1为苗期叶色变异型, 其叶片仅在苗期呈黄绿色, 从分蘖期开始逐渐变绿或恢复为野生型^{[3, 12]}; ygl98^[24]、ygl7^[25]、824ys^[26]、ygl80^[27]、ygl-2^[28]、507ys^[29]、ygl10^[30]、ygl4^[30]和ygl(1)^[31]均为全生育期叶色变异型, 其叶片在苗期、分蘖期及生育后期都呈黄绿色, 叶色变异表型全生育期稳定表达。上述水稻黄绿叶突变体除叶色变淡外, 多数因叶绿素含量降低, 光合能力下降, 植株生长势减弱(抽穗期延迟、分蘖减少、株高降低等)。基因定位结果表明, 水稻黄绿叶突变基因chl13(t)位于第2染色体短臂^[3], ygl98/Chl1/ygl7和chl11(t)分别位于第3染色体长臂和短臂^{[24, 25, 26]}, ygl1和ygl80位于第5染色体长臂^{[12, 27]}, ygl-2位于第6染色体长臂^[28], 507ys、ygl10和ygl4位于第10染色体长臂^{[29, 30]}, ygl(1)位于第11染色体短臂^[31]。
本研究从转基因水稻与常规水稻品种杂交的后代群体中获得1份粳稻黄绿叶突变体ygl209, 与野生型亲本(中国91和镇稻88)相比, 该突变体全生育期叶色变淡, 叶绿素和类胡萝卜素含量降低, 抽穗期、株高及产量等性状无显著变化。ygl209的黄绿叶突变性状呈单基因隐性遗传, 突变基因被定位于第1染色体着丝粒附近571.6 kb区域内, 区间内与叶绿体合成有关的基因LOC_Os01g31110可能是ygl209的候选基因。
1 材料与方法1.1 供试材料及田间试验王爱菊等^[32]采用PIG基因枪法, 将Bt基因(cry1Ab)连同抗除草剂bar基因导入粳稻品种中国91, 自交获得纯合稳定的转基因中国91系(T91)。本实验从T91与镇稻88杂交并回交-自交(轮回亲本为镇稻88)的BC₄F₃育种群体中获得一份转基因黄绿叶粳稻突变体, 经多代自交, 突变体表型稳定遗传, 田间编号为07-209, 下文简称ygl209。将ygl209分别与其野生型轮回亲本镇稻88及正常绿叶籼稻品种9311杂交, 在山东济宁播种亲本、F₁和F₂, 从苗期开始观察叶色表现, 并调查突变体ygl209及其轮回亲本镇稻88的抽穗期、株高、有效穗数、主茎穗总粒数、结实率和千粒重等主要农艺性状, 每个样本3次重复(小区), 调查样本数10株。
1.2 叶绿素和类胡萝卜素含量的测定在苗期、分蘖期及抽穗期分别选取突变体ygl209和野生型亲本镇稻88以及杂交组合ygl209/镇稻88的F₂分离群体中黄化苗单株和正常绿色单株各10株, 测定植株叶片的叶绿素和类胡萝卜素含量。从植株主茎的最上部叶、倒二叶和倒三叶上混合取0.2 g叶片, 剪碎浸泡在15 mL的80%丙酮溶液中, 于4℃避光浸提48 h, 中间振荡数次, 最后定容至25 mL。用紫外分光光度计(UV-1700)测定提取液在663、643和470 nm波长下的吸光值。按照Arnon^[33]的方法计算叶片中总叶绿素(Chl, chlorophyll)、叶绿素a (Chl a)、叶绿素b (Chl b)和类胡萝卜素(Caro)的含量。
Chl a含量(mg g^-1) = (12.72 OD₆₆₃ - 2.59 OD₆₄₅)V/ 1000W
Chl b含量(mg g^-1) = (22.88 OD₆₄₅- 4.67 OD₆₆₃)V/ 1000W
Caro含量(mg g^-1) = (1000 OD₄₇₀- 3.27 Chl a - 104 Chl b)V/(1000W* 229)
Chl含量(mg g^-1) = Chl a + Chl b = (20.29 OD₆₄₅+8.05 OD₆₆₃)V/l000W
式中OD指测定波长下的吸光值; V指叶绿素提取液总体积(mL); W指材料鲜重(g)。
1.3 突变性状的遗传分析应用杂交组合ygl209/镇稻88和ygl209/9311的F₂分离群体对ygl209的黄绿叶突变性状进行遗传分析。为了验证该突变是否由T-DNA插入引起, 应用浓度为1 g L^-1的除草剂Basta溶液涂抹上述F₂群体各单株叶片, 通过叶色变化对选择标记Bar基因进行检测。除此之外, 以Bt-F (5'-GGACAACAACCCAAACATCAAC-3')和Bt-R (5'-GA ATCCAGGAGAACATAGGAG-3')为引物对群体单株中的Bt基因(cry1Ab)进行特异性PCR扩增, 预期产物大小为1368 bp, 25 µ L反应体系, 94℃预变性5 min, 35个循环(94℃ 1 min、57℃ 1 min、72℃ 1 min), 最后72℃延伸10 min, 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙锭染色后紫外灯下观察。
1.4 突变性状基因定位与候选基因分析采用BAS (Bulked segregate analysis)法, 从ygl209/ 9311的F₂群体中分别选择黄绿叶突变单株和正常绿叶单株各10株, 提取各单株的DNA并等量混合, 构建黄绿叶突变池和正常表型池; 利用SSR标记对分离群体的亲本进行多态性分析, 然后利用筛选出的多态性标记检测2个基因池, 找出与目标基因连锁的标记。
从ygl209/9311的F₂群体中选择突变性状的植株(112株), 应用目标基因的连锁标记对突变基因进行初定位。根据基因初定位结果, 从ygl209/9311的F₂群体中选择目标基因染色体区段为杂合的单株, 自交后发展F₃的分离群体(10 100株), 从中选择突变性状单株, 对目标基因进行精细定位。依据Zhang等^[34]方法计算标记与目的基因的重组率, 确定目标基因所在的染色体区间。
1.5 候选基因预测利用水稻基因注释网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/), 对目的基因所在的染色体区段进行候选基因预测。利用软件Primer Premier 5.0设计引物, 分段扩增候选基因的基因组序列, 将扩增产物送山东省农业科学院生物测序中心测序, 测序结果经DNAstar (V5.0)软件分析和拼接, 同时通过DNAMAN 6.0.3.99软件进行基因序列比对。

