彭振, 何守朴, 孙君灵, 许菲菲, 贾银华, 潘兆娥, 王立如, 杜雄明^*
中国农业科学院棉花研究所 / 棉花生物学国家重点实验室, 河南安阳455000
^* 通讯作者(Corresponding author): 杜雄明, E-mail:dxm630723@163.com, Tel: 0372-2562252 收稿日期:2013-12-05 基金:本研究由国家科技基础条件平台项目(2012-012)和农业部农作物种质资源保护项目(NB2013-2130135)资助。; 感谢长江大学付鹏同学在温室鉴定试验中给予的大力协助。;

摘要利用2个耐盐和2个盐敏感的陆地棉品种, 分别设置对照和4% (40 g L^-1)浓度NaCl溶液处理三叶期幼苗, 处理72 h后调查盐害指数, 测定地上部分鲜重、根鲜重、叶片相对含水量、叶绿素荧光参数、相对电导率、丙二醛含量、抗氧化酶类活性等13个与耐盐性相关的重要指标。利用灰色关联聚类、主成分分析和逐步回归等方法综合评价陆地棉苗期耐盐性, 认为最大光化学效率(F_v/F_m)可以作为鉴定陆地棉苗期耐盐性的关键指标, 构建耐盐指数(y)方程y= 1.943x- 0.882 (x= 最大光化学效率), 同时结合另外2个耐盐和2个盐敏感品种所得方程y值对耐盐等级进行划分。进一步利用23个已知耐盐性的品种检验方程, 计算结果与田间鉴定结果完全一致。因此选用最大光化学效率作为唯一指标鉴定陆地棉苗期耐盐性, 高效准确, 同时通过构建方程和划分耐盐等级, 为未来大规模陆地棉品种资源耐盐性鉴定提供技术标准和研究基础。

关键词:棉花; 苗期; 耐盐性鉴定; 最大光化学效率; 耐盐指数
An Efficient Approach to Identify Salt Tolerance of Upland Cotton at Seedling Stage
PENG Zhen, HE Shou-Pu, SUN Jun-Ling, XU Fei-Fei, JIA Yin-Hua, PAN Zhao-E, WANG Li-Ru, DU Xiong-Ming^*
Institute of Cotton Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences / State Key Laboratory of Cotton Biology, Anyang 455000, China
Fund:
AbstractThree-leaf cotton seedlings of two salt-tolerant varieties and two salt-sensitive varieties were treated by water and 4% (40 g L^-1) NaCl solution, respectively. A total of 13 parameters related to salt tolerance including salt injury index (SII), shoot fresh weight (SRW), root fresh weight (RFW), leaf relative water content (RWC), chlorophyll fluorescence parameters (F_o,F_m,F_v/F_m), relative conductivity (RC), manlondialdehyde (MDA) content and the activity of antioxidant enzymes were monitored after 72 h of treatment. Comprehensive assessment of salinity tolerance based on grey relation clustering method, principal component analysis and stepwise regression analysis indicated that the maximum quantum yield of PSII was the most significant correlated indices with salt tolerance in upland cotton, which could be used as a single parameter to assess salt tolerance based on the equation:y= 1.943x- 0.882 (whereyis the salt tolerance index,xis the related value of maximum efficiency of photosystem II). The other two salt-tolerant varieties and two salt-sensitive varieties were used to rate the classification of salt tolerance. Salt tolerance index (y) of 23 varieties with known salt tolerance were calculated to validate the accuracy of the equation, the result was consistent with field investigation. In this study, the maximum efficiency of photosystem II was used as the main index to validate the salt tolerance in cotton, together with the construction of salt tolerance index equation and salt tolerance rating, which could greatly improve the efficiency of salinity tolerance evaluation for massive germplasm in future.

