, 郑平1,2, 孙际宾1,2 1. 中国科学院系统微生物工程重点实验室 天津工业生物技术研究所，天津 300308;
2. 国家合成生物技术创新中心，天津 300308
收稿日期：2020-10-11；接收日期：2020-12-02；网络出版时间：2020-12-22
基金项目：国家重点研发计划(No. 2018YFA0901400)，国家自然科学基金(Nos. 32070083, 31870044) 资助
作者简介：王钰??中国科学院天津工业生物技术研究所副研究员、硕士生导师，2016年于上海交通大学获得博士学位。主要从事工业微生物高效基因组编辑工具的开发和碳一原料的生物转化研究。以第一/通讯作者在Trends Biotechnol、Metab Eng、Green Chem、Biosens Bioelectron、JBC等期刊发表论文20余篇，申请专利10余项。现主持国家自然科学基金面上项目、国家自然科学基金青年项目、科技部重点研发计划合成生物学专项子课题等项目。曾获上海市明治生命科学奖、天津市优秀科技志愿者等荣誉;
郑平??中国科学院天津工业生物技术研究所研究员、博士生导师，入选天津市滨海新区“131”人才工程，天津市三八红旗手。长期从事细菌的代谢工程和系统生物学研究，致力于创建绿色、高效、低成本的生物制造体系，提升推动传统生物及化工企业转型升级。先后在Metab Eng、ACS Synth Biol、Biotechnol Biofuels、AEM等国际学术期刊上发表论文60余篇，申请中国专利50余项，PCT专利3项，获得授权22项，其中，日本、美国等国际专利授权6项.
摘要：谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum是重要的工业微生物，尤其是在氨基酸工业中，每年用于600余万t氨基酸的生物制造。近年来，谷氨酸棒杆菌代谢工程使能技术正在不断完善，不仅加快了细胞工厂的创建和优化，拓展了底物谱和产物谱，也推动了谷氨酸棒杆菌的基础研究，使谷氨酸棒杆菌成为代谢工程的理想底盘细胞。文中综述了近期针对谷氨酸棒杆菌开发的代谢工程使能技术，着重介绍了基于CRISPR的基因组编辑、基因表达调控、适应性进化和生物传感器等技术的开发和应用。
关键词：谷氨酸棒杆菌代谢工程基因组编辑表达调控适应性进化生物传感器
Recent advances in developing enabling technologies for Corynebacterium glutamicum metabolic engineering
Yu Wang1,2
, Ping Zheng1,2, Jibin Sun1,2 1. Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Tianjin 300308, China;
2. National Technology Innovation Center of Synthetic Biology, Tianjin 300308, China
Received: October 11, 2020; Accepted: December 2, 2020; Published: December 22, 2020
Supported by: National Key Research and Development Program of China (No. 2018YFA0901400). National Natural Science Foundation of China (Nos. 32070083, 31870044)
Corresponding author: Yu Wang. Tel/Fax: +86-22-84861943; E-mail: wang_y@tib.cas.cn;
Ping Zheng. Tel/Fax: +86-22-84861994; E-mail: zheng_p@tib.cas.cn.
Abstract: Corynebacterium glutamicum is an important workhorse of industrial biotechnology, especially for amino acid bioindustry. This bacterium is being used to produce various amino acids at a level of over 6 million tons per year. In recent years, enabling technologies for C. glutamicum metabolic engineering have been developed and improved, which accelerated construction and optimization of microbial cell factoriers, expanding spectra of substrates and products, and facilitated basic researches on C. glutamicum. With these technologies, C. glutamicum has become one of the ideal microbial chasses. This review summarizes recent key technological developments of enabling technologies for C. glutamicum metabolic engineering and focuses on establishment and applications of CRISPR-based genome editing, gene expression regulation, adaptive laboratory evolution, and biosensor technologies.