2 结果与分析2.1 突变体ygl209的表型特征 突变体ygl209与野生型亲本中国91、转基因株系T91及轮回亲本镇稻88相比, 其典型特征是突变体的所有叶片颜色变淡, 全生育期表现为黄绿色(图1)。突变体植株的抽穗期、株高、每株有效穗数、主茎穗总粒数、结实率和千粒重与轮回亲本镇稻88相比均无显著差异(表1), 推测此突变体的叶色变异可能对株高及产量不会产生显著影响。
2.2 黄绿叶突变体的叶绿素含量在苗期、分蘖期和抽穗期, 突变体ygl209的光合色素含量与对照镇稻88相比显著下降, 其中类胡萝卜素含量减少15.38%~39.47%, 叶绿素含量减少29.81%~40.10% (表2), 其中叶绿素b含量降低的幅度较大, 叶绿素a含量比野生型亲本减少12.71%~25.11%, 而叶绿素b含量减少大于50% (53.44%~58.86%), 叶绿素a含量与叶绿素b含量的比值则由野生型亲本的 1.25~1.54增加到2.28~2.66。由此推测, 上述黄化突变性状可能是由光合色素含量下降引起, 其中叶绿素b含量的大幅度降低可能起更重要的作用。
2.3 黄绿叶突变性状的遗传分析以突变体ygl209为母本, 轮回亲本镇稻88和籼稻品种9311为父本, 分别配制了杂交组合。表型分析表明两杂交组合的F₁均表现正常绿色, 无黄绿叶突变现象; 在F₂群体中均出现了正常绿色与黄绿叶突变单株的分离, 且正常绿色单株数与黄绿叶突变单株数都呈孟德尔的3:1理论分离比(χ ²< χ ²_{0.05, 1}=3.84, 表3), 说明ygl209的黄绿叶突变性状由1对隐性核基因控制。
图1
Fig. 1

	Figure OptionViewDownloadNew Window
	图1 野生型亲本与突变体ygl209在苗期(A)、分蘖期(B)和抽穗期(C)的植株形态 图片左侧均为野生型亲本(深绿色), 右侧为突变体ygl209 (黄绿色)。Fig. 1 Plant phenotype of the wild type parents and the mutant ygl209 at seedling (A), tillering (B), and heading (C) stages The wild type parents (dark green leaf) and the mutant ygl209 (yellow green leaf) were on the left and right of the photos, respectively.

表1
Table 1
表1(Table 1)

表1 突变体ygl209与其野生型亲本镇稻88的性状比较 Table 1 Comparison of traits between the mutant ygl209 and its wild type parent Zhendao 88 性状 Trait ygl209 镇稻88 Zhendao 88 (CK) 比对照增减 Compared to CK (%) 抽穗期 Heading stage (d) 151± 3.5 150± 1.9 -0.7 (ns) 株高 Plant height (cm) 97± 3.5 96± 1.8 -1.0 (ns) 每株有效穗数 No. of effective panicles per plant 13± 2.7 14± 3.6 7.1 (ns) 主茎穗总粒数 No. of grains in main stem panicle 141± 6.8 136± 5.2 -3.7 (ns) 结实率 Seed-setting rate (%) 89± 3.4 91± 2.1 2.2 (ns) 千粒重 1000-grain weight (g) 26.7± 0.2 27.0± 0.1 1.1 (ns) ns: not significant at P< 0.05. ns表示在P< 0.05水平差异不显著。

表1 突变体ygl209与其野生型亲本镇稻88的性状比较 Table 1 Comparison of traits between the mutant ygl209 and its wild type parent Zhendao 88

表2
Table 2
表2(Table 2)

