白云凤^1,3,*, 聂江婷², 张忠梁¹, 李平¹, 张维锋¹, 闫建俊¹, 冯瑞云¹, 张耀^1
1山西省农业科学院作物科学研究所, 山西太原030032

²山西大学生物工程学院, 山西太原030006

³农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室, 山西太原 030006

^*通讯作者(Corresponding author): 白云凤, E-mail:byfok@126.com 收稿日期:2014-09-16 基金:本研究由国家自然科学基金项目(30971838), 山西省科技攻关项目(201303110015-1)和山西省归国留学人员科研项目(2013-146)资助;

摘要NAD(P)-苹果酸酶催化苹果酸氧化脱羧, 产生丙酮酸和CO₂, 伴随NAD(P)的还原。在C₄植物中, 苹果酸酶参与了C₄光合作用。本研究对克隆的双子叶C₄植物籽粒苋NAD-苹果酸酶基因(AhNAD-ME)编码的氨基酸序列进行了生物信息学分析, 结果表明, AhNAD-ME具有苹果酸酶的完整功能域, 包括苹果酸N端结构域和苹果酸酶的NAD结合结构域; 进化树表明, 该序列属于NAD-ME的α亚基, 该亚基定位于线粒体基质中。半定量RT-PCR分析表明, 该基因主要在叶片和茎中表达, 表达量随光照时间延长而增加。将AhNAD-ME基因重组到原核表达载体pEASY-E1中, 电击法转化到大肠杆菌Transette (DE3)菌株中, IPTG诱导其高效表达, 表达的融合蛋白的分子量与预期相符, 主要以包涵体形式存在。

关键词:籽粒苋; AhNAD-ME; 序列特征; 表达模式; 原核表达
Sequence Characteristics and Expression of NAD-malic enzyme inAmaranthus hypochondriacusL.
BAI Yun-Feng^1,3,*, NIE Jiang-Ting², ZHANG Zhong-Liang¹, LI Ping¹, ZHANG Wei-Feng¹, YAN Jian-Jun¹, FENG Rui-Yun¹, ZHANG Yao^1
1 Institute of Crop Science, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030032, China

² College of Bioengineering, Shanxi University, Taiyuan 030006, China

³China Key Laboratory of Loess Plateau Crop Gene Resources and Germplasm Creation, Ministry of Agriculture, Taiyuan 030006, China


AbstractThe NAD(P)-malic enzyme (NAD(P)-ME) found in many metabolic pathways catalyzes the oxidative decarboxylation of L-malate, which results in producing pyruvate, CO₂ and NAD(P)H. In C₄ plants, NAD(P)-ME plays a key role in photosynthetic carbon fixation. This study was aimed to characterize the AhNAD-ME in dicotyledonous C₄Amaranthus hypochondriacus by sequence analysis, examine the expression patterns ofAhNAD-ME gene in different tissues and different durations of illumination time, and construct a recombinant plasmid pEASY-E1 harboring theAhNAD-ME cDNA and then transform the plasmid intoE. coli Transette (DE3) for prokaryotic expression after IPTG induction. The result showed that AhNAD-ME contains all of the motifs required for a complete and functional malic enzyme and is localized specifically to the mitochondrial matrix. Semi-quantitative RT-PCR results showed thatAhNAD-ME was constitutively expressed in all examined tissues, with different expression levels, and strongly up-regulated under light in the leaf and stem. Results of SDS-PAGE demonstrated that the specific fusion protein with an expected molecular weight was successfully expressed inE. coli transette (DE3) induced by IPTG.