Keyword:Upland cotton; Seedling stage; Salt tolerance evaluation; Maximum quantum yield of PSII; Index of salinity tolerance
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土地已经成为制约农业生产的主要因素, 我国1亿公顷耕地中盐碱地占666万公顷, 另外约有近2亿公顷盐碱荒地资源未被开发利用, 这些盐碱地主要分布在华北、西北、东北及东部滨海地带^{[ 1]}。随着耕地面积减少, 棉花种植逐渐向盐碱地集中, 因此这些盐碱地蕴藏着巨大的开发潜力。较其他作物而言, 棉花虽相对耐盐, 但目前研究表明盐碱地高浓度的盐分仍然是制约棉花产量的主要因子^{[ 2]}。所以提高和改良棉花品种的抗盐碱能力已经成为棉花育种中重点目标, 而从丰富的棉花品种资源中筛选鉴定适合在盐碱地开发的耐盐品种显得尤为重要, 选择合适的耐盐鉴定指标则是棉花耐盐品种选择和育种研究的基础。
已有的研究认为, 棉花幼苗阶段和开花结铃时期对盐分比较敏感, 三叶期的棉花幼苗耐盐性最差, 随着棉花生长发育, 耐盐性不断提高^{[ 3]}。棉花苗期耐盐机理已有相关报道, 重点集中在利用不同浓度盐处理后, 体内渗透调节物质的积累、生物量、光合作用、抗氧化酶、盐离子含量等方面的变化趋势^{[ 4, 5, 6, 7, 8, 9]}。不同品种的耐盐机制不尽相同, 耐盐性表现出来的具体指标也不同, 因此, 需要在特定时期, 对多个指标进行筛选, 同时在多个材料中验证其普遍性, 才能明确与棉花耐盐性密切相关的关键指标。
棉花虽然是比较耐盐的作物, 但真正抗盐的材料并不多。刘国强等^{[ 10]}利用盐害指数作为指标, 通过盐池鉴定, 从4个棉花栽培种的4078份品种材料中仅筛选出3个陆地棉抗盐品种。盐池鉴定费时费力, 极不利于大规模鉴定品种资源, 因此, 迫切需要找到一种快速准确的棉花品种资源耐盐性鉴定方法。
于是后来有研究者提出利用如隶属函数综合评价^{[ 11]}、主成分分析^{[ 12, 13]}和灰色关联分析^{[ 14]}等方法评
价植物抗逆性, 虽然在一定程度上比较合理, 但依然存在局限性。如主成分分析利用降维方法将多个指标简化, 却忽略了某些指标之间存在着密切的内在联系, 它们的变化趋势基本一致, 这些指标实际属于同一类型, 而主成分分析笼统地将所有指标降维, 没有考虑不同类型指标间权重差异。因此如何找到反映棉花耐盐性的关键指标, 建立一个高效可靠的棉花品种资源耐盐性鉴定方法是亟待解决的问题。
由于萌发期和苗期鉴定耐盐性结果准确、省时省力。本研究参考前人在其他领域使用的方法^{[ 15]}, 测定与棉花耐盐性密切相关的13个指标, 对其进行聚类, 主成分分析, 筛选关键指标, 最后基于关键指标的综合权重, 利用逐步回归分析进行进一步筛选, 精简指标, 获得能准确反映棉花耐盐性的标准方程, 同时验证方程的准确性。最终建立起一种稳定高效的陆地棉苗期耐盐性鉴定的简便方法。
1 材料与方法1.1 供试材料以国家棉花种质资源中期库丰富的遗传材料及近10年于盐池和盐碱地抗逆鉴定结果为基础^{[ 16]}, 共选择31份已知耐盐性的陆地棉品种材料, 其中挑选4份不同来源的具有较强耐盐和盐敏感特性的材料用于构建标准方程(表1), 其他27份材料分别用于划分耐盐等级和验证方程准确性。
表1
Table 1
表1(Table 1)

表1 构建标准方程的试验材料 Table 1 Plant materials for standard equation construction in this study 中期库编号 Accession number 品种名称 Variety 来源 Origin 抗逆性特性 Characteristics of stress resistance M111066 南丹巴地大花 Nandanbadidahua 中国广西 Guangxi, China 耐高温、不抗旱、不抗病、盐敏感 Tolerant to high temperature; sensitive to drought, disease, and salt M130293 早熟长绒7号 Zaoshuchangrong 7 美国 America 抗旱、耐盐、不耐高温 Tolerant to drought and salt; sensitive to high temperature M112247 中棉所35 CRI35 中国河南 Henan, China 抗旱、耐盐、高抗病 Tolerant to drought and salt; resistant to disease M112240 宿棉9108 Sumian 9108 中国安徽 Anhui, China 不抗旱、耐病、盐敏感 Tolerant to disease; sensitive to drought and salt

表1 构建标准方程的试验材料 Table 1 Plant materials for standard equation construction in this study

1.2 种植方法调查苗期盐害参照河北省地方标准(DB13/ T1339-2010棉花耐盐性鉴定评价技术规范)进行^{[ 17]}, 方法略有改动。在温室中采用花钵土培法(昼夜温室条件为28℃/14℃), 种子经15%过氧化氢消毒4 h并以无菌水冲洗至少4次, 再用灭菌水室温下浸泡24 h, 然后播种于花钵, 播种前先将规格12 cm×15 cm× 14 cm的花钵加入称量好的灭菌混合土(土∶沙=3∶1) 0.8 kg, 然后加入150 mL清水保证混合土含水量趋于饱和(预试验确认加入150 mL水, 花钵底微微有水渗出为标准)。播种量每盆为5~7粒, 每个品种准备250盆共1000盆。覆盖0.2 kg的细土层稍加平整。播种完成后盖上薄膜防止水分蒸发过快, 待种子出苗均匀后揭掉。定时浇水, 尽量保证每盆含水量大体一致。
1.3 盐胁迫处理待棉花幼苗长至三叶一心期(3片真叶完全展开, 第4片真叶待展开), 提前控制土壤水分, 去掉弱势棉苗, 每盆保证3~4棵, 挑选长势一致的棉苗分成处理与对照两组, 保证每组棉苗100盆以上。其中处理组每盆浇灌150 mL 4% (40 g L^-1) NaCl溶液, 而对照组加入等体积清水。处理72 h后调查各项指标, 取样检测部位均为倒数第2片真叶。
1.4 测定指标与方法本研究共测定4类13个与棉花耐盐性紧密相关的指标, 作为构建耐盐指数标准方程的原始数据。包括盐害指数1个, 生物量指标3个, 叶绿素荧光参数4个, 生理和生化指标5个(表2)。
1.4.1 盐害指数 按照河北省地方标准(棉花耐盐性鉴定评价技术规范)^{[ 17]}对苗情分类(略有修改)。1级植株健壮, 叶片平展, 绿色有光泽, 无受害症状; 2级植株稍有萎蔫, 老叶边缘发黄或轻微失水; 3级植株萎蔫, 中下部叶片下垂皱缩, 子叶、老叶变黄; 4级植株严重萎蔫, 子叶和老叶脱落或干枯, 上部叶片严重下垂, 新叶失水皱缩; 5级植株叶片全部干枯或脱落。盐害指数=Σ(各级受害植株数×相应的级数值)/(调查总株数×最高盐害级数值)。
1.4.2 生物量 根据陈永坤等^{[ 18]}的方法测定根鲜重, 地上部分鲜重, 叶片相对含水量(RWC)。
1.4.3 叶绿素荧光参数 参照Strasser等^{[ 19]}的方法测定叶绿素荧光参数(初始荧光量 F_o、最大荧光量 F_m、最大光化学效率 F_v/ F_m、PSII潜在活性 F_v/ F_o), 采用叶绿素荧光仪Handy PEA (HansaTech, 英国)测定棉花倒数第2叶片的上述参数。
1.4.4 生理和生化指标 参照李合生^{[ 20]}的方法测定丙二醛(MDA)含量、相对电导率(细胞膜相对透性, RC); 参照文献[21]方法测定抗氧化酶(超氧化物歧化酶SOD、过氧化物酶POD、抗坏血酸过氧化物酶APX)活性。
表2
Table 2
表2(Table 2)