表2 突变体与野生型植株中光合色素含量 Table 2 Photosynthetic pigment contents in plants between mutant and wild type plant 生育期 Growth stage 材料 Material 叶绿素 Chl (mg g-1) 叶绿素a Chl a (mg g-1) 叶绿素b Chl b(mg g-1) 叶绿素a/b Chl a/b β -胡萝卜素 β -Car (mg g-1 ) 苗期 Seedling stage ygl209 2.19± 0.03 1.58± 0.00 0.61± 0.01 2.61± 0.02 0.55± 0.01 镇稻88 Zhendao 88 (CK) 3.12± 0.01 1.81± 0.01 1.31± 0.02 1.37± 0.03 0.65± 0.00 比CK增减 Compared to CK -29.81%* * -12.71%* * -53.44%* * 90.51%* * -15.38%* * 分蘖期 Tillering stage ygl209 2.45± 0.01 1.78± 0.01 0.67± 0.04 2.66± 0.01 0.46± 0.01 镇稻88 Zhendao 88 (CK) 3.59± 0.00 2.18± 0.03 1.41± 0.03 1.54± 0.01 0.76± 0.03 比CK增减 Compared to CK -31.75%* * -18.35%* * -52.48%* * 72.73%* * -39.47%* * 抽穗期 Heading stage ygl209 2.36± 0.01 1.64± 0.03 0.72± 0.00 2.28± 0.01 0.51± 0.01 镇稻88 Zhendao 88 (CK) 3.94± 0.01 2.19± 0.00 1.75± 0.01 1.25± 0.02 0.81± 0.01 比CK增减 Compared to CK -40.10%* * -25.11%* * -58.86%* * 82.40%* * -37.04%* * * * Significant at P< 0.01. * * 表示在P< 0.01水平差异显著。

表2 突变体与野生型植株中光合色素含量 Table 2 Photosynthetic pigment contents in plants between mutant and wild type plant

表3
Table 3
表3(Table 3)

表3 突变体ygl209与正常绿色品种杂交F2的叶色分离 Table 3 Segregation of leaf color in F2population of the crosses between ygl209and normal rice 群体 Combination 总株数 Total number of plants 绿叶株数 No. of green plants 黄绿叶株数 No. of yellow green plants χ 2 (3:1) ygl209/ Zhendao 88 801 609 192 0.453 ygl209/ 9311 433 321 112 0.173

表3 突变体ygl209与正常绿色品种杂交F2的叶色分离 Table 3 Segregation of leaf color in F2population of the crosses between ygl209and normal rice

应用除草剂Basta溶液涂抹ygl209/镇稻88和ygl209/9311的F₂群体各单株叶片, 对选择标记基因Bar检测。发现, Basta抗性和黄叶突变性状各自独立分离, 不存在共分离关系。提取分离群体中黄绿叶突变单株的基因组DNA, 以此为模板对Bt基因(cry1Ab)进行PCR扩增, 结果显示该突变性状与Bt基因也不存在共分离关系(图2)。上述分析表明该叶色突变不是由T-DNA插入引起的。
图2
Fig. 2

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图2 cry1Ab基因的PCR扩增 M为1 kb DNA ladder marker; 1~10为杂交组合ygl209/镇稻88和ygl209/9311的F2群体中黄绿叶突变单株, 其中1~3及6~8来源于ygl209/镇稻88群体, 4、5、9和10来源于ygl209/9311群体; P1~P3分别为ygl209、镇稻88和9311。Fig. 2 PCR amplification of cry1Ab M: 1 kb DNA ladder marker; 1-10: the mutant individuals in F2 segregation populations, among them, 1-3 and 6-8 were derived from cross combination ygl209/Zhendao88 and others (4, 5, 9, and 10) were derived from cross combination ygl209/9311; P1-P3: ygl209, Zhendao 88, and 9311, respectively.