Keywords: Corynebacterium glutamicummetabolic engineeringgenome editingexpression regulationadaptive laboratory evolutionbiosensor
谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum是一株来源于土壤的革兰氏阳性细菌。20世纪50年代，日本协和发酵工业株式会社首次开发了谷氨酸棒杆菌发酵生产l-谷氨酸的工艺，展示了该菌在氨基酸工业生产中的巨大潜力[1]。目前，谷氨酸棒杆菌每年被用于生产包括l-谷氨酸和l-赖氨酸在内的600余万t氨基酸产品[2]。由于具有生物安全(被美国FDA认定为GRAS，Generally regarded as safe)、生长速度快、营养需求低、底物谱广等优势，谷氨酸棒杆菌被认为是生物制造的理想微生物底盘[3]。
由于谷氨酸棒杆菌的重要应用价值，大量研究致力于开发可用于该微生物遗传改造的工具方法。20世纪90年代初，研究者建立了谷氨酸棒杆菌的外源DNA转化方法，使用基于自杀质粒的同源重组和转座子插入等方法，实现了基因组的改造。21世纪初，德国和日本的研究人员分别公布了模式菌株ATCC 13032的全基因组序列，为深入理解和系统改造谷氨酸棒杆菌奠定了基础[4]。代谢工程概念的提出，转变了研究人员长期依赖诱变筛选策略获得新菌种的育种模式，转而用更理性的方式对谷氨酸棒杆菌的代谢和调控网络进行改造和重构，极大地加速了谷氨酸棒杆菌的应用和基础研究[5]。目前谷氨酸棒杆菌已被改造用于氨基酸、有机酸、醇类、植物天然产物、蛋白质等70余种产品的生物制造，产值超过千亿元[2, 6]。文中总结了针对谷氨酸棒杆菌开发的基因组编辑、基因表达调控、适应性进化、生物传感器等代谢工程使能技术，并概述了这些使能技术在创建谷氨酸棒杆菌细胞工厂中的应用。
1 基于CRISPR的基因组编辑CRISPR/Cas (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein)系统已广泛应用于多种真核和原核生物的基因组编辑[7]。但该系统对谷氨酸棒杆菌的毒性较大，直至2017年，CRISPR/Cas12a (CRISPR/Cpf1) 和CRIPSR/Cas9系统才成功应用于谷氨酸棒杆菌的遗传改造[8-10]。借助CRISPR/Cas系统的高效反筛能力，大片段基因敲除和敲入效率得到提高，操作流程得到简化[10]。进一步结合RecT介导的单链DNA重组[10-12]和碱基脱氨酶催化的胞嘧啶/腺嘌呤脱氨[13-15]，还可实现染色体的小幅改动和多靶点同时编辑，极大地丰富了谷氨酸棒杆菌的遗传改造方法，为谷氨酸棒杆菌的代谢工程和合成生物学研究提供了技术支持(图 1)。
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| 图 1 基于CRISPR的谷氨酸棒杆菌基因组编辑技术 Fig. 1 CRISPR-based genome editing technologies for C. glutamicum. (A) CRISPR/Cas-mediated gene deletion with plasmid-borne templates. (B) CRISPR/Cas-mediated ssDNA recombineering for introducing small modifications with ssDNA templates. (C) Base editing with nCas-nucleobase deaminase fusion protein for introducing base changes. |
| 图选项 |
1.1 基因敲除和敲入敲除内源基因和敲入异源基因是重构微生物代谢和调控的基本策略。基于自杀质粒pK18mobsacB的经典方法已经广泛应用于谷氨酸棒杆菌的基因敲除和敲入，几乎可以在染色体任何位置进行遗传改造[16]。但是，该方法需要进行两轮同源重组和两轮筛选，分别使用抗生素抗性基因和蔗糖致死基因sacB作为筛选标记，后者易被失活，导致反向筛选失效；尤其在敲除对生长造成负面影响的基因时，成功率较低。借助CRISPR/Cas系统，可实现更高效的反向筛选，从而富集被成功编辑的细胞。该方法的原理为，在未编辑的细胞中，Cas蛋白在引导RNA (Guide RNA，gRNA) 的引导下，通过识别前间隔序列邻近基序(Protospacer adjacent motif，PAM) 序列和靶序列，结合到特定位点，并引入对细菌致死的双链DNA切割(Double-stranded DNA break，DSB)；而在成功编辑的细胞中，靶位点被改变，因此Cas-gRNA复合体无法结合并引入DSB，细胞得以存活(图 1A)[17]。
目前应用最为广泛的CRISPR/Cas系统为来自酿脓链球菌Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas9系统。该系统识别NGG的PAM序列，结合特异性高，切割效率高，非常适合于高GC含量的谷氨酸棒杆菌基因组编辑。但是，研究发现，携带cas9基因的质粒难以转化进入谷氨酸棒杆菌，说明谷氨酸棒杆菌对Cas9造成的细胞毒性较为敏感[9]。Jiang等使用新凶手弗朗西斯菌Francisella novicida的FnCas12a代替Cas9进行基因组编辑。Fncas12a和gRNA的表达盒，以及同源重组所需DNA模板可整合在一个工具质粒上，利用该系统，作者实现了最长7.5 kb的片段敲除，效率最高达到(46.7±9.4)%[9]。但是，FnCas12a识别富含T的PAM序列TTTN，这导致其在高GC含量的谷氨酸棒杆菌基因组中的靶位点数量受限。
