巫桂芬^1,2, 徐鲜均³, 徐建堂¹, 陶爱芬¹, 张立武¹, 魏丽真⁴, 潘漠⁵, 方平平¹, 林荔辉¹, 祁建民^1,*
1福建农林大学 / 作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室 / 福建省作物设计育种重点实验室 /福建省南方特色经济作物遗传育种与多用途综合利用国际合作基地, 福建福州350002

² 广西农业科学院园艺研究所, 广西南宁530007

³武夷山生物资源研究所, 福建武夷山 3543004

⁴ 福州市第三中学, 福建福州 350002

⁵ 福州天地同人信息科技有限公司, 福建福州350001

^* 通讯作者(Corresponding author): 祁建民, E-mail: qijm863@163.com, Tel: 0591-87644898 收稿日期:2014-12-19 基金:本研究由国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-19-E06), 引进国际先进农业科学技术计划(948计划)项目(2013-Z7)和国家科技支撑计划项目(2013BAD01B03-13)资助

摘要以国内外引进保存的231份黄麻种质资源为材料, 分别采用SRAP、ISSR、SSR分子标记和编程DNA指纹图谱分析软件, 绘制黄麻遗传资源基因组DNA指纹图谱。结果表明, 通过筛选出的35对SRAP引物对231份黄麻品种进行标记分析, 获得96份黄麻品种DNA指纹图谱; 11个ISSR多态性引物对96份材料进行DNA标记分析, 获得45份黄麻品种DNA指纹图谱; 49对SSR多态性引物对48份黄麻品种进行DNA标记分析, 获得13份黄麻品种DNA指纹图谱, 累计完成了154份黄麻品种基因组DNA分子指纹图谱绘制。每一个被识别的品种都具有其独特的分子“身份证”。其他77份地方品种因与部分品种遗传相似性过高, 未能被识别, 表明黄麻地方品种存在较为严重的同种异名现象。

关键词:黄麻; 遗传资源; 分子标记; DNA指纹图谱
Construction of Molecular Fingerprinting Map in Gene Pool of Jute with SRAP, ISSR, and SSR Markers
WU Gui-Fen^1,2, XU Xian-Jun³, XU Jian-Tang¹, TAO Ai-Fen¹, ZHANG Li-Wu¹, WEI Li-Zhen⁴, PAN Mo⁵, FANG Ping-Ping¹, LIN Li-Hui¹, QI Jian-Min^1,*
1Key Laboratory of Ministry for Genetics, Breeding and Multiple Utilization of Crops, Fujian Agriculture and Forestry University, Fujian Provincial Key Laboratory of Crop Breeding by Design, Fujian Province International Cooperation Base for Genetics, Breeding and Multiple Utilization of Characteristic Economy Crops in South China , Fuzhou 350002, China

² Horticultural Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530007, China

³ Wuyishan Biological Resource Institute of Fujian Province, Fuzhou 354300, China

⁴ Third Middle School of Fuzhou, Fuzhou 350002, China

⁵ Fuzhou Tanditongren Mdt InfoTech Ltd., Fuzhou 350001, China


AbstractAn experiment was conducted using 231 jute germplasm resources from abroad and at home to construct DNA fingerprints of jute varieties with SRAP, ISSR, SSR marker, and the DNA fingerprint analysis software. The results showed that 96 DNA fingerprints from 231 jute germplasm resources with 35 pairs of selected SRAP primers, 45 DNA fingerprints from 96 jute varieties with 11 selected polymorphic ISSR primers, and 13 DNA fingerprints from 48 jute varieties with 49 selected polymorphic SSR primers were constructed. This study completed a total of 154 genomic DNA molecular fingerprint maps of jute varieties. Every identified jute variety had its unique “ID”. Other 77 local varieties had not been able to be identified due to their high genetic similarity with some varieties. It showed that jute local variety has a serious phenomenon of synonym.

Keyword:Jute; Genetic resources; Molecular markers; DNA fingerprint
Show Figures
Show Figures














黄麻(jute)为椴树科(Tiliaceae)黄麻属(Corchorus)一年生草本植物, 是世界上重要的韧皮纤维作物之一, 其重要性仅次于棉花。黄麻属大约有40个种, 有2个栽培种, 即圆果种黄麻和长果种黄麻^{[1, 2, 3]}。黄麻
纤维金黄而略带丝光, 吸湿性好, 散水快, 具有抗菌抑菌特性。黄麻是一种全身是宝的重要纤维作物, 对其研究可以解决棉花等天然纤维供应不足的生产问题^{[4, 5, 6]}。黄麻为自花授粉作物, 由于20世纪地域间引种利用, 导致地方品种同种异名现象十分普遍, 传统的形态学和细胞学鉴定方法较难做到准确而真实鉴别黄麻品种基因型的遗传差异, DNA指纹图谱则能从分子水平上鉴定出品种间的遗传多样性差异或遗传相似性。因此有必要从分子水平上对黄麻种质基因源进行分子标记鉴定^{[7, 9]}, 建立我国黄麻基因源的分子数据库, 这对深化作物核心种质利用、新品种识别鉴定、种子纯度鉴定、以及在商用品种质量标准化、品种标识、假冒伪劣品种鉴定, 均有重要的意义和实际应用价值^{[8, 9, 10, 16]}。同时, 通过基因组DNA分子聚类分析黄麻品种间亲缘关系及遗传距离, 对指导我国黄麻杂交育种的亲本选配、杂种优势利用的预测等都具有重要作用^{[10, 11, 12, 13, 14, 15]}。
近年来DNA指纹图谱技术广泛运用于水稻、玉米、红麻、甘蔗、白菜、黄瓜、绿豆、葡萄、桃属、荔枝和茶树等多种作物品种间的亲缘关系分析和分子身份证绘制研究^{[17, 18, 19, 20, 21, 22, 23]}。而黄/红麻作物分子身份证的指纹图谱构建近年来刚刚开始, 红麻已完成200余份分子身份证的绘制, 但是黄麻上的构建工作一直无法突破, 且构建效率较低、技术难度较大。近年我们反复进行了多种分子标记并用技术及计算机识别软件的编程设计, 使黄麻分子身份证的绘制取得了较大的进展。初步研究表明, 由于数百年来地方品种的相互引种利用, 导致黄麻地方品种同种异名的程度较高以及基因组DNA结构改变引发品种分子指纹图谱构建唯一性效率低的问题。尤其是以单一分子标记, 一般较难鉴定出数百个品种基因源间的唯一性遗传差异。客观需要向我们提出必须从理论与实际应用结合上进行同质性基因源的广泛整合, 以解决盲目保种人力、资金的浪费和提高创新利用与遗传育种的效率。因此本研究利用3种不同类型的分子标记来绘制黄麻品种基因组DNA指纹图谱, 旨在探讨多种分子标记在DNA指纹图谱构建中应用的可行性, 也为黄麻基因源分子数据库的建立奠定工作基础。
1 材料与方法1.1 供试材料以本实验室搜集保存的国内外231份黄麻品种作为供试材料, 其中包括非洲的肯尼亚、坦桑尼亚、马里和亚洲的巴基斯坦、孟加拉国、印度、尼泊尔等12个国家引进的黄麻品种73份及从中国的海南、广西、广东、福建、浙江、湖南、台湾等省(自治区)征集的黄麻品种158份(见附表1)。
附表1
Supplementary table 1
附表1(Supplementary table 1)