2.4 黄绿叶突变基因的分子标记定位及候选基因分析2.4.1 突变基因的分子标记定位 根据McCouch等^[35]构建的水稻SSR标记遗传图谱, 从水稻12条染色体上均匀选取337个SSR标记, 对ygl209/9311的杂交组合亲本进行PCR多态性检测, 结果有71个标记在两亲本间呈现明显的多态性, 应用这些多态性标记分析黄绿叶突变表型和正常绿色表型植株DNA池的多态性。结果表明, 位于第1染色体着丝粒附近的标记RM446在两池间表现出明显的多态性, 其中黄绿叶池的带型与突变体ygl209的带型相同。应用RM446分析了ygl209/9311的F₂群体中的112个突变型单株的基因型, 检测结果显示所有单株的带型都与ygl209相同, 说明黄叶突变基因与RM446紧密连锁。根据前人构建的水稻遗传和物理图谱^{[35, 36]}, 在RM446两侧又选取了75个SSR标记, 其中28个在ygl209和9311之间有多态性, 应用这28对多态性标记, 分析了上述112个突变单株的基因型。经重组分析, 目标基因ygl209被定位于RM10926和RM11012之间(图3-A)。
次年, 从ygl209/9311的F₂群体中选择突变基因ygl209所在的染色体区段呈杂合的野生型绿叶单株, 自交发展F₃群体。共种植F₃群体10 100株, 其中野生绿叶单株7605株, 黄绿叶突变单株2495株, 也呈孟德尔的3:1理论分离比例(χ ²=0.475< χ ²_{0.05, 1}=3.84), 进一步证实此黄叶突变性状由1对隐性单基因控制。应用介于RM10926与RM11012之间的多态性标记对2495株黄绿叶突变单株进连锁分析, 最终将突变基因YGL209定位于着丝粒附近RM10973和RM466之间约571.6 kb的染色体区段内(图3-B)。
2.4.2 候选基因预测 利用水稻基因组注释网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/), 对ygl209基因所在区域的571.6 kb序列进行候选基因分析。共预测了此染色体区间内76个编码基因, 其中47个基因与转座子有关(46个编码逆转录转座子蛋白, 1个编码转座子蛋白), 在其余29个非转座子基因中, LOC_Os01g31110基因预测编码CRS2-associated factors 1, 该蛋白因子可能参与叶绿体发育(表4)。LOC_Os01g31110基因全长3804 bp, 包含5个外显子和4个内含子, 编码蛋白含有701个氨基酸(图3-C)。根据LOC_Os01g31110的基因组序列, 我们设计了测序引物(表5), 对野生型亲本(中国91和镇稻88)和突变体ygl209中的LOC_Os01g31110的基因组序列进行扩增并测序。测序结果表明在突变体中LOC_Os01g31110基因的编码区有1处SNP变异, 即编码区1390位(位于第5外显子)上碱基C转换成碱基G, 此处变异导致编码蛋白的氨基酸序列第463位的丙氨酸(Ala)变成了甘氨酸(Gly)(图4)。LOC_Os01g31110可能是造成ygl209黄绿叶突变性状的候选基因。
图3
Fig. 3

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图3 黄绿叶突变体ygl209基因的分子定位及候选基因预测 A: ygl209基因初定位; B: ygl209基因精细定位; C: 预测的候选基因; SSR标记的物理位置来源于Gramene网站(http://www.gramene.org/)检索到的数据(2014年10月)。Fig. 3 Molecular mapping and candidate genes prediction of mutant ygl209 A: preliminary mapping of ygl209; B: fine mapping of ygl209; C: candidate genes prediction; the physical positions of the markers were derived from Gramene (http://www.gramene.org/) on October, 2014.

表4
Table 4
表4(Table 4)

表4 定位区间内的编码基因及其推测功能 Table 4 Annotated genes and their putative functions in the target interval 基因名称 Gene name 推测功能 Putative function LOC_Os01g29820.1 Expressed protein LOC_Os01g29830.1 Expressed protein LOC_Os01g29850.1 Expressed protein LOC_Os01g29840.1 No apical meristem protein, putative, expressed LOC_Os01g29860.1 Expressed protein LOC_Os01g29890.1 Expressed protein LOC_Os01g29870.1 Multidrug resistance protein 9, putative, expressed LOC_Os01g31050.1 Expressed protein LOC_Os01g31090.1 Expressed protein LOC_Os01g30970.1 PMR5, putative, expressed LOC_Os01g31270.1 Annexin, putative, expressed LOC_Os01g31110.1 CRS2-associated factor 1, chloroplast precursor, putative, expressed LOC_Os01g31170.1 Expressed protein LOC_Os01g31140.1 Hypothetical protein LOC_Os01g31220.1 Expressed protein LOC_Os01g31210.1 Expressed protein LOC_Os01g31124.1 Expressed protein LOC_Os01g31270.1 Annexin, putative, expressed LOC_Os01g31370.1 Glycosyltransferase, putative, expressed LOC_Os01g31360.2 Expressed protein LOC_Os01g31280.1 Expressed protein LOC_Os01g31310.1 Expressed protein LOC_Os01g31580.1 BZIP protein, putative, expressed LOC_Os01g31560.1 Expressed protein LOC_Os01g31494.1 Expressed protein LOC_Os01g31470.1 Mov34/MPN/PAD-1 family protein, expressed LOC_Os01g31570.1 Expressed protein LOC_Os01g31520.1 Expressed protein LOC_Os01g31310.1 Expressed protein

表4 定位区间内的编码基因及其推测功能 Table 4 Annotated genes and their putative functions in the target interval

表5
Table 5
表5(Table 5)

表5 LOC_Os01g31110基因测序所用引物 Table 5 Primers used for sequencing of LOC_Os01g31110 引物名称 Name of primers 引物序列 Sequence of primer (5'-3') LOC_Os01g31110-F1 TACATTCCCGTGTTTGTCTGCTC LOC_OS01G31110-R1 TCCATCCCCTTCCTTGTTAAAAC LOC_OS01G31110-F2 ATATTTTGTTATTATACTCACCGATCACC LOC_OS01G31110-R2 CCTATTTTGGACATTACTCTTGGCT LOC_OS01G31110-F3 CCACATTAGCCCATCTTCTTGC LOC_OS01G31110-R3 TGAATCTCATCACTGCTGCCC LOC_OS01G31110-F4 CATTGTATTGCCAAAGCTCCCT LOC_OS01G31110-R4 GCTTCGCCGTTCCATATTATTAC

表5 LOC_Os01g31110基因测序所用引物 Table 5 Primers used for sequencing of LOC_Os01g31110

图4
Fig. 4

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	图4 LOC_Os01g31110的序列及其编码产物差异 A: LOC_Os01g31110 编码区的DNA序列差异; B: LOC_Os01g31110编码的氨基酸序列差异。Fig. 4 Sequences and the encoded amino acid difference of LOC_Os01g31110 A, B: the variations of LOC_Os01g31110 in the code region and amino acid sequences, respectively.