与此同时，Liu等和Peng等分别开发了适用于谷氨酸棒杆菌的CRISPR/Cas9系统，实现了高效的大片段敲除和敲入。两个研究均使用了双质粒系统，分别用于表达cas9和gRNA+同源臂片段[10, 18]。以Liu等报道的方法为例，首先，选择严谨的Ptac启动子减少cas9的泄露表达，克服Cas9的细胞毒性；使用TrrnB终止子替代酿脓链球菌gRNA的终止子，提高gRNA转录终止效率，成功在谷氨酸棒杆菌中构建了基于CRISPR/Cas9的反向筛选系统，实现了利用质粒携带同源臂片段进行基因敲除。但是，敲除过程中仍发现大量的假阳性转化子，对其中的工具质粒进行测序，作者发现cas9基因内部存在失活基因的随机突变。为降低假阳性率，开发了双质粒一步共转化结合平板筛选的策略，尽量缩短工具质粒在细胞中的复制时间，减少cas9基因突变失活的概率。该策略成功提升了基因敲除和敲入效率，在模式菌株ATCC 13032中分别达到60%和62.5%，在模式菌株ATCC 13869和谷氨酸工业菌株SL4中也可实现高效的编辑[10]。随后，有多个研究团队对基于CRISPR/Cas的谷氨酸棒杆菌基因敲除和敲入方法进行了系统优化，不断提升编辑效率[11, 19-22]。
1.2 单链DNA重组谷氨酸棒杆菌中外源双链DNA (Double- stranded DNA，dsDNA) 模板与染色体DNA的同源重组效率较低，Binder等在谷氨酸棒杆菌中表达异源的RecT，实现了外源单链DNA (Single- stranded DNA，ssDNA) 模板与染色体DNA高效的同源重组[23]。但是当时缺乏有效的突变体筛选方法，只能借助流式细胞分选技术(Fluorescence- activated cell sorting，FACS) 筛选具有特殊表型，如具有荧光信号输出的突变体。谷氨酸棒杆菌中CRISPR/Cas系统的建立，使得筛选ssDNA重组编辑的突变体成为可能(图 1B)。CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a系统均成功与ssDNA重组相结合，用于谷氨酸棒杆菌染色体DNA的小幅改动，编辑效率高达100%[8-10, 12]。使用该方法，一次可获得数百个正确编辑的克隆。因此，该方法被用于构建靶基因单个位点的突变文库。Jiang等和Krumbach等分别利用该方法构建了γ-谷酰基激酶和机械敏感通道蛋白MscCG的单氨基酸突变文库，筛选得到解除产物反馈抑制和外排谷氨酸能力增强的突变体[9, 12]。ssDNA重组高效的编辑能力，使得同时编辑多个靶点成为可能。Liu等使用两条ssDNA，表达两个gRNA，结合CRISPR/Cas9筛选，成功实现了双基因的同时编辑，效率达到40%。但是，双靶点编辑使获得的克隆数大幅下降(约10个)，难以进行更多靶点的同时编辑[10]。
1.3 碱基编辑上述基因组编辑方法均基于dsDNA或ssDNA模板与染色体DNA的同源重组，以及CRISPR/Cas系统对未发生同源重组细胞的反向筛选。但是，一方面谷氨酸棒杆菌的同源重组效率较低，另一方面，具有dsDNA切割活性的Cas蛋白对细胞的毒性较强，导致被成功编辑的细胞数量较少，难以实现多于2个靶点的同时编辑[10]。基于以上考虑，新兴的碱基编辑(Base editing) 技术被应用于谷氨酸棒杆菌的基因组编辑[13-15]。2016年Komor等和Nishida等分别开发了真核细胞的BE (Base editor) 和Target-AID (Target- activation-induced cytidine deaminase) 碱基编辑技术[24-25]。该技术将CRISPR/Cas系统的定位功能和碱基脱氨酶的脱氨功能相结合，使用dsDNA切割功能受损的Cas突变体(dCas或nCas) 与碱基脱氨酶的融合蛋白，在gRNA的引导下，将靶位点的胞嘧啶(C) 脱氨生成尿嘧啶(U)，U在DNA复制过程中被DNA聚合酶识别为胸腺嘧啶(T)，借此实现靶位点C-T的碱基转换(Transversion) (图 1C)。之后，研究者陆续开发了可实现A-G转换、C-A颠换(Transition) 和C-G颠换的碱基编辑技术[26-28]。
由于碱基编辑不依赖于外源DNA模板与染色体DNA的同源重组，不产生对细菌致死的DSB，因此非常适合于谷氨酸棒杆菌等细菌的基因组编辑，尤其是多靶点的同时编辑[29]。Wang等首先在谷氨酸棒杆菌中建立了Target-AID系统并进行了系统的测试。nCas9(D10A)-AID的融合蛋白比dCas9-AID和nCas9(H840A)-AID具有更高的编辑效率，可在PAM区5′上游?20至?16位(PAM序列NGG为0至2位) 高效地引入C-T转换，对单靶点、双靶点和三靶点的编辑效率可分别达到100%、87.2%和23.3%。C-T转换可用于在基因内部制造终止密码子(例如CAA转换为TAA)，从而失活靶基因，达到与基因敲除类似的效果。作者利用Target-AID的多靶点高效编辑能力，构建了pyk、ldhA和odhA等3基因的组合失活文库，并结合高通量筛选，筛选出最有利于l-谷氨酸生产的基因组合失活模式，为快速研究多基因的组合功能提供了借鉴[14]。