附表1 231份黄麻品种名称、来源和类型 Supplementary table 1 Name, derivation, and type of jute 代号 Code 品种 Variety 来源 Source 品种类型 Variety type 代号 Code 品种 Variety 来源 Source 品种类型 Variety type 1 梅峰2号 中国福建农林大学 栽培圆果 117 竹黄麻 中国台湾 栽培圆果 2 梅峰4号 中国福建农林大学 栽培圆果 118 台湾红果红 中国台湾 栽培圆果 3 梅峰7号 中国福建农林大学 栽培圆果 119 台湾红果青 中国台湾 栽培圆果 4 日本7号 日本 栽培圆果 120 台湾绿果红 中国台湾 栽培圆果 5 闽革1号 中国福建农林大学 栽培圆果 121 台农黄麻 中国台湾 栽培圆果 6 闽革3号 中国福建农林大学 栽培圆果 122 台南红皮 中国台湾 栽培长果 7 闽革4号 中国福建农林大学 栽培圆果 123 淡红皮1号 中国台湾 栽培圆果 8 闽革6号 中国福建农林大学 栽培圆果 124 淡红皮2号 中国台湾 栽培圆果 9 闽革7号 中国福建农林大学 栽培圆果 125 淡红皮3号 中国台湾 栽培圆果 10 闽革8号 中国福建农林大学 栽培圆果 126 淡红皮4号 中国台湾 栽培圆果 11 闽革9号 中国福建农林大学 栽培圆果 127 淡红皮6号 中国台湾 栽培圆果 12 粤圆2号 中国, 广东省农业科学院 栽培圆果 128 淡红皮8号 中国台湾 栽培圆果 13 粤圆3号 中国, 广东省农业科学院 栽培圆果 129 淡红皮9号 中国台湾 栽培圆果 14 粤圆4号 中国, 广东省农业科学院 栽培圆果 130 淡红皮10号 中国台湾 栽培圆果 15 粤圆5号 中国, 广东省农业科学院 栽培圆果 131 波阳土麻 中国江西洛阳村 栽培圆果 16 闽引1号 马里 栽培长果 132 早生赤 中国台湾 栽培圆果 17 闽麻5号 中国, 福建农林大学 栽培圆果 133 中赤种 中国台湾 栽培圆果 18 闽麻5号早熟 中国, 福建农林大学 栽培圆果 134 紫皮麦门新 印度 栽培圆果 19 闽23 中国, 福建省农业科学院 栽培圆果 135 红皮黄麻 中国安徽 栽培圆果 20 闽33 中国, 福建省农业科学院 栽培圆果 136 北巷黄麻 中国台湾 栽培圆果 21 闽49-红 中国, 福建省农业科学院 栽培圆果 137 贵独3号 中国贵州 栽培圆果 22 闽麻369 中国, 福建省农业科学院 栽培圆果 138 紫金黄麻 中国广东 栽培圆果 23 闽麻273 中国, 福建省农业科学院 栽培圆果 139 内江黄麻 中国四川内江 栽培圆果 24 龙溪红皮 中国福建龙海 栽培圆果 140 曲江黄麻 中国广东曲江 栽培圆果 25 龙溪青皮 中国福建龙海 栽培圆果 141 英德黄麻 中国广东 栽培圆果 26 龙溪铁尖麻 中国福建龙海 栽培圆果 142 冬不老 中国四川 栽培圆果 27 龙溪长果 中国福建龙海 栽培长果 143 琼粤红 中国湖南 栽培圆果 28 琼粤青 中国, 湖南省麻类研究所 栽培圆果 144 榕江黄麻 中国贵州榕江 栽培圆果 29 永安黄麻 中国福建永安 栽培圆果 145 新兴黄麻 中国广东新兴 栽培圆果 30 永安淡红皮 中国福建永安 栽培圆果 146 陆丰黄麻 中国广东陆丰 栽培圆果 31 揭阳黄麻 中国, 广东省农业科学院 栽培圆果 147 腾县黄麻 中国广西藤县 栽培圆果 32 揭阳8号 中国, 广东省农业科学院 栽培圆果 148 鄂农165 中国湖北 栽培圆果 33 葛岭黄麻 中国, 福建永泰 栽培圆果 149 潮阳黄麻 中国广东 栽培圆果 34 宽叶圆果 中国, 广东省农业科学院 栽培圆果 150 选46 中国福建 栽培圆果 35 宽叶长果 中国, 湖南省麻类研究所 栽培长果 151 安福黄麻 中国江西 栽培圆果 36 巴长1号 巴基斯坦 栽培长果 152 荣昌驼驼麻 中国四川荣昌 栽培圆果 37 巴长2号 巴基斯坦 栽培长果 153 宜山黄麻 中国广西 栽培圆果 38 巴长3号 巴基斯坦 栽培长果 154 和字4号 中国江西 栽培圆果 39 巴长72-3 巴基斯坦 栽培长果 155 土黄麻 中国江西 栽培圆果 40 巴麻1号 巴基斯坦 栽培长果 156 陆川黄麻 中国广西陆川 栽培圆果 41 巴麻2号 巴基斯坦 栽培长果 157 黄皮挎麻 中国江西 栽培圆果 42 混选19 中国, 福建农林大学 栽培圆果 158 球型光果 中国湖南 栽培圆果 43 JRC-212 印度 栽培圆果 159 会罗竹篙麻 中国湖南 栽培圆果 44 JRC-13 印度 栽培圆果 160 孟加拉长果 孟加拉国 栽培长果 45 东莞青皮 中国广东东莞 栽培圆果 161 原叶绿果 中国海南藤桥 栽培长果 46 广东独尾麻 中国广东 栽培圆果 162 海南野生长果 中国海南 栽培长果 47 吴麻1号 中国广东 栽培圆果 163 漳浦假黄麻 中国福建漳浦 野生种 48 新选1号 中国广东 栽培圆果 164 粘粘菜 中国河南南阳 野生种 49 D154 印度 栽培圆果 165 甜麻 中国云南 野生种 50 第11号 中国, 福建农林大学 栽培圆果 166 假黄麻 中国云南开远 野生种 51 浦城黄麻 中国福建浦城 栽培圆果 167 假圆果 非洲 野生种 52 邵武黄麻 中国福建邵武 栽培圆果 168 假长果 非洲 野生种 53 莆田青皮 中国福建莆田 栽培长果 169 三室种21C 非洲 野生种 54 闽侯红皮 中国福建闽侯 栽培圆果 170 梭状种 非洲 野生种 55 同安红皮 中国福建同安 栽培圆果 