3 讨论目前报道的黄绿叶突变基因多数与叶绿素合成有关, 因突变体叶片中叶绿素合成受阻, 叶绿素含量下降, 光合能力降低, 最终导致突变体生长势减弱。例如, 黄绿叶突变体cde1(t)中因谷酰基tRNA合成酶基因GluRs突变, 导致叶绿素生物合成受阻, 植株在高温时叶绿素缺乏, 株高变矮, 抽穗延迟^[7]; 黄绿叶突变体oschlh、chl1和chl9因编码Mg-螯合酶亚基的基因OsCHLH、OsCHLD和OsCHLI突变, 造成Mg螯合酶的活性降低, 类囊体叶绿素合成减少, 类囊体膜发育不完全, 植株生长缓慢^{[8, 9]}; 自然黄化突变体OsDVR因编码联乙烯还原酶基因OsDVR突变, 影响了叶绿素合成过程中联乙烯叶绿素a转化为单乙烯叶绿素a, 植株叶片呈黄绿色, 叶绿素含量降低, 植株生长受抑制^[10]; 因编码叶绿素a加氧酶基因OsCAO1、OsCAO2和CBL突变而产生的突变体也表现叶色淡黄绿色、株高变矮^[13]。本研究中突变体ygl209全生育期叶色呈黄绿色, 叶片中叶绿素含量下降, 但突变体的抽穗期、株高、有效穗数、主茎穗总粒数、结实率和千粒重等性状与野生型亲本相比无显著变化(表1)。由此推测ygl209黄绿叶突变体具有相对稳定的光合机构和较强的光合效率, 其黄绿叶性状对水稻其他农艺性状不产生负面影响。若将突变体ygl209中的黄绿叶突变基因引入不育系, 其叶色标记可用于快速准确地鉴定杂交稻种子中的不育系, 提高杂交稻种子纯度。YGL209基因优于其他叶色突变基因, 即该基因不抑制植株生长, 在杂交稻繁、制种过程中不会对产量产生较大的负效应, 因此ygl209突变基因在杂交稻育种中将有更好的应用前景。
植物叶绿体为半自主性细胞器, 影响叶绿体发育的蛋白由叶绿体基因和核基因共同编码, 编码叶绿体蛋白的核基因通过转录、翻译、蛋白加工和运输, 参与叶绿体结构的形成、光合色素代谢以及叶绿体基因的表达调控等过程, 该过程中任何基因发生突变, 都可能产生叶色变异。应用水稻叶色突变体, 研究者发现基因OsNUS1/V1编码叶绿体蛋白质NUS1, 参与叶绿体RNA的代谢调控^[18]; V2编码一个新型鸟苷酸激酶GK (pt/mtGK), 控制水稻叶绿体分化早期质体遗传系统中质体转录本的翻译^[19]; OsClpP5编码叶绿体蛋白酶, 控制水稻特定发育时期正常生长^[20]; YSA基因编码PPR蛋白, 调控叶绿体基因的表达^[22]; OsCHR4基因编码一个染色质重构因子(类Mi-2蛋白), 影响水稻近轴端叶肉细胞叶绿体的发育^[17]; NTRC编码水稻叶绿体NADPH硫氧还蛋白还原酶, 参与硫氧化蛋白转录后蛋白质活化^[37]; OsHAP3B和OsHAP3C分别编码CAAAT-box结合复合体HAP3亚基, 控制叶绿体核编码基因的表达^[23]。本研究中, 黄绿叶突变基因ygl209 位于水稻第1染色体着丝粒区域, 未见该染色体区域有其他叶色突变基因被克隆的报道, 推测ygl209可能是一个新的叶色突变位点。在ygl209突变体中, 与叶绿体合成与发育有关的基因LOC_Os01g31110的编码区1390位(位于第5外显子)上碱基C转换为碱基G, 导致编码蛋白的氨基酸序列第463位的丙氨酸(Ala)变成了甘氨酸(Gly)(图4)。在玉米和拟南芥中, LOC_Os01g31110的同源基因编码CAF1 (CRS2-associated factors 1)蛋白, CAF1与叶绿体RNA剪接蛋白2 (chloroplast RNA splicing 2, CRS2)形成复合体促进叶绿体中II类内含子剪接^{[38, 39]}。由此推测, 基因LOC_Os01g31110是造成ygl209黄绿叶突变性状的候选基因, 该基因也可能通过叶绿体中II类内含子剪接调控水稻叶绿体的发育。后续研究将通过基因功能互补试验, 进一步验证候选基因LOC_Os01g31110在水稻突变株中的作用机制。
The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。