基于nCas9(D10A)-AID的碱基编辑方法，需要识别NGG的PAM序列，才可在PAM序列的5′上游进行碱基编辑，这限制了谷氨酸棒杆菌基因组中可编辑的靶点数量。为此，Wang等使用多个具有不同PAM偏好性的nCas9(D10A) 突变体，如nCas9-NG和xnCas9 3.7等，使碱基编辑器可识别的PAM从NGG扩展为NG，将用于制造终止密码子失活基因的可编辑靶点数量提高了3.9倍。在模式菌株ATCC 13032的3 099个基因中，3 075个基因可通过改进后的碱基编辑方法失活。为拓展碱基编辑的类型，作者在谷氨酸棒杆菌中重现了哺乳动物细胞的腺嘌呤碱基编辑技术(Adenine base editing)，实现了A-G转换[13]。之后，李俊维等对培养基、诱导剂用量、编辑时长等进行了系统优化，进一步提升了Target-AID在谷氨酸棒杆菌中的编辑效率[30]。此外，黄华媚等在谷氨酸棒杆菌中开发了基于BE的胞嘧啶碱基编辑器[31]；Deng等在谷氨酸棒杆菌中将胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑技术融合，构建了一个双功能的碱基编辑器，可在靶位点附近同时实现C-T和A-G转换，在对靶位点进行突变时，可获得更多样的单核苷酸多态性[15]。
2 基因表达调控2.1 启动子与RBS元件调控基因的表达水平是常用的代谢工程策略。使用具有不同强度的启动子和核糖体结合位点(Ribosome binding site，RBS)，可分别在转录和翻译水平对靶基因的表达水平进行精细的调控。Albersmeier等通过对谷氨酸棒杆菌的转录起始位点进行系统的分析，鉴定了大量内源的启动子，为进一步的启动子表征和应用奠定了基础[32]。Shang等对16个内源启动子进行了表征，这些启动子可覆盖31倍的表达强度，利用它们调控sucCD的表达，可提高l-赖氨酸的产量[33]。Li等基于RNA测序数据，对谷氨酸棒杆菌中90个200?500 bp的启动子-5′-UTR序列进行了表达强度表征，鉴定了比常用组成型启动子Psod-UTR强5倍的启动子PNCgl1676-UTR，以及受l-甲硫氨酸激活的启动子PbrnF-UTR和受l-赖氨酸抑制的启动子PNCgl1202-UTR[34]。王迎春等基于时间序列转录组筛选到谷氨酸棒杆菌高效的内源组成型启动子PcysK、PgapA和PfumC，其中最强的PcysK启动子在部分测试菌株中强于IPTG诱导型启动子Ptac[35]。
除内源启动子外，研究者还开发了大量适用于谷氨酸棒杆菌的异源和合成启动子。例如，Kortmann等将来自大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) 的T7表达系统转移至谷氨酸棒杆菌，实现了靶基因的严谨可控和高水平的表达[36]。Yim等利用70 bp的随机序列构建了一个合成启动子文库，使用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP) 作为报告基因，结合FACS筛选获得20个具有不同强度的组成型启动子元件，荧光强度介于100–1 200之间[37]。Patek等基于谷氨酸棒杆菌启动子?10区保守序列和大肠杆菌?35区保守序列，并在?35区上游添加一段额外的富含AT的序列，构建了4个组成型启动子文库。此外，作者还以大肠杆菌的lac启动子为基础，对?35区和?10区间的17 bp进行随机突变，构建了一个诱导型启动子文库，诱导强度范围为7?59倍[38]。构建合成启动子文库，调控基因表达已成为谷氨酸棒杆菌代谢工程的常用策略，已被用于l-苏氨酸、四氢嘧啶等高值化合物生产菌株的构建和改造[39-42]。
目前谷氨酸棒杆菌中使用的诱导型启动子，通常具有一定程度的泄露表达，当基因表达产物有毒性或影响中心代谢时，需要更严谨的诱导表达系统和代谢开关。Wiechert等借助谷氨酸棒杆菌的异种沉默(Xenogeneic silencing) 蛋白CgpS和葡萄糖酸响应调控因子GntR，构建了一个严谨的葡萄糖酸诱导激活和诱导沉默系统。该系统使用了融合了噬菌体启动子PpriP和GntR结合域的合成启动子，当不添加葡萄糖酸时，GntR与启动子结合，阻止了CgpS与启动子的结合，下游基因的转录被激活；当添加GntR的效应物葡萄糖酸时，葡萄糖酸与GntR结合，导致GntR从启动子处脱落，CgpS与启动子结合，抑制下游基因的表达。该诱导型启动子被用于调节丙酮酸脱氢酶复合体的表达，实现细胞生长和l-缬氨酸生产状态的切换[43]。
在细胞特定生长时期激活转录的自诱导型启动子可避免诱导剂的使用，在基因表达调控中也具有广泛的应用。Kim等发现sigma因子B (SigB) 依赖型的Pcg3141启动子在对数期与稳定期的过渡时期被激活，以此为基础，作者构建了合成启动子文库，筛选得到比野生型启动子诱导幅度高3.5倍，最高表达强度高20倍的自诱导型启动子，并用于谷胱甘肽硫转移酶的表达[44]。