171 三室种 非洲 野生种 56 武平黄麻 中国福建武平 栽培圆果 172 三齿种 非洲 野生种 57 连江黄麻 中国福建连江 栽培圆果 173 牛刷条 中国四川 栽培圆果 58 福麻1号 中国, 福建省农业科学院 栽培圆果 174 云野I-5 中国云南 野生圆果 59 金山黄麻 中国福建连江 栽培圆果 175 紫苏麻 中国广东 野生圆果 60 永安红皮 中国福建永安 栽培圆果 176 廉江黄麻 中国广东 野生圆果 61 诏安红皮 中国福建诏安 栽培圆果 177 YA/026Cc 泰国 野生圆果 62 诏安青皮 中国福建诏安 栽培圆果 178 Y/129Cc 泰国 野生圆果 63 云霄红皮 中国福建云霄 栽培圆果 179 圆果麻 中国四川 野生圆果 64 云霄粉红皮 中国福建云霄 栽培圆果 180 Kcv/094Cc 尼泊尔 栽培圆果 65 南安篙麻 中国福建南安 栽培圆果 181 台湾5号 中国台湾 栽培圆果 66 铁骨选 中国福建南安 栽培圆果 182 印度205 印度 栽培圆果 67 红铁骨 中国福建南安 栽培圆果 183 Y/107 中国泰国 半野生长果 68 河南长果 中国河南 栽培长果 184 YA/028 中国泰国 栽培圆果 69 河南圆果 中国河南 栽培圆果 185 YA/038 中国泰国 栽培圆果 70 南靖红皮 中国福建南靖 栽培圆果 186 DS/038c 肯尼亚 半野生长果 71 南靖青皮 中国福建南靖 栽培圆果 187 XU/057 印度尼西亚 半野生长果 72 卢滨圆果 中国福州卢滨洲 栽培圆果 188 Y/108 中国泰国 半野生长果 73 仙游黄麻 中国福建仙游 栽培圆果 189 Y/142 中国泰国 半野生长果 74 长泰红皮 中国福建长泰 栽培圆果 190 南阳野生长果 中国河南南阳 野生长果 75 平和竹篙麻 中国福建平和 栽培圆果 191 Y/110CO 中国泰国 野生长果 76 古农红皮 中国福建长果 栽培圆果 192 X/087 坦桑尼亚 野生长果 77 广丰长果 中国江西广丰 栽培长果 193 Y/105CO 泰国 野生长果 78 广西长果 中国广西 栽培长果 194 奠边黄麻 越南 栽培长果 79 三体 中国福建农林大学 栽培长果 195 JRO/550 尼泊尔 栽培长果 80 泰字4号 中国江西 栽培圆果 196 NY/155/CO 坦桑尼亚 栽培长果 81 巴圆6号 中国巴基斯坦 栽培长果 197 JRC/584 尼泊尔 栽培圆果 82 川大501 中国四川 栽培圆果 198 DS/015 孟加拉国 栽培长果 83 快早红 中国, 福建农林大学 栽培长果 199 BL/106CG 肯尼亚 栽培长果 84 马里野生长果 马里 野生长果 200 假黄麻 中国云南开远 野生种 85 越南圆果 越南 栽培圆果 201 上饶一撮英 中国江西上饶 栽培圆果 86 越南54 越南 栽培圆果 202 南阳假黄麻 中国河南南阳 近缘野生种 87 日本大份青皮 日本 栽培圆果 203 爱店野生 中国广西爱店 野生圆果 88 黄麻179 福建 栽培圆果 204 ROXA 印度 栽培长果 89 琼山 中国广东 栽培圆果 205 孟引1号 孟加拉国 栽培圆果 90 圆子麻 中国四川泸县 栽培圆果 206 JG585 中国湖南 栽培圆果 91 园果果黄麻 中国福建 栽培圆果 207 YA/024 泰国 栽培圆果 92 荣昌算盘子 中国四川隆昌 栽培圆果 208 JRC212 印度 栽培圆果 93 三元吉口 中国福建三明 栽培圆果 209 B2/106CG 肯尼亚 栽培长果 94 粤引1号 中国广东 栽培圆果 210 板八黄麻 中国广西 栽培圆果 95 翠绿 印度 栽培长果 211 云野1-1 中国云南 野生长果 96 瑞巴 印度 栽培圆果 212 Y/126CO 泰国 栽培圆果 97 台湾伽俐麻 中国台湾 栽培圆果 213 IJO20 中国广西 栽培长果 98 台湾8号 中国台湾 栽培圆果 214 洋锯齿圆果 中国广西 栽培圆果 99 台湾9号 中国台湾 栽培圆果 215 马里长国 马里巴马科 栽培长果 100 台湾白露黄麻 中国台湾 栽培圆果 216 BZ2-2 中国广西 栽培圆果 101 伽俐青茎红果 中国台湾 栽培圆果 217 JRC/675 印度 栽培圆果 102 台湾绿果 中国台湾 栽培圆果 218 JG109 中国湖南 栽培圆果 103 桃园青皮 中国台湾桃园 栽培圆果 219 NY150/61 中国广西 栽培长果 104 宜兰青皮 中国台湾宜兰 栽培圆果 220 郁南长果 中国广东 栽培长果 105 高雄青皮 中国台湾高雄 栽培圆果 221 巴长4号 巴基斯坦 栽培长果 106 高雄赤皮 中国台湾高雄 栽培圆果 222 巴麻71 巴基斯坦 栽培长果 107 新丰青皮 中国台湾新丰 栽培圆果 223 奠边青麻 越南 栽培长果 108 嘉义黄麻 中国台湾嘉义 栽培圆果 224 日本长果 日本 栽培长果 109 白莲芝 中国台湾 栽培圆果 225 古巴长荚 古巴 栽培长果 110 台湾白胭脂 中国台湾 栽培圆果 226 西贡长荚 越南 栽培长果 111 台中胭脂红 中国台湾台中 栽培圆果 227 印度墨绿子 印度 栽培长果 112 新隆黄麻 中国台湾新隆 栽培圆果 228 JRC/551 尼泊尔 栽培长果 113 台湾青皮 中国台湾 栽培圆果 229 JRC/564 尼泊尔 栽培长果 114 台湾红皮 中国台湾 栽培圆果 230 SM/034 肯尼亚 栽培长果 115 深红皮2号 中国台湾 栽培圆果 231 0-1 孟加拉国 栽培长果 116 红茎黄麻 中国台湾 栽培圆果