表2 构建标准方程所使用的指标 Table 2 Index for standard equation construction 分类 Category 指标 Index 简写 Abbreviation 相对值代码(处理/对照) Relative value code (treatment/control) 表型 Phenotype 盐害指数Salt injury index SII x1 生物量 Biomass 地上部分鲜重Shoot fresh weight SFW x2 根鲜重Root fresh weight RFW x3 叶片相对含水量Relative water content RWC x4 叶绿素荧光参数 Chlorophyll fluorescence parameters 初始荧光值Minimal fluorescence Fo x5 最大荧光值Maximal fluorescence Fm x6 PSII最大光化学效率Maximum efficiency of PSII Fv/ Fm x7 PSII潜在活性Potential activity of PSII Fv/ Fo x8 生理和生化指标 Physiological and biochemical index 相对电导率Relative conductivity RC x9 丙二醛Malondialdehyde MDA x10 过氧化物酶Peroxidase POD x11 超氧化物歧化酶Superoxide dismutase SOD x12 抗坏血酸过氧化物酶Ascorbate peroxidase APX x13 Fv为可变荧光值, Fv = Fm- Fo。 Fv stands for the variable fluorescence, Fv = Fm- Fo.

表2 构建标准方程所使用的指标 Table 2 Index for standard equation construction

1.5 数据分析所有原始数据均为3重复的平均值, 除盐害指数外, 计算每项指标相对值(相对值=盐处理材料数值/对照材料数值)。使用SPSS 19.0 (IBM)及DPS 7.05数据分析软件对4个试验材料的13个指标相对值进行关联度系数矩阵分析并聚类, 在经过主成分分析, 获得每一类指标主成分得分与综合得分用于耐盐性评价, 并与传统主成分分析(PCA)法比较。最后使用逐步回归方程筛选出能代表棉花耐盐性的关键指标。
1.5.1 指标的灰色关联聚类分析
(1)隶属函数转化指标相对值 = 盐处理数值的平均值/非盐处理(对照)的平均值。如果某一指标与耐盐性呈负相关, 则采用模糊数学隶属函数值的方法^{[ 22]}计算隶属函数值 X_{( ij)}, X_{( ij)}= ( X_ij- X_jmin)/( X_jmax- X_jmin), 式中 X_{( ij)}表示 i品种 j指标的隶属值; X_ij表示 i品种的 j指标测定值; X_jmax 、X_jmin分别为 i品种的 j指标最大值和最小值; 如果某一指标与耐盐性呈正相关, 则采用反隶属函数 X′_{( ij)}, X′_{( ij)}= ( X_jmax- X_ij)/( X_jmax- X_jmin), 根据已有文献对各指标相关性的描述, 本文对13个指标中的SII、RC、 F_o和MDA采用反隶属函数值计算。
(2)指标的灰色关联聚类分析 主成分分析前先对所有指标进行灰色关联聚类分析。灰色关联聚类分析的基本思路是如果两个指标的关联程度足够大就认为同属一类^{[ 23]}。利用SPSS软件, 取分辨系数 r= 0.5, 计算13个指标之间的关联系数矩阵, 再取临界值0.74, 将13个指标分成2类。
1.5.2 主成分分析及综合耐盐 D值计算
(1)主成分分析 分别对2类聚类分析后的指标进行主成分分析, 分析集合 Y={ C₁ , C₂ , C₃, … , C_m}, 其中 C_m={ y_m1 , y_m2 , y_m3, … , y_mn}称为第 m类指标的主成分集合, y_mn称为 m类指标的第 n个主成分。
(2)综合耐盐 D值 若 h_mn为第 m类指标第 n个主成分的权重, 则将计算的方差贡献率视为主成
分权重。线性组合 称为第 m类指标的综合指标; 若 w_i为第 m类指标的权重, 则综合耐盐 D值 , 被称为全体指标的综合评分值。其中指标聚类的权重 w_i,可通过层次分析法确定。