除了启动子文库，RBS文库也常用于谷氨酸棒杆菌的基因表达调控。Zhang等以AAAGG(N)6?9序列进行RBS文库构建，并使用了靶基因与GFP的融合蛋白作为报告系统，针对莽草酸合成途径的aroGBDE基因进行RBS表征和筛选。通过在文库中选择不同强度的RBS，作者优化了aroGBDE基因的表达水平，提高了莽草酸的产量[45]。此外，Schneider等和Henke等的研究表明，RBS与下游基因起始密码子之间的序列也显著影响靶基因表达，通过对该区域进行文库构建，优化相关基因的表达，可提高丁二胺和虾青素等产物的产量[46-47]。
2.2 CRISPR干扰当需要抑制细胞生长必需基因，或者需要研究大量靶基因的表达弱化对细胞生长和代谢的影响时，对靶基因进行编辑将非常困难，且耗时耗力。因此，需要方便、高效的基因表达弱化工具。CRISPR干扰(CRISPR interference，CRISPRi) 技术是使用DNA切割功能失活的Cas突变体(Catalytically inactivated Cas，dCas)，在gRNA的引导下，结合到靶基因位置，影响RNA聚合酶的结合，从而抑制靶基因的转录(图 2A)[48]。Cleto等最先在谷氨酸棒杆菌中开发了基于CRISPR/dCas9的CRISPRi方法。该方法使用双质粒系统和IPTG诱导型启动子Ptac控制dCas9和gRNA的表达，以pgi、pck和pyk作为靶基因，当靶向基因的非模板链时，弱化效率均可达到97%以上，可获得与基因敲除相似的l-赖氨酸和l-谷氨酸产量提升效果[6]。Park等同样使用了类似的双质粒系统，分别以四环素诱导型启动子和组成型启动子控制dCas9和gRNA的表达，并通过同时表达两个gRNA，实现了双基因的表达弱化[49]，作者使用该方法快速鉴定了谷氨酸棒杆菌中未知的羧酸酯酶编码基因[50]。该研究团队随后构建了一个单质粒的CRISPRi系统，并在基因工程谷氨酸棒杆菌中通过弱化acn基因提高了丁酸产量[51]，通过弱化idsA基因提高了角鲨烯产量[52]。Gauttam等同样构建了一个单质粒CRISPRi系统，但是分别使用四环素和IPTG诱导型启动子控制dCas9和gRNA的表达，也可用于双基因的同时弱化[53]。
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| 图 2 谷氨酸棒杆菌的转录和翻译抑制技术 Fig. 2 Technologies for transcription and translation repression in C. glutamicum. (A) Transcription repression via CRISPRi. (B) Translation repression via synthetic sRNA. |
| 图选项 |
基于CRISPR/dCas9的CRISPRi工具可高效抑制靶基因的表达。但是，Cas9无法自加工gRNA阵列(gRNA array) 形成多个成熟的gRNA (Mature gRNA)。因此，在同时靶向多个基因时，需要在质粒上插入多个启动子、终止子等序列高度相似的gRNA表达盒，导致质粒构建过程烦琐，质粒稳定性差。因此，目前只有使用CRISPR/dCas9进行双基因弱化的报道[49, 53]。CRISPR/Cas12a具有切割RNA和DNA的双重功能，可加工gRNA阵列成为单个的成熟gRNA，在多基因调控中有明显的优势。Li等利用DNA切割功能失活的dCas12a和一个gRNA阵列，实现了gltA、pck、pgi和hom等4个基因的同时弱化，每个基因的弱化效率均超过90%，可快速筛选有利于l-赖氨酸生产的表型[54]。Liu等使用具有RNA和DNA切割活性的Cas12a，结合截短的gRNA (15 nt或16 nt)，不会引入DSB，但可实现高效的基因表达弱化[19]。
2.3 人工小RNA介导的基因表达弱化不同于在转录水平抑制基因表达的CRISPRi技术，人工小RNA (Synthetic small regulatory RNA，sRNA) 可在翻译水平实现基因表达弱化。该技术的原理为sRNA与其分子伴侣蛋白Hfq形成复合体，与靶基因的mRNA结合，并招募RNA酶降解mRNA，实现基因表达弱化(图 2B)[55]。Sun等使用大肠杆菌来源的MicC sRNA结构和Hfq，在谷氨酸棒杆菌中建立了该系统。sRNA的表达盒和hfq基因均由组成型启动子P11F控制。sRNA包含与靶mRNA互补的24 bp结合区，以及MicC结构域。通过对报告基因gfp和内源基因pyk、ldhA和odhA的测试，该系统对靶基因的表达弱化效率超过80%，有望加快谷氨酸棒杆菌的代谢工程研究[56]。
3 适应性进化新型的基因组编辑与基因表达调控技术提高了研究人员对谷氨酸棒杆菌的代谢改造和调控能力。但是对于一些遗传靶点未知或代谢调控机制复杂的生物学表型，难以通过理性的遗传改造实现。适应性进化技术在此方面有独特的优势，已被广泛应用于提高谷氨酸棒杆菌的生长速度、压力耐受性和底物利用能力等，在提高小分子化合物的合成能力方面也展现出应用潜力[57]。
3.1 直接适应性进化在特定条件下直接对菌株进行适应性进化是最常用的进化方法，适合于提高菌株的生长速度和压力耐受性等。生长速度是菌株的一个关键指标，对于代谢工程应用十分重要。多个团队尝试提高谷氨酸棒杆菌在基本培养基中利用葡萄糖的生长速度[58-60]。例如，Pfeifer等通过适应性进化，将谷氨酸棒杆菌的比生长速率提高至0.67 h?1，较出发菌株提高了26%，并鉴定了pyk、fruK和corA等基因的关键突变[59]。Graf等在不含原儿茶酸的培养基中对谷氨酸棒杆菌进行进化，筛选获得了可在不含原儿茶酸的基本培养基中快速生长的突变株，比生长速度达到0.54 h?1[61]。
