张桂芳^1,2, 丁在松¹, 赵明^1,*
1中国农业科学院作物科学研究所 / 农业部作物生理生态重点实验室, 北京 100081

²北京师范大学生命科学学院 / 北京师范大学学报(自然科学版)编辑部, 北京 100875

^* 通讯作者(Corresponding author): 赵明, E-mail: zhaomingcau@vip.tom.com 收稿日期:2014-12-19 基金:本研究由中国农业科学院创新工程项目资助

摘要稗草( Echinochloa crusgalli)是稻田中的C₄光合型杂草, 为了探索稗草 ppc基因(Eppc)对水稻遗传转化的可行性及其对光合速率的调节效应, 首次将含有稗草根型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)基因 ppccDNA的2个植物表达载体p Ubi-Eppc、p RbcS-Eppc通过农杆菌介导法对水稻进行了遗传转化。对分化植株进行的PCR、RT-PCR、克隆测序和Western杂交等结果均表明稗草 ppc基因已经整合到了水稻基因组中, 并且在转录和翻译水平都得到了表达。转基因水稻PEPC活性和气体交换参数测定结果表明T₀代多数植株的PEPC活性高于对照, 最高达到了对照的5.85倍; T₀代大多数转基因植株叶片的净光合速率( P_n)比对照提高了20.00%, 最大地提高了47.16%, 同时叶片水分利用效率(WUE)也得到增强; T₆代大部分转化植株的PEPC活性及 P_n仍保持高于对照, 本研究表明C₃根型 ppc基因过量表达也可以提高水稻的 P_n, 且证明稗草PEPC对光合作用具有较强的调节作用。

关键词:稗草; 根型 Eppc基因; 水稻; PEPC活性; 净光合速率; 水分利用效率
Transformation of Barnyardgrass ( Echinochloa crusgalli) Root Type Phosphoenolpyruvate Carboxylase Gene into Rice ( Oryza sativa) Plants and Their Effects on Photosynthesitic Gas Exchange
ZHANG Gui-Fang^1,2, DING Zai-Song¹, ZHAO Ming^1,*
1Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of the Ministry of Agriculture Crop Physiology and Ecology, Beijing 100081, China

²College of Life Science / Editorial Department of Journal of Beijing Normal University (Natural Science), Beijing 100875, China


AbstractBarnyardgrass ( Echinochloa crusgalli) is a C₄ weed commonly found in rice field. To fully utilize the photosynthestic potential of Barnyardgrass C₄gene, we transformed Barnyardgrass root Phosphoenolpyruvate Carboxylase gene into rice plant with vectors contained promoters of Ubiqitin gene and Rubisco small unit gene by Agrobactirium- mediated transformation. Both marker genes Hyg^r and ppc were detected by PCR in regenerated plants. RT-PCR and Western blot analysis confirmed that the ppc gene was incorporated into rice plant and expressed with stable transcripts and proteins. PEPC activity as measured in most of the transgenic rice plants was higher than that in control, being up to 5.85-fold of that in untransformed rice. At T₀ generation, net photosynthetic rate ( P_n) in most of transgenic rice plants was 20.00% higher than that in untransformed rice, with the highest increase of 47.16%. Water utilization efficiency (WUE) in transgenic rice was also improved. At T₆ generation, PEPC activity and P_n of transgenic lines remained higher than those of the wild type. These indicate that over-expressing C₃ Eppc gene also can improve rice photosynthesis.

Keyword:Echinochloa crusgalli; Root phosphoenolpyruvate carboxylase gene; Rice; PEPC activities; Net photosynthetic efficiency; Water use efficiency
Show Figures
Show Figures
