2 结果与分析2.1 盐胁迫形态特征与13个耐盐指标的相关性分析由表3可知, 盐胁迫条件下, 4份材料各性状间有很大的差异, 第3天时不同品种已经出现盐害症状差异, 南丹巴地大花, 宿棉9108品种子叶脱落严重, 老叶变黄, 叶边缘出现卷曲, 干枯, 新叶萎蔫呈变黄趋势。早熟长绒7号及中棉所35品种子叶边缘部分卷曲枯死, 老叶稍微有些枯萎, 新叶翠绿。初步表明早熟长绒7号和中棉所35耐盐性相比南丹巴地大花和宿棉9108都强。
表3
Table 3
表3(Table 3)

表3 不同品种盐胁迫测定的生理指标相对值与隶属函数值 Table 3 Relative value and subordinate function value of physiological indices in different varieties under salt stress 指标 Index 南丹巴地大花 Nandanbadidahua 早熟长绒7号 Zaoshuchangrong 7 中棉所35 CRI35 宿棉9108 Sumian 9108 相对值 Relative value 隶属函数值Subordinative function value 相对值Relative value 隶属函数Subordinative function value 相对值Relative value 隶属函数Subordinative function value 相对值Relative value 隶属函数Subordinative function value SII 0.789 0.065 0.475 0.808 0.394 1.000 0.816 0.000 SFW 0.829 0.000 1.655 1.000 1.008 0.217 1.017 0.228 RFW 0.422 0.024 1.483 1.000 0.929 0.491 0.395 0.000 RWC 0.430 0.000 0.866 0.910 0.910 1.000 0.443 0.026 Fo 1.448 0.000 1.082 1.000 1.138 0.847 1.363 0.231 Fm 0.534 0.004 0.765 0.832 0.812 1.000 0.532 0.000 Fv/ Fm 0.461 0.000 0.900 1.000 0.889 0.974 0.526 0.149 Fv/ Fo 0.173 0.000 0.629 0.988 0.634 1.000 0.204 0.067 RC 3.000 0.000 2.178 1.000 2.259 0.901 2.510 0.596 MDA 3.128 0.359 1.327 1.000 1.570 0.913 4.137 0.000 POD 1.391 0.017 2.814 1.000 2.068 0.484 1.367 0.000 SOD 0.606 0.000 1.802 1.000 1.071 0.389 0.848 0.202 APX 1.091 0.357 1.918 1.000 1.864 0.959 0.632 0.000

表3 不同品种盐胁迫测定的生理指标相对值与隶属函数值 Table 3 Relative value and subordinate function value of physiological indices in different varieties under salt stress

13个指标相关分析(表4)表明, 各指标间存在不同程度的相关。盐害指数与初始荧光参数( F_o)、相对电导率(RC)、丙二醛(MDA)呈显著或极显著正相关, 与叶片相对含水量(RWC)、根鲜重(RFW)、最大荧光参数( F_m)、最大光化学效率( F_v/ F_m)、APX呈显著或极显著负相关。地上部分鲜重与SOD显著正相关; 叶片相对含水量(RWC)与盐害指数(SII)、叶绿素荧光参数( F_o, F_m, F_v/ F_m, F_o/ F_m)呈极显著相关。
2.2 不同品种各指标的灰色关联聚类分析2.2.1 指标的分类 利用参试品种的各指标相对值的隶属函数值计算出每2个指标间的灰色绝对关联度, 得上三角矩阵如表5所示, 依据此表即可对棉花耐盐性各评价指标进行灰色聚类。
取定临界值 r∈[0,1], 当 ξ_ij≥ r( i ≠ j)时, 则可认为指标 x_i和指标 x_j为同类指标。 r∈ [0,1]可根据实际问题的需要确定, r越接近于1, 分类越细, 每一类中的指标相对越少, 本试验取临界值 r= 0.74, 一次筛选出 ξ_ij≥ 0.74的指标{ x₁ , x₄ , x₅ , x₆ , x₇ , x₈}, 另一指标聚类是{ x₂ , x₃ , x₉ , x₁₀ , x₁₁ , x₁₂ , x₁₃}。以上分类中将盐害指数、叶片相对含水量、叶绿素荧光参数归
表4
Table 4
表4(Table 4)

表4 不同品种的13个指标之间相关性分析(Pearson相关系数) Table 4 Correlation analysis among 13 indices of all varieties (Pearson correlation coefficient) SII SFW RFW RWC Fo Fm Fv/ Fm Fv/ Fo RC MDA POD SFW -0.520 RFW -0.819 0.901 RWC -0.994** 0.603 0.864 Fo 0.929 -0.769 -0.925 -0.964* Fm -0.999** 0.550 0.833 0.998** -0.946 Fv/ Fm -0.971* 0.685 0.897 0.992** -0.990** 0.982* Fv/ Fo -0.984* 0.655 0.892 0.998** -0.979* 0.991** 0.998** RC 0.784 -0.724 -0.779 -0.839 0.931 -0.815 -0.894 -0.862 MDA 0.940 -0.606 -0.890 -0.934 0.870 -0.932 -0.908 -0.931 0.632 POD -0.816 0.904 1.000** 0.862 -0.925 0.831 0.896 0.890 -0.781 -0.886 SOD -0.684 0.978* 0.963* 0.755 -0.884 0.711 0.821 0.797 -0.819 -0.736 0.965* APX -0.951* 0.583 0.877 0.942 -0.871 0.942 0.913 0.937 -0.638 -0.999** 0.874 *和**分别表示差异达到5%和1%的显著水平 * and** indicate significance at the 5% and 1% levels, respectively.