针对谷氨酸棒杆菌在工业化应用中可能面临的环境压力和抑制因子，研究者通过在逆境下对谷氨酸棒杆菌进行适应性进化，提高了菌株的耐受性。Oide等和Leszczewicz等通过高温下的适应性进化，提高了谷氨酸棒杆菌在高于40 ℃条件下的生长速度[62-63]。Oide等还发现高温耐受突变株同时具有更强的有机溶剂耐受性，通过对突变株的基因组分析，推测耐受表型可能与能量代谢的变化相关[62]。廉价生物质原料如木质纤维素水解液中常含有糠醛等抑制微生物生长的化合物，Wang等使用含有玉米秸秆水解液的培养基中连续培养谷氨酸棒杆菌，筛选获得了对糠醛、香兰素、乙酸等抑制物具有更强耐受性和降解能力的突变株[64]。
3.2 代谢途径改造辅助的适应性进化当需要提高菌株对非天然碳源的利用能力或特定酶的活性时，可首先对菌株的代谢途径进行理性改造，将菌株对特定底物的利用能力或特定酶的催化活性与细胞生长速度偶联，再结合适应性进化获得理想的突变株或突变体。为提高谷氨酸棒杆菌对廉价一碳原料甲醇的利用能力，Tuyishime等在谷氨酸棒杆菌中引入了异源的甲醇利用途径，并敲除了戊糖磷酸途径的rpiB基因，将甲醇利用与细胞生长相偶联，构建了甲醇依赖型菌株；进而通过甲醇和木糖共利用的适应性进化，将菌株利用甲醇的生长速度提高了20倍[65]。Wang等进一步在高甲醇浓度下对甲醇依赖型菌株进行第二轮进化，提高甲醇耐受性的同时提高了菌株对甲醇的利用速率[66]。为提高丙酮酸的供给，为l-缬氨酸合成提供更多前体，Schwentner等[67]敲除了谷氨酸棒杆菌的草酰乙酸回补基因ppc和pyc，但是严重影响了菌株利用葡萄糖的生长速度，经过适应性进化，菌株以葡萄糖为唯一碳源的生长速度恢复到0.31 h?1。通过对突变株的测序，发现突变株的异柠檬酸脱氢酶失活，乙醛酸支路激活，从而增强草酰乙酸的回补，该菌株同时表现出更强的l-缬氨酸合成能力[67]。
通过对内源代谢途径进行改造，可将关键酶的活性与菌株生长速度相关联，快速对靶标酶的活性进行进化。例如，Dele-Osibanjo等通过失活谷氨酸棒杆菌的果糖-6-磷酸激酶(6-phosphofructokinase，PFK)，阻断糖酵解途径，并引入异源的转酮酶(Phosphoketolase，PKT)，使细胞通过非氧化糖酵解(Non-oxidative glycolysis，NOG) 代谢葡萄糖。借此，将细胞生长速度与PKT的活性相关联。进一步将PKT的随机突变文库转入PFK敲除的突变株中，通过简单的连续传代培养，富集筛选到高活性的PFK突变体，展示了代谢工程结合适应性进化在酶定向进化中的应用前景[68]。
3.3 荧光报告系统辅助的适应性进化当需要进化的表型难以与细胞生长相关联时，可通过报告系统将目标表型转化为易于检测和筛选的信号，实现高通量和高选择性的进化，加快菌株表型的提升速度。由于荧光蛋白输出的荧光信号易于检测，可使用FACS进行高通量筛选，因此，荧光报告系统是目前最常使用的报告系统之一。Choi等为提高谷氨酸棒杆菌的重组蛋白表达量，以gfp为报告基因，在适应性进化过程中，使用FACS分选荧光信号较强的细胞，再继续进行传代进化，共经过7代进化和筛选，获得了荧光信号提升4.5倍的突变株。进一步的测序分析表明，该突变株中质粒的parB基因突变，使质粒拷贝数提升约10倍，致使GFP表达水平大幅提升[69]。另一种常用的进化筛选方式是借助生物传感器(Biosensor)，将特定代谢物的浓度信息转化为易于检测的荧光信号或抗生素抗性，实现高效的适应性进化[70]。
4 生物传感器生物传感器是一种将生物物质浓度转化为电信号、荧光信号等易于检测的信号的装置，包含信号识别元件和信号输出元件，可辅助适应性进化，加快进化过程，还可用于高通量筛选、代谢途径的优化与动态调控、细胞成像等。常用的生物传感器主要包括基于转录调控因子(Transcription factor，TF)、核糖体开关(Riboswitch) 和蛋白质相互作用(例如荧光共振能量转移F?rster resonance energy transfer，FRET) 的生物传感器(表 1)[71]。最近，研究者还开发了基于稀有密码子的新型生物传感器，并应用于氨基酸生产菌的高通量筛选[72]。
表 1 应用于谷氨酸棒杆菌的生物传感器Table 1 Biosensors developed for C. glutamicum
| Sensor | Type | Source | Analyte | Signal | References |
| Lrp | TF | C. glutamicum | l-valine, l-isoleucine, l-leucine, l-methionine | eYFP, GFP, TetA | [70, 74-77] |
| LysG | TF | C. glutamicum | l-lysine, l-arginine, l-histidine | eYFP | [78-80] |
| NCgl0581 | TF | C. glutamicum | l-serine | eYFP | [81] |
| GlxR | TF | C. glutamicum | cAMP | eYFP | [82] |
| ShiR | TF | C. glutamicum | Shikimate | eGFP | [83] |