附表1 231份黄麻品种名称、来源和类型 Supplementary table 1 Name, derivation, and type of jute

1.2 黄麻基因组DNA提取与纯化取苗期黄麻的幼嫩叶片, 提取基因组DNA参照徐建堂^{[24, 25]}等改良的CTAB法。用DNA微量测定仪检测样品的DNA浓度与纯度, 同时纯化基因组DNA。
1.3 分子标记分析实验所用引物由上海生物技术有限公司合成, 筛选的多态性SRAP引物编号及序列见表1和表2; 筛选的ISSR引物序列如表3; SSR引物序列暂不公布。3种分子标记的PCR体系与程序见表4和表5。
PCR产物经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测, 银染显带。电泳条带清晰可辩的都被用于统计分析。当某一扩增条带出现时, 赋值为“ 1” , 不存在时赋值为“ 0” , 从而把图形信息转换成数据信息。
表1
Table 1
表1(Table 1)

表1 SRAP上引物编号及序列 Table 1 List of SRAP forward primers code and their sequences 代号 Code 引物序列 Sequence (5° -3° ) 代号 Code 引物序列 Sequence (5° -3° ) Me1 TGA GTC CAA ACC GGA TA Me10 TGA GTC CAA ACC GGA AA Me2 TGA GTC CAA ACC GGA GC Me11 TGA GTC CAA ACC GGA AC Me3 TGA GTC CAA ACC GGA AT Me12 TGA GTC CAA ACC GGA GA Me4 TGA GTC CAA ACC GGA CC Me13 TGA GTC CAA ACC GGA AG Me5 TGA GTC CAA ACC GGA AG Me14 TGA GTC CAA ACC GGT AG Me6 TGA GTC CAA ACC GGA CA Me15 TGA GTC CAA ACC GGC AT Me7 TGA GTC CAA ACC GGA CG Me17 TGA GTC CTT TCC GGT AA Me8 TGA GTC CAA ACC GGA CT Me18 TGA GTC CTT TCC GGT CC Me9 TGA GTC CAA ACC GGA GG Me19 TGA GTC CTT TCC GGT GC

表1 SRAP上引物编号及序列 Table 1 List of SRAP forward primers code and their sequences

表2
Table 2
表2(Table 2)

表2 SRAP下引物代号及序列 Table 2 List of SRAP reverse primers code and their sequences 代号 Code 引物序列 Primer sequence (5° -3° ) 代号 Code 引物序列 Primer sequence (5° -3° ) E1 GAC TGC GTA CGA ATT AAT E12 GAC TGC GTA CGA ATT CTC E2 GAC TGC GTA CGA ATT TGC E13 GAC TGC GTA CGA ATT CTG E3 GAC TGC GTA CGA ATT GAC E14 GAC TGC GTA CGA ATT CTT E4 GAC TGC GTA CGA ATT TGA E15 GAC TGC GTA CGA ATT GAT E5 GAC TGC GTA CGA ATT AAC E17 GAC TGC GTA CGA ATT CGA E6 GAC TGC GTA CGA ATT GCA E18 GAC TGC GTA CGA ATT CCA E7 GAC TGC GTA CGA ATT CAA E19 GAC TGC GTA CGA ATT CCT E8 GAC TGC GTA CGA ATT CA E9-1 GAC TGC GTA CGA ATT ACG E9 GAC TGC GTA CGA ATT AG E10-1 GAC TGC GTA CGA ATT TAG E10 GAC TGC GTA CGA ATT CAT E11-1 GAC TGC GTA CGA ATT TCG E11 GAC TGC GTA CGA ATT CTA