在C₄植物的绿色组织中, 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)是参与光合作用CO₂原初固定反应的酶。PEPC与CO₂有很强的亲和力, 其主要功能是在高温、强光下能把大气中含量很低的CO₂以四碳酸的形式固定下来, 进而运输到维管束鞘细胞叶绿体中供C₃途径利用。将C₄植物的C₄型ppc基因导入C₃作物如水稻中以提高水稻的光合能力已有多例报道^{[1, 2, 3, 4, 5]}。例如, 来源于玉米和谷子的ppc基因都被成功地导入了水稻, 在一定程度上改善了水稻的光合作用^{[1, 6]}。而稗草作为与水稻共生的主要C₄型野生植物, 比水稻具有更强的生长优势, 其ppc基因的利用还鲜有报道。在C₃植物及C₄植物的其他非光合组织中, 还存在其他形式的PEPC同工酶, 这些同工酶起着碳骨架回补作用, 参与植物的多种生理过程如气孔开放、种子发育与萌发、果实发育等^{[7, 8]}。C₃和C₄型PEPC除了具有不同的表达特征外, 其蛋白还具有不同的变构调控特征, 以适应其参与的不同生理过程。已有的研究均是将来源于C₄植物的C₄型ppc基因导入C₃植物, 而将来源于C₄植物的C₃型ppc基因导入水稻中尚未见报道。
我们前期从稗草中克隆了一个属于C₃根型的ppc基因^[9], 将该基因的cDNA分别与Ubiquitin基因启动子pUbi和1, 5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)小亚基基因启动子pRbcS融合构建了2个表达载体, 通过农杆菌介导转化中花8号水稻品种, 建立了稗草根型ppc基因(Eppc)对水稻的转化体系, 获得了一批转基因中花8号水稻植株并对其PEPC活性和气体交换特征进行了检测。
1 材料与方法1.1 试验材料用于遗传转化的水稻品种中花8号、菌株、质粒及载体等均由中国农业科学院作物科学研究所实验室保存; 试剂中的酶类购自TaKaRa公司; 抗生素类购自Sigma; 乙酰丁香酮购自Aldrich。
1.2 方法1.2.1 根癌农杆菌LBA4404的转化 2个植物表达载体pUbi-Eppc和pRbcS-Eppc中, 连接稗草根型ppc基因的启动子分别为pUbi和pRbcS、终止子为nos, 采用三亲杂交法将pUbi-Eppc、pRbcS-Eppc分别转入根癌农杆菌LBA4404。
1.2.2 水稻的遗传转化 水稻种子去除颖壳后, 用次氯酸钠消毒30 min; 然后接种于诱导培养基(NB培养基, 脯氨酸500 mg L^-1、谷氨酰铵500 mg L^-1、酪蛋白水解物300 mg L^-1、蔗糖30 g L^-1、2, 4-D 2 mg L^-1、植物凝胶2.6 g L^-1、pH 5.8)诱导愈伤组织生长, 每10 d继代1次。按照Toki的方法^[10]进行水稻的遗传转化。
1.2.3 GUS报告基因组织化学检测 取转化处理后待分化的愈伤组织块和新分化苗(T₀代)的幼根(切段), 在新配置的GUS染色液中37℃浸泡1~2 h, 观察颜色变化情况。
1.2.4 PCR扩增和测序鉴定 提取转基因T₀代植株总DNA, 对标记基因潮霉素抗性基因(Hyg^r)用引物S_hyg (5'-AAA AAG CCT GAA CTC ACC GC-3')和A_hyg (5'-ACT TCT ACA CAG CCA TCG GT-3')扩增; Eppc基因用引物P_1C(5'-ATC CGC AGA ACC CCT CCC ACT CCT CAA G-3')和P_2C(5'-GGC GTT TCT CCT CCG ACC ACT CAG CAT A-3')扩增。将扩增后的目的基因片段切胶并回收测序。
1.2.5 RT-PCR检测 分别提取转基因T₀代水稻植株和非转基因中花8号(作对照)的总RNA, 进行反转录(Reverse Reaction) PCR扩增, 同样以P_1C和P_2C为扩增目的基因引物, 同时以S_actin(5'-CCC TCC CAC ATG CTA TTC T-3')和A_actin(5'-AGA GCC TCC AAT CCA GAC A-3')为引物扩增Actin基因作为内参。
1.2.6 Western杂交 提取转基因T₀代水稻植株总可溶性蛋白, 通过SDS-PAGE电泳分离不同大小蛋白质, 转移至硝酸纤维素膜上依次用一抗(大豆PEPC)和二抗(碱性磷酸酶标记羊抗兔IGg)进行杂交, NBT/BCIP显色。
1.2.7 叶片PEPC活性的测定 采用分光光度计法, 反应体系总体积1 mL, 组分为: 100 mmol L^-1 Tris-HCl (pH 8.0), 5 mmol L^-1 MgCl₂, 3 mmol L^-1 PEP, 0.2 mmol L^-1 NADH, 10 mmol L^-1 NaHCO₃, 10 U MDH, 以加入20 μ L酶粗提物来启动反应, 检测340 nm的吸光值下降的速率, 以单位质量可溶性蛋白来标定PEPC活性。
1.2.8 气体交换参数测定 用LI-COR-6400型光合系统测定, 设定光强为1200 μ mol m^-2 s^-1, 环境温度30℃左右。分别测得净CO₂同化速率(P_n)、气孔导度(G_s)、细胞间隙CO₂浓度(C_i)、蒸腾速率(E)。叶片水分利用效率(WUE)为同步测定的P_n与E的比值。

2 结果与分析2.1 水稻转化接种在诱导培养基上的脱颖壳消毒后的成熟种子根伸长至3 cm左右时, 愈伤组织块在根部形成(图1-A); 转化后接种在筛选培养基上的大部分愈伤组织在短时间内发生褐化, 部分愈伤组织块约4周左右有新的黄色愈伤组织生成(图1-B); 经过抗性筛选后的愈伤组织接种至分化培养基上光照培养1周后产生绿色分化组织, 继续培养数周分化出绿色小幼苗(图1-C); 将幼苗转移到壮苗培养基上培养2周(图1-D)后成为具有根茎叶的完整水稻植株。2个载体pUbi-Eppc和pRbcS-Eppc分别获得转基因水稻植株18株和16株。
图1
Fig. 1

	Figure OptionViewDownloadNew Window
	图1 愈伤组织诱导、转化及培养 A: 成熟胚愈伤组织诱导; B: 转化愈伤组织的筛选; C: 幼苗分化; D: 壮苗与生根。Fig. 1 Calli induction, transformation and cultivation A: calli inducement from mature embryo; B: calli transformation and selection; C: growth of regenerated plants; D: Rooting and seedling strengthening.