表4 不同品种的13个指标之间相关性分析(Pearson相关系数) Table 4 Correlation analysis among 13 indices of all varieties (Pearson correlation coefficient)

表5
Table 5
表5(Table 5)

表5 13个指标的灰色关联系数矩阵 Table 5 Gray correlation coefficient matrix of 13 indices SII SFW RFW RWC Fo Fm Fv/ Fm Fv/ Fo RC MDA POD SOD SFW 0.570 RFW 0.694 0.716 RWC 0.877 0.582 0.614 Fo 0.678 0.607 0.563 0.736 Fm 0.939 0.580 0.601 0.927 0.645 Fv/ Fm 0.767 0.583 0.583 0.851 0.813 0.805 Fv/ Fo 0.821 0.586 0.637 0.922 0.744 0.867 0.911 RC 0.600 0.559 0.428 0.648 0.686 0.619 0.679 0.670 MDA 0.698 0.507 0.504 0.701 0.666 0.687 0.714 0.718 0.605 POD 0.692 0.720 0.984 0.694 0.618 0.690 0.664 0.702 0.512 0.585 SOD 0.578 0.826 0.672 0.620 0.628 0.605 0.626 0.639 0.530 0.487 0.681 APX 0.721 0.502 0.496 0.729 0.633 0.711 0.740 0.754 0.608 0.950 0.494 0.463

表5 13个指标的灰色关联系数矩阵 Table 5 Gray correlation coefficient matrix of 13 indices

为一类, 将地上部分鲜重、根鲜重、相对电导率、丙二醛3个抗氧化酶活性归为另一大类。在此可以粗略地认为第一类是表型可见或相关(叶片的伤害程度, 萎蔫失水状态叶绿素缺失变黄)的指标; 第二类则是要通过试验测定(生物量, 相对电导率, 代谢物丙二醛, 抗氧化酶活性)才能反映差异的一类指标。从关联度系数矩阵也可以认为这两大类指标对耐盐性的综合评价贡献率是有差异的。
2.2.2 两类指标的主成分分析 根据主成分分析原理, 当累积的方差贡献率达到85%以上时可以基本反映系统变异信息, 所以分别对这两类指标作主成分分析(表6)。对于C1类指标主成分进行线性组合, y_C1= 0.167 x₁+ 0.169 x₄+ 0.165 x₅+ 0.168 x₆+ 0.169 x₇+ 0.169 x₈。对于C2类指标主成分进行线性组合, y_C2= 0.149 x₂+ 0.167 x₃+ 0.148 x₉+ 0.139 x₁₀+ 0.150 x₁₁+ 0.167 x₁₂+ 0.161 x₁₃。
2.3 耐盐性综合评价以及与传统主成分分析方法比较由于主成分权重为其方差贡献率, 所以 h_C1= 0.984, h_C2= 0.851。则C1类综合指标得分为 F₁ = h_C1× Y_C1; C2类综合指标的得分为 F₂ = h_C2× Y_C2。两类指标权重的大小依据实际问题而定。就本试验来说, 观察到的表型性状较好地体现了不同品种之间耐盐性差异, 因此利用层次分析法(AHP)^{[ 24]}计算出指标聚类的权重 w₁= 0.585, w₂= 0.415。利用这两类指标主成分分析的得分值求得各个材料的综合耐盐 D值, D = F₁× w₁+ F₂× w₂, 再根据综合耐盐 D值评价参试品种耐盐性。与此同时用前人不对指标进行分类作传
表6
Table 6
表6(Table 6)

表6 C1、C2指标的主成分特征向量、主成分特征值、贡献率及累计贡献率 Table 6 Power vector (PV), eigenvalues (E), contribution rate (CR), and cumulative contribution rate (CCR) of principal components in C1 and C2 indices 分类 Classify 指标 Index 特征向量 PV 特征值 E 贡献率 CR (%) 累积贡献率 CCR (%) C1 SII 0.167 5.905 98.422 98.422 RWC 0.169 Fo 0.165 Fm 0.168 Fv/ Fm 0.169 Fv/ Fo 0.169 C2 SFW 0.149 5.954 85.056 85.056 RFW 0.167 RC 0.148 MDA 0.139 POD 0.150 SOD 0.167 APX 0.161

表6 C1、C2指标的主成分特征向量、主成分特征值、贡献率及累计贡献率 Table 6 Power vector (PV), eigenvalues (E), contribution rate (CR), and cumulative contribution rate (CCR) of principal components in C1 and C2 indices

表7
Table 7
表7(Table 7)

表7 4个棉花品种主成分分析得分及综合耐盐 D值与传统PCA分析方法的比较 Table 7 Comparison of score calculated by principal components and by traditional PCA analysis in four cotton varieties 早熟长绒7号 Zaoshuchangrong 7 中棉所35 CRI35 宿棉9108 Sumian 9108 南丹巴地大花 Nandanbadidahua C1类指标得分 Score of class C1 index ( F1) 0.915 0.962 0.078 0.011 C2类指标得分 Score of class C2 index ( F2) 0.919 0.567 0.133 0.097 PCA主成分得分Y1 PCA scores Y1 2.075 1.821 0.216 0.504 PCA主成分得分Y2 PCA scores Y2 0.387 -0.407 0.085 0.026 传统PCA综合得分 Traditional PCA score 1.854 1.529 0.199 0.441 田间特性 Characteristics of field 耐盐Tolerant 耐盐Tolerant 盐敏感Sensitive 盐敏感Sensitive 综合耐盐 D值 Consolidated D values 0.917 0.798 0.101 0.047 D值耐盐排序 Sort by salt D values 1 2 3 4 PCA耐盐排序 Sort by salt PCA values 1 2 4 3