表2 SRAP下引物代号及序列 Table 2 List of SRAP reverse primers code and their sequences

表3
Table 3
表3(Table 3)

表3 ISSR引物代号及序列 Table 3 List of ISSR primers code and their sequences 代号 Code 引物序列 Sequence (5° -3° ) 代号 Code 引物序列 Sequence (5° -3° ) I12 AGA GAG AGA GAG AGA gT U848 CAC ACA CAC ACA CAC I13 GAG AGA GAG AGA GAG AC U881 GGG TGG GGT GGG GTG I14 CTC TCT CTC TCT CTC Tg U886 VDV CTC TCT CTC TCT CT I18 VHV GTG TGT GTG TGT GTG T U889 DBD ACA CAC ACA CAC AC U835 ATA TAT ATA TAT ATA TAT YC U890 VHV GTG TGT GTG TGT GT U841 GAG AGA GAG AGA GAG AYC Y=(C, T), V=(A, C, G), H=(A, C, T), D=(A, G, T), B=(C, G, T).

表3 ISSR引物代号及序列 Table 3 List of ISSR primers code and their sequences

表4
Table 4
表4(Table 4)

表4 反应体系 Table 4 Reaction system (μ L) 标记类型 Marker type DNA模板 DNA template 6× PCR buffer dNTPs Taq酶 Taqenzyme 引物 Primer ddH2O 总体积 Total volume SRAP 2 2 0.3 0.28 2 13.42 20 ISSR 2 2 0.4 0.40 4 11.20 20 SSR 2 2 0.3 0.35 2 13.35 20

表4 反应体系 Table 4 Reaction system (μ L)

表5
Table 5
表5(Table 5)

表5 反应程序 Table 5 Response procedures 标记类型Type 预变性 Initial denaturation 变性 Denaturation 退火 Anneal 延伸 Extend 循环数 Cycle number 再延伸 Recycle Temp. Time Temp. Time Temp. Time Temp. Time Temp. Time SRAP 94º C 5 min 94º C 1 min 32.8º C 1 min 72º C 1 min 5 94º C 1 min 52.0º C 1 min 72º C 1 min 34 72º C 1 min 30 s ISSR 95º C 5 min 95º C 30 s 57.0º C 40 s 72º C 30 s 41 72º C 7 min SSR 95º C 5 min 95º C 30 s 57.0º C 40 s 72º C 30 s 35 72º C 5 min

表5 反应程序 Table 5 Response procedures

1.4 DNA条带的生物信息学分析生物信息学是运用计算机辅助生命科学研究生物信息检索、存储和分析的科学。即用信息学的知识来解决生物学上的一些比较繁琐的问题。DNA指纹图谱分析软件(由魏丽真与潘漠共同编程)可对单引物标记结果进行多态性与特异性分析, 也可对双引物的标记结果进行分析。实验中获得的电泳图转化为由0和1描述的数据, 同时把每一个引物的标记结果输入不同的电子表格中, 然后将这些特定矩阵导入DNA指纹图谱分析软件进行多态性与特异性分析, 最终实现计算机的快速计算、快速分析、快出结果, 大大减少了人工观察和指纹图谱绘制时间和可能产生的误差。

2 结果与分析2.1 3种分子标记引物筛选及扩增2.1.1 SRAP引物筛选及扩增 选用黄麻野生种、栽培长果种和栽培圆果种有代表性的6个品种DNA为模板, 用378对SRAP上下引物组合, 在20 μ L反应体系中以200 nmol L^-1引物终浓度进行筛选, 共筛选出35对多态性较理想的引物组合(表1和表2), 对231份黄麻材料进行了SRAP-PCR扩增, 扩增的DNA片段大小一般在250~1500 bp之间。共扩增出2146条条带, 具多态性的有2015条, 多态性条带数占总带数的93.89%, 图1是引物M18E15的扩增效果图。
图1
Fig. 1

	Figure OptionViewDownloadNew Window
	图1 SRAPM18E15引物的扩增结果 M: marker; 1~48: 48份黄麻品种的电泳扩增效果图。Fig. 1 Amplified result of SRAP M18E15 M: marker; 1-48: electrophoresis of DNA in 48 jute varieties amplified with SRAP M18E15.

2.1.2 ISSR引物筛选及扩增 试验对100个ISSR引物进行筛选, 共选出11个多态性较理想的引物。其引物编号为I12、I13、I14、I18、U835、U841、U848、U881、U886、U889和U890。据此, 用其进行了ISSR-PCR扩增, 扩增的DNA片段大小一般在250~1500 bp之间。共扩增出157条带, 多态性条带数为154, 平均每条引物产生的多态性条带为14, 多态性条带比率为98.1%, 扩增效果见图2。
图2
Fig. 2

	Figure OptionViewDownloadNew Window
	图2 引物U889的扩增结果 M: marker; 1~48: 48份黄麻品种的电泳扩增效果图。Fig. 2 Amplified result with U889 M: marker; 1-48: electrophoresis of DNA in 48 jute varieties amplified with U889.