2.2 Gus基因表达的组织化学检测分化前挑取愈伤组织块在GUS染色液处理后大部分愈伤组织出现了面积大小不同的蓝色晕斑; 对所获得的T₀代34株水稻苗幼根进行Gus基因组织化学检测发现: 转入2个载体pUbi-Eppc和pRbcS-Eppc的幼苗分别有16株和14株呈蓝色。表明带有目的基因的表达载体已转入水稻, 报告基因在所检测88.2%的中花8号转化苗中得到了的表达。
2.3 转基因水稻的分子鉴定对Gus报告基因检测呈阳性的所有植株进一步的PCR鉴定发现, 30株均能扩增出约1000 bp的筛选标记基因Hyg^r的片段(图2为部分植株的PCR检测结果), 而未转基因的对照(WT: 中花8号)均无目的条带。
图2
Fig. 2

	Figure OptionViewDownloadNew Window
	图2 筛选标记基因Hygr的PCR检测 泳道1~7为pUbi-Eppc载体的转基因植株, 8~14为pRbcS-Eppc载体的转基因植株; M为标准DNA长度, 依次为300、500、1000、1500、2000和2500 bp, WT为未转化的品种中花8号。Fig. 2 PCR detection of Hyg resistance gene in transgenic rice Lane 1-7: Transformants of vector pUbi-Eppc; Lane 8-14: Transformants of vector pRbcS-Eppc; M: DNA marker, being 300, 500, 1000, 1500, 2000, 2500 bp in length; WT: untransformed Zhonghua 8.

对导入的目的基因Eppc的PCR扩增发现, 30株Gus检测和Hyg^r扩增检测呈阳性的植株多数能扩增出Eppc基因0.8 kb的片段, 2个载体pUbi-Eppc和pRbcS-Eppc分别有13株和12株呈阳性(图3显示了载体pRbcS-Eppc转基因植株的PCR扩增结果), 对扩增条带回收后测序发现序列与GenBank 数据库中已登录的稗草ppc基因^[8]序列完全吻合。说明扩增出的片段的确为Eppc基因片段, 进一步证明Eppc基因已经整合到了水稻基因组内。
图3
Fig. 3

	Figure OptionViewDownloadNew Window
	图3 转基因水稻中Eppc基因的PCR扩增检测 泳道1~12为pRbcs-Eppc转基因水稻样本扩增产物, WT为对照, M为DNA标准长度, 依次为500、1000、2500、5000、7500 bp)Fig. 3 PCR detection of Eppc gene in transgenic rice Lane 1-12: Transformants of vector pRbcS-Eppc; M: DNA marker, being 500, 1000, 2500, 5000, 7500 bp in length; WT: untransformed Zhonghua 8.

在已扩增出Eppc基因的转化水稻中(pRbcS-Eppc), 随机取其中7株的RNA样本进行RT-PCR检测, 7株转基因样品Eppc基因的表达量存在差异, 且都明显比对照高, 6号样品的扩增量相对比其他样品稍低, 但高于对照; 内参基因Actin的表达量在转基因样品和对照中花8号(WT)之间基本无差别(图4)。
图4
Fig. 4

	Figure OptionViewDownloadNew Window
	图4 转基因水稻中Eppc基因的RT-PCR检测 泳道1~7为不同的转pRbcS-Eppc基因水稻植株, WT为对照中花8号。Fig. 4 RT-PCR analysis of Eppc in transgenic rice Lane 1-7: transformants of vector pRbcS-Eppc; WT: untransformed Zhonghua 8.

从转入2个表达载体pUbi-Eppc和pRbcS-Eppc的水稻植株中分别取4株进行Western杂交检测, 结果如图5。8个转化株的PEPC蛋白的表达量存在很大的差异。其中2号和6号样品比对照(WT, 中花8号)略低, 其他6个转基因样品的PEPC表达量均明显高于对照, 7号样品最高。
图5
Fig. 5

	Figure OptionViewDownloadNew Window
	图5 转基因水稻PEPC蛋白的Western检测 泳道1~4和5~8分别为pUbi-Eppc和pRbcS-Eppc载体的转基因植株, WT为对照中花8号。Fig. 5 Western analysis of PEPC in transgenic rice plants Lane 1-4: transformants of vector pUbi-Eppc; Lane 5-8: transformants of vector pRbcS-Eppc; WT: untransformed Zhonghua 8.