表7 4个棉花品种主成分分析得分及综合耐盐 D值与传统PCA分析方法的比较 Table 7 Comparison of score calculated by principal components and by traditional PCA analysis in four cotton varieties

统的主成分分析, 然后将两者结果对比。
由表7可以看出综合耐盐指标既反映全体指标信息, 又体现指标聚类的重要程度。根据综合耐盐指标得分值的大小对不同棉花品种耐盐性强弱排序, 表明, 早熟长绒7号、中棉所35耐盐性较强; 南丹巴地大花、宿棉9108耐盐性弱, 这与在盐胁迫后观察的表型(盐害指数)是相符的。传统的分析方法也能将盐敏感和耐盐材料很好地划分, 但是对盐敏感性的强弱划分不及综合耐盐 D值。
2.4 棉花苗期耐盐性鉴定指标的筛选利用已经获得的综合耐盐 D值与13个盐胁迫相关的指标建立苗期耐盐鉴定回归方程, 由此筛选出苗期耐盐鉴定指标。以综合耐盐 D值为因变量, 各个指标相对值为自变量, 通过逐步回归分析建立最优的回归方程为 y= 1.943 x₇- 0.882 ( y为耐盐指数), 式中 x₇代表PSII最大光化学效率( F_v/ F_m)。直接通径系数为0.994, 而相关系数 r和决定系数 R²分别为0.994和0.988。 F值为166.270, 方程中 x₇和 y(耐盐指数)呈极显著相关( P=0.006)。由此说明 x₇可作为鉴定棉花苗期耐盐性的关键指标, 既科学合理, 又省时省力。
2.5 品种资源耐盐级别的划分为了陆地棉耐盐级别划分, 选择另外4个抗(感)性属于中间型的材料作为参考, 根据田间表型鉴定结果, 盐敏感材料常抗棉和中12高密选相对于南丹巴地大花和宿棉9108, 其盐敏感性稍弱; 而耐盐材料中07和秦荔514相对于早熟长绒7号和中棉所35, 其耐盐性稍弱。利用方程计算这4个材料的耐盐指数如表8所示, 结果与课题组早期田间鉴定结果一致。
通过最优方程获得8个材料的耐盐指数, 综合
表8
Table 8
表8(Table 8)

表8 4个陆地棉品种的田间鉴定特性与耐盐指数 Table 8 Characteristics evaluated in the field and salt tolerance index in four upland cotton varieties 中期库编号 Accession number 品种 Variety 来源 Origin 田间鉴定特性 Characteristics evaluated in the field 相对值 Relative value x 耐盐指数 Index of salinity tolerance M112697 常抗棉 Changkangmian 江苏常熟 Changshu, Jiangsu 盐敏感 Sensitive 0.673 0.426 M112777 中12高密选 Zhong 12 gaomixuan 山东高密 Gaomi, Shandong 盐敏感 Sensitive 0.692 0.463 M111944 中07 Zhong 07 河南安阳 Anyang, Henan 耐盐 Tolerant 0.847 0.764 M112897 秦荔514 Qinli 514 陕西渭南 Weinan,Shaanxi 耐盐 Tolerant 0.868 0.805

表8 4个陆地棉品种的田间鉴定特性与耐盐指数 Table 8 Characteristics evaluated in the field and salt tolerance index in four upland cotton varieties

考虑盐害, 分为高盐敏感( y< 0.300)、盐敏感(0.300 ≤ y≤ 0.500)、耐盐(0.500 < y≤ 0.700)和高耐盐( y> 0.700) 4个等级。相比田间鉴定结果, 利用方程进行等级划分, 可以获得更精细的分级结果。
2.6 最优方程准确性验证为验证本文获得的最优方程准确性, 利用已经
田间鉴定, 耐盐性明确的23份陆地棉材料进行验证, 按照前文所述的试验方法育苗处理, 测定其最大光化学效率( F_v/ F_m), 结果表明方程不仅可以很好地区分盐敏感品种和耐盐品种, 同时可以对盐敏感和耐盐的强弱进行更细致的划分, 获得更准确的结果(表9)。
表9
Table 9
表9(Table 9)