Keyword:Amaranthus hypochondriacus; AhNAD-ME; Sequence characteristics; Expression pattern; Prokaryotic expression
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苹果酸是植物代谢过程中的重要中间产物。苹果酸酶(malic enzyme, ME) 在金属离子Mn²⁺或Mg²⁺的存在下, 催化苹果酸氧化脱羧生成丙酮酸和CO₂, 伴随产生还原性物质NAD(P)H, 调控植物体内的呼吸作用和脂类生成^{[ 1, 2]}等重要代谢途径, 对于保持植物细胞的渗透势、稳定细胞质的pH值^{[ 3]}、维持根系的离子吸收平衡、调节果实成熟和风味形成^{[ 4]}、应对生物和非生物逆境胁迫^{[ 5, 6]}等方面起重要作用。在C₄植物中, 苹果酸酶催化叶肉细胞的苹果酸脱羧释放出的CO₂被核酮糖-1,5二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)重新固定进入Calvin循环, 产生的丙酮酸再生为磷酸烯醇式丙酮酸(PEP), 使C₄途径得以循环。CO₂的释放提高了Rubisco周围的CO₂浓度, 抑制了Rubisco的加氧功能, 提高了CO₂固定效率^{[ 7, 8, 9]}。
根据辅酶因子的不同, 苹果酸酶分为NAD依赖型(NAD-malic enzyme, NAD-ME)和NADP依赖型 (NADP-malic enzyme, NADP-ME)。根据在细胞和组织中的分布, NAD(P)-ME分为细胞质型和质体型, 根据功能又可分为光合型和非光合型等类型。玉米NADP-ME有光合型(C₄)、非光合型(C₃)和根型3种类型^{[ 10, 11]}。光合型定位于绿色叶片, 参与C₄光合循环; 非光合型定位于黄化叶片, 具体作用尚不清楚; 根型定位在根细胞中, 主要参与防御反应^{[ 12]}。水稻和拟南芥的NADP-ME包含1个质体型和3个细胞质型^{[ 13]}, 具有组织和发育特异性表达。高等植物NAD(P)-ME家族成员催化同一个生化反应, 但代谢途径和表达模式不同^{[ 2, 14]}, 可能与其在细胞内的定位有关。
籽粒苋( A. hypochondriacus)粮饲兼用, 是双子叶C₄植物, 属于苋科( Amaranthus)苋属( Amaranth-ceae), 原产于中美洲和东南亚, 近年我国年种植面积在10万公顷以上, 从黑龙江到海南均有分布^{[ 15]}。籽粒苋能高效利用土壤养分^{[ 16]}和水分^{[ 17]}, 光合速率快, 生物学产量很高^{[ 18]}。在本课题组先前克隆到籽粒苋 NAD-ME ( AhNAD-ME)基因^{[ 19, 20]}的基础上, 分析其序列特征, 进行亚细胞定位, 探明时空表达特性, 构建原核表达载体获得原核表达蛋白, 将为进一步研究其酶学特性和转基因利用奠定基础。
1 材料与方法1.1 试验材料供试材料籽粒苋和克隆载体pSURE-AhNAD- ME由本实验室保存, 原核表达载体pEASY-E1和大肠杆菌菌株Trans1-T1和Transetta (DE3)的感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。限制性内切酶、T₄ DNA连接酶、LA- Taq酶、M-MLV反转录酶、DNA Marker、Premixed Protein Marker、IPTG、考马斯亮蓝R-250为大连宝生物公司产品; 氨苄青霉素购自Sigma公司。DNA凝胶回收试剂盒、RNA提取试剂盒购自北京艾德来生物科技有限公司。