2.1.3 SSR引物筛选及扩增 从开发出的434对SSR引物中共筛选出49对多态性较理想的引物, 分别是COSSR133、COSSR140、COSSR167、COSSR168、COSSR174、COSSR176、COSSR177、COSSR178、COSSR179、COSSR181、COSSR184、COSSR188、COSSR191、COSSR192、COSSR194、COSSR195、COSSR196、COSSR227、COSSR228、COSSR229、COSSR231、COSSR232、COSSR238、COSSR239、COSSR244、COSSR266、COSSR015、COSSR045、COSSR027、COSSR013、COSSR022、COSSR023、COSSR024、COSSR025、COSSR026、COSSR54、COSSR052、COSSR049、COSSR042、COSSR030、COSSR029、COSSR031、COSSR058、COSSR039、COSSR040、COSSR050、COSSR053、COSSR008、COSSR016。
用这49对多态性引物对黄麻材料进行了SSR-PCR扩增, 扩增的DNA片段大小一般在250~ 1500 bp之间。扩增效果见图3。
图3
Fig. 3

	Figure OptionViewDownloadNew Window
	图3 编号COSSR024引物对47份黄麻品种扩增条带 M: marker; 1~48: 48份黄麻品种的电泳扩增效果图。Fig. 3 Amplification of primers (COSSR024) in 47 jute varieties M: marker; 1-48: 48 jute varieties electrophoresis amplification figure.

上述3种分子标记的引物对于品种DNA的扩增识别与鉴定贡献率不同, 即使同一种标记的不同多态性引物贡献率也是有差别的, 而同一个引物有的对某些不同来源品种的贡献率大小也是不一样的。如果某一标记在鉴别上的贡献较小, 无法构建出唯一性的分子身份证, 那么就要用2个或3个引物共同作用, 则能将更多品种唯一性鉴定出来。因此本研究以单一标记鉴定为基础, 对不能被鉴别的品种再使用双引物混合鉴定, 其效果比使用单一引物标记高。实验表明, 这种优越性在SRAP中表现较为明显。因此多引物标记的筛选显得更有用, 尤其是在较难构建的黄麻分子身份证上显得更为重要。
2.2 3种分子标记的DNA指纹图谱绘制结果分析2.2.1 黄麻种质资源SRAP标记DNA指纹图谱绘制结果分析 通过DNA指纹图谱分析软件绘制了96个黄麻品种的SRAP指纹图谱(图4), 其中还存在135个品种未能被SRAP多态性引物所识别, 表明供试材料中存在较多遗传相似性较高的品种资源, 揭示出我国黄麻基因源存在较高的同种异名现象。本研究新完成的多数供试品种指纹图谱仍表现出明显的差异, 从中我们发现梅峰2号与YA/028、大分青皮与海南琼山、YA028与越南圆果、浦城黄麻与闽侯红皮、贵独3号与藤县黄麻、日本大分青皮与越南54等品种, 在35对SRAP引物扩增每组多态性间的DNA指纹图仅存在一个谱带位点上的差异, 虽然它们的亲缘较近, 但仍可鉴定或识别出其遗传差异。而黄麻野生种、三室种、三室种21C、梭状种、三齿种DNA的指纹多态位点和其他栽培种差别明显, 揭示其基因的遗传基础有明显差别而易被识别和鉴定。客观上野生种与栽培种DNA指纹多态性位置上的明显差别, 也与野生种驯化成栽培种在表现型上存在较大差别相一致。
2.2.2 黄麻种质资源ISSR标记DNA指纹图谱绘制结果分析 对96份材料进行DNA标记分析共获得45份黄麻种质资源DNA分子身份证(计算机模拟指纹图谱图5)。这些能被鉴定的黄麻品种的DNA指纹, 客观反映黄麻品种分子水平上真实的差异性。其中冬不老与琼粤青、爱店黄麻与廉江黄麻、安福黄麻与宜山黄麻、JRC550与JRC551、巴长4号与巴麻71、日本长果与JRC584等仅存在一个多态性条带的差异。这同样反应出黄麻种质资基因源存在较高的遗传相似性现象, 其中有一半左右的品种未能被识别出来, 同样存在同种异名现象。
2.2.3 黄麻种质资源SSR标记DNA指纹图谱绘制结果分析 对48份黄麻品种进行DNA标记分析, 最终获得13份黄麻品种DNA指纹图谱, 有35份品种未能获得相应的DNA指纹图谱。其中ROXA、JG585、JRC/13、板八黄麻、洋锯齿圆果、BZ2-2、新选1号可通过2对引物被区分开, 而紫金黄麻、印度墨绿子、马里长果、BZ/106CG、孟引1号则由3对引物才能将它们区分开来。可见后者基因相似度较前者更高。
图4
Fig. 4

	Figure OptionViewDownloadNew Window
	图4 黄麻品种SRAP DNA指纹图谱Fig. 4 SRAP DNA fingerprint of jute

图5
Fig. 5

	Figure OptionViewDownloadNew Window
	图5 黄麻品种ISSR DNA指纹图谱Fig. 5 ISSR DNA fingerprint of jute

图6
Fig. 6

	Figure OptionViewDownloadNew Window
	图6 黄麻品种SSR DNA指纹图谱Fig. 6 SSR DNA fingerprint of jute varieties