表9 23个陆地棉品种耐盐鉴定方程与田间鉴定结果的比较 Table 9 Comparison between salt tolerance equation and the field identification results in 23 upland cottons varieties 中期库编号 Accession number 品种名称 Variety 相对值 Relative value 耐盐指数 Salinity index 计算结果 Calculation result 田间鉴定结果 Field identification M112324 运93抗354 Yun 93 kang 354 0.917 0.900 高耐盐High tolerant 耐盐Tolerant M112337 辽96-63-70 Liao 96-63-70 0.727 0.530 耐盐Tolerant 耐盐Tolerant M112372 辽823-834-23 Liao 823-834-23 0.967 0.997 高耐盐High tolerant 耐盐Tolerant M112552 鲁458 Lu 458 0.885 0.837 高耐盐High tolerant 耐盐Tolerant M112567 中棉所30 CRI30 0.654 0.389 盐敏感Sensitive 盐敏感Sensitive M112568 中棉所31 CRI31 0.639 0.360 盐敏感Sensitive 盐敏感Sensitive M112570 豫棉19 Yumian 19 0.894 0.854 高耐盐High tolerant 耐盐Tolerant M112686 中棉所41 CRI41 0.939 0.943 高耐盐High tolerant 耐盐Tolerant M112705 鄂抗棉9号 Ekangmian 9 0.815 0.702 高耐盐High tolerant 耐盐Tolerant M112733 冀668 Ji 668 0.896 0.858 高耐盐High tolerant 耐盐Tolerant M112751 邯郸333 Handan 333 0.892 0.851 高耐盐High tolerant 耐盐Tolerant M112795 GK20 0.544 0.175 高盐敏感High sensitive 盐敏感Sensitive M112796 GK22 0.553 0.193 高盐敏感High sensitive 盐敏感Sensitive M112950 邯681 Han 681 0.791 0.656 耐盐Tolerant 耐盐Tolerant M114007 冀298 Ji 298 0.906 0.878 高耐盐High tolerant 耐盐Tolerant M114008 冀丰197 Jifeng 197 0.876 0.820 高耐盐High tolerant 耐盐Tolerant M114017 中2101 Zhong 2101 0.920 0.905 高耐盐High tolerant 耐盐Tolerant M131509 安集延6号 Anjiyan 6 0.940 0.945 高耐盐High tolerant 耐盐Tolerant M131613 DP410B 0.977 1.017 高耐盐High tolerant 耐盐Tolerant M131624 MSCO-11 0.960 0.984 高耐盐High tolerant 耐盐Tolerant M132651 Upland 0.968 0.998 高耐盐High tolerant 耐盐Tolerant M112233 冀资123 (冀棉25) Jizi 123 (Jimian 25) 0.985 1.032 高耐盐High tolerant 耐盐Tolerant M131395 DP2156 0.833 0.737 高耐盐High tolerant 耐盐Tolerant

表9 23个陆地棉品种耐盐鉴定方程与田间鉴定结果的比较 Table 9 Comparison between salt tolerance equation and the field identification results in 23 upland cottons varieties