1.2 AhNAD-ME特征分析和亚细胞定位预测以 AhNAD-ME基因推导的氨基酸序列作query, 利用BlastP在线工具分析其结构域和进化地位, PSORT (http://www.psort.org/)和SoftBerry ProtComp 9.0 (http://linux1.softberry.com/berry.phtml)在线预测AhDNA-ME的亚细胞定位, 用SignalP 4.1预测导肽^{[ 21]}。用Clustal 1.8.1和MEGA 4.1软件构建系统进化树。
1.3 时空表达模式分析运用半定量RT-PCR检测 AhNAD-ME基因的表达量, 以 Actin为内标基因。将籽粒苋植株暗处理1 d后, 置光照下2、4、6和8 h, 分别提取暗处理和不同光照时段的根、茎、叶的总RNA, 以此为模板, 用Oligo dT Primer作引物, 通过反转录合成cDNA第1链。以cDNA第1链为模板, 扩增 AhNAD-ME基因和内标基因 Actin。扩增 AhNAD-ME的正向引物为5°-ACCCAC AAAGAGTGTTACCG-3°, 反向引物为5°-TTCCCT GATTAACGTGCC-3°, 扩增内标基因的正向引物为5°-CTACAATGAGCTTCGGGTTGC-3°, 反向引物为5°-GGACTTCTGGACAACGGAATCTC-3°。取RT-PCR产物20 μL经1%琼脂糖凝胶电泳, 然后成像, 采用软件BandScan进行灰度分析, 在Microsoft Excel中作图。
1.4 原核表达载体构建以含有 AhNAD-ME全长基因的克隆载体pSURE-AhNAD-ME为模板, 利用引物P1 (5°-CAAG ATCTCAATGTTGTTGCTTTGTAGTC-3°)和P2 (5°-C GGTAACCTTCAGCGTTTCTTGTACAC-3°)进行PCR扩增, 琼脂糖凝胶电泳中可见大约1.8 kb的片段, 将其纯化回收, 取4 μL与1 μL原核表达载体pEASY-E1混匀, 25℃连接15 min。反应结束后, 转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞。挑取单菌落至LB (含100 mg L^-1 Amp)液体培养基, 37℃过夜培养。提取质粒进行PCR检测, 以空载体pEASY-E1作为负对照, 引物为P1和P2。将PCR鉴定呈现阳性的单克隆提取质粒, 用 Xba I和 Sac I双酶切鉴定, 并送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。
1.5 重组载体在大肠杆菌Transetta (DE3)的诱导表达和SDS-PAGE分析将基因序列无变异、插入方向正确的重组质粒, 通过电击导入Transetta (DE3)感受态细胞。挑取单菌落至LB (含100 mg L^-1Amp)液体培养基, 37℃过夜培养。以菌液为模板进行PCR扩增, 以未转化的菌液为负对照, 引物为P1和P2。
将导入重组载体的6 mL单菌落菌液加入600 mL LB液体培养基(含100 mg L^-1 Amp), 于37℃, 200转 min^-1振荡培养。当菌液的OD₆₀₀值为0.4~0.6时, 加入IPTG, 终浓度为1 mmol L^-1。然后等量分成6管, 其中4管于30℃条件下分别诱导0、2、4和6 h。反应结束后, 从每管取菌液2 mL, 18 000× g离心1 min, 弃上清液, 加入SDS上样缓冲液, 悬浮混匀, 沸水浴5~10 min, 18 000× g离心1 min, 冰浴5 min, 进行SDS-PAGE电泳。另2管分别在30℃和16℃条件下诱导4 h, 离心收集菌体后用1×PBS将菌体悬浮, 用超声波破碎(20 mm的变幅杆, 400 W, 超声2 s, 间隔5 s, 重复60次), 9600× g离心10 min, 分离上清液和沉淀, 并分别加入SDS上样缓冲液, 混匀, 沸水浴5~10 min后上样, SDS-PAGE电泳。电泳完毕, 用考马斯亮蓝R-250染色并脱色至背景清晰。