3 讨论3.1 关于多种分子标记及计算机识别软件在黄麻分子数据库建立上的应用由于历史上引种利用等原因, 我国黄麻种质资源存在较为严重的同种异名现象。多年来, 我国黄麻科技工作者曾做过努力, 试图构建黄麻种质资源品种指纹图谱的分子数据库, 但是见效甚微。随着分子标记技术的发展, SRAP、ISSR、SSR分子标记具有多态性好、稳定性高、操作简便和DNA用量相对较少等特点, 为构建DNA指纹图谱提供了较理想的标记方法。由于单一的标记往往较难获得理想的结果, 近年来我们努力探索通过3种分子标记逐一筛选或协同多引物共用的方法, 进行种质资源分子身份证制作的新尝试, 而且编制了相应的识别图谱的计算机软件, 很好地解决了黄麻种质资源分子身份证绘制的难题。首次获得了154份的黄麻基因组DNA的指纹图谱, 是迄今国内外关于黄麻种质资源DNA指纹图谱构建完成数量最大的一次成功的探索性研究, 为我国黄麻分子数据库建立奠定了良好的工作基础。
3.2 关于SRAP、ISSR和SSR标记在绘制DNA指纹图谱上的运用通过35对SRAP多态性引物进行分子标记分析, 构建了96个黄麻的指纹图谱, 平均每对多态性引物可获得2.7个品种的唯一性指纹; 用11个ISSR多态性引物进行标记分析构建了45个黄麻品种的指纹图谱, 平均每个引物可获得4个品种的指纹; 以49对SSR引物进标记分析, 构建了13个黄麻的指纹图谱, 平均每对引物可获得0.27份品种的指纹。从这些数据比较来看, ISSR对黄麻DNA指纹图谱的贡献最大, 其次为SRAP标记, SSR效率最低。但不同品种身份证指纹有的只能由一种分子标记获得, 有的可由2种或3种标记方法同时获得。正如粤圆青、粤圆5号和甜麻这3个品种都可以通过SRAP、ISSR、SSR标记分别获得3种分子标记“ 身份证” 。而从另一个角度讲, 同样的实验材料, 通过SRAP标记能获得其DNA指纹“ 身份证” , 但是通过ISSR或SSR就不一定能获得相应的身份识别, 比如三室种、三室种21C、梭状种、三齿种、台湾伽俐麻、台湾8号、台湾绿果等可用SRAP标记构建其特有的指纹图谱, 而用ISSR和SSR却很难构建出它们的唯一性指纹; 泸滨圆果与新选1号可以用SSR方法构建其指纹图谱, 但用其他2种标记却不能。由此可见, SRAP较易识别种间的遗传差异, 而ISSR和SSR较易发现品种间的差异。结合多种分子标记方法, 可充分利用不同分子标记的独特优点, 解决由单一标记绘制黄麻指纹图谱所出现的难题, 为黄麻的遗传资源识别与鉴定提供更全面的分子生物学信息。显然, 优势互补在黄麻DNA指纹图谱构建上凸现出重要的作用。
3.3 关于黄麻种质资源核心种质构建与遗传相似性种质的整合关于黄麻遗传多样性的起源与演化通讯作者已有专门的论述^[2], 我国是黄麻野生种与栽培种的起源与演化中心之一。由于数百年引用地方品种或引种后重新以地方品种命名, 导致近1/3的品种遗传相似性太高, 而难以利用分子标记进行品种DNA唯一性指纹图谱的鉴定和构建分子身份证。因此可通过多种分子标记对那些同质性的黄麻基因源结合农艺性状进行归类和整合, 以减少种质资源保存鉴定的工作量。本研究还表明, 利用对保存的种质资源的基因组DNA分子标记结合其农艺性状要素的系统性鉴定, 可以构建我国黄麻微型核心种质, 并建立基因源分子数据库, 为遗传育种利用提供科学依据, 也可减少同质性种质盲目利用和保种的工作量。
本研究还表明黄麻种质基因源的遗传关系与其地理分布有较明显的关系, 生态环境相似、经纬度相近、地理分布相邻的地区或国家, 其黄麻资源群体间遗传相似性较高。本研究231份品种中, 有67% (154份)能够获得其相应的基因组DNA指纹图谱, 33% (77份)未能获得相应的DNA指纹图。其原因最大可能是这些黄麻品种的遗传相似性高, 它们的基因结构非常相似或者差异甚微, 因此未能绘出品种的唯一性分子身份证, 说明这些品种很可能存在同种异名问题。例如, 宜兰青皮、高雄青皮、新丰青皮和台湾青皮都是台湾境内的栽培圆果, 表型相似度高。很大可能是同一品种在引种过程中造成的表型的某些微小差异, 而被认为是不同品种, 有的是以引种利用后的地方名重新命名, 或因不知其品种名而以资源搜集地编号命名。

4 结论绘制了154份黄麻品种基因源DNA指纹图谱。SRAP、ISSR和SSR 3种标记对绘制黄麻品种分子身份证的贡献率分别为31.6%、52.6%和5.3%, 尚有10.5%的品种很可能是因为同种异名而未被鉴定出来。复合分子标记比单一的分子标记在黄麻种质资源DNA指纹图谱数据库的建立中更具优越性。
The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。