3 讨论3.1 基于灰色关联聚类和主成分分析的耐盐性综合评价方法的优点棉花是耐盐性较强的经济作物之一, 但在盐胁迫条件下材料之间差别很大, 不同生育时期表型性状及生理生化特性相关, 而且与盐碱地浓度、盐碱类型、自然气候等密切相关, 是一个比较复杂的现象。因此给棉花耐盐鉴定工作带来了挑战。鉴定方法有较早的直接鉴定法包括形态观察法、产量比较法^{[ 1]}以及田间盐池鉴定^{[ 8]}, 参考的鉴定指标是相对成活苗率、盐害指数。其中田间盐池鉴定法是在盐池对4个棉花栽培种4078个品种苗期施加NaCl盐水, 保证含盐量0.3%~0.4%, 处理7 d后调查盐害症状。通过调查不同盐害级别数目计算出各个品种盐害指数, 最后筛选出高耐盐和耐盐的品种19份。后来研究建立的室内鉴定的生理生化指标测定方法均是间接鉴定法, 涉及到较多生理生化指标, 还有Na⁺、K⁺离子含量等^{[ 25]}。
目前众多作物耐盐性鉴定是采用多种表型性状指标、生理生化指标等综合评价的, 只是在分析方法上各有不同。从早期的方差分析和系统聚类法^{[ 26]}到后来的主成分分析法^{[ 27]}和隶属函数分析法^{[ 28]}, 最近刘雅辉等^{[ 29]}综合上述3种方法用主成分分析筛选出的生理指标进行耐盐性综合评价的结果与盐害指数为鉴定指标评价的结果相关度达到0.990, 筛选出的3个生理指标(K⁺/Na⁺值、相对含水量和膜透性)作为棉花苗期耐盐鉴定的综合评价指标是可靠的。但是由于各个指标之间存在着不同程度的相关性, 致使提供的信息产生交叉与重叠, 主成分分析虽然可以利用降维的方法减少指标的数量, 对耐盐性进行定量, 但是由于其基于全体指标数据笼统降维, 没有考虑不同类型指标间权重差异。因此只有基于同类指标筛选, 才能够找到反映棉花耐盐性的关键指标。
本文利用灰色关联聚类方法将4个不同耐盐品种材料的13个指标分成两类指标集合, 从表5关联度系数矩阵也反映出这两大类指标对耐盐性的综合评价贡献率是有差异的, 也证实我们的推断是合理的。分别对这两类具有潜在关联的指标进行主成分分析, 可以消除指标间信息的多重相关性, 避免了直接主成分分析, 得出耐盐指数方程和关键指标。最后利用回归方程选择23份棉花品种试验验证耐盐性与本课题组大田鉴定结果相一致。最后我们认为聚类权重确定中的层次分析法与主成分分析的客观分析相结合, 对同类指标主成分分析比传统的对全体指标的主成分分析(PCA)更易于解释, 更具合理性和客观性。这对于在棉花耐盐性鉴定以及抗逆育种研究具有一定的借鉴性。
3.2 适用于棉花品种资源苗期耐盐性大规模鉴定的方法棉花在不同生长时期, 耐盐性差异较大^{[ 30]}, 一般认为三叶期为鉴定棉花耐盐性最佳时期, 同时相对其他时期, 苗期鉴定的周期短, 重复性好, 可操作性强^{[ 1, 31]}。此外, 对于众多的品种资源及育种中产生的不同耐盐品系简单快速筛选可降低选择的盲目性。大田工作量以及天气的影响, 更要求进而加快筛选进程。对于通过育苗移栽方式进行种植的盐碱地区, 更需要及时了解材料苗期耐盐性^{[ 2]}, 从而服务于育种。
对棉花品种资源进行大规模的筛选, 解决育种生产的迫切需要, 必须首先建立起一套高效简单的棉花品种资源耐盐性鉴定方法。筛选多个关键指标进行评价固然可以更准确地反映作物真实的耐盐性, 然而如果能够找到一个关键可靠的指标, 对棉花品种资源苗期的耐盐性进行评价, 将有利于大规模品种资源鉴定筛选, 极大地提高效率。而本文的结果就证明了“最大光化学效率相对值”可作为唯一指标对陆地棉苗期耐盐性进行鉴定
前人研究证明, 盐胁迫可使光合系统PSI和PSII的捕光色素蛋白复合体受损或部分降解, 导致叶绿体吸能和传递能力大大降低, 反应中心不能充分得到用于转化成生物化学能的激发能, 而且随着盐浓度的提高, PSII的电子传递速率明显下降^{[ 32]}。林世清等^{[ 33]}认为测定植物光合作用过程中光系统对光能的吸收、传递、耗能和分配, 是诊断植物体光合系统运转状况、分析植物对逆境响应机理的重要方法。许多研究表明, 逆境胁迫程度与植物体内叶绿素荧光参数( F_o和 F_m等)变化呈显著相关, 可作为植物抗逆性鉴定的指标^{[ 33, 34]}。王仁雷等^{[ 35]}研究用NaCl处理耐盐性不同的水稻品种叶片的PSII光化学效率( F_v/ F_m)后发现, NaCl胁迫下, Pokkali和Peta叶片中 F_v/ F_m降低, 且胁迫时间越长, 浓度越大, 下降的程度也越大。Everard等^{[ 36]}从荧光动力学角度研究盐胁迫对PSII光能利用和耗散的影响结果表明, 在盐胁迫下, 随着叶绿体片层结构的逐渐降解, 最大光化学反应效率( F_v/ F_m)不可避免地下降,导致光合速率下降。高NaCl浓度下PSII反应中心光能利用效率受到极大损害, PSII潜在热耗散能力较低, 功能受到抑制。张国伟等^{[ 37]}报道指出棉花叶片最大光化学效率( F_v/ F_m)增加量与盐胁迫处理后棉花蕾期和花铃期叶片Na⁺离子含量均呈极显著正相关, 盐胁迫处理降低了棉花功能叶最大光化学效率。 F_v/ F_m反映PSII反应中心最大光能转化效率, F_v/ F_m的降低表明植物受到光抑制^{[ 38]}。本研究用高NaCl浓度(40 g L^-1)处理三叶期幼苗72 h表型上看耐盐品种盐害指数、叶片的失绿程度明显低于盐敏感品种, 耐盐品种最大光化学反应效率( F_v/ F_m)相对值为0.900和0.889, 而盐敏感品种则为0.461和0.526, 相关性分析表明 F_v/ F_m与盐害指数呈显著负相关, 说明盐胁迫大大降低单位面积叶绿素的含量、叶绿体对光能的吸收能力、PSII最大光化学反应效率( F_v/ F_m)。这些变化加剧了植物的光抑制, 光合放氧和碳同化能力下降, 不利于光合产物的积累。而耐盐品种早熟长绒7号和中棉所35叶片受光抑制程度小, 更有效地减少盐分处理下过量激发能对光合机构的伤害, 保证PSII反应中心的相对稳定。这也说明PSII最大光化学反应效率( F_v/ F_m)在抗感材料之间受盐胁迫差异较大, 可以作为棉花品种资源耐盐性鉴定的重要指标。本文研究以耐盐综合 D值为因变量, 各个指标相对值作为自变量, 通过逐步回归分析建立最优的回归方程中只含有最大光化学效率( F_v/ F_m)指标, 说明此指标与陆地棉苗期耐盐性影响极显著。进一步对23个已知耐盐性的材料鉴定发现, 该方程不仅可以准确地区分耐盐和盐敏感材料, 同时可以根据y值和我们设定的标准对材料耐盐(盐敏感)程度进行定量, 如果用于盐池, 将有利于对群体进行鉴定, 提高QTL定位或者关联分析的准确性。所选择指标的测定快速方便, 不伤植株, 还可根据需要加以改进, 从而应用于更广阔的领域。

4 结论在可控条件下以沙土为基质, 4% NaCl溶液浇灌棉花幼苗, 持续处理72 h, 利用统计学方法, 从测定的13个棉花耐盐相关指标中筛选出最大光化学效率( F_v/ F_m)作为最优指标, 建立回归方程, 依据耐盐指数( y)划分出耐盐性等级, 建立了一套陆地棉苗期耐盐性的鉴定方法。经验证, 该方法可以对陆地棉品种资源苗期耐盐性进行大规模的鉴定。
致谢: 感谢长江大学付鹏同学在温室鉴定试验中给予的大力协助。
The authors have declared that no competing interests exist.
作者已声明无竞争性利益关系。The authors have declared that no competing interests exist.

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