2 结果与分析2.1 籽粒苋AhNAD-ME特征分析和亚细胞定位预测将 AhNAD-ME基因(GenBank登录号为HQ186303)编码的氨基酸序列提交NCBI, 进行BlastP。蛋白质保守结构域分析表明该序列含有完整的NAD-ME保守功能域, 包括苹果酸N端结构域和苹果酸酶的NAD结合结构域[含有6个NAD(P)结合位点]。系统进化树( 图1)显示, 该序列先与双子叶植物的NAD- ME的α亚基(62 kD)聚为一类, 再与单子叶植物的NAD-ME的α亚基(62 kD)聚为一类, 而单子叶植物与双子叶植物NAD-ME的β亚基(59 kD)聚为1类, 表明植物NAD-ME的α亚基和β亚基的分化在单、双子叶植物分化之前已经完成。
用SoftBerry ProtComp 9.0 (http://linux1.softberry. com/berry.phtml)在线预测AhNAD-ME的蛋白质亚细胞定位, 表明该蛋白位于线粒体。PSORT在线(http://www.psort.org/)分析进一步表明该蛋白质位于线粒体基质。SignaP4.1在线分析表明AhNAD-ME没有明显的导肽序列(结果未显示)。
图1
Fig. 1

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	图1 籽粒苋AhNAD-ME氨基酸序列与其他植物同源基因的系统进化树Fig. 1 Phylogenetic tree of AhNAD-ME and NAD-ME in other species based on amino acid sequence

2.2 AhNAD-ME基因的光诱导和组织特异性表达特性 在暗处理或光照条件下, AhNAD-ME基因在叶片中均表达, 并且随着光照时间的延长, 表达量相应增加。在光照0~4 h区间, 随光照时间延长, 表达量增加幅度大; 在光照4~8 h区间, 表达量增加幅度趋缓, 证实 AhNAD-ME基因具有光诱导表达特性。根、茎、叶表达模式不尽相同。在暗处理条件下, AhNAD-ME在根、茎、叶中均有低水平表达, 但在光照处理后, 叶片中的表达量急速增加, 茎中表达量也明显增加, 但根中表达量无明显变化( 图2和 图3), 证实在无光条件下, 籽粒苋 AhNAD-ME基因呈现低水平的组成型表达, 在光照条件下则呈现绿色组织特异性表达。预示 AhNAD-ME基因低水平组成型表达可以满足苹果酸的基本代谢活动, 在光照条件下则可能参与了光合作用。
图2
Fig. 2

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	图2 AhNAD-ME的表达模式Fig. 2 Expression profile of AhNAD-ME

图3
Fig. 3

	Figure OptionViewDownloadNew Window
	图3 AhNAD-ME表达模式灰度分析Fig. 3 Grayscale analysis of AhNAD-ME expression profile

2.3 AhNAD-ME的原核表达用IPTG诱导含有重组质粒的Transetta (DE3)菌株表达重组蛋白, SDS-PAGE检测结果表明, 30℃诱导2 h就有特异的蛋白条带出现。随着诱导时间延长, 条带颜色进一步加深。诱导蛋白的分子量约66 kD ( 图4), 与预期的蛋白质分子量相符。
为了获得能够可溶性表达的目的蛋白, 用IPTG分别在30℃和16℃下诱导4 h, 对上清液和沉淀进行SDS-PAGE电泳检测。结果表明, 在2个温度条件下, 融合蛋白均能被诱导, 但30℃诱导的表达量高于16℃, 但2个温度诱导的融合蛋白主要以包涵体的形式存在( 图4)。
图4
Fig. 4

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图4 图 AhNAD-ME原核表达SDS-PAGE电泳M: 蛋白质分子量标准; 1: 不含重组质粒的菌株Transette (DE3) 在30℃诱导2 h后的表达产物; 2~9: 含有重组质粒的菌株Transette (DE3)的表达产物。其中2、3、4和5分别为30℃诱导0、2、4和6 h后的表达产物; 6和7为30℃诱导4 h后的沉淀和上清; 8和9为16℃诱导4 h后的沉淀和上清液。Fig. 4 SDS-PAGE analysis of the AhNAD-MEexpressionM: premixed protein marker; 1 refers to Transette (DE3) without recombined plasmid induced by IPTG under 30℃ for 2 h; 2, 3, 4, and 5 refer to Transette (DE3) with recombined plasmid induced by IPTG for 0, 2, 4, and 6 hours, respectively; 6 and 7 refer to precipitate and supernatant liquor of Transette (DE3) with recombined plasmid induced by IPTG under 30℃ for 4 hours, respectively; 8 and 9 refer to precipitate and supernatant liquor of Transette (DE3) with recombined plasmid induced by IPTG under 16℃ for 4 hours, respectively.