2.4 转基因水稻的PEPC活性测定了25株(Eppc PCR检测为阳性)转基因水稻(T₀代)的PEPC活性(表1)。除2株(uZH8-2和uZH8-3)的PEPC活性(分别为0.0389和0.0358 μ mol mg^-1 min^-1)低于WT (0.0405 μ mol mg^-1 min^-1)外, 其余22株的PEPC活性均高于WT, 其中PEPC活性最大的1株(编号: uZH8-7)为0.2371 μ mol mg^-1 min^-1, 达到了对照的5.85倍。如图6所示的转ppc基因水稻叶片的PEPC相对活性, 2种启动子中以Ubiquitin启动子启动的ppc基因表达效率更高, 相当一部分转化株的PEPC活性比对照提高4倍以上, 而Rubisco小亚基启动子提高的活性不超过3倍。
表1
Table 1
表1(Table 1)

表1 转Eppc基因水稻的PEPC活性和气体交换参数 Table 1 PEPC activity and gas exchange parameters of transgenic rice plants 植株编号 Code of plants PEPC活性 PEPC activity (μ mol mg-1 min-1) 净光合速率 Pn (μ mol m-2 s-1) 气孔导度 Gs (mol m-2s-1) 胞间CO2浓度 Ci(μ L L-1) 蒸腾速率 E(μ mol m-2 s-1) 水分利用效率 WUE uZH8-1 0.0571 24.7 0.332 209 6.66 3.714 uZH8-2 0.0389 26.9 0.325 198 6.66 4.039 uZH8-3 0.0358 16.7 0.180 181 4.31 3.880 uZH8-425 0.0487 22.1 0.263 201 6.22 3.549 uZH8-525 0.1918 23.5 0.296 210 6.18 3.805 uZH8-6 0.1637 20.3 0.213 182 5.24 3.863 uZH8-725 0.2371 22.8 0.332 230 6.14 3.717 uZH8-825 0.0619 22.3 0.247 191 5.58 3.989 uZH8-925 0.0749 24.8 0.277 195 5.87 4.221 uZH8-1030 0.0456 23.0 0.284 205 5.82 3.946 uZH8-11 0.1797 21.8 0.282 211 5.44 4.000 uZH8-1231 0.0918 23.1 0.253 187 5.32 4.335 uZH8-13 0.0795 23.5 0.335 225 5.99 3.920 rZH8-1 0.0766 18.1 0.215 203 5.15 3.515 rZH8-2 0.0947 22.8 0.269 212 4.59 4.964 rZH8-3 0.1165 26.3 0.293 185 6.41 4.109 rZH8-4 0.1208 25.3 0.310 210 4.99 5.075 rZH8-5 0.0881 25.2 0.301 203 4.71 5.349 rZH8-6 0.1037 21.3 0.268 255 5.31 4.014 rZH8-7 0.0689 18.8 0.189 194 3.68 5.109 rZH8-8 0.1106 20.7 0.212 271 4.72 4.375 rZH8-9 0.0656 21.6 0.208 185 4.17 5.174 rZH8-10 0.0544 20.8 0.244 206 4.51 4.622 rZH8-11 0.0513 24.0 0.311 211 4.82 4.980 rZH8-12 0.1213 18.6 0.248 228 4.39 4.244 WT 0.0405 18.3 0.330 251 6.01 3.040 uZH8-n: transformants of vector pUbi-Eppc; rZH8-n: transformants of vector pRbcS-Eppc; WT: untransformed Zhonghua 8. uZH8-n: pUbi-Eppc的转化苗; rZH8-n: pRbcS的转化苗; WT: 中花8号。

表1 转Eppc基因水稻的PEPC活性和气体交换参数 Table 1 PEPC activity and gas exchange parameters of transgenic rice plants

图6
Fig. 6

	Figure OptionViewDownloadNew Window
	图6 转稗草ppc基因植株的PEPC相对活性 uZH8-n: pUbi-Eppc的转化苗; rZH8-n: pRbcS-Eppc的转化苗; WT: 中花8号。Fig. 6 Relative PEPC activity improved by transgenic of Eppc in the control of different promoters uZH8-n: transformants of vector pUbi-Eppc; rZH8-n: transformants of vector pRbcS-Eppc; WT: untransformed Zhonghua 8.