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[1]	邓晓娟, 张海清, 王悦, 舒志芬, 王国槐, 王国梁. 水稻叶色突变基因研究进展. 杂交水稻, 2012, 25(5): 9-14 Deng X J, Zhang H Q, Wang Y, Shu Z F, Wang G H, Wang G L. Research advances on rice leaf-color mutant genes. Hybrid Rice, 2012, 25(5): 9-14 (in Chinese with English abstract)[本文引用:2]
[2]	朱丽, 刘文真, 吴超, 栾维江, 傅亚萍, 胡国成, 斯华敏, 孙宗修. 水稻着丝粒附近一个淡绿叶突变相关基因的定位分析. 中国水稻科学, 2007, 21: 228-234 Zhu L, Liu W Z, Wu C, Luan W J, Fu Y P, Hu G C, Si H M, Sun Z X. Identification and fine mapping of a gene related to pale green leaf near centromere region in rice (Oryza sativa L. ). Chin J Rice Sci, 2007, 21: 228-234 (in Chinese with English abstract)[本文引用:1]
[3]	李秀兰, 孙小秋, 王平荣, 周慧, 邓晓建. 一个新的水稻黄绿叶突变体的遗传分析与基因定位. 作物学报, 2010, 36: 1050-1054 Li X L, Sun X Q, Wang P R, Zhou H, Deng X J. Genetic analysis and gene mapping of a novel yellow-green leaf mutant in rice. Acta Agron Sin, 2010, 36: 1050-1054 (in Chinese with English abstract)[本文引用:3]
[4]	许凤华, 程治军, 王久林, 吴自明, 孙伟, 张欣, 雷财林, 王洁, 吴赴清, 郭秀平, 刘玲珑, 万建民. 水稻白条纹叶Gws基因的精细定位与遗传分析. 作物学报, 2010, 36: 713-720 Xu F H, Cheng Z J, Wang J L, Wu Z M, Sun W, Zhang X, Lei C L, Wang J, Wu F Q, Guo X P, Liu L L, Wan J M. Genetic analysis and fine-mapping of Gws gene using green-white-stripe rice mutant. Acta Agron Sin, 2010, 36: 713-720 (in Chinese with English abstract)[本文引用:1]
[5]	张力科, 李志彬, 刘海燕, 李如海, 陈满元, 陈爱国, 钱益亮, 华泽田, 高用明, 朱苓华, 黎志康. 两个新的水稻叶色突变体形态结构与遗传定位研究. 中国农业科学, 2010, 43: 223-229 Zhang L K, Li Z B, Liu H Y, Li R H, Chen M Y, Chen A G, Qian Y L, Hua Z T, Gao Y M, Zhu L H, Li Z K. Study on morphological structure and genetic mapping of two novel leaf color mutants in rice. Sci Agric Sin, 2010, 43: 223-229 (in Chinese with English abstract)[本文引用:1]
[6]	李育红, 王宝和, 戴正元, 李爱宏, 赵步洪, 左示敏, 陈忠祥, 张洪熙, 潘学彪. 水稻叶色突变体及其基因定位、克隆的研究进展. 江苏农业科学, 2011, 39(2): 34-39 Li Y H, Wang B H, Dai Z Y, Li A H, Zhao B H, Zuo S M, Chen Z X, Zhang H X, Pan X B. Advance in gene mapping and cloning of leaf color mutants in rice. Jiangsu Agric Sci, 2011, 39(2): 34-39 (in Chinese)[本文引用:1]
[7]	Liu W Z, Fu Y P, Hu G C, Si H M, Zhu L, Wu C, Sun Z X. Identification and fine mapping of a thermo-sensitive chlorophyll deficient mutant in rice (Oryza sativa L. ). Planta, 2007, 226: 785-795[本文引用:2]
[8]	Jung K H, Hur J, Ryu C H, Choi Y, Chung Y Y, Miyao A, Hirochika H, An G. Characterization of a rice chlorophyll- deficient mutant using the T-DNA gene-trap system. Plant Cell Physiol, 2003, 44: 463-472[本文引用:2]
[9]	Zhang H T, Li J J, Yoo J H, Yoo S C, Cho S H, Koh H J, Seo H S, Paek N C. Rice Chlorina-1 and Chlorina-9 encode ChlD and ChlI subunits of Mg-chelatase, a key enzyme for chlorophyll synthesis and chloroplast development. Plant Mol Biol, 2006, 62: 325-337[本文引用:2]
[10]	Wang P R, Gao J X, Wan C M, Zhang F T, Xu Z J, Huang X Q, Sun X Q, Deng X J. Divinyl chlorophyll(ide) a can be converted to monovinyl chlorophyll(ide) a by a divinyl reductase in rice. Plant Physiol, 2010, 153: 994-1003[本文引用:2]
[11]	Sakuraba Y, Rahman M L, Cho S H, Kim Y S, Koh H J, Yoo S C, Peak N C. The rice faded green leaf locus encodes protochlorophyllide oxidoreductase B and is essential for chlorophyll synthesis under high light conditions. Plant J, 2013, 74: 122-133[本文引用:1]
[12]	Wu Z M, Zhang X, He B, Diao L P, Sheng S L, Wang J L, Guo X P, Su N, Wang L F, Jiang L, Wang C M, Zhai H Q, Wan J M. A chlorophyll-deficient rice mutant with impaired chlorophyllide esterification in chlorophyll biosynthesis. Plant Physiol, 2007, 145: 29-40[本文引用:3]