参考文献View Option
原文顺序
文献年度倒序
文中引用次数倒序
被引期刊影响因子

[1]	李宗道. 麻类的理论与技术. 上海: 上海科学技术出版社, 1980. pp 388-389 Li Z D. Theory and Technology of Hemp. Shanghai: Shanghai Scientific and Technical Publishers, 1980. pp 388-389(in Chinese)[本文引用:1]
[2]	祁建民, 李维明, 吴为人. 黄麻的起源与进化研究. 作物学报, 1997, 23: 677-682 Qi J M, Li W M, Wu W R. Origin and evolution of jute. Acta Agron Sin, 1997, 23: 677-682 (in Chinese)[本文引用:2][CJCR: 1.667]
[3]	李爱青. 肯尼亚黄麻红麻种质资源的考察报告. 中国麻作, 1990, 1: 16-20 Li A Q. The visiting report of jute and kenaf germplasms in Kenya. China Fiber Crops, 1990, 12(1): 16-21 (in Chinese)[本文引用:1]
[4]	徐静, 董化玲. 黄麻服饰用纺织产品开发及前景. 纺织科技进展. 科学通报, 2005, 50: 904-911 Xu J, Dong H L. Textile product development and foregrounds for jute dress: textile science and technology progress. Sci Bull, 2005, 50: 904-911[本文引用:1][CJCR: 0.3902]
[5]	黎宇, 程新奇, 郭安平. 我国黄麻种质资源的研究进展概述. 中国麻作, 1998, 20(3): 38-41 Li Y, Cheng X Q, Guo A P. Summary of the progress of jute germplasm resources in China. China Fiber Crops, 1998, 20(3): 38-41 (in Chinese)[本文引用:1]
[6]	Smartt J, Gregory W C, Gregory M P. The genomes of Arachis hypogaea: cytogenetiestudies of putative genome donors. Euphytiea, 1978, 27: 665-675[本文引用:1]
[7]	程新奇, 郭安平, 肖瑞芝, 孙家曾. 黄麻种质资源的鉴定与利用分析. 中国麻作, 1993, (4): 1-8 Cheng X Q, Guo A P, Xiao R Z, Sun J Z. identification and utilization analysis of Jute germplasm resources. China Fiber Crops, 1993, (4): 1-8 (in Chinese)[本文引用:1]
[8]	Latif M A, Rafii Yusop M, Motiur Rahman M. Microsatellite and minisatellite markers based DNA fingerprinting and genetic diversity of blast and ufra resistant genotypes. Comptes Rendus Biol, 2011, 334: 282-289[本文引用:1][JCR: 1.804]
[9]	Chuang H Y, Huu-Shen L U R, Kae-Kang H W U, Chang M C. Authentication of domestic Taiwan rice varieties based on fingerprinting analysis of microsatellite DNA markers. Bot Studies, 2011, 52(4): 31-40[本文引用:2][JCR: 0.864]
[10]	Ashkenazi V, Chani E, Lavi U. Development of microsatellite markers in potato and their use in phylogenetic and fingerprinting analyses. Genome, 2001, 44: 50-62[本文引用:2][JCR: 1.668]
[11]	Ercisli S, Ipek A, Barut E. SSR marker-based DNA fingerprinting and cultivar identification of olives (Olea europaea). Biocheml Genet, 2011, 49: 555-561[本文引用:1]
[12]	Yu H F, Wang J S, Zhao Z Q, Sheng X G, Gu H H. DNA fingerprinting and genetic purity testing of a new broccoli hybrid using SSR markers. Seed Sci Technol, 2013, 41: 464-468[本文引用:1][JCR: 0.704]
[13]	Rodriguez M J B. Microsatellite DNA fingerprinting technology for coconut and oil palm. Philippine J Crop Sci, 2011, 10: 88-95[本文引用:1][JCR: 0.152]
[14]	Onasanya A, Basso A, Somado E A, Gasore E. R, Nwilene F E, Nwilene F E, Ingelbrecht I L, Lamo J, Wydra K, Ekperigin M M, Langa M, Oyelakin O, Oyelakin O, Sere Y, Winter S, Onasanya R O. Development of a combined molecular diagnostic and DNA fingerprinting technique for rice bacteria pathogens in Africa. Biotechnology, 2010, 9: 89-105[本文引用:1][CJCR: 0.5439]
[15]	Case C, Kand ola K, Chui L, Li V, Nix N, Johnson R. Examining DNA fingerprinting as an epidemiology tool in the tuberculosis program in the Northwest Territories, Canada. Intl J Circumpolar Health, 2013, 9(3): 72[本文引用:1]
[16]	Tyler K D, Wang G, Tyler S D, Johnson W M. Factors affecting reliability and reproducibility of amplification-based DNA fingerprinting of representative bacterial pathogens. J Clin Microbiol, 1997, 35: 339[本文引用:1][JCR: 4.068]
[17]	Cantini C, Iezzoni A F, Lamboy W F, Boritzki M, Struss D. DNA fingerprinting of tetraploid cherry germplasm using simple sequence repeats. J Am Soc Hort Sci, 2001, 126: 205-209[本文引用:1]
[18]	Wünsch A, Hormaza J I. Cultivar identification and genetic fingerprinting of temperate fruit tree species using DNA markers. Euphytica, 2002, 125: 59-67[本文引用:1][JCR: 1.643]
[19]	Paglia G, Morgante M. PCR-based multiplex DNA fingerprinting techniques for the analysis of conifer genomes. Mol Breed, 1998, 4: 173-177[本文引用:1][JCR: 3.251]
[20]	Vaneechoutte M. DNA fingerprinting techniques for microorganisms. Mol Biotechnol, 1996, 6: 115-142[本文引用:1][JCR: 2.262]
[21]	Partis L, Croan D, Guo Z, Coldham C T, Murby J. Evaluation of a DNA fingerprinting method for determining the species origin of meats. Meat Sci, 2000, 54: 369-376[本文引用:1][JCR: 2.754]
[22]	Prevost A, Wilkinson M J. A new system of comparing PCR primers applied to ISSR fingerprinting of potato cultivars. Theor Appl Genet, 1999, 98: 107-112[本文引用:1][JCR: 3.658]
[23]	Bonito G, Isikhuemhen O S, Vilgalys R. Identification of fungi associated with municipal compost using DNA-based techniques. Bioresource Technol, 2010, 101: 1021-1027[本文引用:1][JCR: 4.75]
[24]	徐建堂, 祁建民, 方平平, 李爱青, 林荔辉, 吴建梅, 陶爱芬. CTAB法提取红麻总DNA技术优化与ISSR和SRAP扩增效果. 中国麻业科学, 2007, 29(4): 179-183 Xu J T, Qi J M, Fang P P, Li A Q, Lin L H, Wu J M, Tao A F. Optimized CTAB protocol for extracting genomic DNA from kenaf and improved PCR amplifications of ISSR and SRAP. Plant Fiber Sci China, 2007, 29(4): 179-183 (in Chinese with English abstract)[本文引用:1][CJCR: 0.3952]
[25]	Zhang G Q, QI J M, Zhang X C, Fang P P, Su J G, Tao A F, Lan T, Wu W R, Liu A M. A genetic linkage map of kenaf (Hibiscus cannabinus L. ) based on SRAP, ISSR and RAPD markers. Agric Sci China, 2011, 10: 1346-1353[本文引用:1][CJCR: 1.0251]