2.5 转基因水稻的气体交换参数25株T₀代转基因水稻植株的气体交换参数P_n、G_s、C_i及E都存在差别(表1); 其中4株的P_n与对照的差异小于10%, 绝大多数植株(共计15株)的P_n都比对照提高20%以上。说明PEPC活性的增加确实提高了水稻的P_n。
分析T₀代光合速率的增加幅度与PEPC活性增加程度并没有显著的相关性(图7)。由P_n/E计算得到的WUE在所有T₀代转基因植株中都得到了不同程度的增加。
表2
Table 2
表2(Table 2)

表2 转Eppc基因水稻的PEPC活性及气体交换参数(T6代) Table 2 PEPC activity and Gas exchange parameters of transgenic rice plants (T6 generation) 植株编号 Code of plants PEPC活性PEPC activity (μ mol mg-1 min-1) 净光合速率 Pn (μ mol m-2 s-1) 气孔导度 Gs (mol m-2s-1) 胞间CO2浓度 Ci(μ L L-1) 蒸腾速率 E(μ mol m-2 s-1) 水分利用效率 WUE WT 0.0315± 0.0075 12.9± 1.0 0.243± 0.054 284± 15 5.84± 1.00 2.25± 0.31 uZH8-7 0.2103± 0.0125 15.1± 1.7* 0.283± 0.030 284± 10 6.55± 0.50 2.31± 0.20 uZH8-10 0.0425± 0.0102 16.0± 2.5* 0.325± 0.060 288± 8 6.96± 0.96 2.30± 0.18 uZH8-11 0.1579± 0.0167 16.6± 1.5* * 0.313± 0.048 280± 10 7.43± 0.93 2.25± 0.23 uZH8-12 0.1018± 0.0124 15.1± 0.7* * 0.276± 0.037 279± 16 6.54± 0.67 2.32± 0.30 uZH8-13 0.0685± 0.0112 13.7± 1.5ns 0.267± 0.045 288± 5 6.11± 0.74 2.25± 0.11 rZH8-3 0.1076± 0.0127 17.2± 2.1* 0.310± 0.053 279± 8 7.05± 0.84 2.44± 0.15 rZH8-4 0.1301± 0.0153 17.9± 2.2* 0.306± 0.040 273± 8 6.67± 0.58 2.68± 0.18 rZH8-7 0.0605± 0.0088 14.4± 1.6* 0.351± 0.042 302± 12 7.58± 0.71 1.92± 0.25 rZH8-11 0.0536± 0.0069 15.1± 1.7* 0.265± 0.016 277± 11 5.77± 0.33 2.62± 0.28 rZH8-12 0.1195± 0.0135 11.1± 1.5ns 0.217± 0.027 290± 7 5.14± 0.49 2.15± 0.15 uZH8-n: transformants of vector pUbi-Eppc; rZH8-n: transformants of vector pRbcS-Eppc; WT: untransformed Zhonghua 8; * P< 0.05, * * P< 0.01, ns: no significant difference. uZH8-n: pUbi-Eppc的转化苗; rZH8-n: pRbcS的转化苗; WT: 中花8号; * P< 0.05, * * P< 0.01, ns: 无差异。

表2 转Eppc基因水稻的PEPC活性及气体交换参数(T6代) Table 2 PEPC activity and Gas exchange parameters of transgenic rice plants (T6 generation)

图7
Fig. 7

	Figure OptionViewDownloadNew Window
	图7 PEPC活性与净光合速率的关系 缩写同图6。Fig. 7 Relationship of PEPC activities and Pn Abbreviations as the same as those given in Table 6.

经过逐代选育, 测定了10株T₆代转基因水稻的PEPC活性(表2), 发现10株的PEPC活性均高于WT, PEPC活性最大的1株达到了对照的6.676倍。相应编号T₆代花后20 d植株的气体交换参数测定结果见表2, 10株中只有1株(rZH8-12)的P_n低于对照, 其他9株的P_n均高于对照, 其中P_n最高的植株rZH8-4 (17.9 μ mol m^-2 s^-1)比对照提高了38.76%左右, 此结果证明转稗草根型ppc基因水稻在高代仍保持较高的光合速率。