[13]	Lee S, Kim J H, Yoo E S, Lee C H, Hirochika H, An G. Differential regulation of chlorophyll a oxygenase genes in rice. Plant Mol Biol, 2005, 57: 805-818[本文引用:2]
[14]	Jiang H W, Li M R, Liang N T, Yan H B, Wei Y B, Xu X L, Liu J, Xu Z F, Chen F, Wu G J. Molecular cloning and function analysis of the stay green gene in rice. Plant J, 2007, 52: 197-209[本文引用:1]
[15]	Sato Y, Morita R, Katsuma S, Nishimura M, Tanaka A, Kusaba M. Two short-chain dehydrogenase/reductases, NON-YELLOW COLORING 1 and NYC1-LIKE, are required for chlorophyll b and light-harvesting complex II degradation during senescence in rice. Plant J, 2009, 57: 120-131[本文引用:1]
[16]	Morita R, Sato Y, Masuda Y, Nishimura M, Kusaba M. Defect in non-yellow coloring 3, an α/β hydrolase-fold family protein, causes a stay-green phenotype during leaf senescence in rice. Plant J, 2009, 59: 940-952[本文引用:1]
[17]	Zhao C F, Xu J M, Chen Y, Mao C Z, Zhang S L, Bai Y H, Jiang D, Wu P. Molecular cloning and characterization of OsCHR4, a rice chromatin-remodeling factor required for early chloroplast development in adaxial mesophyll. Planta, 2012, 36: 1165-1176[本文引用:2]
[18]	Kusumi K, Sakata C, Nakamura T, Kawasaki S, Yoshimura A, Iba K. A plastid protein NUS1 is essential for build-up of the genetic system for early chloroplast development under cold stress conditions. Plant J, 2011, 68: 1039-1050[本文引用:2]
[19]	Sugimoto H, Kusumi K, Tozawa Y, Yazaki J, Kishimoto N, Kikuchi S, Iba K. The virescent-2 mutation inhibits translation of plastid transcripts for the plastid genetic system at an early stage of chloroplast differentiation. Plant Cell Physiol, 2004, 45: 985-996[本文引用:2]
[20]	Tsugane K, Maekawa M, Takagi K, Takahara H, Qian Q, Eun C H, Iida S. An active DNA transposon nDart causing leaf variegation and mutable dwarfism and its related elements in rice. Plant J, 2006, 45: 46-57[本文引用:2]
[21]	Gothand am K M, Kim E S, Cho H, Chung Y Y. OsPPR1, a pentatricopeptide repeat protein of rice is essential for the chloroplast biogenesis. Plant Mol Biol, 2005, 58: 421-433[本文引用:1]
[22]	Su N, Hu M L, Wu D X, Wu F Q, Fei G L, Lan Y, Chen X L, Shu X L, Zhang X, Guo X P, Cheng Z J, Lei C L, Qi C K, Jiang L, Wang H Y, Wan J M. Disruption of a rice pentatricopeptide repeat protein causes a seedling-specific albino phenotype and its utilization to enhance seed purity in hybrid rice production. Plant Physiol, 2012, 159: 227-238[本文引用:2]
[23]	Miyoshi K, Ito Y, Serizawa A, Kurata N. sHAP3 genes regulate chloroplast biogenesis in rice. Plant J, 2003, 36: 532-540[本文引用:2]
[24]	孙小秋, 王兵, 肖云华, 万春美, 邓晓建, 王平荣. 水稻ygl98黄绿叶突变基因的精细定位与遗传分析. 作物学报, 2011, 37: 991-997 Sun X Q, Wang B, Xiao Y H, Wan C M, Deng X J, Wang P R. Genetic analysis and fine-mapping of ygl98 yellow-green leaf gene in rice. Acta Agron Sin, 2011, 37: 991-997[本文引用:2]
[25]	Deng X J, Zhang H Q, Wang Y, He F, Liu J L, Xiao X, Shu Z F, Li W, Wang G H, Wang G L. Mapped clone and functional analysis of leaf-color gene Ygl7 in a rice hybrid (Oryza sativa L. ssp. indica). PLoS One, 2014, 9: e99564[本文引用:2]
[26]	黄晓群, 王平荣, 赵海新, 邓晓建. 一个新的水稻叶绿素缺失突变基因的遗传分析和分子标记定位. 中国水稻科学, 2007, 21: 355-359 Huang X Q, Wang P R, Zhao H X, Deng X J. Genetic analysis and molecular mapping of a novel chlorophyll deficit mutant gene in rice. Chin J Rice Sci, 2007, 21: 355-359[本文引用:2]