3 讨论植物的多数蛋白质由核基因编码, 在细胞质内与内质网相结合的核糖体上合成, 之后在前导序列的指引下到达特定的细胞器, 部分蛋白质被分泌到细胞外或留在细胞质中。蛋白质只有转运到正确部位才能参与细胞的各种代谢活动, 协同保证生命活动的正常运行。前导序列一般位于前体蛋白质N-端, 长度约20~80个氨基酸。有些蛋白质则由内部定位信号指导它们在细胞内的转运和定位。内部定位信号序列隐藏在成熟的蛋白质中, 不会被删除, 可能对蛋白质的折叠和功能有重要作用^{[ 22]}。线粒体是重要的细胞器, 但线粒体的蛋白质合成能力有限。大量的线粒体蛋白质是在细胞质中合成的, 在前导序列, 也称之为导肽的指引下, 通过TOM复合体和TIM23转位酶分送到基质、内膜或膜间隙, 之后信号肽酶切除导肽, 前体蛋白变为成熟蛋白。导肽通常是疏水的, 这种特征性结构有利于穿过线粒体的双层膜。线粒体导肽有一些特征^{[ 23]}, 如富含丙氨酸、精氨酸、亮氨酸和丝氨酸, 很少含带有负电荷的谷氨酸、天冬氨酸以及异亮氨酸和赖氨酸, 在相对于切割位点-2位的氨基酸为精氨酸, 是protease-I的识别位点, 第8位为非极性氨基酸; 起始的2个氨基酸为Met-Leu。但同一种蛋白质的导肽在不同植物中差异较大, 不具有高度保守的序列^{[ 24]}。我们用SignalP在线分析了AhNAD-ME的氨基酸序列, 发现其不具备导肽序列, 而Long等^{[ 25]}微量测序结果表明成熟的AhNAD-ME的N-端缺少了31个氨基酸。分析AhNAD-ME N-端的31个氨基酸序列, 发现丙氨酸、精氨酸、亮氨酸和丝氨酸的含量占到54.8%, 不含有天冬氨酸以及异亮氨酸和赖氨酸等带负电荷的氨基酸, 符合线粒体导肽的序列特征。由于线粒体导肽的非保守性, 给判断蛋白质是否具有导肽序列带来困难, 需要生物信息学技术和亚细胞蛋白质组学技术相互印证。
植物的NAD-ME有不同的构成形式, 如三色苋( Amaranthus tricolor)、禾草龙爪稷( Eleusine coracana)^{[ 26]}和洋野黍( Panicum dichotomiflorum)^{[ 27]}叶片的NAD-ME是同源八聚体, 籽粒苋的NAD-ME是异源八聚体^{[ 22]}。本研究用AhNAD-ME作query进行BlastP, 表明双子叶植物的α亚基(62 kD)先与单子叶植物的α亚基聚合, 双子叶植物的β亚基(59 kD)则先与单子叶植物的β亚基聚合, 似乎表明在单、双子叶植物分化之前这2个亚基的编码基因已经分化。不同物种的α亚基均具有完整的苹果酸酶的结构域, 似乎β亚基与α亚基的聚合对于酶活性调节具有重要作用。深入研究不同植物的NAD-ME构成形式及其活性, 将有助于加深理解NAD-ME功能的自我调节和进化机制。
蛋白质的体外表达是功能鉴定和抗体制备的基础。原核表达系统具有培养方法简单, 产量高、速
度快、稳定性好等优点^{[ 28, 29]}。但真核基因在大肠杆菌中的正确表达受很多因子的影响, 如目的基因本身的特性、诱导温度和时间、密码子偏好性等。Transetta (DE3)菌株是BL21的衍生系, 该菌株补充了大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子(AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA)对应的tRNA, 利于提高真核基因在原核系统中的表达水平。本研究将 AhNAD-ME基因重组到pEASY-T载体上, 电击转化到Transetta (DE3)菌株中, 在原核细胞中高效表达。籽粒苋 AhNAD-ME基因较大, 开放可读框长度为1872 bp, 编码623个氨基酸^{[ 20]}。原核表达蛋白的获得为基因功能鉴定奠定了基础, 也为制备抗体提供了抗原。
4 结论籽粒苋AhNAD-ME具有苹果酸酶的完整功能域, 定位于线粒体基质中; 表达模式为光诱导、绿色组织特异性表达。构建了 AhNAD-ME基因的原核表达载体, 并在大肠杆菌中高效表达。
The authors have declared that no competing interests exist.
作者已声明无竞争性利益关系。