3 讨论植物的PEPC由多基因家族编码。植物的不同组织如根、茎、叶、果实、种子等器官^{[11, 12, 13]}都存在着不同类型的PEPC同工酶, 并通过组织特异性表达调节着细胞的各种生理过程。C₄光合型ppc基因主要在叶肉细胞中表达, 受光照的调控^[14], 在光合组织中主要执行原初CO₂固定的功能; 而非光合类型同工酶还具有为硝酸盐同化后的合成氨基酸提供碳骨架、维持细胞质pH和离子渗透平衡、参与种子形成与萌发、果实发育过程中物质代谢、调节气孔运动、为根瘤共生固氮过程提供碳骨架等多种功能^{[7, 15, 16, 17, 18, 19]}。
由于栽培作物玉米和谷子的C₄光合型ppc基因导入水稻后, 能使转基因水稻的光合效率不同程度地改善^{[1, 2, 3, 4, 5, 6]}, 而稗草是稻田中最常见的C₄型野生植物, 与玉米、谷子等栽培作物相比, 其更能适应水、旱2种生存环境条件, 具有更强的生长优势, 因此, 本研究选定稗草PEPC基因对水稻进行转化。根型PEPC同工酶主要在根组织表达, 根型PEPC同工酶活性的增加可提高氨的同化能力^[8]。本研究将稗草根型ppc基因分别由强组成型表达的启动子pUbi和受强光调控在叶组织特异性表达的启动子pRbcS调控下, 在转基因水稻叶组织中的表达研究发现: T₀代92%的转基因水稻P_n高于对照, 比对照提高30%以上的植株占28%; 通过逐代选育, 到T₆代检测的大部分植株P_n仍高于对照, P_n最高的植株比对照提高了38.76%左右, PEPC活性也保持高于对照。表明转稗草根型ppc基因水稻在高代大多数植株仍能保持高的光合速率, 此结果也证明C₄植物根型PEPC与叶组织表达的C₄型PEPC一样可以对C₃植物光合作用具有调节作用。国内****凌丽俐等利用从美国华盛顿州立大学引进的转C₄光合酶基因的水稻, 经过世代繁殖、检测、选择, 得到第8代稳定的种质, 其PEPC活性经测定与第6代种质的PEPC活性相近, 他们的结果也说明PEPC基因可以稳定遗传并高表达^[20]。可见在改善C₃作物光合作用方面, 与转PPDK、NADP-ME等酶基因水稻植株的光合特性相比, PEPC起到了很关键的作用^[21], 而转PEPC+ PPDK双基因水稻植株也未表现比转PEPC基因^{[22, 23]}水稻植株有明显的光合优势^{[24, 25]}。我们转入水稻的是稗草根型PEPC基因, 我们将继续关注根型PEPC对水稻光合生理特性的改善以及在其他代谢方面的调控功能。
由气体交换参数计算得到的WUE可以反映叶片的生理抗旱能力。本研究获得的25株T₀代转基因水稻的WUE均高于对照。在玉米中导入高粱C₄型ppc基因的研究也证实WUE和抗旱能力得到了提高^[26]。我们前面的研究也已发现导入玉米和谷子C₄型ppc基因的水稻抗旱能力得到了增强^{[6, 27, 28, 29]}。本研究导入了C₄植物的根型(非光合型) ppc基因, 同样也可能提高水稻的抗旱能力, 由表1数据可知, P_n高于对照的转基因水稻中, 78.3%植株的E反而低于对照, 因而提高了WUE, 推断稗草根型PEPC同时也可能调节转基因水稻的羧化能力与气孔运动。但转基因植株的叶面积、绿叶面积的持续期及植株的干重等方面与对照没有明显差异。
转基因水稻的PEPC 活性增加的同时的确也提高了水稻的P_n, 但分析结果显示P_n增加的幅度与PEPC活性增加的程度并没有显著的相关性, 表明PEPC活性的提高被限制在一定水平内可同时提高P_n, PEPC活性的过高或过低反而对P_n的增加或降低影响不明显, 可能是与细胞质内苹果酸的代谢和运转^[30]以及苹果酸对PEPC的反馈调节作用有关^[31]。
The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。