| CrtR | TF | C. glutamicum | Geranylgeranyl pyrophosphate | GFP | [84] |
| PadR | TF | B. subtilis | p-coumaric acid | YFP | [85] |
| CgtSR2a | TF | C. glutamicum | Protein secretion | eYFP | [86] |
| LAO-BP | FRET | E. coli | l-lysine | eCFP, Citrine | [87] |
| MglB | FRET | E. coli | Glucose | Cyan, Venus | [88] |
| RppA | Enzyme | S. griseus | Malonyl-CoA | Red-colored flaviolin | [89] |
| mBFP | Enzyme | Metagenome | NADPH | mBFP | [90] |
| Mrx1-roGFP2 | Enzyme | C. glutamicum | Mycothiol redox potential | roGFP2 | [91] |
| tRNA | Rare codon-rich marker | C. glutamicum | l-arginine | KanR | [72] |
| aPredicted by authors. | |||||
表选项
4.1 转录调控因子Lrp是谷氨酸棒杆菌中响应l-甲硫氨酸和支链氨基酸(l-亮氨酸、l-缬氨酸和l-异亮氨酸) 的转录调控因子。Lrp可响应胞内l-甲硫氨酸和支链氨基酸的浓度，并激活外排蛋白BrnFE的表达，以维持胞内正常的氨基酸浓度[73]。Mustafi等发现Lrp对l-缬氨酸的亲和力最强，并以黄色荧光蛋白(Enhanced yellow fluorescent protein，eYFP) 作为报告系统，构建了可监测胞内l-缬氨酸浓度的生物传感器[74]。之后，该生物传感器被应用于从随机突变文库中筛选可胞外积累支链氨基酸的突变株[74-75]，以及在单细胞水平监测细胞的l-缬氨酸合成能力的差异[76]。Mahr等使用Lrp生物传感器，将胞内的l-缬氨酸浓度转化为eYFP的表达量，在适应性进化中，通过FACS筛选荧光信号较高的细胞，通过5代进化和筛选，获得了l-缬氨酸产量提升一倍的突变株，并鉴定到脲酶辅助蛋白UreD的关键突变[70]。Tan等进一步对Lrp调控的PbrnFE启动子进行突变，获得了对l-异亮氨酸响应增强的突变启动子，用于调控胞内l-异亮氨酸的浓度，从而提高4-羟基-l-异亮氨酸的合成[77]。
与响应l-甲硫氨酸和支链氨基酸的Lrp相似，LysG是谷氨酸棒杆菌中响应碱性氨基酸(l-赖氨酸、l-精氨酸和l-组氨酸) 的转录调控因子，当胞内碱性氨基酸浓度升高时，LysG可激活外排蛋白LysE的表达，启动相应氨基酸外排[92]。Binder等使用LysG和eYFP构建了l-赖氨酸生物传感器，鉴定了其对胞内l-赖氨酸的线性响应范围为5?25 mmol/L，并通过FACS从随机突变文库中筛选获得了l-赖氨酸生产菌株，通过基因组测序鉴定了关键突变位点[78]。该生物传感器还被用于筛选l-赖氨酸、l-精氨酸和l-组氨酸合成关键酶的突变体文库，获得了解除反馈抑制和催化活性提升的突变体[79-80]。Zhang等利用特异性响应l-丝氨酸的LysR型转录调控因子NCgl0581、启动子PNCgl0580和eYFP构建了l-丝氨酸生物传感器，并应用于从随机突变菌株文库中筛选高产l-丝氨酸的突变株。最优突变株的产量(34.78 g/L，0.35 g/g蔗糖) 和转化率较出发菌株分别提高了35.9%和66.7%，展示了该生物传感器在筛选高产菌种中的应用[81]。
除氨基酸外，研究者还开发了谷氨酸棒杆菌其他小分子代谢物的生物传感器。Schulte等利用全局转录调控因子GlxR、受其抑制的启动子Pcg3195和eYFP，开发了第二信使环磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate，cAMP) 的生物传感器，并对具有不同cAMP水平的突变株文库进行了筛选[82]。Liu等利用LysR型转录调控因子ShiR、shiA基因的启动子区域和eGFP构建了莽草酸生物传感器，其响应胞内莽草酸的线性范围为19.5?120.9 pmol/细胞。该生物传感器可以用于实时监测胞内的莽草酸浓度，以及对莽草酸合成基因的RBS文库进行筛选，获得高产菌株。此外，与莽草酸摄入蛋白ShiA组合使用，可以对环境中的莽草酸进行监测[83]。谷氨酸棒杆菌具有类胡萝卜素的合成途径，在天然产物合成中有着潜在的应用。Henke等利用类胡萝卜素合成基因簇crt操纵子的转录调控因子CrtR、受其抑制的启动子PcrtE和GFP，构建了可响应胞内类胡萝卜素前体——香叶基香叶基焦磷酸(Geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP) 的生物传感器，可用于筛选GGPP积累的突变株和调控类胡萝卜素的合成途径[84]。