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[1]	Shearer H L, Turpin D H, Delinis D T. Characterization of NADP-dependent malic enzyme from developing castor oil seed endosperm. Arch Biochem Biophy, 2004, 429: 134-144[本文引用:1][JCR: 3.37]
[2]	Drincovich M F, Casati P, Andreo C S. NADP-malic enzyme from plants: a ubiquitous enzyme involved in different metabolic pathways. FEBS Lett, 2001, 490: 1-6[本文引用:1][JCR: 3.582]
[3]	Davies D D. The fine control of cytosolic pH. Physiol Plant, 1986, 67: 702-706[本文引用:1][JCR: 6.555]
[4]	董庆龙, 王海荣, 安淼, 余贤美, 王长君. 苹果NADP依赖的苹果酸酶基因克隆、序列和表达分析. 中国农业科学, 2013, 46: 1857-1866 Dong Q L, Wang H R, An M, Yu X M, Wang C J. Cloning, sequence and expression analysis of NADP-malic enzyme genes in apple. Sci Agric Sin, 2013, 46: 1857-1866 (in Chinese with English abstract)[本文引用:1][CJCR: 1.889]
[5]	Casati P, Drincovich M F, Edwards G E, Andreo C S. Malate metabolism by NADP-malic enzyme in plant defense. Photosynth Res, 1999, 61: 99-105[本文引用:1][JCR: 3.15]
[6]	Fu Z Y, Zhang Z B, Hu X J, Shao H B, Ping X. Cloning, identification, expression analysis and phylogenetic relevance of two NADP-dependent malic enzyme genes from hexaploid wheat. Comptes Rendus Biol, 2009, 332: 591-602[本文引用:1][JCR: 1.804]
[7]	Berry J O, Yerramsetty P, Zielinski A M, Mure C M. Photosynthetic gene expression in higher plants. Photosynth Res, 2013, 117: 91-120[本文引用:1][JCR: 3.15]
[8]	Moreney J V, Jungnick N, Dimario R J, Longstreth D J. Photorespiration and carbon concentrating mechanisms: two adaptation to high O2, low CO2 conditions. Photosynth Res, 2013, 117: 121-131[本文引用:1][JCR: 3.15]
[9]	Langdale J A. C4 cycles: past, present, and future research on C4 photosynthesis. Plant Cell, 2011, 23: 3879-3892[本文引用:1][JCR: 9.251]
[10]	Tausta S, Coye H, Rothermel B, Stiefel V, Nelson T. Maize C4 and non-C4 NADP-dependent malic enzymes are encoded by distinct genes derived from a plastid-localized ancestor. Plant Mol Biol, 2002, 50: 635-652[本文引用:1][JCR: 3.518]
[11]	Detarsio E, Maurino V G, Alvarez C E, Mueller G L. Maize cytosolic NADP-malic enzyme (ZmCytNADP-ME): a phylogenetically distant isoform specifically expressed in embryo and emerging roots. Plant Mol Biol, 2008, 68: 355-367[本文引用:1][JCR: 3.518]
[12]	Maurino V, Drincovich M, Casati P, Andreo C, Edwards G, Ku M, Gupta S, Franceschi V. NADP-malic enzyme: immunolocalization in different tissues of the C4 plant maize and the C3 plant wheat. J Exp Bot, 1997, 48: 799-811[本文引用:1][JCR: 5.242]
[13]	Chi W, Yang J H, Wu N H, Zhang F. Four rice genes encoding NADP-malic enzyme exhibit distinct expression profiles. Bios Biotechnol Biochem, 2004, 68: 1865-1874[本文引用:1]
[14]	Detarsio E, Andreo C S, Drincocich M F. Basic residues play key roles in catalysis and NADP+-specificity in maize (Zea mays L. ) photosynthetic NADP+-dependent malic enzyme. Biochem J, 2004, 382: 1025-1030[本文引用:1][JCR: 4.654]