参考文献View Option
原文顺序
文献年度倒序
文中引用次数倒序
被引期刊影响因子

[1]	Ku M S B, Agarie S, Nomura M, Fukayama H, Tsuchida H, Ono K, Hirose S, Toki S, Miyao M, Matsuoka M. High-level expression of maize phosphoenolpyruvate carboxylase in transgenic rice plants. Nat Biotechnol, 1999, 17: 76-80[本文引用:3][JCR: 32.438]
[2]	Fukayama H, Imanari E, Tsuchida H, Izui K, Matsuoka M. In vivo activity of maize phosphoenolpyruvate carboxylase in transgenic rice plants. Plant Cell Physiol, 2000, 41: S112[本文引用:2][JCR: 4.134]
[3]	Matsuoka M, Fukayama H, Tsuchida H, Nomura M, Agari S, Ku M S B, Miyao M. How to express some C4 photosynthesis genes at high levels in rice. In: Sheehy J E, Mitchell P L, Hardy B, eds. Redesigning Rice Photosynthesis to Increase Yield. Proceedings of the Workshop on the Quest to Reduce Hunger: Redesigning Rice Photosynthesis, 30 November to 3 December 1999, Los Banos, Philippines. International Rice Research Institute and Amsterdam: Elsevier Science BV, 2000. pp 167-175[本文引用:2]
[4]	Agarie S, Miura A, Sumikura R, Tsukamoto S, Nose A, Arima S, Matsuoka M, Miyao-Tokutomi M. Overexpression of C4 PEPC caused O2-insensitive photosynthesis in transgenic rice plant. Plant Sci, 2002, 162: 257-265[本文引用:2][JCR: 2.922]
[5]	Fukayama H, Hatch M D, Tamai T, Tsuchida H, Sudoh S, Furbank R T, Miyao M. Activity regulation and physiological impacts of maize C4-specific phosphoenolpyruvate carboxylase overproduced in transgenic rice plants. Photosynth Res, 2003, 77: 227-239[本文引用:2][JCR: 3.15]
[6]	Ding Z S, Huang S H, Zhou B Y, Sun X F, Zhao M. Over-expression of phosphoenolpyruvate carboxylase cDNA from C4 millet (Seteria italica) increase rice photosynthesis and yield under upland condition but not in wetland fields. Plant Biotechnol Rep, 2013, 7: 155-163[本文引用:3][JCR: 1.051]
[7]	O’Leary B, Park J, Plaxton W C. The remarkable diversity of plant PEPC (phosphoenolpyruvate carboxylase): recent insights into the physiological functions and post-translational controls of non-photosynthetic PEPCs. Biochem J, 2011, 436: 15-34[本文引用:2][JCR: 4.654]
[8]	Setién I, Vega-Mas I, Celestino N, Calleja-Cervantes M E, González-Murua C, Estavillo J M, González-Moro M B. Root phosphoenolpyruvate carboxylase and NAD-malic enzymes activety increase the ammonium-assimilating capacity in tomato. J Plant Physiol, 2014, 171: 49-63[本文引用:3][JCR: 2.699]
[9]	张桂芳, 赵明, 丁在松, 张丽, 肖俊涛. 稗草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)基因的克隆与分析. 作物学报, 2005, 31: 1365-1369 Zhang G F, Zhao M, Ding Z S, Zhang L, Xiao J T. Cloning and characterization of phosphoenolpyruvate carboxylase gene from Echinochloa crusgalli. Acta Agron Sin, 2005, 31: 1365-1369 (in Chinese with English abstract)[本文引用:1][CJCR: 1.667]
[10]	Toki S. Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice. Plant Mol Biol Rep, 1997, 15: 16-21[本文引用:1][JCR: 5.319]
[11]	Kawamura T, Shigesada K, Yanagisawa S, Izui K. Phosphoenolpyruvate carboxylase prevalent in maize roots: Isolation of cDNA clone and its use for analysis of the gene and the gene expression. J Biochem (Tokyo), 1990, 107: 165-168[本文引用:1]
[12]	Kawamura T, Shigesada K, Toh H, Okumura S, Yanagisawa S, Izui K. Molecular evolution of phosphoenolpyruvate carboxylase for C4 photosynthesis in maize: comparison of its cDNA sequence with a newly isolated cDNA encoding an isozyme involved in the anaplerotic function. J Biochem (Tokyo), 1992, 112: 147-154[本文引用:1]
[13]	Hudspeth R L, Grula J W. Structure and expression of the maize gene encoding the phosphoenolpyruvte carboxylse isozyme involved in C4 photosynthesis. Plant Mol Biol, 1989, 12: 579-589[本文引用:1][JCR: 3.518]
[14]	Westhoff P, Svensson P, Ernst K, Blasing O, Bruscheidt J, Stockhaus J, von Caemmerer S, Furvank R T. Molecular evolution of C4 phosphoenolphyruvate carboxylase in the genus Flaveria. Aust J Plant Physiol, 1997, 24: 429-436[本文引用:1]
[15]	Gowik U, Westhoff P. C4-phosphoenolpyruvate carboxylase. In: Raghavendra A S, Sage R F. C4 Photosynthesis and Related CO2 Concentrating Mechanisms. Advances in Photosynthesis and Respiration. Dordrecht: Springer, 2011, 32: 257-275[本文引用:1]