[27]	李燕群, 高家旭, 肖云华, 李秀兰, 蒲翔, 孙昌辉, 王平荣, 邓晓建. 水稻ygl80黄绿叶突变体的遗传分析与目标基因精细定位. 作物学报, 2014, 40: 644-649 Li Y Q, Gao J X, Xiao Y H, Li X L, Pu X, Sun C H, Wang P R, Deng X J. Genetic analysis and gene fine mapping of yellow-green leaf mutant ygl80 in rice. Acta Agron Sin, 2014, 40: 644-649[本文引用:2]
[28]	王军, 王宝和, 周丽慧, 徐洁芬, 顾铭洪, 梁国华. 一个水稻新黄绿叶突变体基因的分子定位. 中国水稻科学, 2006, 20: 455-459 Wang J, Wang B H, Zhou L H, Xu J F, Gu M H, Liang G H. Genetic analysis and molecular mapping of a new yellow-green leaf gene ygl-2 in rice. Chin J Rice Sci, 2006, 20: 455-459[本文引用:2]
[29]	李燕群, 蒲翔, 李春梅, 钟萍, 孙昌辉, 李秀兰, 邓晓建, 王平荣. 水稻507ys黄绿叶突变体的遗传鉴定与候选基因分析. 中国农业科学, 2014, 47: 221-229 Li Y Q, Pu X, Li C M, Zhong P, Sun C H, Li X L, Deng X J, Wang P R. Genetic identification and cand idate gene analysis of yellow-green leaf mutant 507ys in rice. Sci Agric Sin, 2014, 47: 221-229[本文引用:2]
[30]	杨海莲, 刘敏, 郭旻, 李荣德, 张宏根, 严长杰. 一个水稻黄绿叶突变体ygl10的遗传分析和基因定位. 中国水稻科学, 2014, 28: 41-48 Yang H L, Liu M, Guo M, Li R D, Zhang H G, Yan C J. Genetic analysis and position cloning of a yellow-green leaf ygl10 gene, responsible for leaf colour in rice. Chin J Rice Sci, 2014, 28: 41-48[本文引用:3]
[31]	邓晓梅, 叶胜海, 修芬连, 周涯, 尚海漩, 纪现军, 刘继云, 陈萍萍, 金庆生, 张小明. 一个水稻黄绿叶突变性状的遗传分析及基因定位. 核农学报, 2012, 26: 203-209 Deng X M, Ye S H, Xiu F L, Zhou Y, Shang H X, Ji X J, Liu J Y, Chen P P, Jin Q S, Zhang X M. Genetic analysis and gene fine mapping for mutation of yellow-green leaf in rice. Acta Agric Nucl Sin, 2012, 26: 203-209[本文引用:2]
[32]	王爱菊, 姚方印, 温孚江, 朱常香, 李广贤, 杨磊, 朱其松, 张洪瑞. 利用Bt基因和Xa21基因转化获得抗螟虫、白叶枯病的转基因水稻. 作物学报, 2002, 28: 857-860 Wang A J, Yao F Y, Wen F J, Zhu C X, Li G X, Yang L, Zhu Q S, Zhang H R. Obtaining of transgenic rice plants resistant to both stem borer and bacterial blight disease from Bt and Xa21 genes transforming. Acta Agron Sin, 2002, 28: 857-860 (in Chinese with English abstract)[本文引用:1]
[33]	Arnon D I. Copper enzymes in isolated chloroplasts: polyphenoloxidase in Beta vulgaris. Plant Physiol, 1949, 24: 1-15[本文引用:1]
[34]	Zhang Q, Shen B Z, Dai X K, Mei M H, Saghai Maroof M A, Li Z B. Using bulked extremes and recessive class to map genes for photoperiod-sensitive genic male sterility in rice. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91: 8675-8679[本文引用:1]
[35]	McCouch S R, Teytelman L, Xu Y B, Lobos B K, Clare K, Walton M, Fu B, Maghirang R, Li Z, Xing Y, Zhang Q, Kono I, Yano M, Fjellstrom R, DeClerck G, Schneider D, Cartinhour S, Ware D, Stein L. Development and mapping of 2240 new SSR markers for rice (Oryza sativa L. ). DNA Res, 2002, 9: 199-207[本文引用:2]
[36]	Matsumoto T, Wu J Z, Kanamori H, Katayose Y. The map-based sequence of the rice genome. Nature, 2005, 436: 793-800[本文引用:1]
[37]	Pérez-Ruiz J M, Spínola M C, Kirchsteiger K, Moreno J, Sahrawy M, Cejudo F J. Rice NTRC is a high-efficiency redox system for chloroplast protection against oxidative damage. Plant Cell, 2006, 18: 2356-2368[本文引用:1]
[38]	Ostheimer G J, Hadjivassiliou H, Kloer D P, Barkan A, Matthews B W. Structural analysis of the group II intron splicing factor CRS2 yields insights into its protein and RNA interaction surfaces. J Mol Biol, 2005: 345: 51-68[本文引用:1]
[39]	Ostheimer G J, Rojas M, Hadjivassiliou H, Barkan A. Formation of the CRS2-CAF2 group II intron splicing complex is mediated by a 22-amino acid motif in the COOH-terminal region of CAF2. J Biol Chem, 2006, 281: 4732-4738[本文引用:1]