目前，谷氨酸棒杆菌的生物传感器通常选用内源的转录调控因子，虽然在谷氨酸棒杆菌中的适配性好，但是能够检测的代谢物种类有限。因此，仍需开发利用异源的生物传感器。Siedler等利用枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis的转录调控因子PadR，开发了适用于谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌等异源宿主的对香豆酸生物传感器，并通过微流控液滴同时包埋对香豆酸的生产菌和携带生物传感器的检测菌，实现了胞外对香豆酸的检测[85]。
谷氨酸棒杆菌不仅是生产氨基酸等小分子化合物的理想宿主，也可用于蛋白质的分泌表达。Jurischka等构建了可监测谷氨酸棒杆菌蛋白质分泌表达的生物传感器。作者通过转录组分析发现，当谷氨酸棒杆菌分泌表达蛋白质时，蛋白酶HtrA的转录上调，通过将染色体上的htrA替换为eyfp报告基因，所获得的工程菌在分泌表达蛋白质时，可输出eYFP荧光信号，且蛋白质分泌表达量在一定范围内与eYFP信号呈线性关联。但是，调控htrA基因的转录调控因子未知，作者推测双组分调控系统CgtSR2可能起到重要调控作用[86]。
4.2 FRETFRET是指供体荧光分子的荧光发射光谱与另一个受体荧光分子的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体荧光分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减的现象。该原理被应用于FRET型生物传感器的构建。Steffen等将来自大肠杆菌的l-赖氨酸、l-精氨酸和l-鸟氨酸结合蛋白LAO-BP与两个青色白荧光蛋白(Enhanced cyan fluorescent protein，eCFP) 和Citrine融合，并将LAO-BP的C端和N端使用连接肽进行环化，构建了l-赖氨酸生物传感器，进一步通过优化LAO-BP与荧光蛋白间的连接肽，改进了生物传感器，应用于检测谷氨酸棒杆菌发酵过程中胞外l-赖氨酸的浓度[87]。类似地，Otten等使用来自大肠杆菌的葡萄糖/半乳糖结合蛋白MglB与供体荧光蛋白Cyan和受体荧光蛋白Venus，构建了可检测葡萄糖的FRET型生物传感器，并应用于谷氨酸棒杆菌微孔板培养过程中发酵液中葡萄糖浓度的在线监测[88]。
4.3 酶一些酶由于其具有特定的催化功能，也可被用于构建生物传感器。Ⅲ型聚酮合酶RppA可催化5分子丙二酰CoA生成1, 3, 6, 8-四羟基萘，后者可自发转化为红色的聚酮类化合物淡黄霉素(Flaviolin)。Yang等利用该原理，从链霉菌Streptomyces、糖多孢菌Saccharopolyspora等细菌中筛选了对丙二酰CoA亲和性较好的RppA，构建了可检测胞内丙二酰CoA浓度的生物传感器，在包括谷氨酸棒杆菌在内的多个细菌中均可应用[89]。除了在可培养微生物中挖掘生物传感器的元件，宏基因组数据中也蕴藏着丰富的基因元件。Hwang等从宏基因组数据中挖掘出一个特殊的氧非依赖、NADPH依赖型蓝色荧光蛋白(Blue fluorescent protein)，命名为mBFP[93]。Goldbeck等发现mBFP对NADPH具有高亲和性(KD= 0.64 mmol/L) 和高特异性，可特异性放大NADPH的荧光信号，不与NADH结合，因此可用作监测NADPH的生物传感器。此外，mBFP还具有NADPH依赖的苯乙醛还原酶活性[90]。
4.4 富含稀有密码子的报告系统除上述传统的生物传感器外，Zheng等开发了一种基于稀有密码子的新型生物传感器。其原理为，在gfp报告基因或抗生素抗性基因序列中增加稀有密码子的数量，稀有密码子的翻译受到稀有的氨酰tRNA量的限制，当胞内相应的氨基酸浓度较低时，氨酰tRNA合成受限，导致基因低水平表达。添加外源氨基酸或增强内源氨基酸合成，可提高稀有密码子的翻译速度，从而提高报告基因或抗性基因的表达水平，使细胞输出更强的荧光信号或具有更强的抗生素抗性。该生物传感器被用于筛选l-精氨酸合成能力增强的谷氨酸棒杆菌突变菌株，在其他氨基酸生产菌株的筛选中也有应用前景[72]。
5 总结与展望新型的基因组编辑、基因表达调控、适应性进化、生物传感器等代谢工程和合成生物学使能技术的快速发展，显著加快了谷氨酸棒杆菌细胞工厂的构建和优化。基于此，谷氨酸棒杆菌仍是氨基酸生物制造的核心菌种，在其他大宗化学品、生物燃料、天然产物、蛋白质等产品的生物制造中，也扮演着越来越重要的角色。但是，与另外两个常用的底盘微生物大肠杆菌和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae相比，谷氨酸棒杆菌的多基因或多靶点编辑工具仍需提升，缺乏多重自动化基因组工程(Multiplex automated genome engineering，MAGE)[94]或eMAGE (Eukaryotic MAGE)[95]等在染色体上直接产生遗传多样性的高效技术。另一方面，谷氨酸棒杆菌基因组的3 000余个基因中仍有超过40%的基因功能未知或缺乏实验证据。因此，为更好地挖掘谷氨酸棒杆菌的代谢潜力，进一步提升生物制造的效率，需要进一步优化代谢工程使能技术，结合自动化实验装备，进行高通量的功能基因组研究，解析谷氨酸棒杆菌优良生物学和工业性状背后的遗传和分子机制。另一方面，亟需完善谷氨酸棒杆菌的代谢模型和调控网络，为菌株构建和优化提供更精确的预测和设计。
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