[16]	Guillet C, Just D, Bénard N, Destrac-Irvine A, Baldet P, Hernould M, Causse M, Raymond P, Rothan C. A fruit-specific phosphoenolpyruvate carboxylase is related to rapid growth of tomato fruit. Planta, 2002, 214: 717-726[本文引用:1][JCR: 3.347]
[17]	Rolletschek H, Borisjuk L, Radchuk R, Mirand a M, Heim U, Wobus U, Weber H. Seed-specific expression of a bacterial phosphoenolpyruvate carboxylase in Vicia narbonensis increases protein content and improves carbon economy. Plant Biotech J, 2004, 2: 211-219[本文引用:1]
[18]	张占琴, 王金梅, 王学军, 汪凯华, 袁春新, 麻浩. 油菜籽粒发育过程中PEPCase活性与油脂、蛋白及亚基积累的特点. 中国油料作物学报, 2009, 31: 14-18 Zhang Z Q, Wang J M, Wang X J, Wang K H, Yuan C X, Ma H. The characteristics of PEPCase activity and accumulation of oil, protein and major protein subunits during seed development of rape (Brassica napus). Chin J Oil Crop Sci, 2009, 31: 14-18 (in Chinese with English abstract)[本文引用:1][CJCR: 0.95]
[19]	Pan L J, Yang Q L, Chi X Y, Chen M N, Yang Z, Chen N, Wang T, Wang M, He Y N, Yu S L. Functional analysis of the phosphoenolpyruvate carboxylase on the lipid accumulation of peanut (Arachis hypogaea L. ) seeds. J Integr Agric, 2013, 12: 36-44[本文引用:1]
[20]	凌丽俐, 林宏辉, 焦德茂. 转PEPC基因水稻种质的稳定光合生理特性. 作物学报, 2006, 32: 527-531 Ling L L, Lin H H, Jiao D M. The stable photosynthetic characteristics of a PEPC transgenic rice germplasm. Acta Agron Sin, 2006, 32: 527-531 (in Chinese with English abstract)[本文引用:1][CJCR: 1.667]
[21]	Jiao D M, Huang X Q, Li X. Characteristics of carbon assimilation and tolerance to photooxidation in transgenic rice expressing C4 photosynthesis enzymes. In: PS2001 Proceedings, 12th International Congress on Photosynthesis. Brisbane: CSIRO Publishing, 2001, S33-004, 1-6[本文引用:1]
[22]	焦德茂, 李霞, 黄雪清, 迟伟, 匡廷云, 古森本. 转PEPC基因水稻的光合CO2同化和叶绿素荧光特性. 科学通报, 2001, 46: 414-418 Jiao D M, Li X, Huang X Q, Chi W, Kuang T Y, Gu S B. The characteristics of CO2 assimilation of photosynthesis and chlorophyll fluorescence in transgenic PEPC rice. Chin Sci Bull, 2001, 46: 414-418[本文引用:1][CJCR: 0.95]
[23]	焦德茂, 匡廷云, 李霞, 戈巧英, 黄雪清, 郝乃斌, 白克智. 转PEPC基因水稻具有初级CO2浓缩机制的生理特点. 中国科学, 2003, 33: 33-39 Jiao D M, Kuang T Y, Li X, Ge Q Y, Huang X Q, Hao N W, Bai K Z. Physiological characteristics of the primitive CO2 concentrating mechanism in PEPC transgenic rice. Sci China, 2003, 33: 33-39[本文引用:1]
[24]	Huang X Q, Jiao D M, Chi W, Ku M S B. Characteristics of CO2 exchange and chlorophyll fluorescence of transgenic rice with C4 genes. Acta Bot Sin, 2002, 44(4): 405-412[本文引用:1][JCR: 0.599]
[25]	张边江, 华春, 周峰, 周泉澄, 陈全战, 王荣富, 焦德茂. 转PEPC+PPDK双基因水稻的光合特性. 中国农业科学, 2008, 41: 3008-3014 (in Chinese with English abstract) Zhang B J, Hua C, Zhou F, Zhou Q C, Chen Q Z, Wang R F, Jiao D M. Photosynthetic characteristics of transgenic rice with PEPC+PPDK gene. Sci Agric Sin, 2008, 41: 3008-3014 (in Chinese with English abstract)[本文引用:1][CJCR: 1.889]
[26]	Jeanneau M, Gerentes D, Foueillassar X, Zivy M, Vidal J, Toppan A, Perez P. Improvement of drought tolerance in maize: towards the functional validation of the Zm-Asr1 gene and increase of water use efficiency by over-expressing C4-PEPC. Biochimie, 2002, 84: 1127-1135[本文引用:1][JCR: 3.142]
[27]	丁在松, 赵明, 荆玉祥, 李良璧, 匡廷云. 玉米ppc基因过表达对转基因水稻光合速率的影响. 作物学报, 2007, 33: 717-722 Ding Z S, Zhao M, Jing Y X, Li L B, Kuang T Y. Effect of overexpression of maize ppc gene on photosynthesis in transgenic rice plants. Acta Agron Sin, 2007, 33: 717-722 (in Chinese with English abstract)[本文引用:1][CJCR: 1.667]
[28]	方立锋, 丁在松, 赵明. 转ppc基因水稻苗期抗旱特性研究. 作物学报, 2008, 34: 1220-1226 Fang L F, Ding Z S, Zhao M. Characteristics of drought tolerance in ppc overexpressed rice seedlings. Acta Agron Sin, 2008, 34: 1220-1226 (in Chinese with English abstract)[本文引用:1][CJCR: 1.667]
[29]	周宝元, 丁在松, 赵明. PEPC过表达可以减轻干旱胁迫对水稻光合的抑制作用. 作物学报, 2011, 37: 112-118 Zhou B Y, Ding Z S, Zhao M. Alleviation of drought stress inhibition on photosynthesis by overexpression of PEPC gene in rice. Acta Agron Sin, 2011, 37: 112-118 (in Chinese with English abstract)[本文引用:1][CJCR: 1.667]
[30]	Scheibe R. Malate valves to balance cellular energy supply. Physiol Plant, 2004, 120: 21-26[本文引用:1][JCR: 6.555]
[31]	Andreo C S, Gonzalez D H, Iglesias A A. Higher plant phosphoenolpyruvate carboxylase: structure and regulation. FEBS Lett, 1987, 213: 1-8[本文引用:1][JCR: 3.582]