[15]	张锡州, 李廷轩, 王昌金. 富钾植物籽粒览研究进展. 中国农学通报, 2005, 21(4): 230-235 Zhang X Z, Li T X, Wang C J. Progress of research on K-rich plant of grain amaranth. Chin Agric Sci Bull, 2005, 21(4): 230-235 (in Chinese with English abstract)[本文引用:1]
[16]	李廷轩, 马国瑞. 籽粒苋富钾基因型的根系形态和生理特性. 作物学报, 2004, 30: 1145-1151 Li T X, Ma G R. Physiological and morphological characteristics of roots in grain amaranth genotypes enrichment in potassium. Acta Agron Sin, 2004, 30: 1145-1151 (in Chinese with English abstract)[本文引用:1][CJCR: 1.667]
[17]	Johnson B L, Henderson T L. Water use patterns of grain amaranth in the northern great plains. Agron J, 2002, 94: 1437-1443[本文引用:1][JCR: 1.518]
[18]	Shukla S, Bhargava A, Chatterjee A, Srivastava A, Singh S P. Genotypic variability in vegetable amaranth (Amaranthus tricolor L. ) for foliage yield and its contributing traits over successive cuttings and years. Euphytica, 2006, 151: 103-110[本文引用:1][JCR: 1.643]
[19]	李平, 白云凤, 张维锋. 籽粒苋苹果酸酶基因克隆及分析. 西北植物学报, 2010, 30: 229-236 Li P, Bai Y F, Zhang W F. Cloning and analysis of NAD-ME gene of Amaranthus hypochondriacus. Acta Bot Boreali-Occident Sin, 2010, 30: 229-236 (in Chinese with English abstract)[本文引用:1][CJCR: 1.321]
[20]	李平, 白云凤, 冯瑞云, 王原媛, 张维锋. 籽粒苋苹果酸酶(NAD-ME)基因密码子偏好性分析. 应用与环境生物学报, 2011, 17: 12-17 Li P, Bai Y F, Feng R Y, Wang Y Y, Zhang W F. Analysis of codon bias of NAD-ME gene in Amarnathus hypochondriacus. Chin J Appl Environ Biol, 2011, 17: 12-17 (in Chinese with English abstract)[本文引用:1][CJCR: 0.867]
[21]	Petersen T, Brunak S, von Heijne G, Nielsen H. SignalP 4. 0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nat Methods, 2011, 8: 785-786[本文引用:1][JCR: 23.565]
[22]	Truscott K N, Brand ner K, Pfanner N. Mechanisms of Protein Import into Mitochondria. Curr Biol, 2003, 13: R326-R337[本文引用:2][JCR: 9.494]
[23]	von Heijne G, Steppuhn J, Herrmann R G. Domain structure of mitochondrial and chloroplast targeting peptides. EurJ Biochem, 1989, 180: 535-545[本文引用:1]
[24]	Christopher J, Tonkin C J, Foth B J, Ralph S A, Struck N, Cowman A F, McFadden G I. Evolution of malaria parasite plastid targeting sequences. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105: 4781-4785[本文引用:1][JCR: 9.737]
[25]	Long J J, Wang J L, Berry J O. Cloning and analysis of the C4 photosynthetic NAD-dependeng malic enzyme of Amaranth Mitochondria. J Biol Chem, 1994, 269: 2827-2833[本文引用:1][JCR: 4.651]
[26]	Murata T, Ohsugi R, Matsuoka M, Nakamoto H. Purification and characterization of NAD malic enzyme from Leaves of Eleusine coracana and Panicum dichotomiflorum. Plant Physiol, 1989, 89: 316-324[本文引用:1][JCR: 6.555]
[27]	Oshugi R, Murata T. Leaf anatomy, post-illumination CO2 burst and NAD-malic enzyme activity in Panicum dichotomiflorum. Plant Cell Physiol, 1980, 21: 1329-1333[本文引用:1][JCR: 4.134]
[28]	Esposito D, Chatterjee D K. Enhancement of soluble protein expression through the use of fusion tags. Curr Opin Biotechnol, 2006, 17: 353-358[本文引用:1]
[29]	Waugh D S. Making the most of affinity tags. Trends Biotechnol, 2005, 23: 316-320[本文引用:1][JCR: 9.66]